Laboratórna diagnostika CLL: cytológia, prietoková cytometria

166 Laboratórna diagnostika CLL: cytológia, prietoková cytometria MUDr. Ľubica Váleková, PhD. 1, MUDr. Juraj Chudej, PhD. 1, MUDr. Juraj Sokol 1 1 Klinika hematológie a transfuziológie JLF UK a UN Martin Bchronická lymfo cytová leukémia (CLL) je heterogénne ochore vychádzajúce z antigénne stimulovaného zrelého Blymfocytu. Imunofenotyp je veľmi stabilný a dobre odlíšiteľný (CD19+, CD20+, CD22, CD23+, CD5+), napriek tomu sa môže zmeniť, zvlášť pri transformácii ochorenia do agresívnejšej formy. V súčasnosti je predpokladom úspešnej starostlivosti o pacientov včasná a presná diagnostika, cielená liečba základného ochorenia a podporná terapia. Mimoriadne dôležité je laboratórne zázemie jednotlivých pracovísk. Morfologická diferenciácia CLL od iných malígnych lymfoproliferatívnych ochorení či od benígnych lymfoproliferatívnych porúch môže byť náročná. Dôležitým krokom pri riešení tohto problému je imunofenotypizácia pomocou prietokovej cytometrie. Prietoková cytometria je moderná laboratórna metóda, ktorá v posledných rokoch dosiahla výrazný technologický rozvoj a predstavuje dnes už bežnú a dôležitú súčasť klinickej praxe. Cieľom tohto článku je priblížiť okrem významu cytologického vyšetrenia, súčasné postave prietokovej cytometrie v diagnostike a diferenciálnej diagnostike CLL vrátane monitorovania minimálnej reziduálnej choroby a detekcie prognostických markerov. Kľúčové slová: chronická lymfocytová leukémia, diagnóza, morfológia, imunofenotyp, CD38, ZAP70, minimálna reziduálna choroba. Laborathory diagnosis of CLL: cytology, flow cytometry Bcell chronic lymphocytic leukemia (CLL) is a heterogeneous disorder entity; it is characterized by the expansion of a mature, antigenstimulated Bcell. Immunophenotype is very stable and well distinguishable (CD19+, CD20+, CD22, CD23+, CD5+). However, changes can occur, especially during the transformation to more aggressive form of the disease. At present, early and accurate diagnosis, targeted treatment and supportive therapy seem to be a prerequisite for successful disease management. Laboratory equipment for departments is extremely important. Morphological differentiation of CLL from other malignant or benign lymphoproliferative disorders is difficult. Immunophenotyping by flow cytometry is the important step in this problemsolving. Flow cytometry is a modern laboratory method, which has recently achieved significant technological development and it is now common and important part of clinical practice. The aim of this article is to describe the importance of cytological examination, the current status of flow cytometry in the diagnosis and differential diagnosis of CLL, including the monitoring of minimal residual disease and the detection of prognostic markers. Key words: chronic lymphocytic leukemia, diagnosis, morphology, immunophenotype, CD38, ZAP70, minimal residual disease. Onkológia (Bratisl.), 2014; roč. 9(3): 166 172 Úvod Chronická lymfocytová leukémia/lymfóm z malých lymfocytov (CLL/SLL) je klonálna proliferácia malých Blymfocytov s typickým fenotypom CD5+ a CD23+ v periférnej krvi (PK), kostnej dreni (KD), lymfatických uzlinách (LU), prípadne pečeni, slezine či ďalších orgánoch. Menšiu časť malígnych buk potom tvoria prolymfocyty a paraimunoblasty. Termín SLL je používaný pre aleuk emickú formu CLL, primárne uzlinovú. V klasifikácii hematologických malignít WHO CLL sa považuje za malignitu vychádzajúcu výhradne z B buk, zatiaľ čo jednotka TCLL bola zrušená a pre svoj obligátne agresívny priebeh bola zahrnutá do skupiny Tprolymfocytových leukémií (TPLL). V PK pri CLL je spravidla lymfocytóza > 10 10 9 /l, ak je však menšia, je diagnóza možná pri typickom morfologickom a imunofenotypovom obraze (1). V roku 1988 a 1996 boli pracovnou skupinou pre CLL (National Cancer Institutesponsored Working Group on chronic lymphocytic leukemia NCISWG) publikované štandardné postupy na diagnostiku, staging a hodnote liečebnej odpovede. Revidované odporúčania boli publikované v roku 2008 IWCLL sponsored working group (International workshop on chronic lymphocytic leukemia) v periodiku (odbornom časopise) Blood. Morfologické vyšetre PK a potvrdený charakteristický fenotyp pomocou prietokovej cytometrie je na postave diagnózy postačujúci. Vyšetre KD je na stanove diagnózy bezpodmienečne nutné, ale informuje nás o rozsahu infiltrácie, príčine cytopé a pomáha zhodnotiť dreňovú rezervu (2, 3). Diagnostika CLL Diagnóza CLL je založená na kritériách NCI SWG z roku 2008 uvedených v tabuľke 1. Zakladá sa na vyšetrení krvného obrazu s diferenciálnym rozpočtom, mikroskopickom zhodnotení náteru z periférnej krvi a prietokovej cytometrii periférnej krvi. Keďže malígny klon je možné jednoznačne identifikovať v PK, je na urče diagnózy CLL nutné vyšetre kostnej drene (KD) či lymfatickej uzliny (LU). Vyšetre KD sa robí obyčajne na objasne etiológie anémie či trombocytopé, to znamená odlíšiť buď infiltráciu KD pri CLL, autoimunitnú príčinu anémie a trombocytopé, alebo útlm KD po liečbe. Aspirát aj biopsiu KD sa odporúča realizovať pred liečbou, pri hodnotení jej efektu a pri perzistujúcich cytopéniách. Exstirpácia a histologické vyšetre LU je indikované vtedy, keď je diagnóza CLL jednoznačná (napríklad netypický imunofenotyp), alebo pri podozrení na transformáciu do inej lymfoproliferácie (Richterov syndróm) (2, 3, 4). Klasické morfologické vyšetre PK sa považuje za prvú líniu v rozpoznávaní správnej diagnózy. Cytologická diagnóza CLL sa často opiera o ziste homogénnej populácie malých lymfocytov, na ktorých sa dokazuje charakteristický fenotyp (5). Morfologické vyšetre Pri typickej CLL predstavujú lymfocyty morfologicky homogénnu, monotónnu populáciu uniformných malých zrelých lymfocytov od veľkosti o čo menšej než normálny malý lymfocyt,

167 maximálne však dosahujú dvojnásobok veľkosti erytrocytu, guľatého alebo mierne oválneho tvaru s ľahko excentricky uloženým jadrom, hutným, kondenzovaným chromatínom. Nukleoly sú vo svetelnom mikroskope zreteľné. Cytoplazma tvorí len úzky lem, ktorý je ľahko asymetrický, je slabo bazofilný, väčšinou agranulárny a len vzácne obsahuje inklúzie či vakuoly. Tieto nádorové lymfocyty sú veľmi fragilné. V nátere preto nachádzame veľké množstvo jadrových tieňov a rozpadajúcich sa buk, ktoré sú v prípade CLL označované ako Gumprechtove tiene. Ide o artefakt vzniknutý mechanickým poškodením pri robení náteru. Nález Gumprechtových tieňov je síce pre CLL patognomonický, avšak tento termín sa používa výhradne v súvislosti s CLL. Ak sú v nátere prítomné prolymfocyty, nemal by ich podiel presahovať 10 %. Ak dosiahne počet prolymfocytov 55 %, hovoríme už o Bprolymfocytovej leukémii (BPLL), čo je ochore s agresívnejším správaním (1, 6). Retikulocytóza, polychromázia a ďalšie prejavy hemolýzy svedčia o autoimunitnej hemolytickej anémii, ktorá je pri CLL relatívne častá, rovnako ako je možná aj autoimunitná trombocytopénia. Možná je aj trombocytopénia spôsobená hypersplenizmom (1). Atypická CLL, nazývaná aj zmiešanobunková CLL (mixed cell type of CLL), má dva varianty. Prvý CLL/PL (chronic lymphocytic leukemia/ prolymphocytic leukemia) má typicky dimorfný obraz leukemickej populácie malé lymfocyty a prolymfocyty, ktorých podiel z lymfoidných buk PK je > 10 %, ale < 55 %. Druhý variant má leukemické lymfocyty veľmi polymorfné ( pleomorfný typ) rôzne veľké lymfocyty s rôzne objemnou cytoplazmou, bez typickej mozaikovitej kondenzácie chromatínu, s nepravidelným jadrom. Zastúpe prolymfocytov je pri tomto variante nižšie ako pri predchádzajúcom. Prolymfocyty pri oboch variantoch sú morfologicky ľahko odlišné od typickej BPLL väčšia variabilita veľkosti buk aj objemu cytoplazmy, nukleolus môže byť menej nápadný. Môže byť prítomné aj malé percento väčších lymfoidných buk s objemnou bazofilnejšou cytoplazmou, ba dokonca aj ojedinelé imunoblasty blastové elementy s veľkými nukleolami a so silne bazofilnou cytoplazmou. Atypické CLL majú sklon k agresívnejšiemu priebehu (1, 6, 7, 8, 9). Aspirát KD býva hypercelulárny s infiltráciou malými lymfocytmi rovnakými ako v PK. Ich zastúpe je obyčajne > 30 % nukleárnych buk (alebo > 50 % v prípade hyperplázie erytropoézy). V prípade autoimunitnej deštrukcie erytrocytov či trombocytov býva hyperplázia Tabuľka 1. Diagnostické kritériá CLL Diagnostické kritériá NCISWG 1996 IWCLL 2008 lymfocytóza v PK > 5 x 10 9 /l > 5 x 10 9 /l morfológia lymfocytov nešpecifikované zrelého vzhľadu malé, zrelé s úzkym lemom cytoplazmy, s denzným jadrom, bez jadierok atypické bunky (prolymfocyty) < 55 % alebo < 15 x 10 9 /l < 55 % trva lymfocytózy nevyžaduje sa > 3 mesiace imunofenotyp 1 B znak (CD19, CD20, CD23) a pozitivita CD5 pri negativite ostatných T znakov monoklonová expresia κ a λ reťazca slabá expresia povrchového Ig erytropoézy, respektíve megakaryopoézy (aj v prípade hypersplenismu) (1). BCLL sa môže časom transformovať do agresívnejšej formy ochorenia. Možná je tzv. prolymfocytoidná transformácia do obrazu BPLL, keď prolymfocyty v PK tvoria > 55 % lymfoidných buk. Ďalšia forma transformácie CLL je transformácia do difúzneho veľkobunkového lymfómu (DLBCL), predtým nazývaná Richterov syndróm (1, 7, 8, 9). Morfologický obraz typickej, atypickej CLL a jej prolymfocytovej transformácie a transformácie do DLBCL ukazuje obrázok 1. Imunofenotypové vyšetre Pokrok v imunologickej fenotypizácii, molekulárnej biológii a cytogenetike umožnil presnejšiu klasifikáciu malígneho klonu, má prognostický význam v čase diagnózy a priamy vplyv na stratifikáciu liečby. Imunofenotypovým vyšetrením dokážeme odpovedať na otázky, či je nádor leukocytového pôvodu, či je leukocytová proliferácia malígna, o aký typ leukémie či lymfómu ide, či sú 1 B znak (CD19, CD20, CD23) a pozitivita CD5 pri negativite ostatných T znakov monoklonová expresia κ a λ reťazca slabá expresia povrchového Ig kostná dreň 30 % lymfocytóza 30 % lymfocytóza Obrázok 1. Morfologický obraz CLL a jej transformácie typická CLL, PK prolymfocytová transformácia CLL, PK typická CLL, KD transformácia do DLBCL, (Richterov syndróm), KD atypická forma CLL/PL, PK prítomné znaky, ktoré pomôžu vybrať terapiu alebo určiť prognózu a aký efekt má liečba (monitorova priebehu terapie a detekcia minimálnej reziduálnej choroby MRD) (10, 11, 12, 13). Prietoková cytometria (PC) je moderná diagnostická metóda, ktorá doplňuje štandardné morfologické vyšetre o údaje, ktoré sa týkajú informácií o bunkových líniách, o stupni diferenciácie a o klonovom pôvode buk. Pomocou prietokovej cytometrie možno vyšetrovať akékoľvek imunofluorescenčne označené bunkové suspenzie. Analyzuje prítomnosť a množstvo molekúl na bunkách, pričom bunkové suspenzie sa inkubujú s fluorescenčne označenou monoklonálnou protilátkou, bunky potom získajú fluorescenčný signál detegovaný prietokovým cytometrom. Súčasné prietokové cytometre umožňujú detegovať na každej bunke viac molekúl súčasne (10, 11, 13, 14, 15, 16). Keďže diagnóza CLL je jednoznačná, pokiaľ je dokázaný charakteristický fenotyp, musí byť použitý dostatočný panel monoklonových protilátok na diagnostiku a na odlíše CLL od iných www.solen.sk 2014; 9(3) Onkológia

168 Tabuľka 2. Imunologické kritériá: skórovací systém BCLL (Matutes et al., 1994) znak prítomnosť neprítomnosť znaku body CD5 + 1 CD22/CD79a Slabo +/ 1 CD23 + 1 sig Slabo + 1 FMC7 1 Pacienti s BCLL skóre 4 5 (87 % CLL) Pacienti s iným LPO skóre 0 1 (89 % iných Bbb. leukémií, 72 % lymfómov) (18) Obrázok 2. PC analýza CLL: graf FSC/SSC a CD45/CD14 identifikuje populáciu buk s jasnou expresiou znaku CD45 a nízkym SSC, nachádzajúcu sa v oblasti lymfocytov. Expresia Bbunkových antigénov: CD19+, CD20 slabá+, CD24+, s koexpresia s CD5+, typicky CD23+, HLADr+, FMC7, CD10, scd22, CD11c, slabá expresia sig s klonálnou reštrikciou ľahkého reťazca λ, nepravidelná expresia cig FSC (forward scatter) predný svetelný rozptyl, miera veľkosti; SSC (side scatter) bočný svetelný rozptyl, miera granularity, R6 lymfocytový gate; R2 monocytový gate; R3 granulocytový gate Blymfoproliferatívnych ochorení. Výber by mal obsahovať znaky pan Bbuk CD19, CD20, CD22, CD24, CD79b a povrchový imunoglobulín (sig), ďalej znaky pre diferenciálnu diagnostiku s ostatnými Bbunkovými chronickými lymfoproliferatívnymi ochoreniami CD5, CD23, CD10, FMC7 a CD11c, aj CD103, HLADr, CD25. V roku 1994 profesorka Estella Matutes a jej spolupracovníci navrhli bodovací systém na základe hodnotenia 5 parametrov: CD5, CD23, FMC7, intenzita povrchového imunoglobulínu (sig) alebo kappa/lambda (κ/λ) ľahkých reťazcov na povrchu buk a CD22/CD79b. BCLL skóre sa pohybuje v rozmedzí 5 (typické prípady BCLL) a 3 (menej typické prípady BCLL). Výsledky 0 2 vylučujú diagnózu BCLL (tabuľka 2). Nedávno skupina Euroflow navrhla väčší panel monoklonových protilátok v snahe dosiahnuť diagnózu a zlepšiť identifikáciu prekrývajúcich sa prípadov (CD43, CD81, CD38, CD200, CD21). Použitie 8farebného prietokového cytometra umožňuje súčasné hodnote 8 až 12 znakov danej bunkovej populácie (17, 18, 19, 20). Diagnostika BCLL je zvyčajne jednoduchá, pretože populácia Bbuk vykazuje charakteristický imunofenotyp (obrázok 2): slabá expresia povrchového imunoglobulínu (sigm a/alebo sigd) s klonálnou expresiou ľahkého reťazca κ alebo λ, nepravidelná expresia cytoplazmatického imunoglobulínu (cig), expresia Bbunkových antigénov, ako je CD19+, CD20 (slabá+), CD24+, CD79a (slabá+) s koexpresiou so znakom CD5+. Populácia je typicky CD23+, FMC7 a znak CD22 na povrchu patologických buk je obyčajne negatívny (scd22). Niekedy sú bunky scd22+, ccd22+. Znak CD11c býva obyčajne pozitívny (CD11c+/), znak CD200 býva silno pozitívny (CD200+/silná), ďalej exprimujú znaky CD21 (slabo), CD43 (slabo) a HLADr. Znaky CD79b, CD10, CD103 a CD25 sú obyčajne negatívne (CD79b, CD10, CD103. CD25). Silná expresia znaku CD44 alebo sig, expresia FMC7, slabá expresia CD23, neprítomnosť CD11c môže znamenať horšiu prognózu. Znak CD20 je spravidla slabší ako CD19, na rozdiel od MCL (1, 4, 11, 13, 21). Do diagnostického panelu sú dnes zahrnuté aj znaky CD20 a CD52 s ohľadom na používa monoklonových protilátok anti CD20 (rituximab) a anticd52 (alemtuzumab) v liečebných režimoch pre CLL (25). Graf CD45/ SSC identifikuje populáciu buk s jasnou expresiou znaku CD45 a nízkym SSC a bunky CLL sa nachádzajú v oblasti lymfocytov (13). Problémy vznikajú v prípade necharakteristického imunofenotypu, vrátane pacientov, ktorí majú skóre 3 (alebo dokonca 4) podľa Matutes. Problémy sú hlavne v tých prípadoch, keď chýba expresia znaku CD5 alebo CD23, alebo je silná expresia CD20 či CD22/CD79b (19, 20, 22). Pri morfologicky atypických formách BCLL sa väčšinou zisťuje silná pozitivita CD20 a CD22, ľahkých a ťažkých reťazcov Ig, prípadne pozitivita CD79b a FMC7. Dôkaz transformácie BCLL pomocou PC býva ťažký. Pri prolymfocytovej transformácii si leukemické bunky väčšinou ponechávajú základný imunofenotyp (CD19+, CD5+, CD23+), mení sa ich intenzita expresie ktorých znakov v zmysle nárastu tak, ako to býva opisované pri atypických formách BCLL to je silná expresia CD20, CD22, CD79b, FCM7 a ľahkých a ťažkých reťazcov. Je nutné pripomenúť, že sa zväčšuje veľkosť buk, čiže narastá parameter FSC. Richterov syndróm je možné PC analýzou dokázať, samozrejme, len v prípade postihnutia KD a PK v rámci tejto transformácie. Potom vedľa malobunkovej populácie s typickým BCLL fenotypom možno zachytiť v analyzovanej vzorke prítomnosť odlišnej veľkobunkovej frakcie s vysokým FSC, ktorá si však väčšinou ponecháva imunofenotyp CLL. Len kedy je tu možné zachytiť odchýlky fenotypu, ktoré spočívajú v zosilnení expresie ktorých antigénov, ako je CD20, CD22, CD79b, FMC7 a ľahkých reťazcov, vymiznutí expresie CD23, prípadne i CD5 (7, 8, 17). Diagnosticky spoľahlivejšie než PC je v takomto prípade histologické vyšetre suspektnej uzliny či KD (1). Diferenciálna diagnostika Nález lymfocytózy a/alebo lymfadenopatie a splenomegálie bez bližšieho určenia môže byť spojený s benígnymi, väčšinou infekčnými chorobami (EBV, CMV, HIV, rubeola, varicela, infekčné hepatitídy, brucelóza, toxoplazmóza), ale môže

169 byť aj prejavom iného malígneho lymfoproliferatívneho ochorenia (LPO). Najdôležitejší marker na odlíše reaktívnej a malígnej lymfocytózy je dôkaz klonality populácie Bbuk: abnormálny pomer povrchových alebo cytoplazmatických imunoglobulínových ľahkých reťazcov (κ, λ) a dôkaz typického Bbunkového fenotypu. Pre diagnózu CLL je okrem fenotypu dôležitý aj počet Bbuk. V prípade zachytenia typického klonu CD5+/19+/23+ lymfocytov v množstve pod arbitrárnu hranicu 5 x 10 9 /l a pri neprítomnosti cytopé, lymfadenopatie či splenomegálie, ide o tzv. monoklonálnu lymfocytózu z Blymfocytov (MBL), ktorá predstavuje premalígny stav analogický s monoklonálnou gamapatiou nejasného významu (MGUS). Iba časť týchto pacientov progreduje do CLL (približne 1 2 % ročne) (3, 4, 22). Frekvencia MBL v populácii sa pohybuje okolo 3 %, ale zdá sa významne vyššia (až 17 %) u príbuzných CLL pacientov. Toto, spolu s epidemiologickými údajmi, podporuje dedičný základ pre CLL. Jednotka SLL má identický imunofenotyp, hlavným rozdielom proti CLL je nesplne kritéria periférnej lymfocytózy. Spravidla prevažuje lymfadenopatia, preto väčšina dôkazov SLL je z histológie LU (4, 5, 8, 22). Tabuľky 3 a 4 prehľadne uvádzajú najčastejšiu diferenciálnu diagnózu CLL (7, 8). Diferenciálne diagnosticky je potrebné od CLL odlíšiť hlavne BPLL, leukemizovaný lymfóm z plášťových buk (MCL) (obrázok 3), lymfoplazmocytový lymfóm (LPL) (obrázok 4), leukémiu z vlasatých buk (HCL) (obrázok 5), leukemizovaný folikulárny lymfóm (FL) (obrázok 6) a ďalšie indolentné lymfoproliferácie. BPLL je agresívnejšie ochore charakterizované inou polohou patologických bunkových populácií na grafe FSC/SSC dané morfológiou, s expresiou Bbunkových antigénov: CD19+, CD20+, CD24+, CD79a+, CD21+, s typicky CD5, scd22+, FMC7+, HLADr+, silnejší sig, znaky CD10, CD25, CD11c (11, 13). Veľký dôraz je kladený hlavne na odlíše CLL od MCL, ktoré sa zjavne líšia, pokiaľ ide o prognózu. Kým CLL máva obyčajne indolentný priebeh s mediánom prežitia v rozmedzí od 95 do 293 mesiacov, MCL je obyčajne agresívne ochore s mediánom prežitia 36 až 60 mesiacov a býva často refraktérne na konvenčnú liečbu. Diferenciácia týchto subjektov má dôležité prognostické a liečebné dôsledky. Dôkaz typického fenotypu CLL prietokovým cytometrom je relatívne dobrý spôsob odlíšenia CLL od MCL. Niektoré štúdie ukázali, že CLL môže však byť CD23, FMC7+, s jasnou expresiou CD20 aj sig. Dokázať, či ide o atypický fenotyp CLL, alebo o MCL (obrázok 3), Tabuľka 3. Diferenciálna diagnóza medzi CLL a inými Bbunkovými leukémiami obraz CLL BPL HCL morfológia veľkosť bunky chromatín jadierko jadro cytoplazma imunofenotyp CLL skóre CD5 CD23 sigm FMC7 CD79b cyklín D1 hutný /malé úzka 3 5 môžeme jadrovou expresiou cyklínu D1 či dôkazom translokácie t(11;14) a mrna pre cyklín D1, alebo dôkazom cytogenetických abnormalít vyskytujúcich sa pri CLL. Početné štúdie ukazujú, že PC dôkaz CD23 a FMC7 sú relatívne dobré na odlíše MCL a CLL. Často používané, ale menej spoľahlivé, sú aj intenzita expresie CD20 a sig. Hodnote cyklínu D1 pomocou PC je problematické, nemá dostatočnú citlivosť a špecificitu v rozlišovaní MCL od CLL. Antigén CD5 je považovaný za dôležitý ukazovateľ odlíšenia MCL a CLL od iných lowgrade Bbunkových lymfómov. Boli však dokázané rozdiely v expresii znaku CD5 u MCL, pričom jeho negatívna expresia CD5 pri MCL je mimoriadna, preto dôkaz cyklínu D1 a/alebo FISH analýza sú dôležité. Znak CD10 je ukazovateľom Bbuk zárodočných centier a je exprimovaný pri FL a DLBCL (8, 18, 20). kondenzovaný nápadné 0 2 /veľká retikulárny/špongiózny obličkovitý tvar bohatá s výbežkami 0 stredný áno () Vysvetlivky: sig: surface immunoglobulin (povrchový Ig) (): negatívne alebo pozitívne v menej ako 10 % prípadov; (): pozitívne pri 10 až 25 % prípadov; (+): pozitívne v 25 až 75 % prípadov, (): pozitívne vo viac ako 75 % prípadov, BPL Bprolymfocytová leukémia; HCL leukémia z vlasatých buk Tabuľka 4. Diferenciálna diagnóza medzi CLL a inými Bbunkovými lymfómami obraz CLL MCL SMZL FL morfológia veľkosť bunky chromatín jadierko jadro cytoplazma imunofenotyp CLL skóre CD5 CD23 sigm FMC7 CD79b cyclin D1 hutný /malé úzka 3 5 škvrnitý /malé vrúbkované 1 2 + kondenzovaný 0 2 + veľmi kondenzovaný rozštiepené úzka 0 1 Vysvetlivky: MCL mantlecell lymphoma (lymfóm z plášťových buk); SMZL/SLVL splenic marginalzone lymphoma with villous lymphocytes (splenický lymfóm z marginálnej zóny/ splenický lymfóm s výbežkovitými lymfocytmi); FL folikulový lymfóm; SmIg povrchový Ig (): negatívne alebo pozitívne v menej ako 10 % prípadov; (): pozitívne pri 10 až 25 % prípadov; (+): pozitívne v 25 až 75% prípadov, (): pozitívne vo viac ako 75 % prípadov Prognóza CLL je ochore s veľmi heterogénnym priebehom. Kým u ktorých pacientov má indolentný charakter a neskracuje predpokladanú dĺžku života pacienta, u iných sa správa veľmi agresívne, rýchlo progreduje a prežitie pacienta od stanovenia diagnózy je 2 3 roky. Keďže väčšina pacientov sa diagnostikuje vo včasnom štádiu CLL, je snaha o predikciu ďalšieho vývoja ochorenia (9). Za klasické markery pre nepriaznivú prognózu BCLL detegované PC sa považujú znaky CD38, CD49d a ZAP70. Znak CD49d môže byť považovaný za prediktor celkového prežitia pri CLL. Väčšina štúdií uvažuje o zlej prognóze BCLL pri aspoň 30 % pozitivite buk pre CD49d (23). Hoci väčšina štúdií považuje 30 % pozitívnych buk ako cutoff aj pre stanove pozitivity expresie znaku CD38, ktoré štúdie preukázali negatívnu prognózu u pacientov s expresiou CD38 na viac www.solen.sk 2014; 9(3) Onkológia

170 Obrázok 3. PC analýza MCL: Bbunkové antigény: CD19+, CD20+, CD22+, CD24+, typicky CD5+ a CD23 (odlíši od CLL), FMC7+, CD11c, sig+, expresia κ ľahkého reťazca, CD25, CD10 R7 lymfocytový gate; R8 monocytový gate; R9 granulocytový gate Obrázok 4. PC analýza LPL: Bbunkové antigény: CD19+, CD20+, CD22+, CD24+, typicky CD5 (odlíši od CLL), CD10, výrazný cig, expresia κ ľahkých reťazcov, CD23, HLADr+, CD11c R7 lymfocytový gate; R1 monocytový gate; R2 granulocytový gate než 20 % buk alebo ešte menej. Za posledných 10 rokov bol antigén CD38 vyskytujúci sa na povrchu lymfocytov CLL predmetom extenzívneho výskumu, zdalo sa totiž, že jeho zvýšená expresia je spojená s prítomnosťou nemutovaného génu IgVH a bola snaha jednoduchou detekciou CD38 pomocou PC nahradiť stanove mutačného stavu. Bolo však zistené, že korelácia CD38+ s nemutovaným stavom IgVH je jednoznačná a aj miera expresie CD38 v priebehu trvania ochorenia kolíše. Aj napriek tomu, že antigén CD38 nenahradil mutačný stav IgVH, je stále považovaný za nezávislý prognostický faktor (17, 24). Zeta asociovaný proteín (ZAP70) je tyrozínkináza, prítomnosť ktorej bola dlho považovaná za špecifickú pre Tlymfocyty a NK bunky. Neskôr sa zistilo, že je v menšej miere exprimovaná i na rôznych vývojových štádiách Blymfocytov a odráža stupeň bunkovej aktivácie. Pri štúdiu CLL bola opísaná expresia ZAP70 aj v nádorových Blymfocytoch a ich vyššia hladina bola asociovaná častejšie s nemutovaným IgVH a agresívnejším priebehom ochorenia, pri mutovaných CLL bola expresia ZAP70 uniformne nízka. Mieru expresie ZAP70 na CLL bunkách stanovujeme PC analýzou z PK, pričom cutoff pre pozitivitu ZAP70 je 20 %. Je málo údajov o jej stanovení na Blymfocytoch KD a LU. PC umožňuje posúdiť prítomnosť ZAP70 samostatne na CLL klone aj na T a NKbunkách (24, 25, 26, 17, 9). Na základe výsledkov dosiaľ publikovaných prác môžeme predpokladať, že miera expresie ZAP70 sa javí na populácii leukemických buk uniformná. Javí sa ako časovo stála a oproti čerstvo odobratým vzorkám sa významne nelíši pri použití zmrazených mononukleárnych buk. Je odporučené skoré spracova vzorky v ten istý deň, optimálne do 6 8 hodín po odbere, prípadne skoro po rozmrazení (26). Napriek určitým problémom, predstavuje PC v súčasnom období najčastejšie používanú metódu stanovenia expresie ZAP70. Jej výhodou je veľmi dobrá dostupnosť, relatívna jednoduchosť a časová nenáročnosť. Navyše sú potrebné separované Blymfocyty a výsledok je ovplyvnený mierou kontaminácie Tlymfocytmi vo vzorke (Tlymfocyty sú identifikované špecifickými povrchovými protilátkami). Hlavnou a doteraz zásadnou nevýhodou je absencia jednotne používanej, štandardizovanej metodiky, ktorej výsledky by boli vzájomne dobre porovnateľné. Ide hlavne o absenciu dohody, ak ide o výber optimálnej antizap70 protilátky, voľbu stratégie gatingu, pozitívnej a negatívnej kontroly a optimálny prah pozitivity. ZAP70 je lokalizovaný v cytoplazme, preto vyžaduje na detekciu permeabilizačné

171 techniky, ktoré môžu viesť k zníženiu intenzity farbenia. Všetky metódy narážajú na prekážku relatívne nízkej intenzity expresie ZAP70 na CLL bunkách v porovnaní s T a NK bunkami (5, 6, 8). Expresia ZAP70 a CD38 na CLL bunkách (obrázok 7) sa však môže v priebehu ochorenia významne meniť a pri oboch markeroch je istá diskonkordancia medzi ich pozitivitou a nemutovaným IgVH. Preto v súčasnosti, keď vyšetre mutačného stavu IgVH je dostupným a štandardizovaným vyšetrením, považujeme ZAP 70 a CD 38 za významné, ale skôr doplňujúce prognostické faktory pri určovaní prognózy konkrétneho pacienta. Zatiaľ čo zmena z pozitivity do negativity bola zaznamenaná len u klinicky stabilných pacientov, pozitivizácia bola spojená s progresiou ochorenia. Zaujímavou sa javí súvislosť pozitivizácie ZAP70 s nemutovanými IgVH génmi, čo by mohlo byť v dôsledku klonálneho vývoja opisovaného u týchto pacientov. Je preto vhodné znovu vyšetriť expresiu ZAP70 u pôvodne ZAPnegatívneho pacienta v čase progresie ochorenia (25). Minimálna reziduálna choroba (MRD) Moderné liečebné protokoly vedú u významnej časti chorých k zníženiu leukemického klonu pod úroveň detekcie bežnými metódami, zvyškové leukemické elementy (MRD) môžu byť zistiteľné iba veľmi citlivými metódami. V literatúre pribúda dôkazov o predĺžení prežitia bez progresie a celkového prežitia u pacientov, u ktorých bola dosiahnutá negativita MRD. Sledova MRD pomocou viacfarebnej PC s citlivosťou až 10 5 je vhodné zvážiť u pacientov liečených intenzívnou liečbou. Na identifikáciu MRD pri CLL je odporučená minimálne štvorfarebná kombinácia monoklonových protilátok, najviac odporučené kombinácie na identifikáciu MRD sú CD22 slabá+/ CD81 slabá+/cd19+/cd5+ a CD43 silná+/cd79b slabá+/cd19+/cd5+ (4, 27). Obrázok 5. PC analýza HCL: Bbunkové antigény: CD19+, CD20+, CD22+, CD24+, typicky CD5 (odlíši od CLL), CD10 CD23, HLADr+, CD25+, sig+, s expresiou κ ľahkých reťazcov, typicky: CD11c+, FMC7+, CD103+, CD123+ (odlíši od iných) R6 lymfocytový gate; R3 monocytový gate; R2 granulocytový gate Obrázok 6. PC analýza FL: Bbunkové antigény: CD19+, CD20+, CD22+, CD24+, typicky D10+ (výnimočne), znaky CD5, CD43 (odlíši od CLL a MCL), CD23 (odlíši od CLL), sig+ (všetky, najčastejšie IgM+) s reštrikciou ľahkých reťazcov. CD11c, CD25, HLADr+ Záver Aj keď cytologické vyšetre zostáva pri koreni každej diagnózy a môže byť dostatočné vo väčšine prípadov typickej CLL za prítomnosti Gumprechtových tieňov v krvnom nátere, na jednoznačné potvrde diagnózy CLL je potrebné imunofenotypové vyšetre PK. Cytologické a imunofenotypové vyšetre poskytujú príslušné informácie, ak ide o diagnózu, priebeh ochorenia, diferenciálnu diagnózu a prognózu. Klinická diagnóza musí byť výsledkom komplexného zhodnotenia celého diagnostického postupu a obyčajne si vyžaduje multidisciplinárny prístup. R8 lymfocytový gate; R10 monocytový gate; R11 granulocytový gate; R7 lymfómové bunky Obrázok 7. Expresia znaku CD38 a ZAP70 u pacienta s CLL www.solen.sk 2014; 9(3) Onkológia

172 Literatúra 1. Kačírková P, Campr V. Hematoonkologický ATLAS krve a kostní dřeně. Praha: Grada, 2007. 2. Mikušková E, Demitrovičová Ľ. Chronická lymfocytová leukémia biológia, klinický obraz a prognóza (1. časť). Onkológia. 2008;3(5):316 319. 3. Hallek M. Guidelines for the diagnosis and treatment of chronic lymphocytic leukemia: a report from the International Workshop on Chronic Lymphocytic Leukemia (IWCLL) updating the National Cancer InstituteWorking Group (NCIWG) 1996 guidelines. Blood. 2008. 4. Smolej L, Doubek M, Špaček M, Urbanová R, Obrtlíková P, Schwarz J, Lysák D, Pospíšilová Š, Jarošová M, Peková S, Kozák T. Doporučení pro diagnostiku a léčbu chronické lymfocytární leukemie (CLL). Transfuze Hematologie dnes. 2013;19(2):61 68. 5. Kastenbaum HA, Khalbuss WE, Felgar RE, Stoller R, Monaco SE. The spectrum of coincident entities with small lymphocytic lymphoma/chronic lymphocytic leukemia (SLL/CLL) diagnosed by cytology. CytoJournal. 2010;7:20. 6. Dusse LMS, Silva TP, Freitas LG, Vieira LM, Sabino AP, Carvalho M. Gumprecht shadows: when to use this terminology? J. Bras. Patol. Med. Lab. 2013;49(5):320 323. 7. Matutes E, Wotherspoon A, Catovsky D. Differential diagnosis in chronic lymphocytic leukaemia. Best Practice & Research Clinical Haematology. 2007;20(3):367 384. 8. Matutes E, Wotherspoon A, Catovsky D. Diagnostic issues in chronic lymphocytic leukaemia (CLL). Best Practice & Research Clinical Haematology. 2010;23:3 20. 9. Panovská A, Doubek M. Chronická lymfocytární leukemie diagnostika a léčba. Onkologie. 2013;7(3):117 120. 10. Eckschlager T, et al. Průtoková cytometrie v klinické praxi. Praha: Grada, 1999. 169 s. 11. Marinov I. Průtoková cytometrie v klinické hematologii. 2. prepracované a rozšírené vyda. Praha: Triton, 2008. 152 s. 12. Stewart CC. Multiparameter flow cytometry. J Immunoassay. 2000;21:255 272. 13. Váleková Ľ. Princípy prietokovej cytometrie v diagnostike malígnych lymfómov. Lekárske listy. 2005;32:20 26. 14. Riley RS, Idowu M. Principles and Applications of Flow Cytometry. Richmond; VA: Medical College of Virginia/VCU Health Systems Virginia Commonwealth University, 2003.14 p. 15. Smithz HG, Rothe G. Durchflubzytometrie in der klinischen Zelldiagnostik. Stuttgart, New York: Schattauer, 1994. 199 p. 16. Váleková Ľ, Vošková D, Fedorová J, Kubisz P. Význam prietokovocytometrických vyšetrení v hematológii. Lekárske listy. 1999;20:2 8. 17. Craig1 FE, Foon KA. Flow cytometric immunophenotyping for hematologic neoplasms. Blood. 2008;111(8):3941 3967. 18. Matutes E, Polliack A. Morphological and Immunophenotypic features of Chronic lymphocytic leukemia. Rev Clin Exp Hematol. 2000;4(1):22 47. 19. Afaf AbdelAziz AbdelGhafar, Manal Ahmed Shams El Din El Telbany, Hanan Mohamed Mahmoud, et al. Immunophenotyping of chronic Bcell neoplasms: flow cytometry versus immunohistochemistry, Hematology reports. 2012;4(1):6 11. 20. Béné MC, Nebe T, Bettelheim P, et al. Immunophenotyping of acute leukemia and lymphoproliferative disorders: a consensus proposal of the European LeukemiaNet Work Package 10. Leukemia. 2011;25(4):567 574. 21. Spacek M, Obrtlikova P, Tměný M. Chronická lymfocytární leukémie [online]. Postgraduální medicína. 2013. Available from: <http://zdravi.e15.cz/clanek/postgradualnimedicina/chronickalymfocytarnileukemie470643>. Accessed June 6, 2013. 22. Rawstron AC, Shingles J, de Tute R, et al. Chronic lymphocytic leukaemia (CLL) and CLLtype monoclonal Bcell lymphocytosis (MBL) show differential expression of molecules involved in lymphoid tissue homing. Cytometry B Clin Cytom. 2010;78 Suppl 1:42 46. 23. Bulian P, Shanafelt TD, Fegan Ch, et al. CD49d Is the Strongest Flow Cytometry Based Predictor of Overall Survival in Chronic Lymphocytic Leukemia. JCO. 2014;32(9):897 904. 24. Kozák T. Chronická lymfocytární leukemie. Onkologie. 2008;2(3):156 162. 25. Smolej L. ZAP70 expression may changes significantly in patients during the course of chronic lymphocytic leukemia. Hematology. 2012;17(5):268 274. 26. Smolej L, Saudková L, Špaček M, et al. ZAP70 u chronické Blymfocytární leukémie: klinický význam a metódy detekce. Vnitř Lek. 2006;52(12):1194 1199. 27. Böttcher S, Ritgen M, Fischer K, et al. Minimal Residual Disease Quantification Is an Independent Predictor of ProgressionFree and Overall Survival in Chronic Lymphocytic Leukemia: A Multivariate Analysis from the Randomized GCLLSG CLL8 Trial. J Clin Oncol. 2012;30(9): 980 988. MUDr. Ľubica Váleková, PhD. Klinika Hematológie a transfuziológie JLF UK Univerzitná nemocnica Martin Kollárova 2, 036 59 Martin valekova@unm.sk