Genetika celiakie detekcia asociovaných

! Genetika celiakie detekcia asociovaných antigénov metódou microarray Elena Tibenská, Simona Duranková, Barbora Onderová Medirex, Bratislava 11.-13.6.2014

a i c n e l a v r e k o s y Celiakálna choroba (gluténová/ glutén- senzitívna enteropatia, celiakálna sprue) Øautoimunitné ochorenie postihujúce geneticky predisponovaných jedincov, spôsobené patologickou reakciou organizmu na prítomnosť lepku (komplex bielkovín v povrchovej časti obilných zŕn) v strave, na základe ktorej dochádza k poškodeniu sliznice tenkého čreva v p á ko syvøaicnelav eráp SR: predpokladaná 1:250 diagnostikovaná (január 2008) 1:677 vysoký počet nediagnostikovaných prípadov - vysoký výskyt tzv. mimočrevných foriem- najmä dospelí diagnostické oneskorenie 7 rokov Fasano, et al. Arch Intern Med 2003;163:286-92 Ciclitira PJ. Nature Clinical Practice Gastroenterology & Hepatology 2007 (4);9:483

C Celiakia - mimočrevné príznaky lkové: oneskorený rast u detí, váhový úbytok, celková únava Kožné: herpetiformná dermatitída, folikulárna keratóza, pigmentácie Kostrovosvalové: osteoporóza, osteopénia, fraktúry, bolesti kostí a svalov, defekty zubnej skloviny, myopatie, tetania, artritídy Neurologické: ataxia, periférna polyneuropatia, epilepsia, šeroslepota Psychiatrické: anxieta, depresia, iritabilita, poruchy pozornosti Hematologické: anémia nejasnej etiológie (nedostatok Fe a k. listovej), trombocytóza, atrofia sleziny Reprodukčný systém: infertilita a poruchy reprodukcie u žien i mužov, opakované aborty Laboratórne nálezy: nízke hladiny sérového Fe, Ca a výrazné izolované zvýšenie aminotransferáz (v typickom prípade AST < ALT), ev. zníženie ALP, predĺžený protrombínový čas

G Celiakálny ľadovec ézie ká predispozícia: - DQ2, DQ8 Pozitívna sérologia

H # " % $ #" C Genetika celiakie üfamiliárny výskyt (10-12%) ü výskyt u jednovaječných dvojčiat (83-86%) oproti dvojvaječným (11%) ü prvostupňoví príbuzní - prevalencia - 10% üdruhostupňoví - 2%???? + ü polyvalentná dedičnosť ü silná HLA asociácia

& ' J Genetika celiakie *)(Solid: Nature Immunology:2009,9:858-870

Genetika celiakie +DQ2-90-95% pacientov s celiakiou ü DQ8-8-10% pacientov ü DQ2/DQ8 negatívna CD veľmi zriedkavá (vylúčenie CD s 99% pravdepodobnosťou),dq2/dq8 positivita! CD ü bežná populácia: DQ2 ~ 30% ü DQ8 ~ 10% ü HLA DQ2 a/alebo DQ8 positivita HLA haplotypu nevyhnutná, ale nie postačujúca podmienka CD Koning et al:bpr Clin Gastro, 2005, 19:373-387

Genetika celiakie DQA1 / DQB1 alel Megiorni and Pizzuti Journal of Biomedical Science 2012, 19:88

- D 1. 0/ - D :9 8 :99 7 6 5 4 3 x Genetika celiakie HLA-DQ status a riziko Celiakie 2Very high DQ2.5 (with a double dose of DQB1*02) DQ8 DQ2.5 (with a single dose of DQB1*02) DQ2.x (with a double dose of DQB1*02) DQ2.x (with a single dose of DQB1*02) DQX.5 DQX.x Very high High High High Low Extremely low Extremely low ;different from *05. X = DQB1 alleles different from *02 and *03:02 Megiorni and Pizzuti Journal of Biomedical Science 2012, 19:88

= < = < A @? = < Genetika celiakie ü ü ü >-DQ2 = HLA-DQ2.5? >-DQ2 haplotypy DQ2.5 - DQB1*02+DQA1*05 A B- DQB1*02+DQA1*02 >-DQ 2.2 hrá úlohu pri rozvoji celiakie HLA typ Retrospektívna štúdia (n=70) Prospektívna štúdia (n=85) Spolu (n=155) HLA-DQ2.5 63 (90.0%) 76 (89.4%) 139 (89.7%) HLA-DQ8 2 ( 2.9%) 5 ( 5.9%) 7 ( 4.5%) HLA-DQ2.2 5 ( 7.1%) 4 ( 4.7%) 9 ( 5.8%) Mubarak et all: JPGN 2013 Apr;56(4):428-30

\ E g UZ W YX Q P W Q F t g U V Pt Q R S q P m uqp j M N O d f h Tw I K` t _^ Q R S q P m uqp j M N O d f h Lb I K` t _^ ~ } z zz { Diagnostický algoritmus pri podozrení na CD (podľa ESPGHAN, 2011) ]mptomatickí pacienti (deti/adolescenti) s predpokladanou CD (gastrointestinálne príznaky, rastová retardácia, osteoporóza, anémia,..) Fti-tTG (IgA) + celkové IgA1 pozit negat CD vylúčená O [erenie: IgA deficiencia? Liečba? Vek < 2 roky? Symptómy? GFD? Asociované ochorenia? 2 & HLA DQ2/DQ8 2 Testy nedostupné Biopsia tenkého čreva EMA - HLA - EMA + HLA - EMA + HLA + EMA - HLA + Marsh 2-3 Marsh 0-1? overiť falošne pozit ttg? falošne negat HLA? liakálna choroba potvrdená D falošne negat. biopsia? falošne pozit. serologia? 1 (IgA def.- ttg IgG), 2 nová vzorka

Ž Diagnostický algoritmus pri podozrení na CD (podľa ESPGHAN, 2011) ymptomatickí pacienti s genetickým rizikom CD (prvostupňoví príbuzní, DM I.typu, Downov syndróm,...) ƒ DQ2/DQ8 ˆ -ttg (IgA) + celkové IgA1 pozit negat riziko CD vylúčené pozit. ttg > 3x ref.h. Biopsia tenkého čreva Marsh 0-1 pozit. ttg < 3x ref.h. Marsh 2-3 EMA negat. EMA + EMA - CD vylúčená? overiť o? Œ Š? f l.negat.testov? IgA deficiencia? Vek < 2 roky? GFD? Opakované sledovanie/testovanie podľa potreby? overiť? falošne pozit ttg? Opakované sledovanie/testovanie podľa potreby liakálna choroba potvrdená falošne negat. biopsia? falošne pozit. serologia? D 1 (IgA def.- ttg IgG), 2 nová vzorka

ž š œ ž š œ The EUROArray system: Principle of DNA microarray analysis tient sample (genomic DNA) G T T C G A C A A A G C T Ÿhybridisation of sample DNA to probes on microarray Ÿdetection of the spots with hybridized PCR-products by measuring fluorescence emission capture DNAoligonucleotide (probes) šstep: amplification and labeling of target DNA target sequence by polymerase chain reaction (PCR) solid phase spot: millions of identical DNA molecules

The EUROArray system

EUROArray HLA-DQ2/DQ8 - Advantage compared to other tests - All 4 relevant HLA alleles are determined by a single microarray incubation:

EUROArray HLA-DQ2/DQ8 - Advantage compared to other tests - Other tests: false positive results possible, e.g. because -subunit of HLA-DQ8 not determined #-subunits of HLA-DQ2 and -DQ8 can not be distinguished ü False positive results! x x => lower diagnostic specificity

-DQA1 alleles Microarray HLA-DQ2/DQ8 Microrray HLA-DQ2/DQ8 unikátne zloženie: -DQB1 alleles

ª ª ª Hodnotenie HLA-DQ2/DQ8 «-DQ2.2 pozitivny pacient HLA-DQ2 DQ8 negativny pacient HLA-DQ2.5 pozitivny pacient «-DQ8 pozitivny pacient «-DQ2.2+2.5 pozitivny pacient

Microarray HLA-DQ2/DQ8 naše skúsenosti

Microarray HLA-DQ2/DQ8 naše skúsenosti

Microarray HLA-DQ2/DQ8 naše skúsenosti!!!nastavenie termocykléra RAMP RATE!!!

Microarray HLA-DQ2/DQ8 naše skúsenosti

HLA-DQ2/DQ8 výsledky august 2012 apríl 2014 1549 pacientov: 1200 1000 600 1099 400 50 45 200 40 Muži Ženy 35 30 25 20 15 10 5 1925 1933 1936 1939 1942 1945 1948 1951 1954 1957 1960 1963 1966 1969 1972 1975 1978 1981 1984 1987 1990 1993 1996 1999 2002 2005 2008 2011

² ± ¹ µ ¹ ¾ à ½ ¾ ½ Ä ¾ ½ à ¾ ½ HLA-DQ2/DQ8 výsledky august 2012 apríl 2014 1549 pacientov: ³-DQ + 645 41.6% HLA-DQ - 901 58.2% not valid 3 0.2% DQ 2 428 66.4% DQ 8 185 28.7% DQ 2 + DQ 8 32 5% 5,00% 0,20% 28,70% 58,20% ¼ ¾½»º  ÁÀ¾½¼»ºvalid Ä

Ñ Ð Î Ï Ë Íä Ë Ì Ê Ç Æ É È Èä Ç Æ Ç Æ É È åä Ç Æ ê Üé çè ÝçÚæ ëìë Þ Ý Óìë Þ Ý Ù ÖÕÔ Ó ß Óìë ëìë Þ Ý í Þ Ý í Þ ß Ý ëìë Þ Ý Þ ß Ý Óìë Þ Ý HLA-DQ2/DQ8 výsledky + HLA-DQ2.2 Åaugust 2012 apríl 2014 1549 pacientov: Ò-DQ + 846 54.6% HLA-DQ - 700 45.2% not valid 3 0.2% DQ 2.2 178 21.60% DQ 2.5 316 38.40% DQ 2.2 + 2.5 112 13.60% DQ 8 172 20.90% Ê32 3.90% 0,20% [HODNOTA] [HODNOTA] 45,20% [HODNOTA] í [HODNOTA] ß Ü ÞÝ ÛÚ ã âàþýüûúvalid [HODNOTA]

ù ø ø ö õ ó ô ò ñ ð ðð ïî ñ ðûúð ñ ððúð HLA-DQ2/DQ8 výsledky DGP pozit. - 2x DQ2.2-110 pac.: ttg+ema+dgp pozit. - 1x (potvrdená celiakia) 120,00% HLA-DQ 2.2.+ 100,00% 97,30% 80,00% 60,00% 40,00% 20,00% 1,80% ttg, EMA, DGP + ttg, EMA, DGP - DGP +

Záver haplotypu HLADQ2.2?

Ďakujem za pozornosť