NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN, CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA FUCOIDAN CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ MỘT SỐ LOÀI RONG NÂU Ở VỊNH NHA TRANG

Transcription

1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN HÓA HỌC PHẠM ĐỨC THỊNH NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN, CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA FUCOIDAN CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ MỘT SỐ LOÀI RONG NÂU Ở VỊNH NHA TRANG Chuyên ngành: Hóa phân tích Mã số: LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Hướng dẫn khoa học: 1. PGS. TS. Bùi Minh Lý 2. PGS. TS. Lê Lan Anh Hà Nội, 2015

2 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu nêu trong luận án là trung thực. Những kết luận khoa học của luận án là chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Hà Nội, 2015 Tác giả Phạm Đức Thịnh

3 LỜI CẢM ƠN Trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận án này, tôi đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ quý báu của các thầy cô, các nhà khoa học thuộc nhiều lĩnh vực cùng bạn bè và đồng nghiệp. Đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất đến PGS.TS Bùi Minh Lý và PGS.TS Lê Lan Anh đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện tốt nhất giúp tôi hoàn thành bản luận án này. Tiếp theo, tôi xin chân thành cảm ơn Quỹ Nafosted (Đề tài nghiên cứu khoa học cơ bản, mã số: ) và Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam (Đề tài hợp tác quốc tế, mã số: VAST.HTQT.NGA. 06/13-14) đã hỗ trợ kinh phí cho việc thực hiện Luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ và tạo điều kiện về mọi mặt của các cô chú, các anh chị em của phòng: - Phòng Hóa phân tích và Triển khai công nghệ nói riêng cũng như Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang nói chung. - Phòng Hóa phân tích, Trung tâm các phương pháp phổ ứng dụng - Viện Hóa học. Phòng thử nghiệm hoạt tính sinh học - Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên. - Phòng Hóa enzym, Phòng cộng hưởng từ hạt nhân và khối phổ- Viện Hóa sinh Hữu cơ Thái Bình Dương, Viện Hàn lâm Khoa học Nga, Chi nhánh Viễn Đông, Liên Bang Nga. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo Viện Hóa học, Phòng Quản lý Đào tạo sau Đai học - Viện Hóa học đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thành các học phần của luận án và mọi thủ tục cần thiết. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân và bạn bè đã luôn quan tâm, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận án. Hà Nội, ngày 20 tháng 04 năm 2015 Tác giả Luận án Phạm Đức Thịnh

4 i MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC...i DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT...iv DANH MỤC CÁC BẢNG...vi DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ...viii DANH MỤC PHỤ LỤC...ix MỞ ĐẦU...1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN RONG BIỂN Giới thiệu chung về rong biển Phân loại và phân bố của rong biển Thành phần hóa học có trong rong biển FUCOIDAN Giới thiệu chung về fucoidan Thành phần của fucoidan trong rong nâu Đa dạng cấu trúc của fucoidan Các phương pháp chiết tách fucoidan từ rong nâu Hoạt tính sinh học và ứng dụng của fucoidan CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CẤU TRÚC CỦA FUCOIDAN Phương pháp phân tích thành phần đường Phương pháp phân tích liên kết Phương pháp phổ hồng ngoại (IR) Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)...23

5 ii Phương pháp phổ khối lượng (MS) TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM LIÊN QUAN ĐẾN NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CỦA LUẬN ÁN Tình hình nghiên cứu fucoidan trên thế giới Tình hình nghiên cứu fucoidan ở Việt Nam CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...36 VÀ THỰC NGHIỆM ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Phương pháp chiết tách và phân đoạn fucoidan Phân tích hàm lượng tổng carbohydrate và thành phần đường Phương pháp phân tích hàm lượng sulfate Phương pháp khử sulfate Phương pháp phân tích hàm lượng uronic axít Phương pháp phân tích liên kết bằng methyl hóa Phương pháp thủy phân tạo oligosacarit Phương pháp phổ hồng ngoại IR Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR Phương pháp phổ khối lượng MS Phương pháp thử hoạt tính sinh học và xử lý số liệu THỰC NGHIỆM Chiết tách và phân đoạn tinh chế fucoidan từ rong nâu Phân tích hàm lượng tổng carbohydrate và thành phần đường Phân tích hàm lượng sulfate Phân tích hàm lượng uronic axít Khử sulfate Phương pháp phân tích liên kết bằng methyl hóa...42

6 iii Thủy phân tạo fucoidan oligosacarit Phổ khối MALDI-TOF/MS và ESI-MS của fucoidan oligosacarit Khảo sát hoạt tính gây độc tế bào của fucoidan...44 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN CHIẾT TÁCH VÀ PHÂN LẬP FUCOIDAN TỪ RONG NÂU PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA FUCOIDAN TÁCH PHÂN ĐOẠN VÀ PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN CỦA CÁC PHÂN ĐOẠN FUCOIDAN HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA FUCOIDAN Hoạt tính gây độc tế bào ung thư của fucoidan Hoạt tính gây độc tế bào của các phân đoạn fucoidan được phân lập từ rong Sargassum swartzii và Sargassum mcclurei ĐẶC TRƯNG CẤU TRÚC CỦA CÁC PHÂN ĐOẠN FUCOIDAN Các đặc trưng cấu trúc thu được từ phổ IR Các đặc trưng cấu trúc thu được từ phổ NMR PHÂN TÍCH CẤU TRÚC CỦA PHÂN ĐOẠN FUCOIDAN SmF3 ĐƯỢC CHIẾT TÁCH TỪ RONG NÂU SARGASSUM MCCLUREI ĐÁNH GIÁ MỐI TƯƠNG QUAN GIỮA ĐẶC TRƯNG CẤU TRÚC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA FUCOIDAN...97 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...99

7 1 MỞ ĐẦU Trong đa dạng và vô tận của thảm thực vật đại dương, rong nâu là một trong số các loài thực vật biển có thể tự tái tạo đáng lưu ý nhất mà con người đã phát hiện ra. Rong nâu chứa rất nhiều polysacarit sinh học quí như alginate, laminaran, fucoidan với khả năng ứng dụng hết sức rộng lớn [29,103]. Trong số đó fucoidan là hợp chất được đặc biệt quan tâm nghiên cứu do có nhiều hoạt tính sinh học quý như: hoạt tính chống đông tụ máu và chống huyết khối, chống virus, chống ung thư và điều biến miễn dịch, chống viêm, giảm lipid máu, chống oxy hóa và các đặc tính chống bổ thể (anticomplementary), chống lại các bệnh về gan, về đường tiết niệu (uropathy renalpathy), tác dụng bảo vệ dạ dày và khả năng điều trị trong phẫu thuật [69,88]. Fucoidan là một sulfate polysacarit có cấu trúc hóa học rất phức tạp bởi tính đa dạng của liên kết glycoside và khả năng phân nhánh với các vị trí nhóm sulfate được sắp xếp không theo quy luật trên mạch polymer. Thành phần của nó bao gồm nhiều loại đường, chủ yếu là fucose và một số các gốc đường khác như galactose, glucose, manose, xylose..., đôi khi còn có axít uronic [23,36,69,71]. Mặc dù có rất nhiều công trình nghiên cứu nhằm xác định cấu trúc chi tiết của fucoidan, nhưng các kết quả nghiên cứu phát hiện được tính quy luật trong cấu trúc của chúng về trật tự liên kết giữa các gốc đường, sự phân nhánh và vị trí các gốc sulfate vẫn còn rất hạn chế [23,34,35,36,48]. Mặt khác, mối quan hệ giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học của fucoidan thực tế cho đến nay vẫn chưa được sáng tỏ [88,36,38,48,69]. Để giúp cho việc nghiên cứu cơ chế tác dụng của fucoidan lên các tế bào sinh vật và tiến tới sử dụng fucoidan để làm dược liệu thì việc xác định chính xác thành phần và cấu trúc hóa học của fucoidan là điều tiên quyết và đang thu hút sự chú ý của nhiều nhà khoa học trên thế giới. Nước ta có hơn km bờ biển trải dài từ Bắc xuống Nam, với diện tích mặt nước rộng hơn km 2 được thiên nhiên ban tặng cho nguồn tài nguyên rong nâu rất đa dạng và phong phú, hiện tại đã có khoảng 147 loài rong nâu được phân loại [1,8], trong đó các loài rong thuộc chi Sargassum có trữ lượng lớn nhất

8 2 với hơn 60 loài và sản lượng ước tính đạt tới tấn rong khô/năm [58]. Tuy nhiên cho đến nay ở nước ta vẫn chưa có một công trình nghiên cứu có tính hệ thống về thành phần hóa học, cấu trúc và hoạt tính sinh học của fucoidan rong nâu Việt Nam. Do vậy, chúng tôi chọn đề tài: Nghiên cứu phân tích thành phần, cấu trúc hóa học của fucoidan có hoạt tính sinh học từ một số loài rong nâu ở vịnh Nha Trang nhằm hoàn chỉnh thêm những nghiên cứu về fucoidan của rong nâu Việt Nam theo định hướng tìm kiếm những nguồn dược liệu mới phục vụ sức khỏe cộng đồng và phát triển kinh tế xã hội. Mục tiêu của luận án: Chiết tách và phân đoạn fucoidan từ một số loài rong nâu Việt Nam. Phân tích thành phần, xác định đặc điểm cấu trúc và mối quan hệ giữa cấu trúc với hoạt tính sinh học của fucoidan. Để đạt được mục tiêu đề ra, nội dung nghiên cứu của luận án bao gồm: - Thu thập các loài rong nâu có trữ lượng lớn ở vùng biển vịnh Nha Trang. - Tách chiết và phân đoạn fucoidan từ các loài rong thu được. - Phân tích thành phần hóa học và thăm dò hoạt tính sinh học của fucoidan và các phân đoạn của chúng. - Xác định cấu trúc của fucoidan có hoạt tính quan tâm. - Đánh giá mối tương quan giữa hoạt tính sinh học với đặc trưng cấu trúc của fucoidan

9 3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 2.3 RONG BIỂN Giới thiệu chung về rong biển Hàng năm đại dương cung cấp cho trái đất khoảng 200 tỷ tấn rong biển. Nhiều nhà khoa học cho rằng trên 90% cacbon trên trái đất được tổng hợp nhờ quang hợp, trong đó 20% có nguồn ngốc từ rong biển [83,97] Việc tiêu thụ sản phẩm từ rong biển (tảo đa bào ở biển) đã trải qua thời kì lịch sử rất lâu dài. Các dấu vết khảo cổ học cho thấy, người Nhật đã dùng rong biển từ hơn năm trước. Trong nền văn hoá Trung Quốc cổ đại, rong biển được coi là đặc sản dùng trong các món ăn của triều đình và chỉ hoàng tộc hay khách của hoàng thân, quốc thích mới được thưởng thức. Dù rong biển được coi là món ăn đặc trưng của châu Á, nhưng trên thực tế các quốc gia có bờ biển trên thế giới như Scotland, Ireland, Newzealand, quần đảo nam Thái Bình Dương và các nước Nam Mỹ ven biển cũng đã sử dụng rong biển từ rất lâu. Rong biển cũng được sử dụng trong nhiều lĩnh vực khác. Chúng là nguồn nguyên liệu tự nhiên cho công nghiệp thực phẩm (Cải biển Ulva lactuca, bột rong biển, chất tạo gel E400, E401 Alginate Agar E406, E407, Carrageenan...), mỹ phẩm (chất tạo kết cấu và hoạt hóa), công nghiệp (Phycocolloids, hydrocolloids tạo độ sánh, gel hoặc chất ổn định), thức ăn gia súc, nông nghiệp... Qua các tài liệu tham khảo trong lịch sử và trong thời gian sử dụng lâu dài, không có nguy cơ gây hại sức khỏe nào được đề cập đến rong biển. Vì vậy, rong biển được xếp vào loại thực phẩm chức năng ngày càng được sử dụng rộng rãi trên thế giới. Hiện nay, Nhật Bản, Trung Quốc và Hàn Quốc là những nước tiêu thụ rong biển thực phẩm lớn nhất và nhu cầu của họ là cơ sở của một nghề nuôi trồng thủy sản với sản lượng hằng năm trên toàn thế giới khoảng 6 triệu tấn rong tươi, trị giá lên đến 5 tỉ USD [97]. Các nước và lãnh thổ cung cấp rong biển thực phẩm chính là Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc và Đài Loan. Các nước cung cấp chính rong biển cho công nghiệp là Đan Mạch, Pháp, Na Uy, Tây Ban Nha, Mỹ và Nhật.

10 Phân loại và phân bố của rong biển * Phân loại và phân bố của rong biển trên thế giới Dựa vào thành phần cấu tạo, đặc điểm hình thái và màu sắc, rong biển có thể được chia thành 3 ngành rong chính [30]: 1. Ngành rong nâu (Phaeophyta) 2. Ngành rong đỏ (Rhodophyta) 3. Ngành rong lục (Chlorophyta) Trong số 03 ngành rong trên, rong nâu là ngành rong có trữu lượng lớn nhất và phân bố đa dạng nhất với hơn 1800 loài đã được phân loại. Trên thế giới hiện nay chỉ riêng các loài rong thuộc họ Sargassaseae, bộ Fucales đã phân loại được khoảng hơn 400 loài [1, 8]. Rong nâu (Phaeophyta) phân bố nhiều nhất ở Nhật Bản, tiếp theo là Canada, Việt Nam, Hàn Quốc, Alaska, Ireland, Mỹ, Pháp, Ấn Độ, kế tiếp là Chile, Achentina, Brazil, Hawaii, Malaysia, Mexico, Myanmar, Bồ Đào Nha. Trong đó bộ Fucales, đối tượng phổ biến và kinh tế nhất của rong nâu đại diện là họ Sargassaceae với hai loài Sargassum và Turbinaria phân bố chủ yếu ở vùng cận nhiệt đới. Sản lượng rong nâu lớn nhất thế giới tập trung tại Trung Quốc với trên tấn khô, với 3 chi chính là Laminaria, Udaria, Ascophyllum. Hàn Quốc khoảng tấn với 3 chi Udaria, Hizakia, Laminaria. Nhật Bản khoảng tấn Laminaria, Udaria, Cladosiphon, Na Uy khoảng tấn, Chile khoảng tấn [5]. * Phân loại và phân bố các loài rong nâu ở Việt Nam Ở Việt Nam đến nay có khoảng 147 loài rong nâu đã được phân loại, trong đó các loài rong thuộc chi Sargassum có trữ lượng lớn nhất với khoảng 68 loài phân bố dọc ven biển Việt Nam và sản lượng ước tính trên tấn khô/năm [9]. Theo điều tra tới năm 2011 có 39 loài rong nâu thuộc chi Sargassum phân bố ở vùng biển Khánh Hòa, tập trung nhiều nhất và có trữ lượng lớn nhất là ở vịnh Nha Trang với 21 loài phổ biến và sản lượng ước tính gần tấn khô/năm [1]. Rong nâu phân bố phổ biến ở các vùng biển Đà Nẵng (chân đèo Hải Vân, bán đảo Sơn Trà), Quảng Nam (Cù Lao Chàm, Núi Thành), Quảng Ngãi (Bình

11 5 Châu, đảo Lý Sơn, Sa Huỳnh), Bình Định (Phù Mỹ, Qui Nhơn), Phú Yên (vịnh Xuân Đài, Cù Mông), Khánh Hòa (vịnh Vân Phong, Hòn Khói, vịnh Nha Trang, vịnh Cam Ranh), Ninh Thuận (huyện Ninh Hải, Ninh Phước). Trong khi đó vùng bờ biển từ Bình Thuận đến Bà Rịa-Vũng Tàu không phát hiện sự có mặt của rong nâu. Đoạn bờ biển Tây Nam Bộ thuộc tỉnh Kiên Giang từ Hòn Chông, Hòn Trẹm (xã Bình An) đến thị xã Hà Tiên, Mỹ Đức, giáp biên giới Campuchia là vùng biển có nhiều điều kiện thuận lợi cho rong nâu phát triển [1]. Nhìn một cách tổng quan hai khu vực ở ven biển phía Nam Việt Nam rong nâu phân bố tập trung là vùng ven biển và đảo từ Đà Nẵng đến Vũng Tàu và huyện Hà Tiên (từ xã Bình An đến Mỹ Đức Hà Tiên) [8] Thành phần hóa học có trong rong biển Rong biển có chứa đa dạng các thành phần hoá học, chúng đều là các thành phần rất có giá trị về mặt dinh dưỡng cũng như dược liệu bao gồm: các axít amin, các axít béo nhiều nối đôi, các vitamin và khoáng chất, polyphenol, các hợp chất chứa iốt, laminaran, alginat và fucoidan (bảng 1.1). Trong số các hợp chất polysacarit của rong biển thì fucoidan là hợp chất được đặc biệt quan tâm nghiên cứu do chúng sở hữu rất nhiều hoạt tính sinh học thú vị (kháng u, kháng đông tụ máu, kháng virus, kháng viêm, chống oxi hóa, ) với tiềm năng ứng dụng rất lớn để làm dược liệu [69, 132]. Từ kết quả các số liệu trong bảng 1.1, ta thấy fucoidan chỉ có trong thành phần của ngành rong nâu mà không có trong thành phần của hai ngành rong đỏ và rong lục [5]. Bảng 1.1: Thành phần hoá học (%) của một số loài rong biển. Ascophyllum Laminaria Alaria Palmaria Porphyra Porphyra Ulva nodosum digitata esculenta palmata sp. yezoensis sp. Ngành rong Nâu Nâu Nâu Đỏ Đỏ Đỏ Lục Nước Nd 78 Tro , Alginic axít Xylan

12 6 Laminaran Mannitol Fucoidan nd Floridosid nd nd 0 Protein , Chất béo ,3-0,8 0,7 2,1 0,6-0,7 Tannin ,1 0,5-6,0 nd nd nd nd Kali 2-3 1,3-3,8 nd 7-9 3,3 2,4 0,7 Natri 3-4 0,9-2,2 nd 2,0-2,5 Nd 0,6 3,3 Magie 0,5-0,9 0,5-0,8 nd 0,4-0,5 2,0 nd nd Iod 0,01-0,1 0,3-1,1 0,05 0,01-0,1 0,0005 nd nd 1.2 FUCOIDAN Giới thiệu chung về fucoidan Fucoidan là một anion polysacarit sulfate hóa nằm trong thành tế bào của rong nâu, hợp chất này được phân lập và mô tả lần đầu tiên bởi Kylin vào năm 1913 [67], khi đó nó được đặt tên là fucoidin theo tên gọi của gốc đường fucose là thành phần chính cấu tạo nên polysacarits này. Nhưng theo danh pháp carbohydrate nghiêm ngặt, thuật ngữ này là không chính xác, vì các polysacarit được tạo nên bởi fucose và sulfate được đặt tên là sulfate fucan. Các polysacarit như vậy trên thực tế chỉ có mặt trong ngành Da gai, cụ thể là cầu gai và hải sâm [125]. Ngược lại, thành phần và cấu trúc của các polysacarit rong nâu phức tạp hơn nhiều. Ngoài hai thành phần chính là fucose và sulfate, trong phân tử của fucoidan còn có thể chứa thêm các đường đơn khác như: galactose, xylose, manose, glucuronic axít, đồng thời có thể bị acetyl hóa một phần. Cấu trúc hóa học chi tiết của các polyme sinh học phức tạp này trong nhiều trường hợp còn chưa được biết đến. Chính vì vậy, tên gọi phổ thông fucoidan là thích hợp nhất nhằm dùng cho tất cả các polysacarit sulfate hóa

13 7 của rong nâu, nó không liên quan đến thành phần của chúng, nhưng hiển nhiên không được sử dụng cho fucan sulfate hóa có nguồn gốc động vật [125]. Nhờ sự đa dạng về thành phần và cấu trúc mà fucoidan sở hữu nhiều hoạt tính sinh học thú vị như: kháng đông tụ máu, kháng huyết khối, kháng virut, chống kết dính tế bào, chống tạo mạch (antiangiogenic), kháng viêm, kháng u, kháng bổ thể (anticomplementary), điều biến hệ miễn dịch, v.v... [69]. Nhờ vậy, fucoidan đã trở thành đối tượng thu hút được nhiều sự quan tâm nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế giới với tiềm năng ứng dụng rất lớn trong các lĩnh vực như thực phẩm chức năng, thực phẩm bổ dưỡng và dược liệu. Cùng với đó số các công trình nghiên cứu về fucoidan đã tăng vọt trong khoảng hơn 10 năm trở lại đây (Hình 1.1) [81] Hình 1.1 Số các công trình công bố có liên quan đến fucoidan từ năm Thành phần của fucoidan trong rong nâu Hàm lượng của fucoidan phụ thuộc vào loài rong, địa điểm và thời gian thu hoạch rong. Năm 1997, Park và cộng sự đã công bố hàm lượng fucoidan từ 1-20% trọng lượng rong khô và phụ thuộc vào loài rong [100]. Trước đó, công bố của Stewart và cộng sự (1961) cho rằng hàm lượng fucoidan của rong nâu không thay đổi nhiều khi thu rong ở các mùa vụ khác nhau [120]. Tuy nhiên, sau đó công bố

14 8 này đã được hiệu chỉnh lại trong nhiều nghiên cứu, theo các công bố [100,126] hàm lượng fucoidan phụ thuộc vào vùng địa lý, loài rong và thời điểm thu hoạch. Năm 1994, Koo đã công bố hàm lượng fucoidan được phân lập từ các loài rong L. religiosa, U. pinnatifida, H. fusiforme và S. fulvellum lần lượt là 2,7%; 6,7%; 2,5% và 1,6% [66]. Bảng 1.2. Thành phần hóa học của một số fucoidan [69] Rong nâu F. vesiculosus Fucose/sulfate (1/1,20) Thành phần hóa học (tỉ lệ mol) F. evanescens Fucose/sulfate/acetate (1/1,23/0,36) F. distichus Fucose/sulfate/acetate (1/1,21/0,08) F. serratus L. Fucose/sulfate/acetate (1/1/0,1) Lessonia vadosa Fucose/sulfate (1/1,12) Macrocytis pyrifera Fucose/galactose (18/1) Pelvetia wrightii Fucose/galactose (10/1) Undaria pinnatifida (Mekabu) Fucose/galactose (1/1,1) Ascophyllum nodosum Fucose/xylose/GlcA (4,9/1/1,1) Himanthalia lorea và Bifurcaria bifurcate Padina pavonia Fucose/xylose/GlcA (2,2/1,0/2,2) Fucose/xylose/mannose/glucose/galactose (1,5/1,5/1,2/1,2/1) Laminaria angustata Fucose/galactose/sulfate (9/1/9) Ecklonia kurome Fucose/galactose/mannose/xylose (1/0,67/0,03/0) Sargassum stenophyllum Fucose/galactose/mannose/xylose (1/0,2/0,02/0,24) Adenocytis utricularis Fucose/galactose/mannose (1/0,38/0,15) Hizikia fusiforme Dictyota menstrualis Fucose/galactose/mannose/xylose/GlcA (1/0,72/0,72/0,2/0,25) Fucose/xylose/uronic acid/galactose/sulfate (1/0,8/0,7/0,8/0,4) và (1/0,3/0,4/1,5/1,3) Spatoglossum schroederi Fucose/xylose/galactose/sulfate (1/0,5/2/2) Fucoidan là một sulfate polysacarit dị thể với thành phần cấu tạo hết sức phức tạp. Lần đầu tiên thành phần của fucoidan trong dịch chiết nước được xác định là một polysacarit có chứa L-fucose và D-xylose, trong khi đó D-galactose và

15 9 uronic axít được xem là các tạp chất [102]. Tuy nhiên, trong cô bố của Percival và Ross (1950) cho thấy fucoidan trong dịch chiết nước nóng của các loài rong Fucus vesiculosus, Fucus spiralis and Himanthalia lorea có chứa 38% ester sulfate, 56,7% fucose, 4% galactose, 1,5% xylose, 3% uronic axít và 8% khoáng [103]. Tỉ lệ fucose/galactose trong phân tử fucoidan cũng phụ thuộc vào các loài rong [80,92,102]. Dillon và cộng sự. (1953) đã phân lập được fucoidan từ loài rong Ascophyllum nodosum có tỉ lệ fucose: galactose là 8:1 [43], trong khi fucoidan được phân lập từ rong Macrocystis pyrifera có tỉ lệ fucose:galactose = 18:1 [69]. Ngoài ra, các thành phần đường khác (như xylose, mannose,...) cũng được xác nhận là hợp phần của fucoidan [102]. Thành phần của fucoidan từ rong F. vesiculosus là 44,1% fucose, 26,3% sulfate, 31,1% tro và một lượng nhỏ amino-glucose [69,103]. Như vậy, thành phần của fucoidan phụ thuộc vào các loài rong (bảng 1.2) [69,81]. Ngoài ra phương pháp chiết cũng có thể ảnh hưởng tới thành phần của fucoidan [81]. Theo công bố [81], tác giả Percival (1968) đã phân lập fucoidan từ rong Ascophyllum nodosum bằng cách chiết với nước nóng và dung dịch kiềm loãng nóng, kết quả thu được fucoidan có thành phần gồm fucose, xylose, sulfate và uronic axít, trong khi đó cũng với loài rong Ascophyllum nodosum tác giả Marais và Joseleau (2001) đã tiến hành chiết bằng dung dịch 0,01% NaCl và 1% CaCl 2 thu được fucoidan có thành phần là fucose, glucose, galactose và sulfate [80] Đa dạng cấu trúc của fucoidan Việc phân tích cấu trúc của các polysacarit nói chung và fucoidan nói riêng là một trong những thách thức lớn trong hóa học các chất hữu cơ có gốc đường. Cấu trúc của fucoidan rong biển là vô cùng phức tạp và không đồng nhất [23] với những thay đổi về mô hình liên kết (linkages), sự phân nhánh (branching), vị trí nhóm sulfate cũng như các gốc đường trong polysacarit này phụ thuộc vào nguồn gốc của chúng [25,34,35]. Vì vậy, việc phân tích cấu trúc của chúng vẫn còn là vấn đề nan giải, ngay cả khi sử dụng các kỹ thuật phổ NMR phân giải cao mới nhất [88]. Đã có nhiều công trình nghiên cứu nhằm xác định cấu trúc chi tiết của fucoidan được công bố, nhưng mới chỉ có một vài kết quả nghiên cứu phát hiện được tính quy luật trong cấu trúc của fucoidan.

16 10 -L-fucp-4(SO - 3 ) 3 2)- -L-fucp-(1 2)- -L-fucp-(1 2)- -L-fucp-(1 2)- -L-fucp-(1 2) SO 3 - SO 3 - SO 3 - SO 3 - Hình 1.2. Cấu trúc của fucoidan từ F. vesiculosus được mô tả vào năm 1950 [103] Percival và Ross (1950) đã mô tả cấu trúc fucoidan từ rong Fucus vesiculosus là một polysacarit có bộ khung mạch chính là -L-fucose(1 2), vị trí mạch nhánh là gốc đường -L-fucose(1 3) và nhóm sulfate chủ yếu gắn ở vị trí C- 4 của gốc đường L-fucospynanose (hình 1.2) [103]. Mô hình cấu trúc fucoidan này tồn tại hơn 40 năm. Năm 1993, cấu trúc fucoidan của rong F.vesiculosus đã được nghiên cứu lại bởi Patankar và công sự, kết quả cho thấy có sự khác nhau ở bản chất liên kết glycoside của fucoidan này với mạch chính là -L-fucose(1 3) thay vì - L-fucose(1 2), nhóm sulfate được tìm thấy chủ yếu ở vị trí 4, phù hợp với mô hình đã công bố trước [101]. Sự khác nhau về cấu trúc fucoidan so với công bố của Percival và Ross được Pantakar giải thích như sau: đầu tiên là kỹ thuật chiết tách khác nhau, fucoidan được Percival và Ross chiết trong dung môi nước nóng, thay vì được chiết trong dung môi axít như Pantakar; thứ hai là sự khác nhau về phương pháp methyl hóa và cuối cùng là sự khác nhau về phương pháp phân tích cấu trúc. Percival và Ross phân tích cấu trúc fucoidan dựa trên các tính chất về sắc ký và hóa học của sản phẩm methyl hóa, trong khi đó các sản phẩm methyl hóa được Patankar phân tích bằng phương pháp GC-EI/MS. Cấu trúc fucoidan từ loài rong Ascopphyllum nodosum (A. nodosum) đã được công bố trong các nghiên cứu [34,35,40,42]. Năm 2001, Chevolt và cộng sự đã phân lập được fucoidan từ rong nâu Ascorphylum nodosum [35], cấu trúc fucoidan oligosacarit (bậc polyme hóa từ 8-14) của loài rong này được cấu thành bởi các liên kết luân phiên (1 3) và (1 4) (hình 1.3) [35]. Cấu trúc fucoidan từ A.nodosum cũng đã được Daniel và cộng sự nghiên cứu

17 11 khi sử dụng các enzym đặc hiệu làm xúc tác sinh học để thủy phân tạo fucoidan oligosacarit, kết quả cho thấy sự có mặt của lượng lớn các liên kết glycoside của gốc -L-fucose(1 3) và -L-fucose(1 4) [40]. [ 3)-α-L-Fucp (2SO - 3 )-(1 4)-α-L-Fucp (2,3SO - 3 )-1 ] n H H H HO CH 3 H - O 3SO H 1 4 H CH 3 H - O 3SO - OSO 3 H 3 1 H H Hình 1.3. Cấu trúc của một phân đoạn fucoidan tách và phân lập từ rong nâu A. nodusum. Cấu trúc fucoidan từ loài rong Ecklonia kurome đã được công bố năm 1991 bởi Nishino và Nagumo. Do tính dị thể trong phân tử của fucoidan nên phổ NMR của chúng quá phức tạp để có thể giải thích cấu trúc một cách trực tiếp. Cấu trúc phân tử trung bình của fucoidan này chủ yếu được tạo thành bởi liên kết α-lfucose(1 3) với phần lớn nhóm sulfate gắn ở vị trí C-4 và một phần ở C-2 hoặc vị trí C-2 là các điểm chẻ nhánh (hình 1.4) [91]. H H CH 3 H - O 3SO H OH H H - O 3SO CH 3 H OH H H Hình 1.4. Cấu trúc fucoidan có sulfat ở vị trí 4 và liên kết 3-O-linked của loài rong E.kurome H Năm 1999, cấu trúc fucoidan của 3 loài rong Cladosiphon Okamuranus (Chordariales) [89], Chorda filum (Laminariales) và Ascophyllum nodosum (Fucales) [34,41] đã được công bố. Cấu trúc fucoidan của rong Cladosiphon

18 12 okamuranus và Chorda filum được tạo thành bởi các gốc α-l-fucose(1 3) lặp lại đều đặn, với một số nhóm sulfate ở vị trí C-2 (2-O-sulfateation) hoặc vị trí C-4 (4- O-sulfateation) (hình 1.5). Sự xuất hiện của các nhóm O-acetyl và các mạch nhánh trong phân tử fucoidan càng làm tăng thêm tính dị thể về cấu trúc của chúng. H H CH 3 H R 2 O H R 1 O H H CH 3 H H H CH 3 R 2 O H R 3 O H H R 1 - = SO 3 hoặc H hoặc COCH 3 R 2 = SO - 3 hoặc H - H R 2 O H R 1 O H H H H R 2 O CH 3 H R 1 O H H H R 2 O CH 3 H R 1 O H H R 2 O CH 3 H R 1 O H H Hình 1.5. Cấu trúc trung bình của fucoidan được phân lập từ rong Chorda filum [36] OH H H Năm 2002, cấu trúc fucoidan trọng lượng phân tử cao được phân lập từ rong Fucus evanescens đã được nghiên cứu bởi Bilan và cộng sự, kết quả họ đã phát hiện thấy có sự tương đồng giữa cấu trúc fucoidan này với cấu trúc fucoidan của rong A.nodosum [23]. Sau đó vào các năm 2004 và 2006, nhóm tác giả này tiếp tục công bố thêm hai cấu trúc fucoidan từ rong Fucus distichus L và Fucus serratus được tạo thành bởi các gốc 1 3)α-L-Fucp và 1 4)α-L-Fucp liên kết lặp lại một cách tuần tự, nhóm sulfate chủ yếu ở vị trí C-2 và C-2,4 (hình 1.6 và hình 1.7) [24,25].

19 13 [ 3)- -L-Fucp-(2,4 SO 3 - )-(1 4)- -L-Fucp-(2SO 3 - )-(1 ]n 1 H H 2 H CH 3 H HO OSO O 3SO CH 3 1 H H H H OSO 3 Hình 1.6. Cấu trúc của một phân đoạn fucoidan được phân lập từ rong Nâu Fucus distichus L. Trong đó: R 1 = SO 3 -, R 2 = H chiếm 50% và 3)- -L-Fucp(2R 1,4R 2 )-(1 4)- -L-Fucp(2SO 3 - )-(1 R 1 = H, R 2 = -L-fucp-(1 4)- -L-fucp(2SO 3 - )-(1 3) -L-fucp(2SO 3 - )-(1 chiếm 50% Như vậy, mặc dù có mối liên hệ rõ ràng giữa các loài rong và cấu trúc fucoidan, nhưng chưa đủ bằng chứng để thiết lập bất cứ mối tương quan hệ thống giữa cấu trúc fucoidan với các Bộ rong (algal order). Hầu hết các công bố về cấu trúc của fucoidan được phân lập từ các loài rong ở vùng ôn đới, thành phần hóa học của các loại fucoidan này nhìn chung là đơn giản với chỉ một gốc đường fucose và sulfate. Tuy nhiên, fucoidan của các loài rong ở vùng nhiệt đới thì thành phần hóa học của chúng phức tạp hơn nhiều khi trong phân tử của chúng thường tồn tại đồng thời nhiều gốc đường khác nhau điều đó gây ra rất nhiều khó khăn cho việc phân tích cấu trúc của những loại fucoidan này. Đó cũng là lý do tại sao không có nhiều công bố về cấu trúc của fucoidan rong biển ở vùng nhiệt đới, cho dù hoạt tính sinh học của chúng vô cùng thú vị. Hình 1.7. Cấu trúc fucoidan từ Fucus serratus Các phương pháp chiết tách fucoidan từ rong nâu Một số quy trình khác nhau đã được sử dụng để chiết fucoidan. Mối bận tâm chính trong quy trình tách chúng là nhiễu gây bởi các polysacarit khác như

20 14 laminaran và alginat. Những thử nghiệm chiết đầu tiên được tiến hành với dung môi là nước. Năm 1950, fucoidan từ rong Fucus vesiculosus và Fucus spiralis đã được Percival và Ross chiết tách bằng nước sôi trong 24 giờ, sau đó loại bỏ alginate và protein bằng Pb-acetate, tiếp theo fucoidan được kết tủa dưới dạng phức hydroxide khi cho phản ứng với Ba(OH) 2. Phức thu được, đem thủy phân trong dung dịch H 2 SO 4 loãng, fucoidan được tách ra và làm sạch bằng màng thẩm tách [103]. Năm 1952, Black đã khảo sát ảnh hưởng của ph, nhiệt độ, thời gian chiết và tỷ lệ dung dịch chiết với rong nguyên liệu đến hiệu suất thu hồi fucoidan. Kết quả cho thấy điều kiện tối ưu để chiết fucoidan bao gồm khuấy huyền phù rong với dung dịch HCl ở ph: 2,0-2,5 (tỷ lệ 1:10) tại 70 o C trong 1h. Bằng cách xử lý này chỉ 1 lần chiết có thể phân lập được cỡ 50% fucoidan trong khi 3 lần chiết có thể tách ra được hơn 80% fucoidan. Fucoidan còn có thể được chiết bằng đun nóng một phần rong khô với 10 phần H 2 O tại 100 o C trong 3-7,5h, bằng cách này có thể thu được 55-60% fucoidan. Khi tăng tỉ lệ H 2 O : rong, thời gian chiết hoặc số lần chiết có thể tăng được hiệu suất chiết. Theo tác giả chiết nước đôi khi không thích hợp do khó tách cặn rong khỏi dung dịch nước. Fucoidan thô được tách khỏi dịch chiết axít bằng trung hòa và cho bay hơi đến khô, hòa tan lại trong nước và kết tủa thu các phân đoạn fucoidan với cồn ở nồng độ 30% và 60% (v/v). Phân đoạn 60%, fucoidan thô có chứa 30-36% fucose. Có thể tách được fucoidan với hàm lượng fucose lớn hơn 40% từ sản phẩm thô bằng cách xử lý rong nguyên liệu với formaldehyde [29]. Những nỗ lực đầu tiên nhằm đưa ra một phương pháp chiết fucoidan có hệ thống đã được thực hiện bởi Mian và Percival [84]. Họ đã tiến hành chiết tuần tự, đầu tiên là xử lý rong nguyên liệu với formaldehyde, tiếp theo xử lý với cồn ở nồng độ 80% để loại bỏ mannitol, các hợp chất màu và các sản phẩm khối lượng phân tử thấp, sau đó rong được chiết bằng cách khuấy trộn với dung dịch CaCl 2 2% (ở nhiệt độ phòng và 70 o C) để phân lập laminaran và fucoidan (alginate được cố định dưới dạng muối Ca-alginat không tan). Fucoidan được chiết tiếp với dung dịch HCl loãng (ph: 2). Sau cùng bã rong được chiết với 3% Na 2 CO 3 để thu lại alginate dưới dạng muối tan Na-alginat. Hai dung môi bổ sung cuối cùng nhằm chiết ra thêm các

21 15 phân đoạn fucoidan. Quy trình chiết tuần tự phức tạp này hầu như không được sử dụng về sau, nhưng đã trở thành cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo. Các tách giả Zvyagintseva và Duarte [48,143] đã sử dụng các phương pháp chiết fucoidan đơn giản nhưng lại áp dụng các bước làm sạch phức tạp tốn nhiều công sức. Fucoidan từ rong Adenocystis utricularis đã được phân lập bởi Ponce và cộng sự [96] như sau: đầu tiên rong được xử lý với cồn 80%. Sau đó để thu nhận fucoidan, rong được chiết riêng biệt với ba dung môi khác nhau thường được sử dụng để thu nhận fucoidan là nước cất, dung dịch CaCl 2 2% và dung dịch HCl loãng (ph: 2). Trong cả 3 trường hợp việc chiết được thực hiện ở nhiệt độ phòng và sau đó ở 70 o C. Hiệu suất chiết và đặc tính của các sản phẩm thu được trong ba trường hợp là tương tự nhau với chỉ một số ít khác biệt. Các dung dịch chiết ở nhiệt độ phòng cho ra sản phẩm fucoidan giàu L-fucose, D-galactose và ester sulfate được gọi đặt tên là galactofucan, thể hiện đặc tính ức chế chống lại herpes simplex virus 1 và 2 nhưng không gây độc tế bào. Sản phẩm khác là thành phần chính của dịch chiết thu được ở 70 o C, bao gồm chủ yếu là fucose cùng với các monosacarit khác (phần lớn là Man, nhưng đồng thời có cả Glc, Xyl, Rha, Gal), một lượng đáng kể axít uronic và lượng nhỏ sulfate ester, được gọi chung là uronofucoidan, không thể hiện hoạt tính kháng virus, nhưng lại thể hiện hoạt tính gây độc tế bào. Như vậy có thể thấy phương pháp chiết có ảnh hưởng rất lớn đến thành phần, cấu trúc cũng như hoạt tính sinh học của fucoidan. Hiện nay vẫn chưa có phương pháp chuẩn áp dụng để chiết tách fucoidan từ các loài rong khác nhau. Hầu hết các phương pháp chiết fucoidan hiện nay đều hướng đến mục tiêu bảo toàn cấu trúc tự nhiên vốn có của fucoidan, đồng thời hạn chế tối đa sự nhiễm tạp của các thành phần không mong muốn Hoạt tính sinh học và ứng dụng của fucoidan a. Hoạt tính kháng đông tụ máu và kháng huyết khối Fucoidan có phổ hoạt tính sinh học rộng và đa dạng, nhưng hoạt tính chống đông máu của chúng được nghiên cứu sớm nhất. Nishino và cộng sự, đã thử nghiệm

22 16 hoạt tính chống đông máu của fucoidan được phân lập từ các loài rong E. Kurome, H.fusiforme, L.angustata var. longissima kết quả cho thấy chúng có hoạt tính kháng đông tụ máu cao hơn so với Heparin [92]. Hàm lượng sulfate có ảnh hưởng lớn đến hoạt tính kháng đông tụ máu của fucoidan từ một số loài rong (E.kurome, H.fusiforme, vv ), hàm lượng sulfate càng cao thì hoạt tính kháng đông tụ càng lớn [31,38,70,91,93,108]. Vị trí của các nhóm sulfate trên các gốc đường cũng rất quan trọng với hoạt tính kháng đông tụ của fucoidan. Theo các nghiên cứu [34,35,48,118,137] fucoidan sulfate hóa ở vị trí C-2 hoặc C-2, C-3 thể hiện hoạt tính kháng đông tụ, trong khi đó nhóm sulfate ở vị trí C-4 không thể hiện hoạt tính này. Trọng lượng phân tử fucoidan cũng có ảnh hưởng lên hoạt tính kháng đông tụ máu của chúng. Fucoidan tự nhiên từ Lessonia vadosa (Phaeophyta) có khối lượng phân tử ( Da MW) cho thấy hoạt tính chống đông máu tốt hơn các fucoidan đề polymer hóa có khối lượng phân tử ( MW) [31,35]. Một số nghiên cứu khác cho thấy thành phần đường (fucose, galactose, v.v) của fucoidan có ảnh hưởng đến hoạt tính chống đông máu [44,95,104,105,106]. Thành phần axít uronic không ảnh hưởng trực tiếp lên hoạt tính chống đông máu, nhưng nó gián tiếp làm tăng hoạt tính chống đông máu của fucoidan thông qua việc làm cho chuỗi đường trở nên linh động hơn [70]. Hoạt tính chống huyết khối của fucoidan cũng đã được thử nghiệm in vivo theo mô hình ngẽn tĩnh mạch và động mạch ở động vật thí nghiệm [87]. Sulfate galactofucan được phân lập từ rong Spatoglossum schroederi không thể hiện hoạt tính chống đông máu trên một số thử nghiệm in vitro. Tuy nhiên, nó lại thể hiện hoạt tính kháng huyết khối mạnh khi thực hiện thí nghiệm in vivo, điều này có thể được giải thích do ảnh hưởng của yếu tố thời gian đến hoạt tính kháng huyết khối của fucoidan [110]. Như vậy có thể thấy rằng fucoidan có tiềm năng rất lớn để sử dụng làm thuốc chống đông máu, thuốc chống huyết khối hoặc thực phẩm chức năng và dược liệu mà hầu như không có tác dụng phụ [33,70,87].

23 17 b. Hoạt tính chống virus Trong những năm gần đây, các thử nghiệm về hoạt tính kháng virus của fucoidan đã được thực hiện bằng cả in vitro và in vivo yếu tố gây độc tế bào thấp của chúng so với các thuốc kháng virus khác đang được quan tâm xem xét sử dụng trong y học lâm sàng. Fucoidan từ các loài rong Laminaria japonica [75], Adenocytis utricularis [107], Undaria pinnatifida (Mekabu) [68], Stoechospermum marginatum [13], Undaria pinnatifida [55], Cystoseira indica [79] và Undaria pinnatifida [54] cho thấy hoạt tính kháng virus HSV-1 và HSV-2 mà không gây độc cho tế bào Vero [79]. Hơn nữa, fucoidan còn cho thấy hoạt tính ức chế chống lại sự tái tạo nhiều loại virus màng bao gây ra hội chứng suy giảm miễn dịch của người và cytomegalovirus [107]. Hoạt tính antiprion và kìm hãm sự khởi phát bệnh khi bị nhiễm trùng prion đường ruột của fucoidan đã được công bố bởi Doh-ura và cộng sự [46]. c. Hoạt tính kháng u và điều hòa miễn dịch Hoạt tính kháng u của nhiều polysacarit đã được công bố trong những năm gần đây. Fucoidan từ rong Eisenia bicyclics và Laminaria japonica có tác dụng chống u báng 180 [115,119,127]. Fucoidan được phát hiện có khả năng ức chế sự tăng sinh và gây chết tế bào trong dòng tế bào u lympho HS-Sultan của người [14]. Fucoidan từ các loài rong L. saccharina, L. digitata, F. serratus, F. distichus và F. vesiculosus có tác dụng khóa chặt tế bào ung thư vú MDA-MB-231 ngăn kết dính với các tiểu cầu, tác dụng này có ý nghĩa quan trọng trong quá trình di căn khối u [38, 52, 82]. Khả năng phục hồi các chức năng miễn dịch của fucoidan từ rong L. japonica đã được thử nghiệm in vivo [131]. Fucoidan giúp thúc đẩy sự phục hồi chức năng miễn dịch trên các con chuột bị chiếu xạ [133,134]. Fucoidan có thể làm tăng khả năng sản xuất interleukin-1 (IL-1) và interferon-γ (IFN-γ) trong các thử nghiệm in vitro, tăng cường các chức năng của tế bào lympho T, tế bào B, đại thực bào, tế bào giết tự nhiên (NK tế bào) và thúc đẩy các kháng thể chính phản ứng lại với tế bào hồng cầu máu cừu (SRBC) trong thí nghiệm in vivo [136]. Fucoidan trọng lượng phân tử cao được điều chế từ Okinawa Mozuku (Cladosiphon

24 18 okamuranus) thúc đẩy sự gia tăng tỷ lệ gây độc tế bào T ở chuột [117]. Fucoidan từ rong F.vesiculosus có các tác dụng lên sự trưởng thành và điều hòa miễn dịch trên các tế bào tua (DCs), đây là các tế bào có kháng nguyên mạnh mẽ, thông qua con đường liên quan ít nhất đến yếu tố nhân tế bào (Nuclear factor - κb (NF- κb)) [65]. d. Hoạt tính chống oxy hóa Rất nhiều công bố cho thấy rằng fucoidan thể hiện hoạt tính chống oxy hóa quan trọng trong các thí nghiệm in vitro. Nó là một chất chống oxy hóa tự nhiên tuyệt vời để ngăn ngừa các bệnh gây ra bởi các gốc tự do [139]. Tác dụng ức chế sự hình thành các gốc tự do hydroxyl và gốc peoxit của fucoidan (homofucan) từ F.vesiculosus và fucan (heterofucans) từ Padina gymnospora đã được nghiên cứu bởi Micheline và cộng sự, kết quả cho thấy fucan có hoạt tính chống oxy hóa thấp so với fucoidan [85]. Hoạt tính chống oxy hóa liên quan đến trọng lượng phân tử và hàm lượng sulfate của fucoidan [23]. Các phân đoạn fucoidan từ L. japonica có khả năng làm mất gốc peoxit và axít hypochlorous tuyệt vời [140]. Cả khối lượng phân tử và hàm lượng sulfate của fucoidan đều đóng vai trò rất quan trọng trong việc tác động lên các gốc azo 2-2'-Azobis (2-amidinopropane) dihydrochloride (AAPH) gây ra quá trình oxy hóa LDL [76]. e. Giảm lipid máu Fucoidan là hợp chất có hoạt tính tương tự như axít sialic, nó có thể làm tăng các điện tích âm của bề mặt tế bào đến mức có hiệu lực với sự tích tụ của cholesterol trong máu, kết quả làm giảm lượng cholesterol trong huyết thanh. Các nghiên cứu [73,74,77,130] cho thấy fucoidan từ rong L. japonica giảm đáng kể cholesterol toàn phần, triglyceride và LDL-C mà không có tác dụng phụ gây tổn hại cho gan và thận. Hoạt tính giảm lipid máu của fucoidan phụ thuộc vào trọng lượng phân tử của chúng, trọng lượng phân tử càng thấp thì hoạt tính càng cao [51]. f. Chống viêm Năm 2007, Cumashi và cộng sự đã nghiên cứu hoạt tính chống viêm của fucoidan thu nhận được từ chín loài rong nâu. Kết quả cho thấy tất cả fucoidan của 9 loài rong đều có khả năng ức chế sự tăng số lượng bạch cầu trên mô hình chuột bị

25 19 viêm, hiệu quả chống viêm của fucoidan trong mô hình này không bị ảnh hưởng nhiều bởi hàm lượng của gốc fucose và sulfate cũng như các đặc tính cấu trúc khác của bộ khung mạch polysacarit của chúng [38]. Ngoài ra hoạt tính kháng viêm của fucoidan cũng đã được nghiên cứu bởi các tác giả [82,135]. g. Bảo vệ dạ dày Fucoidan từ Cladosiphon okamuranus tokida là một chất an toàn với khả năng bảo vệ dạ dày [116]. Fucoidan như là một tác nhân chống viêm loét và ức chế kết dính với vi khuẩn Helicobacter pyroli (một loại vi khuẩn gây viêm loét dạ dày) [59]. Fucoidan từ rong Cladosiphon okamuranus có khả năng ức chế sự tăng trưởng của tế bào ung thư dạ dày nhưng không cho thấy bất kỳ ảnh hưởng nào lên tế bào bình thường [62]. h. Chống lại bệnh về gan Fucoidan ngăn chặn tổn thương gan gây ra bởi concanavalin A bằng việc gián tiếp sinh ra interleukin (IL)-10 nội sinh và ức chế yếu tố tiền viêm (proinflammatory cytokine) ở chuột [113]. Một số nghiên cứu [54,63,64] thấy cho fucoidan có thể là một chất chống xơ rất tốt năng nhờ sở hữu chức năng kép, cụ thể là: bảo vệ tế bào gan và ức chế sự tăng sinh tế bào gan hình sao. i. Các ứng dụng của fucoidan Những nghiên cứu trong suốt thập niên vừa qua đã đưa ra số lượng lớn bằng chứng khoa học về những lợi ích sức khỏe của fucoidan, một loại polysacarit sulfat hóa giàu fucose từ rong nâu. Nghiên cứu về hoạt tính sinh học của fucoidan chiết xuất từ rong nâu đã mở ra những cơ hội tiềm năng cho ngành công nghiệp dược phẩm, thực phẩm dinh dưỡng, mỹ phẩm và thực phẩm chức năng. Hiện nay, trên thị trường đã xuất hiện nhiều loại fucoidan với thành phần, tác dụng và nhãn mác khác nhau như: LCR fucoidan của Larson Century Ranch, INC, Mỹ có tác dụng điều trị các bệnh ung thư vú, ruột kết, buồng trứng, cũng như tác dụng chống dị ứng, chống lão hóa, chống đái tháo đường, giảm cholesterol, loét dạ dày, Fucoidan Tongan Limu Moui của công ty AHD International, LLC, Mỹ có tác dụng trị tim mạch, chống lão hóa, tăng cường miễn dịch, U-Fucoidan sản phẩm của tập đoàn Pharmaceutical Grade Nutritional & Dietary Anti-aging Supplements, Mỹ gây ra

26 20 sự giáng hóa các tế bào ung thư, Fucoidan của tập đoàn Qingdao Yijia Huayi Import & Export Co.,Ltd., Trung Quốc được sử dụng để phục hồi khả năng kháng ung thư, sản phẩm thuốc kháng virut, điều trị ung thư và tim mạch, [5]. Sản phẩm Best fucoidan 70% của công ty Doctor best INC., Mỹ có tác dụng hỗ trợ điều trị ung thư, ngăn ngừa lão hóa, tăng cường hệ miễn dịch, [57]. Ở nước ta hiện nay, các sản phẩm fucoidan từ rong nâu Việt Nam đã xuất hiện trên thị trường dưới dạng thực phẩm chức năng hỗ trợ điều trị bệnh ung thư và viêm loét dạ dày do Công ty Cổ phần Fucoidan Việt Nam sản xuất là: FucoUmi, FucoAntiK và Fucogastro. Ngoài ra, fucoidan cũng được sử dụng như một thành phần chức năng trong sản phẩm sữa chua fucoidan và nước yến fucoidan của Công ty Sannet Khánh Hòa. Như vậy có thể thấy, fucoidan với rất nhiều hoạt tính sinh học thú vị cũng như tiềm năng ứng dụng hết sức rộng rãi trong nhiều lĩnh vực của cuộc sống đang ngày càng thu hút sự quan tâm nghiên cứu mạnh mẽ của các nhà khoa học trên toàn thế giới. 1.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CẤU TRÚC CỦA FUCOIDAN Việc phân tích cấu trúc của các polysacarit nói chung và fucoidan nói riêng là một trong những thách thức lớn trong hóa học các chất hữu cơ có gốc đường. Cấu trúc của fucoidan chiết từ rong biển thường hết sức phức tạp, bao gồm nhiều vấn đề như thành phần các đường đơn, các dạng đồng phân của đường, mức độ phân nhánh và polyme hóa của chúng. Vì vậy, để xác định được cấu trúc của fucoidan cần phải phân tích, xác định được các thông số sau: - Thành phần các gốc đường và hàm lượng sulfate - Vị trí nhóm sulfate trong các gốc đường - Vị trí liên kết giữa các gốc đường - Trật tự sắp xếp của các gốc đường Phương pháp phân tích thành phần đường Phân tích thành phần các đường đơn của fucoidan là bước quan trọng đầu tiên trong nghiên cứu cấu trúc của fucoidan. Quy trình chung để xác định các đường đơn là thủy phân fucoidan thành các monosacarit (hình 1.8) và sau đó phân tích

27 21 thành phần của từng monosacarit bằng phương pháp sắc ký. Hai phương pháp sắc ký phổ biến nhất được sử dụng để phân tích thành phần các đường đơn là phân tích trực tiếp bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và phân tích gián tiếp thông qua các dẫn xuất acetyl hóa của chúng bằng sắc ký khí (GC): Fucoidan được thủy phân Khử Acetyl hóa Sắc ký [12]. Hình 1.8. Quy trình phân tích thành phần đường đơn của fucoidan Phương pháp phân tích liên kết Xác định vị trí của các liên kết trong polysacarit (fucoidan) chủ yếu được thực hiện bằng phương pháp metyl hóa [44]. Nguyên tắc của phương pháp dựa vào xác định dạng và số lượng dẫn xuất metyl eter của các đại lượng đường sau khi metyl hóa các nhóm hydroxy tự do trong chúng [44], phản ứng này luôn thực hiện trong dung môi DMSO. Ví dụ: nếu sản phẩm thủy phân sau khi metyl hóa là dạng 2,3,6 tri-o-methyl α-d-glucopyranose (hình 1.9) có nghĩa là các gốc glucose liên kết với nhau qua liên kết (1 4) [12].

28 22 Hình 1.9. Quy trình methyl hóa phân tích liên kết glycoside trong polysacarit Phương pháp phổ hồng ngoại (IR) Dựa vào vùng phổ hấp thụ đặc trưng của nhóm sulfate trong phổ hồng ngoại mà ta có thể xác định được vị trí liên kết của nhóm sulfate trong các gốc đường ở vị trí axial hay equatorial (bảng 1.3) [12]. Với axial ta chỉ có một vị trí là C4, còn với

29 23 equatorial có hai vị trí là C2 và C3, do vậy cần phải dựa vào phổ NMR để xác định các vị trí này. Bảng 1.3. Các đỉnh phổ đặc trưng của fucoidan trên phổ hồng ngoại Đỉnh Dao động 775 Dao động dãn vòng của - anome Dao động gấp của liên kết C-O-S của nhóm SO 3 ở vị trí C6 822 Dao động gấp của liên kết C-O-S của nhóm SO 3 ở vị trí equatorial 845 Dao động gấp của liên kết C-O-S của nhóm SO 3 ở vị trí axial 847 Dao động của liên kết C1-H của -anome 893 Dao động của liên kết C1-H của anomer 917 Dao động vòng của -anome Dao động hoá trị của hemiacetal 1034 Dao động hoá trị đối xứng của C-O-C Dao động hoá trị của S=O 1420 Dao động hoá trị đối xứng của COO 1430 Dao dộng gấp của C-H 1730 Dao động hoá trị của C=O Dao động hoá trị của O-H Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) Trong phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton, tất cả proton của carbohydrate (bao gồm cả mono-, oligo- và polysacarit-) có độ dịch chuyển hóa học nằm trong khoảng từ 1-6 ppm. Các proton anomeric của mỗi monosacarit có độ dịch chuyển hóa học phụ thuộc vào cấu dạng α- hoặc β- của chúng. Ví dụ, hầu hết các proton của α-anomeric xuất hiện trong vùng từ 5-6 ppm, trong khi đó các proton β-anomeric xuất hiện ở vùng 4-5 ppm.

30 24 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton được coi như một phương pháp đặc trưng để nhận biết fucoidan dựa vào nhóm methyl ở vị trí C6 với tín hiệu từ 1,2 đến 1,4 ppm là vùng là vùng đặc trưng H-6 của nhóm methyl, các tín hiệu có độ dịch chuyển hóa học từ 5,0 đến 5,5ppm là vùng của H-1 (H- ) của fucoidan. Hình Độ dịch chuyển hóa học trong phổ NMR của polysacarit Mặc dù phổ 13 C-NMR có tín hiệu yếu hơn nhiều, nhưng lại có nhiều thuận lợi hơn phổ 1 H-NMR trong phân tích cấu trúc của polysacarit do các tín hiệu trong phổ 13 C-NMR có độ dịch chuyển hóa học rộng hơn (0-220 ppm) so với phổ 1 H- NMR. Vì vùng giá trị lớn nên các tín hiệu ít chồng lấp lên nhau như trong phổ proton NMR. Các tín hiệu của C-anomeric trong phổ 13 C-NMR thường xuất hiện trong vùng từ ppm, trong khi đó các tín hiệu của C-nonanomeric xuất hiện trong vùng từ ppm. Với fucoidan thì vùng tín hiệu đặc trưng để nhận biết trong phổ 13 C-NMR là vùng trường cao từ ppm thuộc về nhóm methyl (C-6) của vòng α-l-fucopyranose. Các tín hiệu của cacbon α-anomeric thường xuất hiện trong vùng từ ppm, trong khi cacbon của β-anomeric xuất hiện trong vùng từ ppm. Với nguyên tử cacbon carboxyl của axít uronic các tín hiệu sẽ xuất hiện ở vùng trường thấp hơn từ ppm (hình 1.10). Các tín hiệu của nguyên tử cacbon có gắn với nhóm -OH, như C-6 của vòng pyranose và C-5 của vòng furanose xuất hiện trong vùng trường cao hơn từ ppm, trong khi các tín

31 25 hiệu của các nguyên tử cacbon với nhóm hydroxyl thứ cấp (C2,3,4 trong vòng pyranose và C2,3 trong vòng furanose) xuất hiện trong vùng ppm. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều 13 C và 1 H của polysacarit thường có độ phân giải thấp, các tín hiệu trùng lấp nhau khi trong phân tử của chúng có chứa nhiều gốc đường tương tự nhau. Điều này gây ra rất nhiều khó khăn trong việc giải thích chi tiết cấu trúc của polysacarit. Khi đó, phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều sẽ giúp xác định thêm những thông tin về các liên kết trong phân tử, thông qua các tương tác giữa proton với proton và giữa proton với cacbon. Phổ 1 H, 1 H-COSY (Correlation spectroscopy) biểu diễn mối tương quan giữa 1 H và 1 H của hạt nhân cùng loại, phổ 1 H, 13 C-COSY (hay cũng được gọi là phổ HMQC (Heteronuclear Multiple Quantum Correlation) hay HECTOR (Heteronuclear Correlated Spectroscopy)) biểu diễn mối tương quan giữa 1 H và 13 C của các hạt nhân khác loại. Phổ hai chiều 2D-NOESY (Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy) thể hiện sự tương tác về mặt không gian của các proton nằm trên các nguyên tử cacbon ở cách xa nhau nhưng khoảng cách không gian giữa chúng nhỏ hơn 4Å. Phổ 2D-HMBC (Hecteronuclear Multiple Bond Coherence) thể hiện mối tương quan của tín hiệu 1 H ở một nguyên tử 13 C với tín hiệu của nguyên tử 13 C khác cách xa nó 2 hoặc 3 liên kết, ngược lại phổ 13 C- 1 H HMQC hay HETCOR thể hiện mối tương tác của 1 H với 13 C liên kết trực tiếp với nhau. Phổ 2D-TOCSY (Totally Correlated Spectroscopy) là phổ tương quan toàn phần biểu diễn sự tương quan của các proton liên kết và không liên kết trực tiếp nhưng trong cùng một hệ spin giống nhau. Ví dụ: tất cả proton của một gốc đường là thuộc cùng một hệ spin giống nhau. Tóm lại, phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều sẽ cho ta thêm những thông tin để xác định trình tự và vị trí của các liên kết trong phân tử polysacarit thông qua các tương tác giữa proton với proton và proton với cacbon trong các liên kết trực tiếp đồng hạt nhân hoặc các liên kết dị hạt nhân không trực tiếp. Như vậy, có thể thấy việc phân tích cấu trúc của các polysacarit là rất khó khăn, nhưng với polysacarit sulfate hóa từ rong biển còn khó khăn hơn rất nhiều do chúng có cấu trúc rất phức tạp, có mạch nhánh và chuỗi liên kết có mức độ lặp lại không cao nên việc phân tích cấu trúc chỉ dựa vào phổ 1 H-NMR và 13 C-NMR là

32 26 không đủ và đôi khi không mang lại hiệu quả. Để phân tích cấu trúc các polysacarit phức tạp này các tác giả [5,12,23,24,34,48] thường kết hợp các phương pháp hóa học như chiết phân đoạn hoặc tách phân đoạn dựa vào sắc ký trao đổi ion, sau đó làm đơn giản hóa cấu trúc bằng các phản ứng đề sulfate hóa, metyl hóa, đề acetyl hóa, tiếp theo kết hợp các phương pháp phổ NMR, đôi khi cả phương pháp khối phổ (MS) để phân tích cấu trúc Phương pháp phổ khối lượng (MS) Phổ khối là kỹ thuật phân tích dựa trên việc xác định số khối của các phân tử hoặc các mảnh phân tử mang điện tích. Nó là một trong những phương pháp quan trọng trong phân tích cấu trúc của các polysacarit. Việc ứng dụng các phương pháp phân tích khối phổ hiện đại trong phân tích cấu trúc của hợp chất carbohydrate phức tạp đã dẫn đến những tiến bộ nhanh chóng trong lĩnh vực khoa học sự sống suốt hai thập kỷ qua của thế kỷ 21. Các kỹ thuật ion hóa truyền thống như: ion hóa bằng va chạm điện tử, ion hóa hóa học, là những kỹ thuật ion hóa chỉ sử dụng được cho các hợp chất dễ bay hơi. Các kỹ thuật ion hóa mới như: bắn phá nguyên tử nhanh (fast atom bombardment-fab), ion hóa phun mù điện tử (electrospray ionization- ESI) và gần đây là kỹ thuật ion hóa phản hập thụ laser được hỗ trợ bởi chất nền (matrix-assisted laser desorption ionization-maldi) đã được phát triển để ứng dụng phân tích cấu trúc của các hợp chất không bay hơi như các oligosacarit, các hợp chất polysacarit trọng lượng phân tử nhỏ, protein, glycoprotein và các glycolipid. Các kỹ thuật ion hóa mới có khả năng ứng dụng phân tích được nhiều hợp chất hơn với độ nhạy và độ chính xác khối cao hơn các kỹ thuật ion hóa truyền thống. Hiện nay, cấu trúc của nhiều hợp chất polymer sinh học phức tạp đã được phân tích thành công nhờ ứng dụng các kỹ thuật phân tích khối phổ hiện đại này [17-20,32,42,53,60,86,124,138,141]. a. Kỹ thuật ESI (ElectroSpray Ionization - ion hóa phun mù điện tử): trong kỹ thuật phun mù điện tử, dung dịch có chứa phân tử mẫu được phun ra khỏi đầu của mao quản mảnh vào buồng nhiệt ở áp suất giảm (gần bằng áp suất khí quyển). Mao quản mà dung dịch mẫu đi qua có điện thế cao dọc theo bề mặt của nó và những giọt nhỏ tích điện được tách ra, đi vào buồng ion hóa. Các giọt tích điện nhập