11 ZÁKLADY TOXIKOLÓGIE

Transcription

1 11 Základy toxikológie ZÁKLADY TOXIKOLÓGIE Toxikológia je veda o jedoch, ich účinkoch na organizmus a o liečbe otráv. Súčasťou toxikológie je aj laboratórny dôkaz jedu. Klinická toxikológia vychádza z princípu, ktorý definoval Paracelsus: All things are poison and nothing is without poison. Solely the dose determines that a thing is not a poison. Samotná myšlienka moderation in ale things (Publius Terentius Afer, pred n.l.) je určite podstatne staršia. Jed je chemická látka, ktorá je schopná vyvolať otravu po vniknutí do organizmu už v relatívne malom množstve. Aj liečivá sa môžu pri predávkovaní prejaviť ako jedy. Účinok jedu sa vyjadruje ako: o Toxická dávka je najmenšie množstvo jedu schopné vyvolať príznaky otravy. o Letálna dávka sa obvykle udáva hodnotou LD50, čo je taká dávka, ktorá vyvolá smrť 50 % postihnutých. o Najvyššia prípustná koncentrácia je zákonom povolená maximálna koncentrácia toxickej látky v ovzduší, vo vode, v potravinách, v pracovnom prostredí a pod. o Najvyšší prípustný limit v biologickom materiáli je koncentrácia, ktorá sa ešte považuje za bezpečnú u osôb prichádzajúcich do styku s jedom, napr. v pracovnom prostredí. Toxikologické vyšetrenia sa vykonávajú v rôznych situáciách, z rôznych dôvodov a na rôznych pracoviskách: o Vyšetrenie v prípade podozrenia na akútnu otravu u pacientov hospitalizovaných na jednotkách intenzívnej starostlivosti a resuscitačných oddeleniach nemocníc. Pacienti sú často v stave ohrozenia života, a preto je nevyhnutné čo najrýchlejšie získať výsledok analýzy (minimálne zistiť, či skutočne ide o otravu a o akú). Vyšetrenie sa zvyčajne vykonáva na oddelení klinickej biochémie. o Vyšetrenie liečených alebo novo podchytených toxikomanov. Cieľom vyšetrenia je zistiť, či pacienti dodržali abstinenciu alebo predpísanú liečbu, analýza zvyčajne nie je súrna a obvykle sa vykonáva na oddelení klinickej toxikológie. o Vyšetrenie v situáciách, keď v pracovnom procese dochádza k pôsobeniu toxických látok na organizmus. Výhodou je, že obvykle je známy jed, ktorý je potrebné stanoviť. Problematikou priemyselnej toxikológie sa zaoberajú toxikologické oddelenia kliník pracovného lekárstva. o Otravy, pri ktorých je podozrenie na trestný čin, obvykle rieši toxikologické laboratórium súdneho lekárstva. o Kontrolu dopingu vykonávajú špeciálne antidopingové laboratória obvykle analýzou moču. Medzinárodný olympijský výbor zostavil zoznam zakázaných látok a metód, v ktorom sa nachádzajú stimulanty, narkotiká, anaboliká, diuretiká, peptidy a glyko-

2 11 Základy toxikológie 238 proteínové hormóny, podávanie krvi, červených krviniek a iných krvných produktov, kateterizácia, náhrada moču, potlačenie vylučovania moču a iné. Antidopingová kontrola sa vykonáva analýzou moču v dvoch fázach. V prvej fáze sa sériou screeningových imunoanalytických testov zo všetkých vzoriek vylúčia vzorky správne negatívne. Ak vznikne podozrenie, že v určitej vzorke sa nachádza zakázaná látka, použije sa druhý špecifický test na potvrdenie prítomnosti tejto látky. Väčšina antidopingových analýz je založená na chromatografických metódach, predovšetkým na GC MS. o Prítomnosť toxických látok v potravinách a v životnom prostredí zisťujú hygienické laboratóriá. o Liečivá sa stanovujú v laboratóriách klinickej farmakológie alebo klinickej biochémie (medzi terapeutickými a toxickými koncentráciami je často malý rozdiel) Biologické materiály Výber biologickej vzorky pre toxikologickú analýzu závisí od dostupnosti vzorky, času uplynutého od predpokladanej otravy, druhu jedu, spôsobu jeho vylučovania organizmom a pod. Pri otrave neznámou látkou je vhodné odobrať čo najširšie spektrum biologických vzoriek. Pri odbere biologického materiálu na stanovenie známeho jedu je nutné zohľadniť jeho biologický polčas a podľa toho voliť biologický materiál. Najčastejšie používané biologické vzorky sú moč, krvné sérum, obsah žalúdka, dych a vlasy. Moč Výhodou je, že obvykle sa získa veľké množstvo vzorky, pričom koncentrácia jedu býva v moči vysoká. Nevýhodou je, že jed sa v moči objaví až po určitom čase a jeho koncentrácia významne závisí od množstva vylučovaného moču. V moči sa často zistí nielen samotný jed, ale aj mnohé metabolity, takže hodnotenie výsledkov je zložitejšie. Na dôkaz prítomnosti zneužívaných liečiv sa zvyčajne používa moč, s čím súvisí niekoľko problémov: väčšinu liečiv možno dokázať v moči maximálne 2-3 dni od podania, značné riziko podvodu a výmeny vzoriek, nemožnosť opakovania odberu vzorky v neskoršom termíne. Aj napriek tomu väčšina screeningových metód využíva ako biologickú vzorku práve moč, ale na kvantitatívnu analýzu sa používa predovšetkým krv/plazma/sérum. Krvné sérum Výhodou je obvykle dobrá korelácia medzi vážnosťou otravy a koncentráciou jedu v krvi, nevýhodou je nutnosť použiť veľmi citlivú analytickú metódu, pretože koncentrácie jedov v krvi bývajú nízke. Aj keď sa krvné sérum používa predovšetkým v kvantitatívnej analýze, vývoj v oblasti úpravy vzorky, chromatografie a detektorov umožnil vykonávať obidva typy analýz, screening aj vlastné stanovenie, zo vzoriek séra. V krvi možno zistiť prítomnosť jedov niekoľko hodín až dní po intoxikácii.

3 11 Základy toxikológie 239 Obsah žalúdka V prvej časti výplachu žalúdka možno určiť pôvodnú zložku (napr. liečivo v tabletách), avšak len dovtedy, kým sa liečivo neabsorbuje. Analýza obsahu žalúdka umožňuje síce identifikovať jed, ale posúdiť stupeň otravy je už zložitejšie. Dych Obsahuje prchavé látky, alkohol, CO, chlórované uhľovodíky. Výhodou je rýchly, aj keď len orientačný dôkaz týchto jedov. Vlasy a nechty Vlasy sú materiál, v ktorom dochádza ku kumulácii ťažkých kovov, ale aj liečiv. Vlasy sú vhodný materiál na sledovanie dlhodobého vystavenia organizmu účinkom jedov. Pri dlhodobom užívaní sa vo vlasoch zistia opiáty, barbituráty, amfetamíny, kokaín, nikotín. Vlasy ako komplementárny materiál k moču majú niektoré výhody: jednoduché získanie vzorky, dobrá dlhodobá stabilita vzorky pri laboratórnej teplote, možnosť dlhodobého podchytenia vystavenia jedu. Nechty sú tiež vhodný materiál na sledovanie dlhodobého vystavenia organizmu účinkom jedov, pretože jed sa objaví v odstrihnutej časti nechtu asi po 6 mesiacoch Analytické metódy Na zistenie a stanovenie neznámych látok s neznámym koncentračným rozmedzím sa používajú univerzálne inštrumentálne systémy umožňujúce screening, delenie, izoláciu a detekciu látok. Používajú sa chromatografické, spektrálne a imunochemické metódy (tab. 11-1). Chromatografické metódy V screeningu sa ešte stále pomerne často využíva TLC, pretože je jednoduchá, rýchla, môže byť aj automatizovaná a spolu s denzitometrickou detekciou umožňuje aj stanovenie zložiek. Výsledky získané TLC je potrebné potvrdiť inou metódou. GC umožňuje priame stanovenie prchavých zložiek (alkoholy, chlórované uhľovodíky) a tiež menej prchavých zložiek po ich predchádzajúcej derivatizácii. HPLC umožňuje separáciu a stanovenie rozsiahlej skupiny jedov. Podobne ako v TDM, aj v toxikologickej analýze sa stále častejšie používa spojenie chromatografie s MS, prípadne MS MS. Chromatografické metódy zvyčajne vyžadujú úpravu vzorky, napr. hydrolýzu konjugátov v moči, odstránenie proteínov, derivatizáciu, extrakciu. Spektrálne metódy Na stanovenie kovov (Pb, Cd, Pt, Al a iné) sa používa metóda AAS. Ak sa zo vzorky izoluje čistý jed, nameraním UV/VIS, IČ alebo MS spektier, možno tento jed identifikovať.

4 11 Základy toxikológie 240 Tabuľka 11-1 Prehľad toxikologických vyšetrení Jed Indikátor otravy Metóda Vzorka Anilín p-aminofenol fotometria moč As As fotometria moč Benzén fenol fotometria moč Benzén benzén GC krv Fenol fenol fotometria moč Fluoridy fluoridy ISE moč Metanol metanol, kyselina mravčia GC krv, moč CO karbonylhemoglobín fotometria krv Hg Hg fotometria moč Toluén kyselina hippurová fotometria, GC moč Toluén toluén GC krv Trichlóretylén trichlóetanol, trichlóracetát fotometria moč Xylén kyselina metylhippurová GC moč Xylén xylén GC krv Organofosfáty aktivita cholínesterázy fotometria krv Organofosfáty organofosfáty HPLC, GC moč Paracetamol paracetamol FPIA, fotometria, HPLC, TLC moč, krv Benzodiazepíny benzodiazepíny imunometódy (skupinovo), moč, krv HPLC, GC (jednotlivo) Barbituráty barbituráty TLC moč, Antidepresíva antidepresíva FPIA (skupinovo), HPLC, GC, TLC (jednotlivo) obsah žalúdka moč, krv Imunometódy Imunometódy umožňujú priame stanovenie jedov v rôznych biologických vzorkách, sú rýchle, dajú sa automatizovať. Nevýhodou je, že zvyčajne umožňujú len skupinovú detekciu, keďže s protilátkou reaguje viac štruktúrne podobných látok (haptenov, antigénov). Čím je štruktúra týchto látok podobnejšia, tým je vyššia krížová reaktivita s danou protilátkou. Napr. imunometódy umožňujú stanoviť skupinu opiátov bez toho, aby sa zistilo, či ide o morfín, kodeín, alebo heroín. Sú preto zvyčajne vhodné len na rýchlu orientačnú analýzu; prítomnosť určitej zložky je potrebné potvrdiť inou metódou (napr. chromatografiou). Teoreticky je samozrejme možné pripraviť a použiť vysoko špecifickú monoklonálnu protilátku pre určitý antigén bez nežiaducej krížovej reaktivity. Komerčne sú dostupné diagnostické (papierikové alebo doštičkové) testy umožňujúce v priebehu min vizuálne odčítať pozitívnu reakciu vo vzorke moču. Testy poskytujú len orientačný výsledok, ktorý je potrebné potvrdiť špecifickejšou analytickou metódou. Diagnostický test na kvalitatívne určenie drog a ich metabolitov v moči je založený na princípe inhibície zachytávania mikročastíc. Test obsahuje (obr. 11-1) modro vyfarbené mikročastice obalené monoklonálnou protilátkou proti príslušnej droge (napr. anti-amfetamín) a BSA (bovine serum albumin, antigén) v tlmivom roztoku obsahujúcom konzervačné látky a vysušenom na membráne. Ďalšie zložky testu sú konjugát drogy (napr. konjugát amfetamínu) imobilizovaný na membráne v testovacej zóne a monoklonálna protilátka proti BSA (anti-bsa) imobilizovaná na membráne v kontrolnej zóne.

5 11 Základy toxikológie 241 Vzorka moču sa absorbuje do vzorkovacieho priestoru a postupuje ďalej reakčným prúžkom. Na reakčnom prúžku vzorka rozpustí modré mikročastice potiahnuté monoklonálnou protilátkou proti amfetamínu a BSA. Suspenzia mikročastíc a moču postupuje prúžkom ďalej a stretne sa s imobilizovaným konjugátom drogy amfetamínom. Ak vzorka moču neobsahuje drogu, naviažu sa mikročastice s protilátkou (anti-amfetamín) na konjugát drogy (amfetamín) a v testovacej zóne sa vytvorí modrý prúžok. Ak je vo vzorke droga prítomná, naviaže sa na svoju protilátku na modrých mikročasticiach. Ak je množstvo drogy v moči dostatočne veľké, nastane inhibícia väzby mikročastíc na konjugát príslušnej drogy a v testovacej zóne sa nevytvorí modrý prúžok. V obidvoch prípadoch prebehne v kontrolnej zóne reakcia antigénu (BSA na modrých mikročasticiach) s protilátkou anti-bsa imobilizovanou v reagenčnej membráne. Modré prúžky potvrdzujúce platnosť skúšky sa vytvoria, keď sa protilátka anti-bsa imobilizovaná v reagenčnej membráne naviaže na antigén (BSA) na modrých časticiach. anti-bsa Kontrolná zóna amfetamín Testovacia zóna BSA anti-amfetamín Testovací prúžok Negatívny test Pozitívny test amfetamín Obr Diagnostický prúžok na určenie amfetamínu Kontrolné otázky Uveďte spôsoby vyjadrenia účinku jedu. Uveďte výhody a nevýhody využitia moču a krvného séra v toxikologickej analýze. Analytické metódy používané v toxikologickej analýze (využitie, výhody a nevýhody).