UNIVERSITATEA DIN ORADEA FACULTATEA DE MEDICINĂ ŞI FARMACIE

UNIVERSITATEA DIN ORADEA FACULTATEA DE MEDICINĂ ŞI FARMACIE STRESUL OXIDATIV ÎN INFECłIA CU VIRUSUL HEPATITIC C TEZĂ DE DOCTORAT PENTRU OBłINEREA TITLULUI ŞTIINłIFIC DE DOCTOR ÎN ŞTIINłE MEDICALE DOMENIUL MEDICINĂ Conducător ştiinńific, Prof. Dr. SPINEANU RADU Doctorand, LENARD ILDIKÓ ORADEA 2008 1

CUPRINSUL TEZEI DE DOCTORAT Listă de abrevieri Introducere Partea I-a SINTEZĂ BIBLIOGRAFICĂ Cap. I. InfecŃia cu virusul hepatitic C 1.1. Introducere 1.2. Etiologie 1.2.1. Structura virusului hepatitic C 1.2.2. Variabilitatea genomică 1.2.3. Tropismul viral 1.2.4. Replicarea virală 1.2.5. Modelul experimental 1.2.6. RezistenŃa la agenńi fizici şi chimici 1.3. Epidemilogie 1.3.1. Baza biologică a transmiterii 1.3.2. ModalităŃi de transmitere 1.4. Patogenie 1.5. Istoria naturală 1.5.1. Hepatita acută virală C 1.5.2. Hepatita cronică virală C 1.5.3. InfecŃia cronică cu VHC şi patologia extrahepatică 1.6. Diagnostic 1.6.1. Diagnosticul infecńiei cu VHC 1.6.2. Biopsia hepatică 1.6.3. Metode neinvazive de evaluare în hepatita cronică virală C 1.7. Tratamentul antiviral în hepatita virală C 1.7.1. Tratamentul antiviral în hepatita acută virală C 1.7.2. Tratamentul antiviral în hepatita cronică virală C 1.7.3. Terapii pe cale de propunere 1.7.4. Transplantul hepatic 1.7.5. Profilaxia infecńiei cu VHC Cap.II. Stresul oxidativ în infecńia cu virusul hepatitic C 2.1. Date generale 2.2. Stresul oxidativ în hepatitele acute virale 2.3. Stresul oxidativ în infecńia cu virusul hepatitic C 2.3.1. Mecanismele stresului oxidativ în infecńia cu VHC 2.3.2. Rolul stresului oxidativ în patogeneza infecńiei cu VHC 2

Cap.III. Ipoteză de lucru Cap.IV. Obiective Cap.V. Material şi metode 5.1. Material 5.2. Metode Cap.VI. Rezultate şi discuńii Partea II-a CERCETĂRI PERSONALE 6.1. Evaluarea stresului oxidativ în hepatita acută virală C versus hepatita cronică virală C la adulńi 6.1.1. Rezultate 6.1.2. DiscuŃii 6.1.3. Concluzii 6.2. Urmărirea evoluńiei stresului oxidativ la adulńii cu hepatită cronică virală C versus copiii cu hepatită cronică virală C 6.2.1. Rezultate 6.2.2. DiscuŃii 6.2.3. Concluzii 6.3. Analiza stresului oxidativ în hepatita cronică virală C versus hepatita cronică virală B la copii 6.3.1. Rezultate 6.3.2. DiscuŃii 6.3.3. Concluzii 6.4. Studiul stresului oxidativ în hepatita cronică virală C înainte şi după terapia antivirală 6.4.1. Rezultate 6.4.2. DiscuŃii 6.4.3. Concluzii 6.5. Decelarea stresului oxidativ în hepatita cronică virală C cu şi fără manifestări extrahepatice 6.5.1. Rezultate 6.5.2. DiscuŃii 6.5.3. Concluzii 3

Cap.VII. Concluzii generale Bibliografie Anexe LISTA DE LUCRĂRI PUBLICATE Anexa 1. Articole publicate in extenso ca prim autor Anexa 2. Articole publicate în rezumat ca prim autor Anexa 3. Articole publicate in extenso ca şi coautor Cuvinte cheie: stres oxidativ, hepatită acută virală C 4

INTRODUCERE InfecŃiile cu virusurile hepatitice reprezintă o problemă importantă de sănătate publică în lume. În România, prevalenńa acestor infecńii este, de asemenea, în continuă ascensiune atât la populańia infantilă, cât şi la adulńi. În ultimii ani, din ce în ce mai pregnant, din acest ansamblu nosologic complex se desprinde infecńia cu virusul hepatitic C, cea mai frecventă cauză de hepatită cronică, ciroză hepatică şi carcinom hepatocelular. Deşi patogenia acestei infecńii nu este încă pe deplin elucidată, în prezent - argumentat şi acceptat în literatura de specialitate - este din ce în ce mai incriminat rolul stresului oxidativ, alături de mecanismele imunologice. PARTEA I-A SINTEZĂ BIBLIOGRAFICĂ Cap.I. INFECłIA CU VIRUSUL HEPATITIC C 1.1. Introducere Descoperirea virusului hepatitic A şi a virusului hepatitic B în anii 1970-1973 a dat speranńe (care s-au dovedit neîntemeiate) că îmbolnăvirile de hepatită ar putea fi controlate cel puńin în mediul spitalicesc. S-a observat însă, că în condińii severe de igienă şi supraveghere medicală, apăreau hepatite posttransfuzionale de etiologie necunoscută. Acestea au fost grupate ca hepatite nona-nonb (1, 2). Q. L. Choo şi M. Houghton (1989) de la laboratoarele Chiron (Emeryville), utilizând tehnici de clonare moleculară, descoperă virusul hepatitic C (VHC) la cimpanzeii infectańi cu serul provenit de la bolnavii cu hepatită nona-nonb. 1.2. Etiologie Comitetul InternaŃional de Taxonomie Virală a propus să includă virusul hepatitic C (VHC) în familia FLAVIVIRIDAE, alături de flavi- şi pestivirusuri, şi în genul HEPACIVIRUS, având ca prototip VHC (3). Studii de imunoelectronomicroscopie ale unor preparate de plasmă având concentrańii înalte de ARN-VHC au relevat faptul că virionul are formă sferică şi diametrul de 55-65 nm, este învelit, la suprafańă fiind vizibile proiecńii fine de 6 nm lungime; în interior se observă nucleocapsida cu dimensiuni de 30-35 nm. 5

1.3. Epidemiologie Între 170 şi 200 de milioane de persoane din întreaga lume (aproximativ 3% din populańia globului) sunt în prezent infectate cronic cu VHC. În România prevalenńa infecńiei este de 4-5% (4). Baza biologică a transmiterii. Pentru transmiterea VHC este necesar ca virionii infecńioşi să se poată replica în celulele susceptibile (hepatocite, mononucleare? limfocite?). Utilizând tehnici sensibile, ARN-VHC a fost detectat în sânge (incluzând serul şi plasma), salivă, lacrimi, lichid seminal, secreńii vaginale, lichidul de ascită, LCR (5). 1.4. Patogenie Cu toată apartenenńa VHC la familia Flaviviridae (recunoscută pentru potenńialul citotoxic ridicat), răspunsul imun are rol determinant în patogeneza hepatitei virale C pentru că intervine atât în controlul infecńiei şi vindecare, cât şi în evoluńia spre cronicizare şi ciroză hepatică. Astfel, VHC este un virus hepatotrop non-citopatic capabil să inducă boală hepatică acută sau cronică şi să interacńioneze complex cu sistemul imun (6). Este general acceptat faptul că intensitatea şi persistenńa răspunsului VHC-specific al limfocitelor T, precum şi profilul citokinelor secretate determină evoluńia infecńiei VHC. Astfel, un rapid, puternic, policlonal şi multispecific (împotriva mai multor epitopi virali) răspuns din partea limfocitelor CD4 şi CD8 este corelat cu clearance-ul viral (7, 8, 9). Profilul citokinelor secretate poate influenńa, de asemena, evoluńia infecńiei VHC. Citokinele Th1 (IL-1, Interferon γ, TNF α) stimulează limfocitele citotoxice CD8, pe când citokinele Th2 (IL-4, IL-5, IL-10) stimulează producńia de anticorpi. Astfel, secreńia citokinelor Th1 este asociată cu vindecarea infecńiei acute (10, 11). Dacă răspunsul imun este tardiv, mai puńin eficient (de intensitate mai mică), împotriva unui număr redus de epitopi virali şi nu persistă suficient timp, infecńia VHC tinde să devină cronică. De asemenea, pacienńii cu secreńie crescută de citokine Th2 dezvoltă hepatită cronică (7, 9). 1.5. Istoria naturală a infecńiei cu VHC InfecŃia cronică cu VHC şi patologia extrahepatică. InfecŃia cronică cu VHC determină şi o patologie extrahepatică semnificativă (1-2%), cu spectru variabil de exprimare, începând cu manifestări serologice, care consistă în aparińia unor autoanticorpi circulanńi şi sunt adeseori asimptomatice clinic şi terminând cu boli organice extrahepatice ce pot avea un caracter sistemic. Mecanismele patogenice implicate nu sunt bine cunoscute în prezent. SubiecŃii afectańi aparńin, de obicei, haplotipului ancestral A-1 (HLA-A1, Cw7, TNFAB*a2b3, TNFN*S, C2*C, Bf*s, C4A*0501, DQB1*0201), alelele fiind relativ specifice diverselor zone geografice. Rolul principal revine probabil 6

mecanismelor imunologice, infecńia cronică virală având capacitatea de a declanşa şi întreńine o reacńie de tip autoimun (12). 1.6. Tratamentul antiviral în hepatita virală C Obiectivul principal al tratamentului antiviral este prevenirea progresiei bolii hepatice prin eradicarea infecńiei cu VHC. Un obiectiv secundar poate fi considerat întârzierea evoluńiei bolii cu reducerea progresiei fibrozei hepatice şi prevenirea aparińiei carcinomului hepatocelular. 1.6.1. Tratamentul antiviral în hepatita acută virală C Studii meta-analitice recente recomandă inińierea terapiei antivirale la 3-4 luni de la debutul infecńiei, pentru a se evita tratarea celor care se vor debarasa de virus (până la 50% din cazuri); se consideră că o perioadă de 12 săptămâni de la debutul clinic este suficientă pentru realizarea clearance-ului viral spontan (13). Vor fi tratańi în acest moment doar cei care prezintă ARN-VHC seric şi, eventual, valori crescute ale transaminazelor. Regimurile terapeutice standard recomandă administrarea de Interferon α 2b în doză de 5 MU/zi timp de 4 săptămâni, urmată de doze de 5 MU de 3x/săptămână timp de 20 de săptămâni (rata de răspuns virusologic susńinut de 98%) (14). 1.6.2. Tratamentul antiviral în hepatita cronică virală C Tratarea pacienńilor cu hepatită cronică cu VHC este justificată de riscul crescut de evoluńie al acesteia către ciroză hepatică şi carcinom hepatocelular şi se face conform protocolului elaborat de Casa NaŃională de Asigurări de Sănătate. 1.6.3. Terapii pe cale de propunere Este evident faptul că în ciuda progreselor făcute în ultimii ani, rezultatele terapiei antivirale în hepatita cronică cu VHC sunt nesatisfăcătoare în ansamblu. O serie de noi medicamente antivirale se află în faza de testare urmând ca eficienńa lor să fie dovedită pentru a putea fi introduse în schemele terapeutice curente. Cap.II. STRESUL OXIDATIV ÎN INFECłIA CU VIRUSUL HEPATITIC C InfecŃia cu VHC se caracterizează printr-un stres oxidativ sistemic cauzat mai probabil prin combinarea efectelor inflamańiei cronice, a supraîncărcării hepatice cu fier, leziunilor hepatice şi proteinelor codate ale VHC. ProducŃia crescută de specii reactive ale oxigenului şi nitrogenului, împreună cu scăderea apărării antioxidante, promovează dezvoltarea şi progresia complicańiilor hepatice şi extrahepatice ale infecńiei VHC (15). 7

Mecanismele stresului oxidativ în infecńia cu VHC (15): - activarea NAD(P)H oxidazei din celulele Kupffer şi PMN în timpul inflamańiei; - supraîncărcarea cu fier şi peroxidarea lipidică; - activarea NAD(P)H oxidazei de către proteina NS3; - creşterea producńiei mitocondriale de SRO/SRN prin lanńul de transport electronic legat de proteinele NS5A şi core; - scăderea producńiei de GSH datorită leziunilor hepatice; - scăderea antioxidanńilor şi expresiei genelor acestora; - alcoolul, drogurile şi alte chimicale; - creşterea citokinelor care augmentează SRO; - creşterea expresiei CYP2E1; - creşterea expresiei/activităńii Cox-2. Pe de altă parte, studiile arată că VHC poate induce direct stres oxidativ în hepatocite. Expresia genelor core ale VHC a fost asociată cu creşterea SRO, scăderea intracelulară şi/sau mitocondrială a conńinutului de GSH şi creşterea nivelului tioredoxinei oxidate şi a produşilor peroxidării lipidice (16, 17, 18, 19). PARTEA II-A CERCETĂRI PERSONALE Cap.III. IPOTEZA DE LUCRU Ficatul este centrul metabolic al organismului, cu un rol important în fagocitoză şi reacńiile imunologice. Acesta conńine atât cantităńi mari de antioxidanńi (SOD, CAT, ceruplasmină, vitamina E, GSH, GSH-Px şi GSHreductază), cât şi sisteme care, în cantităńi prooxidante, devin surse ale formării de SRO (xantin-oxidază, enzime oxidative microsomale, celule Kupffer). łinând cont de cele de mai sus, stresul oxidativ este astăzi din ce în ce mai mult incriminat în patogeneza infecńiilor cu virusuri hepatitice, alături de procesele imunologice. Pornind de la această constatare, am emis ipoteza că în infecńia cu virusul hepatitic C există, în mod cert, stres oxidativ, fapt relevat prin niveluri serice crescute ale malondialdehidei (marker prooxidativ) şi niveluri serice scăzute ale glutationului redus (un antioxidant endogen puternic). 8

Cap.IV. OBIECTIVE 1. Evaluarea stresului oxidativ în hepatita acută virală C versus hepatita cronică virală C la adulńi. 2. Urmărirea evoluńiei stresului oxidativ la adulńii cu hepatită cronică virală C versus copii şi tineri (3-21 ani) cu hepatită cronică virală C. 3. Analiza stresului oxidativ în hepatita cronică virală C versus hepatita cronică virală B la copii. 4. Studiul stresului oxidativ în hepatita cronică virală C înainte şi după terapia antivirală. 5. Decelarea stresului oxidativ în hepatita cronică virală C cu şi fără manifestări extrahepatice. Cap.V. MATERIAL ŞI METODE A fost un studiu analitic prospectiv randomizat care s-a derulat în perioada 1 ianuarie 2003-31 martie 2008 pe un număr de 30 de adulńi cu hepatită acută virală C, 50 de pacienńi adulńi cu hepatită cronică virală C fără manifestări extrahepatice, 20 adulńi cu hepatită cronică virală C şi manifestări extrahepatice, 24 pacienńi pediatrici cu infecńie cronică cu VHC şi 15 cu VHB, precum şi două loturi de martori: un lot de 20 adulńi sănătoşi şi un lot pediatric cu un număr de 20 subiecńi sănătoşi. Tuturor pacienńilor luańi în studiu li s-au determinat: - aminotransferazele serice (ALAT şi ASAT), - malondialdehida (MDA) serică ca şi marker prooxidativ, - glutationul seric redus (GSH) ca şi marker antioxidant endogen. PacienŃii cu hepatită acută/cronică virală C au beneficiat de determinarea: - Ac antivhc, - cuantificarea ARN-VHC, - determinarea GSTM1 (cu excepńia pacienńilor pediatrici). PacienŃilor cu hepatită cronică virală C şi terapie antivirală, aceste probe au fost efectuate înainte de inińierea tratamentului antiviral, precum şi la încheierea acestuia. PacienŃilor pediatrici cu hepatită cronică virală B li s-au determinat: - Ag HBs, - ADN-VHB. În cazul loturilor martor au fost cuantificate: - aminotransferazele serice (ALAT, respectiv ASAT), - malondialdehida serică (MDA), - glutationul seric redus (GSH). 9

Cap.VI. REZULTATE ŞI DISCUłII 6.1. Evaluarea stresului oxidativ în hepatita acută virală C versus hepatita cronică virală C la adulńi Obiectivul acestui studiu a fost de a furniza informańii privind intervenńia stresului oxidativ în patogeneza infecńiei cu virusul hepatitic C. Ipoteza a fost de a se evalua stresul oxidativ la pacienńii cu hepatită acută şi cronică virală C, de a se raporta markerii acestuia luańi în studiu (MDA ca şi cel mai relevant prooxidativ, respectiv GSH cu rol de antioxidant endogen puternic cantonat mai ales la nivel hepatic) la parametrii necrozei hepatocelulare şi cantitatea de VHC în sânge, precum şi de a demonstra rolul glutation S-transferazei în cronicizarea infecńiei. Originalitatea cercetării s-a axat pe compararea stresului oxidativ între hepatita acută şi cronică produsă de virusul hepatitic C, precum şi în demonstrarea rolului GSTM1 în cronicizarea infecńiei acute cu VHC, la ora actuală neexistând un studiu pe pacienńi cu hepatită acută C şi implicarea GSTM1 în evoluńia spre cronicizare, toate cercetările de până acum axându-se pe loturi de pacienńi cronici. În ceea ce priveşte markerul prooxidativ studiat, s-a observat că nivelurile serice ale MDA la adulńi nu diferă semnificativ între tipul de hepatită virală C, acută sau cronică (p>0,05), în schimb, la ambele loturi de pacienńi aceste valori sunt semnificativ mai mari versus lotul martor (p<0,001). Determinarea glutationului seric redus în studiul de fańă, a dus la constatarea că acesta a prezentat valori mai scăzute, dar fără semnificańie statistică (p>0,05), la adulńii cu hepatită acută virală C versus cei cu hepatită cronică; în schimb, la ambele loturi de pacienńi valorile antioxidantului endogen au fost semnificativ mai mici comparativ cu subiecńii sănătoşi (p<0,001). Efectuarea de corelańii între parametrii stresului oxidativ luańi în studiu (GSH şi MDA) pe de o parte, şi aminotransferazele serice şi nivelul ARN-VHC pe de altă parte, la pacienńii cu hepatită acută şi cronică virală C a relevat următoarele aspecte: - existenńa unei corelańii directe între MDA şi transaminazele serice atât la pacienńii cu hepatită acută C (ALAT cu r=0,67, respectiv ASAT cu r=0,72), cât şi la cei cu hepatită cronică (ALAT cu r=0,78 şi ASAT cu r=0,72); - MDA se corelează direct cu GSH în hepatita acută (r=0,64), şi mai slab (r=0,48) în cea cronică, pe când corelańia cu ARN-VHC este inexistentă pentru cei cu hepatită acută (r=0,12) şi moderată în cazul hepatitei cronice (r=0,55); - valorile GSH se corelează puternic cu transaminazele (ALAT cu r=0,78 şi ASAT cu r=0,64) în infecńia acută, pe când în cea cronică această corelańie este practic inexistentă (ALAT cu r=0,19, respectiv ASAT cu r=0,17); 10

- datele noastre relevă inexistenńa unei corelańii între GSH şi valorile ARN-VHC (r=0,26) pentru pacienńii cronici, şi o corelańie inversă în cazul hepatitei acute virale C (r= 0,06). Datele obńinute au demonstrat prezenńa crescută a genotipului 0 al GSTM1 atât la pacienńii cu hepatită acută virală C (66,7%), cât şi în cea cronică (64%) versus lotul martor (30%), cu semnificańie statistică (p<0,001) şi un factor predictiv pozitiv pentru cronicizare (VPP) de 80%, indicele de acurateńe fiind de 3,1; astfel, un pacient cu hepatită acută virală C şi GSTM1 tip 0 este supus riscului de cronicizare de 3 ori mai mult decât un pacient cu GSTM1 tip 1. Validitatea rezultatelor a fost susńinută de eliminarea bias-urilor care ar fi putut influenńa veridicitatea datelor obńinute. Astfel, prin selecńionarea de eşantioane reprezentative de bolnavi şi lot martor pe baza criteriilor de includere şi excludere în studiu, criterii care reflectă omogenitatea loturilor, s-a reuşit eliminarea bias-ului de selecńie, precum şi a factorului de confuzie. Determinarea riguroasă, prin metode şi aparatură moderne au permis evitarea bias-ului de măsurare. Pentru evidenńierea stresului oxidativ s-au efectuat doar doi parametrii, cei mai reprezentativi pentru scopul propus, evitându-se şi de această dată factorul confuzie prin utilizarea mai multor factori de stres oxidativ, în principal antioxidanńi exogeni de tipul vitaminei E, vitaminei A, seleniului, ubichinonei al căror valori ar fi putut fi influenńate prin administrarea acestora sub diverse preparate antioxidante. Analiza statistică a rezultatelor s-a efectuat prin teste de ultimă oră, în conformitate cu cerinńele CDC Atlanta. 6.2. Urmărirea evoluńiei stresului oxidativ la adulńii cu hepatită cronică virală C versus copii şi tineri (3-21 ani) cu hepatită cronică virală C Obiectivul propus a fost de a demonstra prezenńa stresului oxidativ la adulńii şi pacienńii pediatrici cu hepatită cronică virală C, precum şi implicarea factorului vârstă în derularea acestuia. Ipoteza de lucru a constat în compararea valorilor markerilor de stres oxidativ (MDA şi GSH de această dată) la cele două loturi, cu trasarea de corelańii, cu implicarea factorilor de durată a infecńiei VHC şi vârsta pacienńilor. De asemenea, s-a descris o durată mult mai mare a infecńiei cu VHC la adulńi comparativ cu copiii cu hepatită cronică virală C, fapt ce s-a regăsit şi în studiul de fańă (durata medie a infecńiei VHC la adulńii luańi în studiu a fost de 28,5±8,5 ani versus copii la care durata medie a infecńiei VHC s-a situat la 5,6 ±1,2 ani). Rezultatele obńinute au evidenńiat : - analiza statistică a valorilor medii ale MDA a relevat o creştere netă atât la adulńii, cât şi la copiii cu hepatită cronică C fańă de limita normală (p<0,001), dar cu valori nesemnificativ mai mari statistic la adulńi versus copii (p>0,05); 11

- pentru GSH s-au observat valori semnificativ mai mici ale acestuia în cazul ambelor loturi, nivelurile serice fiind de aproximativ 2 ori mai mici la cei infectańi VHC versus normalitate (p<0,001), dar cu diferenńe nesemnificativ mai mici la adulńi decât la copiii cu infecńie cronică VHC (p>0,05). Corelarea parametrilor de stres oxidativ cu nivelul transaminazelor serice, respectiv viremie, a permis trasarea următoarelor concluzii: - MDA s-a corelat puternic cu valorile ALAT (r=0,78) şi ASAT (r=0,72) la adulńii cu hepatită cronică virală C; dar nu şi în cazul lotului pediatric în cazul căruia nu a existat nici o corelańie între valorile MDA şi ALAT (r=0,03), respectiv ASAT (r=0,26); - la pacienńii adulńi cu hepatită cronică virală C nivelurile serice ale MDA s-au corelat mediu cu ARN-VHC (r=0,55) şi GSH (r=0,48), pe când la copii corelańia a fost inversă atât cu GSH (r= 0,07), cât şi cu ARN-VHC (r= 0,57); - nu a existat corelańie între valorile GSH şi aminotransferazele serice nici la adulńii (ALAT cu r=0,19 şi ASAT cu r=0,17) şi nici la copiii cu hepatită cronică C, la aceştia din urmă corelańia fiind inversă (ALAT cu r=-0,36 şi ASAT cu r=-0,13); - GSH-ul seric nu s-a corelat cu viremia nici în cazul adulńilor (r=0,26), şi nici în cazul lotului pediatric cu hepatită cronică C (r=0,30). Validitatea rezultatelor a fost justificată la punctul II.1., cu menńiunea că lotul pediatric a fost selectat din rândul pacienńilor a două judeńe, dar prin prevalenńa scăzută a infecńiei VHC în rândul populańiei pediatrice, eşantionul a fost considerat reprezentativ din punct de vedere numeric. Valabilitatea rezultatelor obńinute a fost întărită şi de rezultatele altor autori, originalitatea studiului constând însă în compararea stresului oxidativ la populańia adultă versus populańia pediatrică, fapt neîntâlnit în datele literaturii de specialitate. 6.3. Analiza stresului oxidativ în hepatita cronică virală C versus hepatita cronică virală B la copii Jinah Choi şi colaboratorii sunt de părere că în hepatita cronică virală C stresul oxidativ este mai exprimat decât în hepatita virală B, punând acest efect pe seama mecanismelor specifice prin care VHC induce stres oxidativ. Pornind de la această afirmańie, ca şi obiectiv al acestui studiu s-a propus evidenńierea stresului oxidativ la pacienńii pediatrici cu hepatită cronică virală B şi C. Ca şi ipoteză, s-a recurs la cuantificarea markerilor oxidativi, a transaminazelor serice şi încărcăturii virale la pacienńii analizańi. De la început s-a pornit de la ideea că cele două loturi de copii cu hepatită cronică să aibă durata medie relativ egală a infecńiei virale: 5,6±1,2 ani pentru lotul cu hepatită cronică virală C şi 6,5±2,4 ani pentru lotul cu hepatită cronică virală B, factorul vârstă nealterând valorile stresului oxidativ. 12

Originalitatea acestei lucrări a constat în compararea datelor obńinute prin monitorizarea parametrilor de stres oxidativ luańi în studiu între lotul de copii cu hepatită cronică virală B şi lotul pediatric cu hepatită cronică C, neexistând comunicări similare în literatura de specialitate. Concluziile obńinute s-au axat pe rezultatele prezentate mai jos: - prelucrarea statistică a datelor referitoare la valorile medii ale MDA a arătat o creştere semnificativă statistic pentru ambele loturi de pacienńi versus lotul martor (p<0,001), dar cu valori semnificativ mai mari la copiii cu hepatită C versus copiii cu hepatită B (p<0,001); - pentru GSH seric s-a constatat că cele mai mici valori au fost înregistrate la copiii cu hepatită cronică virală C, semnificativ mai mici decât la cei cu hepatită B (p<0,001), la ambele loturi obńinându-se valori semnificativ mai mici ale acestui parametru comparativ cu lotul martor (p<0,001). Trasarea de corelańii între markerii stresului oxidativ studiańi - MDA serică şi GSH seric pe de o parte, şi nivelurile serice ale transaminazelor şi viremiei pe de altă parte au permis următoarele afirmańii: - la copiii cu hepatită cronică virală B au existat corelańii puternice între valorile MDA şi cele ale ALAT (r=0,70), respectiv ASAT (r=0,78), comparativ cu lotul cu virus C în cazul căruia MDA seric nu s-a corelat cu ALAT (r=0,03), respectiv ASAT (r=0,26); - la copiii cu hepatită cronică C s-a obńinut o corelańie inversă între MDA serică şi viremie (r=-057); pe când în cazul lotului de copii cu hepatită cronică B a existat o corelańie directă (r=0,69) între aceşti parametrii; - s-a arătat inexistenńa unei corelańii între valorile GSH şi ALAT (r=0,36), respectiv ASAT (r=0,26) la pacienńii cu hepatită cronică B şi existenńa unei corelańii inverse între aceşti factori în cazul copiilor cu hepatită cronică virală C (r=-0,36 pentru ALAT, respectiv r=-0,13 pentru ASAT); - s-a dovedit că valorile serice ale GSH nu s-au corelat cu ARN-VHC în sânge nici în cazul hepatitei cronice C (r=0,30), nici pentru infecńia cu VHB (r=0,11) la copil. Argumentele care au pledat în favoarea validităńii acestor rezultate au fost prezentate detaliat la punctul II.1. Există puńine date în domeniul medical referitoare la stresul oxidativ în hepatitele cronice virale ale copilului, dar cele parcurse au întărit rezultatele acestui studiu. 6.4. Studiul stresului oxidativ în hepatita cronică virală C înainte şi după terapia antivirală Deşi Interferonul şi Ribavirina nu sunt antioxidanńi, prin capacitatea lor antivirală pot să amelioreze stresul oxidativ prin reducerea încărcăturii virale şi ameliorarea inflamańiei. Numeroase trialuri clinice au demonstrat efectul benefic al administrării de antioxidanńi la pacienńii cu hepatită cronică virală C (administrarea 13

combinańiei dintre acidul alfa-lipoic, silimarină şi selenium dovedindu-se benefică) (20, 21). Numeroşi autori au propus chiar introducerea unor markeri de stres oxidativ în monitorizarea terapiei antivirale. Pornind de la aceste date, obiectivul cercetării a vizat evoluńia stresului oxidativ (relevat prin nivelurile serice ale MDA şi GSH) sub terapia antivirală. Ipoteza de lucru a constat astfel în determinarea valorilor serice ale MDA şi GSH în paralel cu viremia şi transaminazele serice anterior inińierii tratamentului antiviral, precum şi la încheierea acestuia. Originalitatea acestui studiu s-a bazat pe evaluarea serică concomitentă a celui mai reprezentativ parametru prooxidativ (MDA) şi a celui mai puternic antioxidant endogen, cu localizare predominant hepatică, şi anume, glutationul redus. Datele obńinute prin monitorizarea dinamică a parametrilor aleşi, au demonstrat următoarele aspecte: - determinarea ALAT a relevat valori medii moderat crescute la pacienńii cu hepatită cronică virală C anterior tratamentului antiviral, cu normalizare în urma terapiei cu Interferon pegylat şi Ribavirină, analiza statistică a acestui parametru arătând o scădere de peste 3 ori, cu semnificańie statistică mare (p<0,001) şi o mărime a efectului moderată (EF= 6); - evaluarea valorilor medii ale ASAT, moderat crescute anterior terapiei antivirale, a relevat o scădere netă a acestora, până aproape de normalizare la încheierea acesteia (p<0,001), mărimea efectului fiind, de asemenea, medie (EF= 5,4); - evoluńia în dinamică a nivelurilor serice ale ARN-VHC a demonstrat o scădere semnificativă a acestora în urma tratamentului cu Interferon şi Ribavirină (p<0,001), cu ARN-VHC nedetectabil la 10 pacienńi (66,7%), mărimea efectului fiind foarte puternică în această situańie, cu scădere de la valori de ordinul milioanelor de UI/ml, la valoarea medie de 101,4±12,3 UI/ml (ES= 12,8); - anterior tratamentului antiviral, valorile medii ale MDA au fost net crescute (de aproximativ 2,5 ori versus valorile normale), dar cu normalizare după încheierea acestuia (p<0,001), mărimea efectului obńinut fiind moderată (ES= 6,2); - prelucrarea statistică a valorilor serice medii ale GSH-ului anterior terapiei antivirale au fost net scăzute, cu normalizarea acestor valori în urma tratamentului instituit (p<0,001), ońinându-se o mărime a efectului puternică (ES=10,4). Veridicitatea rezultatelor obńinute în urma studiului a fost întărită de argumentele punctului II.1., cu menńiunea că eşantionul desprins din lotul de 50 de pacienńi cu hepatită cronică virală C a fost reprezentativ inclusiv din punct de 14

vedere numeric, loturile altor autori nedepăşind numeric eşantionul studiat de noi. 6.5. Decelarea stresului oxidativ în hepatita cronică virală C cu şi fără manifestări extrahepatice Obiectivul propus a fost de comparare a stresului oxidativ la pacienńii cu hepatită cronică virală C fără manifestări extrahepatice (MEH) şi la bolnavii cu hepatită cronică C cu MEH. Ipoteza a constat în determinarea serică a MDA, GSH şi GSTM1, alături de aminotransferazele serice şi ARN-VHC la ambele loturi de pacienńi, cu corelarea tipului 0 al GSTM1 cu aparińia MEH. Originalitatea studiului a fost reflectată tocmai în compararea markerilor de stres oxidativ la bolnavi cu hepatită cronică C cu şi fără MEH, precum şi în încercarea de a corela GSTM1 cu prezenńa MEH, în literatura de specialitate nefiind semnalate astfel de cercetări. Studiul s-a finalizat cu următoarele rezultate: - în cazul MDA serice s-au obńinut valori semnificativ mai mari la pacienńii cu infecńie cronică cu VHC (cu şi fără MEH) versus lotul martor (p<0,001), dar fără ca aceste valori să prezinte diferenńe semnificative statistic în rândul pacienńilor cu hepatită C cu şi fără MEH (p>0,05); - prelucrarea statistică a valorilor serice ale GSH a demonstrat că acestea au fost semnificativ mai mici în cazul pacienńilor cu hepatită cronică C versus martori, indiferent de existenńa sau nu a manifestărilor extrahepatice (p<0,001), şi de această dată neînregistrându-se diferenńe semnificative statistic între nivelurile obńinute la pacienńii cu MEH versus cei fără MEH (p>0,05). - a fost obńinut un procent aproximativ egal al prezenńei GSTM1 între lotul fără şi lotul cu manifestări extrahepatice (64% versus 65%) comparativ cu subiecńii sănătoşi în rândul cărora tipul 0 enzimatic s-a regăsit doar într-un procent de 30%; astfel, prevalenńa tipului 0 al GSTM1 la loturile cu sau fără manifestări extrahepatice a fost de peste 2 ori mai mare decât la lotul de sănătoşi (p<0,001), raportul dintre pacienńii cu GSTM1 tip 0 şi GSTM1 tip 1 în loturile cu hepatită cronică situându-se la valori de 1,9:1 pentru cei cu MEH şi la valori de 1,8:1 la cei fără MEH (p>0,05), în timp ce la cei sănătońi raportul a fost invers (1:2,3). Valabilitatea rezultatelor s-a bazat pe argumentele prezentate la punctul II.1., cu menńiunea că eşantionul pacienńilor cu MEH a corespuns din punct de vedere numeric, deoarece prezenńa manifestărilor extrahepatice în rândul bolnavilor cu hepatită cronică virală C a fost estimată în medie la 1-2%, pacienńii selectańi făcând parte dintr-un număr total de 354 pacienńi diagnosticańi cu hepatopatii cronice cu VHC (hepatită cronică, ciroză hepatică), reprezentând un procent de 5,36%. 15

Cap.VII. CONCLUZII GENERALE 1. S-a dovedit prezenńa indubitabilă a stresului oxidativ, fapt relevat prin niveluri serice crescute ale malondialdehidei (marker prooxidativ) şi niveluri serice semnificativ scăzute ale glutationului redus (antioxidant endogen puternic): - în hepatita acută virală C, - în hepatita cronică virală C fără manifestări extrahepatice atât la adulńi, cât şi la copii, - în hepatita cronică virală C cu manifestări extrahepatice la adulńi, - în hepatita cronică virală B la pacienńii pediatrici. 2. Există corelańie directă între valorile serice ale MDA, GSH şi cele ale amonitransferazelor doar în hepatita acută virală C, spre deosebire de infecńia cronică unde corelańie există doar între MDA şi transaminazele serice, ceea ce sugerează faptul că nivelurile serice ale MDA şi GSH nu sunt în strânsă interdependenńă cu gradul de necroză hepatocelulară. 3. Nu s-a obńinut corelańie între ARN-VHC şi valorile serice ale MDA şi GSH nici în hepatita acută, şi nici în hepatita cronică virală C, ceea ce înseamnă că nivelul viremiei nu reflectă cu fidelitate valoarea stresului oxidativ în sânge, fiind mai degrabă în strânsă interdependenńă cu valorile tisulare ale MDA, respectiv GSH. 4. Vârsta pacienńilor (procesul de îmbătrânire), precum şi durata procesului infecńios (mai mare în cazul adulńilor) nu influenńează semnificativ stresul oxidativ (p>0,005). 5. Durata medie a infecńiei virale nu pare a influenńa nivelul seric al MDA şi GSH, mai probabil mecanismele prin care cele două virusuri (VHB, respectiv VHC) potenńează stresul oxidativ au rol determinant. 6. Tipul 0 al GSTM1 poate fi corelat cu evoluńia mai severă a infecńiei cu VHC, cu o valoare predictivă pozitivă pentru cronicizare de 80%, cu un indice de acurateńe de 3,1, un pacient cu infecńie cu VHC şi GSTM1 tip 0 prezentând un risc de 3 ori mai mare pentru cronicizarea infecńiei. 7. Au lipsit disponibilităńile tehnice de determinare a antigenelor HLA incriminate în cronicizarea infecńiei VHC la pacienńii cu tipul 0 de GSTM1, cunoscut fiind rolul unora dintre ele în evoluńia severă a infecńiei VHC, precum şi în potenńarea manifestărilor extrahepatice. 8. Parametrii stresului oxidativ prezintă valori semnificativ mai alterate la pacienńii pediatrici cu hepatită cronică virală C versus cei cu hepatită virală B (p<0,001). 9. După terapia antivirală se obńine o ameliorare netă (p<0,001) a valorilor MDA şi GSH, în paralel cu ameliorarea semnificativă a transaminazelor serice (p<0,001) şi ARN-VHC (p<0,001), mărimea efectului fiind puternică, mai ales pentru ARN-VHC şi GSH. 16

10. Rezultatele favorabile obńinute în urma tratamentului antiviral în ceea ce priveşte parametrii studiańi, cu toate că nivelul viremiei a fost foarte mare, se datorează, mai probabil, vârstei tinere a pacienńilor (vârsta medie de 36±9,3 ani) şi evoluńiei relativ recente a hepatitei (durata medie a infecńiei VHC de 5,6±1,4 ani). 11. Cu toate că Interferonul şi Ribavirina nu sunt antioxidanńi, prin capacitatea lor de a inhiba multiplicarea virală, reduc inflamańia şi, implicit evoluńia spre fibroză hepatică, ameliorând stresul oxidativ. 12. PrezenŃa manifestărilor extrahepatice nu augmentează nivelul markerilor de stres oxidativ. 13. PredominanŃa tipului 0 GSTM1 este demonstrată în procente relativ egale atât la pacienńii cu infecńie cronică VHC fără manifestări extrahepatice, cât şi la cei care asociază aceste manifestări, cu semnificańie statistică şi de această dată fańă de lotul martor (p<0,001), neputându-se asocia aparińia manifestărilor extrahepatice cu stresul oxidativ (p>0,05). 14. Malondialdehida serică, glutationul seric redus şi glutation S- transferaza pot fi utilizate ca biomarkeri ai severităńii şi evoluńiei infecńiei cu virusul hepatitic C. BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ 1. Feinstone SM, Kapikian AZ, Purcell RH, et al. Transfusion-associated hepatitis not due to viral hepatitis type A or B. N England J med. 1975; 292: 767-770. 2. Prince AM, Brotman B, Grady GF, et al. Long-incubation post-transfusion hepatitis without serological evidence of exposure to hepatitis-b virus. Lancet. 1974; 2: 241-246. 3. Ciufecu ES. Virusologie medicală. Editura Medicală NaŃională. 2003; 370-376. 4. Ceauşu E, Căruntu FA. InfecŃia cu virusurile hepatitice B şi C. Boli InfecŃioase-Orizont 2004-ActualităŃi. Certitudini. Controverse. 2004; 136-161. 5. Mandell GL, Bennett JE, Dolin R. Principles and Practice of Infectious Diseases, 6 th ed. 2005 (2): 1950-1973. 6. Rehermann B, Nascimbeni M. Immunology of hepatitis B virus and hepatitis C virus infection. Nat Rev Immunol. 2005; 5: 215-229. 7. Heller T, Rehermann B. Acute hepatitis C: a multifaceted disease. Semin Liver Dis. 2005; 25: 7-17. 8. Sarobe P, Lasarte JJ, Garcia N, et al. Characterization of T-cell responses against immunodominant epitopes from hepatitis C virus E2 and NS4A proteins. J Viral Hepat. 2006; 47-55. 17

9. Orland JR, Wright TL, Cooper S. Acute hepatitis C. Hepatology. 2001; 33: 321-327. 10. Mondelli MU, Cerino A, Cividini A. Acute hepatitis C: Diagnosis and management. J Hepatol. 2005; 42(9): S108-S114. 11. Afdhal NH. The natural history of hepatitis C. Semin Liver Dis. 2004; 24(2): 3-8. 12. Tănăsescu C, NiŃescu D, Ionescu R, et al. Hepatitis C and B virus and autoimmunity. The significance of anticardiolipin antibodies. Rom J Intern Med. 1999; 37: 373-379. 13. Dienstag JL, McHutchison JG. American Gastroenterological Association. Technical review on the management of hepatitis C. Gastroenterology. 2006; 130: 231-264. 14. Zekry A, Patel K, McHutchison JG. Treatment of acute hepatitis C infection: more pieces of the puzzle? J Hepatol. 2005; 42: 293-296. 15. Choi J, Ou JH. Mechanism of Liver Injury. III. Oxidative stress in the pathogenesis of hepatitis C virus. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2006; 290: G847-G851. 16. Abdalla MY, Ahmad IM, Spity DR, et al. Hepatitis C virus-core and non structural proteins lead to different effects on cellular antioxidant defenses. J Med Virol. 2005; 76: 489-497. 17. Bureau C, Bernard J, Chaouche N, et al. Nonstructral 3 protein hepatitis C virus triggers an oxidative burst in human monocytes via activation of NADPH oxidase. J Biol Chem. 2001; 276: 23077-23083. 18. Moriya K, Nakgawa K, Santa T, et al. Oxidative stress in the absence of inflammation in a mouse model for hepatitis C virus-associated hepatocarcinogenesis. Cancer Res. 2001; 61: 4365-4370. 19. Okuda M, Li K, Beard MR, et al. Mithocondrial injury, oxidative stress, and antioxidant gene expression are induced by hepatitis C virus core protein. Gastroenterology. 2002; 122: 366-375. 20. Salmi HA, Sarna S. Effect of silymarin on chemical, functional, and morphological alterations of the liver. A double-blind controlled study. Scand Gastroenterol. 1982; 17: 517-521. 21. Buzeelli G, Moscarella S, Giusti A, et al. A pilot study on the liver protective effect of silybin-phosphatidylcholine complex (IdB1016) in chronic active hepatitis. Int J Clin Pharmacol Ther Toxicol. 1993; 31: 456-460. 18