RIZIKOVÉ FAKTORY POTRAVOVÉHO REŤAZCA

Transcription

1 Slovenská poľnohospodárska univerzita v Nitre Fakulta biotechnológie a potravinárstva Katedra fyziológie živočíchov a Katedra hygieny a bezpečnosti potravín Pedagogická univerzita v Krakowe, Poľsko Inštitút biológie Slovenská spoločnosť pre poľnohospodárske, lesnícke, potravinárske a veterinárne vedy pri SAV RIZIKOVÉ FAKTORY POTRAVOVÉHO REŤAZCA NITRA

2 Slovenská poľnohospodárska univerzita v Nitre Fakulta biotechnológie a potravinárstva Katedra fyziológie živočíchov a Katedra hygieny a bezpečnosti potravín Pedagogická univerzita v Krakowe, Poľsko Inštitút biológie Slovenská spoločnosť pre poľnohospodárske, lesnícke, potravinárske a veterinárne vedy pri SAV ZBORNÍK Z MEDZINÁRODNEJ KONFERENCIE RIZIKOVÉ FAKTORY POTRAVOVÉHO REŤAZCA NITRA

3 Redakčná rada: Ing. Adriana Kolesárová,, PhD., doc. Ing. Norbert Lukáč, PhD., doc. MVDr. Peter Massányi, PhD., doc. Ing. Róbert Toman, Dr. Schválil rektor Slovenskej poľnohospodárskej univerzity v Nitre dňa ako zborník z vedeckej konferencie s medzinárodnou účasťou ISBN

4 Vedecký výbor: László Bárdos, prof. DVM., PhD. Szent István University, Gödöllő, Hungary Jozef Bíreš, prof. DVM. DSc. University of Veterinary Medicine, Košice, Slovak Republic Jozef Bulla, prof. MSc., DSc. Slovak Agricultural University, Nitra, Slovak Republic Zsolt Forgács, Dr. PhD. National Institute of Chemical Safety, Budapest, Hungary Jaroslav Kováčik, prof. MSc., PhD. Slovak Agricultural University, Nitra, Slovak Republic Stanislav Kráčmar, prof. MSc., DSc University of Tomas Bata, Zlín, Czech Republic Ján Pliešovský, DVM. PhD. State Veterinary and Food Service of Slovak Republic, Bratislava, Slovak Republic Jozef Sokol, prof. DVM., DSc. Regional Veterinary and Food Service of Slovak Republic, Trnava, Slovak Republic Jaroslav Slamečka, Ass. prof. MSc., PhD. Slovak Centre of Agricultural Research, Nitra, Slovak Republic Eva Dudríková, doc. MVDr., PhD. University of Veterinary Medicine, Košice, Slovak Republic Frieda Tataruch, prof. Dr., PhD. University of Veterinary Medicine, Wien, Austria Lenka Vorlová, prof. MVD., CSc. Veterinary and Farmaceutical University, Brno, Czech Republic Marian Zakrzewski, prof. Dr., PhD. Pedagogical University, Krakow, Poland Wladyslaw Zamachowski, prof. Dr., PhD. Pedagogical University, Krakow, Poland Recenzenti: prof. MVDr. Juraj Pivko, DrSc. doc. MVDr. Peter Massányi, PhD. Dr. Grzegorz Formicki, PhD. doc. Ing. Jozef Golian, PhD. doc. Ing. Norbert Lukáč, PhD. doc. Ing. Róbert Toman, PhD. Dr. Robert Stawarz, PhD. RNDr. Alena Jančová, PhD. RNDr. Janka Drábeková, PhD.

5 HISTOLOGICKÝ OBRAZ SEMENNÍKOV JAPONSKÝCH PREPELÍC VYSTAVENÝCH DLHODOBEJ HYPODYNAMII HISTOLOGICAL PICTURE OF JAPANESE QUAIL TESTES SUBJECTED TO LONG TERM HYPODYNAMY Almášiová, V., Cigánková, V., Holovská, K., Zibrín, M., *Massányi, P., ** Škrobánek P. Univerzita veterinárskeho lekárstva, Košice *Slovenská poľnohospodárska univerzita, Nitra **Ústav biochémie a genetiky živočíchov SAV, Ivanka pri Dunaji Abstract The aim of present study was to observe the influence of simulated weightlessness on the structure, ultrastructure and morphometric analysis of testes of Japanese quails reared under the conditions of experimental longterm hypodynamy. Hypodynamy is a method to simulate weightlessness in the earth laboratory conditions. Two days after hatching the quails were suspended in special shirts below the ceiling of a cage so their feet did not touch the floor. They could consume food and water ad libitum. Experimental animals were sacrificed after 14, 21, 28, 35, 42, 49 and 56 days of hypodynamy. Birds of the same age, hatched at the same time, and fed the same diet were used as a control. Samples of testes were processed for light (LM) and transmission electron microscopy (TEM). Shortterm hypodynamy (14 28 days) caused no marked damage on structure and ultrastructure of testes. However, after longterm hypodynamy (3559 days), morphological changes were observed in some cells of seminiferous epithelium and Leydig cells. Hypodynamy had an adverse effect on body weight of Japanese quail which was reflected in its average decrease by % in comparison with the control. This was in correlation with lower mass of testes, decreased diameter of seminiferous tubules and lower seminiferous epithelium. The morphometric data obtained agree with our morphological findings and indicated delayed development of testes and a delay in onset of spermatogenesis by approximately seven days. Apoptosis of Leydig cells was observed in testicular interstitium from day 35 to 56 of hypodynamy. On the basis of our findings and the data from literature we assume that stress is the principal factor affecting negatively the organism during hypodynamy. The stress causes disturbances in the hypophysishypothalamusgonad axis which affects negatively the development and structure of testes. In conclusion we can state that Japanese quail are able to grow, develop and reach productive age even under unfavourable conditions of longterm hypodynamy. Úvod Experimenty s hypodynamiou slúžia ako pokračovanie našich štúdií vplyvu beztiaže na organizmus japonskej prepelice. Cieľom je, aby v kozme vyliahnuté japonské prepelice dosiahli dospelosť a boli schopné ďalšej reprodukcie. Nakoľko experimenty v kozme sú veľmi náročné a drahé, je snaha vytvoriť podobné podmienky aj na Zemi. Jednou z metód imitujúcich stav beztiaže v laboratórnych podmienkach na Zemi je hypodynamia. Na umožnenie života aj za hranicami zemskej biosféry je potrebné vytvoriť umelý uzavretý ekologický systém, ktorý je na základe cirkulácie látok medzi autotrofmi, heterotrofmi a deštruktormi schopný autonómne fungovať (Boďa, 1984). Pri dlhodobých pobytoch človeka v kozme je jedným z limitujúcich faktorov zásoba potravín, je preto nutné získať kvalitné zdroje najmä živočíšnych bielkovín z vlastných zdrojov. Vďaka vynikajúcim fyziologickým parametrom, adaptačným schopnostiam a produkcii veľmi kvalitných živočíšnych bielkovín a to vajec a mäsa bol do UUES, ktorým sú kozmické lode a orbitálne stanice zaradený ako vyšší herterotrofný článok aviárny druh japonská prepelica. Vyznačuje sa nízkou hmotnosťou tela, vysokou produkčnou a reprodukčnou schopnosťou, krátkym individuálnym vývojom, dobrou toleranciou na stiesnené podmienky a adaptabilitou na mikrogravitáciu 4

6 Materiál a metódy Experimenty prebiehali na Ústave biochémie a genetiky živočíchov SAV v Ivanke pri Dunaji. Kurčatá japonských prepelíc dva dni po vyliahnutí boli sexované a kohútiky boli zavesené na strop klietky pomocou špeciálnych košieľok zo sieťoviny tak, aby sa nemohli dotýkať podlahy, ale prístup ku krmivu a vode mali neobmedzený. Prepelice toho istého veku chované v štandardných chovateľských podmienkach slúžili ako kontrola. Vzorky semenníkov pokusných a kontrolných prepelíc sme odoberali na 14., 21., , 42., 49., 56. a 63. deň pokusu a spracovali na svetelnú (SM), transmisnú elektrónovú mikroskopiu (TEM) a morfometrické analýzy. Výsledky a diskusia Na 14. deň hypodynamie sa mikroskopický obraz semenníkov pohlavne nedospelých kohútikov kontrolných a pokusných prepelíc nelíšil. Semenotvorné povrazce pozostávali z veľkého množstva Sertoliho buniek pyramídového tvaru s trojuholníkovým jadrom a výrazným jadierkom, ktoré nasadali na súvislú bazálnu membránu. V centre povrazcov sa nachádzali veľké svetlé okrúhle zárodočné bunky gonocyty. Niektoré z nich odumierali, iné sa presúvali k bazálnej membráne a menili na spermatogónie A. Stena semenotvorných povrazcov bola výrazná a súvislá. V interstíciu sa nachádzali Leydigove bunky, väzivové bunky, krvné a lymfatické cievy, ktoré nejavili známky poškodenia. Na 21. deň hypodynamie sme v semenníkoch kontrolných kohútikov pozorovali, že niektoré spermatogónie A sa mitoticky delili, čo svedčí o nástupe spermatogenézy. Mitózy Sertoliho buniek sme nepozorovali. Avšak v semenníkoch pokusných kohútikov japonských prepelíc diferenciácia zárodočných buniek zaostávala za kontrolnými. Na polotenkých rezoch sme pozorovali, že v semenotvorných povrazcoch sa nachádzali vyššie Sertoliho bunky, pribudlo aj množstvo okrúhlych alebo oválnych spermatogónií A ležiacich na súvislej bazálnej membráne. Gonocyty sa vyskytovali už iba sporadicky. Na 28. deň hypodynamie sme už aj v semenníkoch pokusných kohútikov zaznamenali nástup spermatogenézy. Na polotenkých rezoch sme u kontrolných kohútikov pozorovali tvoriaci sa lúmen a semenotvorné kanáliky mali väčší priemer. V semenotvorných kanálikoch kontrolných aj pokusných kohútikov nachádzali mitoticky sa deliace spermatogónie A. V intersticiálnom väzive sa v blízkosti krvných kapilár nachádzali dva typy Leydigovych buniek svetlé a tmavé. Svetlé Leydigove bunky mali v cytoplazme mitochondrie s tubulami a svetlé tukové vakuoly rôznej veľkosti. Tmavé odumierajúce Leydigove bunky mali tmavé scvrknuté jadro a v ich denznej cytoplazme sa nachádzali tukové vakuoly a mitochondrie s tenkými priehradkami. Na 35. deň hypodynamie sme v semenníkoch kontrolných aj pokusných kohútikov namiesto semenotvorných povrazcov pozorovali semenotvorné kanáliky s lúmenom a jednotlivé bunky semenotvorného epitelu boli uložené vo viacerých vrstvách, čo je znakom prebiehajúcej spermatogenézy. U kontrolných prepelíc sme nachádzali všetky vývojové štádiá zárodočných buniek semenotvorného epitelu spermatogónie, spermatocyty, spermatídy a spermie. V lúmene niektorých kanálikov prisemenníka sa nachádzali ojedinelé spermie. Semenníky pokusných kohútikov oproti kontrolným zaostávali vo vývoji. V ich semenotvorných kanálikoch sa nachádzali spermatogónie, spermatocyty a okrúhle spermatídy a medzi bunkami semenotvorného epitelu boli prázdne priestory. Výskyt dozrievajúcich spermatíd bol iba ojedinelý. Kanáliky rete testis a kanáliky prisemenníka boli prázdne. Leydigove bunky v interstíciu mali pretiahnutý polygonálny alebo nepravidelný tvar a nachádzali sa často v zoskupeniach po 2 3 bunky. Mali okrúhle alebo oválne centrálne uložené jadro a v ich cytoplazme sa nachádzali mitochondrie s tubulami, cisterny agranulovaného endoplazmatického retikula, glykogén a početné tukové vakuoly, ktoré sa zlievali a dodávali bunkám penovitú štruktúru. Prítomnosť glykogénu a veľkých tukových vakuol v cytoplazme Leydigových buniek svedčila o inhibícii ich steroidogenézy. Na 42., 49. a 56. deň hypodynamie bol mikroskopický obraz v semenníkoch kontrolných kohútikov veľmi podobný ako sme ho opísali vyššie. V niektorých semenotvorných kanálikoch 5

7 sa nachádzalo veľmi veľa dozrievajúcich spermatíd. V kanálikoch prisemenníka a v semenovode boli prítomné enormné masy spermií. Aj v semenníkoch pokusných kohútikov sme pozorovali jednotlivé vývojové štádiá buniek semenotvorného epitelu, ktoré svedčia o priebehu spermatogenézy. V jednotlivých semenotvorných kanálikoch sme nachádzali zoskupenia zárodočných buniek na rozličnom stupni vývoja, čo potvrdzuje vlnovitý priebeh spermatogenézy. Pri všetkých vývojových štádiách bol typický nález prázdnych priestorov medzi bunkami semenotvorného epitelu. V lúmene semenotvorných kanálikov sa nachádzali aj odlúpnuté nezrelé bunky semenotvorného epitelu. V kanálikoch prisemenníka sa nachádzali spermie, avšak v porovnaní s kontrolou ich bolo výrazne menej. Jednotlivé bunky semenotvorného epitelu v štádiách mitózy, meiózy a metamorfózy sme pozorovali aj v semenníkoch pokusných kohútikov. Ich štruktúra nebola výrazne porušená. V cytoplazme niektorých spermatogónií, spermatocytov a okrúhlych spermatíd sme nachádzali vakuoly. Jadro niektorých spermatocytov malo nepravidelný tvar a jadrová membrána bola zvlnená. Diferencujúce sa spermatídy nejavili výrazné známky poškodenia. Bičíky vyvíjajúcich sa spermatíd s komplexom osových vláken mali charakteristické usporiadanie, pozostávali z dvoch centrálnych mikrotubulov a koncentricky usporiadaných deviatich dvojíc vláken dupletov. Na povrchu boli obalené súvislou, avšak v dôsledku fixácie zvlnenou cytoplazmatickou membránou. V interstíciu sa v blízkosti krvných kapilár nachádzali Leydigove bunky s typickými mitochondriami tubulárneho typu a cisternami agranulovaného endoplazmatického retikula. Avšak sporadicky sme nachádzali aj tmavé odumierajúce Leydigove bunky s tmavým scvrknutým jadrom, tukovými vakuolami a mitochondriami s tenkými mitochondriovými priehradkami. Mikroskopickou analýzou pomocou priamej TUNEL reakcie sme potvrdili, že Leydigove bunky odumierali formou apoptózy. Morfometrickou analýzou semenníkov sme zaznamenali výrazné zníženie hmotnosti semenníkov kohútikov odchovaných v podmienkach hypodynamie a to najmä na 28., 35. a 42. a 49. deň hypodynamie, kedy sme zistili aj menší priemer semenotvorných kanálikov a nižšiu priemernú výšku semenotvorného epitelu. Signifikantný pokles telesnej hmotnosti pokusných prepelíc sme pozorovali vo všetkých sledovaných obdobiach trvania hypodynamie. V porovnaní s kontrolou sme zaznamenali priemerné zníženie hmotnosti o 29,38%. Najvýraznejšie zníženie telesnej hmotnosti sme pozorovali na 42. a 49. deň hypodynamie. Aj keď sme v našich pokusoch priamo nesledovali príjem krmiva pokusných a kontrolných zvierat, naše údaje sú v súlade s pozorovaniami Škrobáneka a kol. (2004), ktorí zaznamenali až 34% zníženie telesnej hmotnosti v porovnaní s kontrolou. Vplyvy samotného kozmického letu mikrogravitácie a hypokinézy ako aj simulovaných podmienok hypodynamie na reprodukčné funkcie samcov sú málo objasnené. Veľká časť prác sa zameriava na sledovanie fyziologických parametrov, pričom morfologické aspekty ostávajú neobjasnené. Vo všeobecnosti môžeme konštatovať, že výsledky prác týkajúce sa tejto problematiky sú výrazne protichodné. Denisova a kol. (1988) študovali semenníky potkanov po 7 dňovom kozmickom lete, ktorý nemal negatívny dopad na sledované orgány. Plakhuta Plakutina a kol.(1977) pozorovali, že v semenníkoch potkanov nevznikajú výraznejšie zmeny ani po 22 dňovom pobyte v kozme. Naopak Baikova (1988) zistila negatívny dopad na pohlavné orgány samcov už po 7 dňovom pobyte potkanov v kozme. Okrem týchto morfologických zmien v semenníkoch a porúch spermatogenézy zistila aj zmeny v hladinách pohlavných hormónov, najmä pokles koncentrácie sérového testosterónu a prolaktínu a napoak vzrast sérového FSH a LH. Tash a kol. (2002), ktorí pri sledovaní testikulárnych funkcií samcov dospelých potkanov zaznamenali po 6 týždňovej hypodynamii morfologické abnormality na semenotvornom epiteli, ale Leydigove bunky, obsah testosterónu v semenníkoch a hladiny FSH a LH v sére neboli oproti kontrole výrazne zmenené. Rozsiahlejšie letové experimenty robili Kaplanskij a kol. (2003), pričom zaznamenali pokles hladín hlavných anabolických hormónov STH a testosterónu v sére potkanov, a vyslovili názor, že redukcia produkcie týchto hormónov je jednou z hlavných príčin zaostávania rastu potkanov, prevahy katabolizmu a následne svalovej atrofie a osteopénie. Pri modeli zavesenia potkanov za chvost (RTS) tiež došlo k supresii aktivity somatotropínov, kým funkčná aktivita a koncentrácie gonadotropínov 6

8 paradoxne prudko vzrástli. Deaver a kol. (1992) to potvrdili aj tým, že napriek dezintegrácii semenotvorného epitelu došlo k proliferácii Leydigových buniek semenníka. K podobným zisteniam dospeli aj Kamiya a kol. (2003) a Sasaki a kol. (2004). My sa prikláňame k názorom autorov Cigánková a kol. (2001, 2002, 2005) a Škrobáneka a kol. (2001, 2003), ktorí mnohé neuroendokrinné zmeny v organizme vznikajúce či už pri reálnom kozmickom lete, alebo hypodynamii na Zemi pripisujú stresu ako adaptačnému mechanizmu pri záťaži a sú považované za reverzibilné. Pozorovanie vplyvu simulovanej alebo reálnej mikrogravitácie na štruktúru semenníkov je v podstate obmedzené na potkany a myši ako cicavčí model a náš aviárny model, ho veľmi vhodne dopĺňa a sčasti sa môže aplikovať aj na človeka. Záver Z našich pozorovaní môžeme usúdiť, že dlhodobá (28 až 63 dňová) hypodynamia pôsobila nepriaznivo na vývoj a štruktúru semenníkov a tým na pohlavné dospievanie kohútikov japonských prepelíc a ich reprodukčné funkcie. Predpokladáme, že morfologické zmeny vznikli ako následok stresu z hypodynamie, sú reverzibilné a japonské prepelice sa v týchto špecifických záťažových podmienkach dokážu adaptovať. Práca bola finančne podporená Grantovou agentúrou VEGA 1/3495/06 Literatúra 1. Boďa K.: Kozmická biológia. Gravitačná fyziológia. Vydavateľstvo SAV, Košice, 1984, s Cigánková V., Lenhardt Ľ., Zibrín M., Kočišová J., Tomajková E., Komorová T., Sabo V., Boďa K., Dadasheva O.A., Guryeva T.S.: Folia Veter., 2001, 45, 1, Suppl., Cigánková V., Zibrín M., Kočišová J., Tomajková E., Sabo V., Boďa K., Dadasheva, O.A., Guryeva, T.S.: Aviakosm. Ekolog. Med., 2002, 36, 5, Cigánková V., Zibrín M., Boďa K., Holovská K.: Bull. Vet. Inst. Pulawy 49, 2005, Deaver D.R., Ammann R.P., Hammerstedt R.H., Ball R., Veeramachaneni D.N., Mussacchia X.J.: J. Androl. 13, 3, 1992, Denisova L.A., Tikhonova G.P., Apanasenko Z.I., Pustynnikova A.M.., Ivanov I.V.: Kosm. Biol. Aviakosm. Med. 22, 6, 1988, Kamiya H., Sasaki S., Ikeuchi T., Umemoto Y., Tatsura H., Hayashi Y., Kaneko S., Kohri K.: J. Androl. 24, 6, 2003, Kaplanskii A.S., Alekseev E.I., Loginov V.I. : Aviakosm. Ekol. Med , 2003, PlakhutaPlakutina G.I.: State of spermatogenesis in rats flown aboard the biosatellite Cosmos690. Aviat. Space Environ. Med. 48, 1, 1977, Sasaki S, Ikeuchi T., Kamiya H., Kojima Y., Umemoto Y., Kohri K.: Hinyokika Kiyo 50, 8, 2004, Škrobánek P., Sabo V., Boďa K., Baranovská M., Mravcová M.: The capacity of Japanese quail hatchlings to adapt to hypodynamie. Folia Vet. 45, 1, 2001, Škrobánek P., Hrančová M.: Adaptability of Japanese quail chicks to conditions of simulated weightlessness. Acta Vet. Brno 72, 2003, Škrobánek P., Hrbatá M., Baranovská M, Juráni M.: Acta Vet. Brno 73, 2004, Tash J.S., Johnson D.C., Enders G.C.: J.Appl. Physiol. 92., 3, 2002, Viera Almášiová, MVDr., Univerzita veterinárskeho lekárstva, Ústav histológie a embryológie, Komenského 73, Košice, [email protected] 7

9 OBSAH NIEKTORÝCH ANORGANICKÝCH KONTAMINANTOV A VYBRANÉ MIKROBIOLOGICKÉ UKAZOVATELE KVALITY MÄSA PSTRUHA DÚHOVÉHO (ONCORHYNCHUS MYKISS) Z FARMOVÉHO CHOVU CONTENT OF SOME INORGANIC POLLUTANTS AND SELECTED MICROBIOLOGICAL INDICATORS OFMEAT QUALITY OF RAINBOW TROUT (ONCORHYNCHUS MYKISS) FROM THE FISH FARM Andreji J., Stráňai I., Kačániová M*., Naď P**., Skalická M**. Slovenská poľnohospodárska univerzita v Nitre, Fakulta agrobiológie a potravinových zdrojov, Katedra hydinárstva a malých hospodárskych zvierat, Tr. A. Hlinku 2, Nitra, *Slovenská poľnohospodárska univerzita v Nitre, Fakulta biotechnológie a potravinárstva, Katedra mikrobiológie, Tr. A. Hlinku 2, Nitra **Univerzita veterinárskeho lekárstva v Košiciach, Ústav výživy, dietetiky a krmovinárstva, Komenského 73, Košice Abstract The aim of this study was to assess concentration and correlation of selected heavy metals and level of some microbiological indicators (total bacteria count TBC, mesophilic anaerobic sporulating microorganisms MASM, coliforms bacteria CB and Vibrio parahaemolyticus VP) in the muscle of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). The fish were collected from trout fish farm in July, Concentrations of selected metals were measured using an atomic absorption spectrophotometer Pye Unicam SP9. The concentrations of metals (mg.kg 1 wet weight basis) ranged as follows: Zn ; Cu ; Ni ; Pb ; and Cd The count of CB, MASB and TBC (in CFU.g 1 ) varied as follow: x 10 3, x 10 4 and x 10 5, respectively. Significant positive correlations (P<0.001) between accumulation of Pb Cd and TBC MASM were recorded. Relationship between microbiological indicators and heavy metals accumulation showed in majority a negative correlations without statistically significant differences. Copper, lead and cadmium concentrations exceeded the maximum values allowed concentration in Slovakia by Codex Alimentarius (20.0; 0.2 and 0.05 mg.kg 1 ) by 100%, 27% and 60%, respectively. The level of MASM count exceeded the maximum allowed concentration (10 2 CFU.g 1 ) in 100%. Key words: Heavy metals; Accumulation; Oncorhynchus mykiss; Slovakia; Microbiological quality; Úvod Pstruh dúhový je dominantným druhom chovaným farmovým spôsobom na Slovensku, aj keď nepatrí medzi najviac lovené a konzumované ryby športovými rybármi. Jeho mäso sa svojim zložením a vlastnosťami radí medzi kvalitné druhy mias. Aj napriek týmto všeobecne známym vlastnostiam, konzumácia rybieho mäsa sa takmer dve desaťročia drží na rovnakej úrovni okolo 4 kg/osobu/rok, pričom ani zďaleka nedosahuje odporúčanú spotrebu 6 kg/osobu/rok. Na strane druhej sa aj v mäse pstruha môžu vyskytovať niektoré reziduá ako dôsledok akumulácie rôznych kontaminantov, ktoré prenikajú do organizmu z vodného prostredia alebo potravy a takto sa sekundárne môže kontaminovať konečný konzument, čiže človek. Ďalším potenciálnym rizikom pre konzumenta je mikrobiálna kontaminácia pri samotnom spracovaní mäsa. Mäso (svaly) a vnútorné orgány zdravých, čerstvých rýb sú zvyčajne sterilné, ale koža a tráviaci trakt rýb obsahujú množstvo baktérií, ktoré najčastejšie pri pitvaní prenikajú do mäsa (Adams a Moss, 2002). Cieľom našej práce bolo stanoviť koncentrácie niektorých anorganických kontaminantov zo skupiny ťažkých kovov a vybrané mikrobiologické ukazovatele kvality mäsa pstruha dúhového 8

10 pochádzajúceho z farmového chovu. Zistiť závislosti medzi jednotlivými kovmi a mikroorganizmami a či dochádza ku vzájomnej interakcii medzi obsahom ťažkých kovov a mikroorganizmami. Materiál a metodika Pstruhy boli získané priamo z farmy v Skačanoch (okres Partizánske) v júli 2005 a v živom stave boli transportované do laboratória, kde sa urobilo základné biometrické vyšetrenie a determinácia veku podľa šupín. Následne sa z každého kusa odobrala vzorka svaloviny z oblasti chrbta v množstve 2 3 g na stanovenie obsahu cudzorodých látok (Fe, Mn, Zn, Cu, Co, Ni, Cr, Pb a Cd) a g pre mikrobiologické analýzy. Vzorky svaloviny pre analýzu ťažkých kovov boli mineralizované za použitia roztoku HNO 3 (2:1) pri 130 C počas 2 hod. Samotné stanovenie obsahu jednotlivých ťažkých kovov bolo vykonané na atómovom absorpčnom spektrofotometri Pye Unicam SP9 (Andreji et al., 2005). Uvádzané hodnoty sú vyjadrené v mg.kg 1 čerstvej hmoty. Vzorky svaloviny určené pre mikrobiologické vyšetrenie boli zhomogenizované a nariedené fyziologickým roztokom (1:10) a následne ďalším riediacim roztokom (1:10). Z mikrobiologických ukazovateľov sme sledovali celkový počet mikroorganizmov (CPM) na GTK agare pri teplote 30 C počas 4872 hodín, počet koliformných baktérií (KB) na VČŽL agare pri teplote 37 C počas 2448 hodín, počet baktérií Vibrio parahaemolyticus (VP) sme sledovali na Vibrio parahaemolyticus sucrose agare pri teplote 42 C počas 1820 hodín a počet mezofilných anaeróbne sporulujúcich mikroorganizmov (MASM) na MPA agare pri teplote 25 C počas 4872 hodín v anaeróbnych podmienkach (Andreji et al. 2006). Zistené hodnoty sú vyjadrené v CFU.g 1 (kolónie tvoriace jednotky). Zistené výsledky sa štatisticky vyhodnotili programom Statgraphics Plus v lineárnym regresným modelom. Výsledky a diskusia Analyzované pstruhy dúhové (n = 15) boli vo veku 1+ a dosahovali dĺžku tela v rozpätí mm (priemer 265,5 mm) a hmotnosť g (priemer 263 g). Zistené koncentrácie jednotlivých ťažkých kovov a hodnoty sledovaných mikrobiologických indikátorov kvality svaloviny sú uvedené v tabuľke 1. Vzájomné interakcie medzi sledovanými koncentráciami ťažkých kovov ako aj mikrobiologickými indikátormi sú uvedené v tabuľke 2. Spomedzi všetkých nami analyzovaných kovov sa v súčasnosti najvyššie prípustné množstvo (NPM) definované v Potravinovom kódexe SR vzťahuje len na Cu, Ni, Pb a Cd. V prípade niklu NPM (0,5 mg.kg 1 ) nebolo prekročené. Iná situácia však bola zaznamenaná u medi, olova a kadmia. V prípade medi bolo prekročenie NPM (10,0 mg.kg 1 ) zistené u všetkých analyzovaných vzoriek (100 %) v rozmedzí 1,03 1,85 krát; u olova bolo prekročenie NPM (0,2 mg.kg 1 ) zaznamenané u 4 vzoriek (27 %) a to 1,18 2,77 násobne; u kadmia bolo prekročenie NPM (0,05 mg.kg 1 ) zaznamenané u 9 vzoriek (60 %), čo predstavuje 1,02 5,62 násobok NPM (tab. 1). Štatisticky významná (P<0,001) pozitívna korelácia bola zistená len medzi Pb Cd (tab. 2). Tab. 1. Koncentrácie jednotlivých ťažkých kovov a hodnoty mikrobiologických ukazovateľov v svalovine pstruha dúhového (mg.kg 1, resp. KTJ.g 1 ). Zn Cu Ni Pb Cd KB * MASM ** CPM *** VP Priemer 58,99 23,90 0,08 0,17 0,09 0,90 3,81 4,82 0,00 SD 38,49 4,84 0,07 0,17 0,07 0,81 0,81 0,55 0,00 min 22,21 20,66 0,00 0,01 0,01 0,00 2,54 4,01 0,00 max 138,00 37,08 0,19 0,55 0,28 2,11 5,65 5,74 0,00 KB koliformné baktérie, MASM mesofilné anaeróbne sporulujúce baktérie, CPM celkový počet mikroorganizmov, VP Vibrio parahaemolyticum, * 103 KTJ.g1, ** 104 KTJ.g1, *** 105 KTJ.g1 9

11 Pokiaľ ide o mikrobiologické ukazovatele, Potravinový kódex SR pre čerstvé a mrazené ryby (ryby morské a sladkovodné) sa vzťahuje len na počet mezofilných anaeróbne sporulujúcich mikroorganizmov (MASM) a Vibrio parahaemolyticus (VP). Maximálne prípustný počet MASM je 10 2 KTJ.g 1, resp. 0 KTJ.g 1 pre VP. Hraničné hodnoty počtu MASB boli prekročené vo všetkých analyzovaných vzorkách v rozpätí krát, v prípade Vibrio parahaemolyticus k prekročeniu nedošlo. Taktiež prítomnosť koliformných baktérií v 60 % analyzovaných vzoriek nasvedčuje o mikrobiálnej kontaminácii mäsa, ku ktorému mohlo dôjsť v dôsledku zlyhania ľudského faktoru (nesprávna manipulácia), kontamináciou v laboratóriu, alebo prestupom z tráviaceho traktu v dôsledku jeho poškodenia (Kačániová a Petrová, 2006). Medzi jednotlivými mikrobiologickými ukazovateľmi sa štatisticky významný vzťah (P<0,001) potvrdil len v prípade CPM MASM bol zistený pozitívny korelačný vzťah. Pokiaľ ide o vzájomnú interakciu medzi jednotlivými ťažkými kovmi a skupinami mikroorganizmov, tak v prípade koliformných baktérii a MASM dominoval väčšinou negatívny korelačný vzťah. Celkový počet mikroorganizmov vykazoval v porovnaní s ostatnými skupinami mikroorganizmov opačný trend. Avšak vo všetkých prípadoch išlo o závislosti bez štatisticky významných rozdielov (P>0,05). Tab. 2. Hodnoty korelačných koeficientov závislosti koncentrácií jednotlivých kovov a mikrobiologických indikátorov. Zn Cu Ni Pb Cd KB MASM CPM Zn Cu 0,513 Ni 0,081 0,239 Pb 0,071 0,164 0,296 Cd 0,127 0,211 0,014 0,814 *** CB 0,013 0,076 0,367 0,462 0,462 MASM 0,223 0,056 0,100 0,105 0,459 TBC 0,145 0,115 0,224 0,046 *** P<0,001 0,084 0,400 0,082 0,770 *** Záver Záverečným šetrením sme zisti, že analyzovaná svalovina pstruha dúhového prekročila NPM pre meď, olovo a kadmium, ako aj počet MASM. Na základe týchto výsledkov by sa svalovina ako taká nemala vôbec konzumovať. Tu sa však naskytá otázka odkiaľ sa nabrali tak vysoké koncentrácie ťažkých kovov, keďže farma je na podhorskom potoku a mimo priemyselnej zóny a navyše je pod veterinárnym dozorom. Vysvetlenie sa čiastočne naskytá v tom, že chovateľ nakupuje násadu pstruha dúhového, ktorá už môže byť potenciálne kontaminovaná, poprípade je zdrojom kontaminácie krmivo, alebo ide o reziduá minulosti (sklársky priemysel). V prípade kontaminovaného krmiva by sa aj nepriamo potvrdil výskyt koliformných baktérií, resp. ich penetrácia cez zažívací trakt až do svaloviny, či už v dôsledku mechanického poškodenia alebo fyziologických zmien. Tento príspevok vznikol vďaka finančnej podpore grantovej agentúry Ministerstva školstva SR VEGA 1/2417/05. Literatúra ADAMS, M. MOSS, M.O Food microbiology. Cambridge : The royal Society of chemistry, 6. vydanie, 2002, 479 s., ISBN

12 ANDREJI, J. STRÁŇAI, I. MASSÁNYI, P. VALENT, M Concentration of Selected Metals in Muscle of Various Fish Species. In: Journal of Environmental Science and Health, Part A: Toxic/Hazardous Substances & Environmental Engineering, 40 (4), 2005, s ANDREJI, J. STRÁŇAI, I. KAČÁNIOVÁ, M. MASSÁNYI, P. VALENT, M Heavy Metals Content and Microbiological Quality of Carp (Cyprinus carpio) Muscle from Two Southwestern Slovak Fish Farms. In: Journal of Environmental Science and Health, Part A: Toxic/Hazardous Substances & Environmental Engineering, 41 (6), 2006, s KAČÁNIOVÁ, M. PETROVÁ, J Mikrobiologická kvalita mäsa rýb. In: Kováčik, J. et al Biologické aspekty zvyšovania kvality surovín a potravín živočíšneho pôvodu. SPU Nitra, 2006, s POTRAVINOVÝ KÓDEX SR Výnos MP SR a MZ SR z 15. marca 2004 č. 608/3/ , ktorým sa vydáva hlava Potravinového kódexu Slovenskej republiky upravujúca cudzorodé látky v potravinách. In: Vestník MP SR, 2004, roč. XXXVI, čiastka 10 I. časť Adresy autorov: Ing. Jaroslav Andreji ([email protected]), doc. Ing. Ivan Stráňai, CSc., Slovenská poľnohospodárska univerzita v Nitre, Fakulta agrobiológie a potravinových zdrojov, Katedra hydinárstva a malých hospodárskych zvierat, Tr. A. Hlinku 2, Nitra, doc. Ing. Miroslava Kačániová, PhD., Slovenská poľnohospodárska univerzita v Nitre, Fakulta biotechnológie a potravinárstva, Katedra mikrobiológie, Tr. A. Hlinku 2, Nitra MVDr. Pavel Naď, PhD., MVDr. Magdaléna Skalická, PhD., Univerzita veterinárskeho lekárstva v Košiciach, Ústav výživy, dietetiky a krmovinárstva, Komenského 73, Košice VPLYV EXPERIMENTÁLNEHO PODANIA NIKLU NA KVALITU ŽĹTKA A HMOTNOSŤ VAJEC EFFECT OF EXPERIMENTAL ADMINISTRATION OF NICKEL ON EGG WEIGHT AND EGG YOLK QUALITY OF MARKET EGGS Arpášová, H., Massányi, P., Capcarová, M., Kolesárová, A., Kalafová, A., Schneidgenová, M., Lukáč, N. Slovenská poľnohospodárska univerzita Abstrakt Do experimentu bolo zaradených 20 nosníc znáškového hybrida Isa brown vo veku 53 týždňov. Pokusné nosnice boli ustajnené v konvenčnej trojetážovej klietkovej batérii, kŕmené boli ad libitum, kompletnou kŕmnou zmesou pre chov nosníc na produkciu konzumných vajec HYD 10. Sliepky boli rozdelené do 4 skupín. V kontrolnej skupine zvieratá prijímali pitnú vodu bez akýchkoľvek prídavkov, v pokusných skupinách bol do pitnej vody pridaný NiCl 2 v rôznych koncentráciách. V pokusnej skupine P1 v koncentrácii 0,02 g.l 1, v pokusnej skupine P2 v koncentrácii 0,2 g.l 1 a v pokusnej skupine P3 v koncentrácii 2 g.l 1. Vo všetkých skupinách prijímali sliepky pitnú vodu ad libitum. Sledované ukazovatele : hmotnosť vajec, hmotnosť žĺtka, percentuálny podiel žĺtka, index žĺtka, farba žĺtka. Pokus trval 30 dní. Najvýraznejšie rozdiely v priebehu pokusu aj pri priemernom vyhodnotení boli zaznamenané u hmotnosti vajec a hmotnosti žĺtka medzi kontrolnou skupinou K a pokusnou skupinou P3 s najvyššou koncentráciou niklu (2 g.l 1 ). Hmotnosť vajec bola v poradí skupín : 62,26; 59,11;64,90; 50,97 g. Pri hmotnosti vajec bol veľmi vysoko významný rozdiel (P 0,001) medzi skupinou P3 a všetkými ostatnými skupinami a vysoko významný rozdiel (P 0,01) medzi skupinami P1 : P2. Hmotnosť žĺtka bola v poradí skupín : 17,54; 16,24; 16,86; 14,40 g. Pri štatistickom vyhodnotení bol zaevidovaný veľmi vysoko významný rozdiel (P 0,001) medzi skupinami P3 : K, vysoko významný rozdiel (P 0,01) medzi skupinami P3 : P2 a významný 11

13 rozdiel (P 0,05) medzi skupinami P1 : P3.V percentuálnom podiele žĺtka a v indexe žĺtka boli rozdiely medzi skupinami zo štatistického hľadiska nevýznamné (P>0,05). Farba žĺtka bola v poradí skupín : 6,80; 6,60; 7,13; 6,80 HLR, významný rozdiel (P 0,05) bol medzi skupinami P2: P1. Abstract The experiment was implemented on the efficient Isa brown laying hens producing brown shell eggs. We used 20 selected 53 weeks old hens. Three level cages were used for the stabling of experimental hens. Laying hens were divided into four groups, 5 fowls in each. Laying hens in each group had approximately the same body weight. The hens were fed by the standard feed mixture HYD10. Laying hens accepted fodder ad libitum. In control group C hens taked drinking water without additions, in experimental groups was supplement in the drinking water NiCl 2 in different concentrations. In experimental group E1 in concentration 0.02g.l 1 in experimental group E2 in concentration 0.2g.l 1 and in experimental group E3 in concentration 2g.l 1. In all groups laying hens accepted drinking water ad libitum. The experiment lasted 30 days. The egg weight was in order groups: 62.26; 59.11;64.90; 50.97g. The greatest differences during experiment were achieved between control group C and experimental group E3 with the highest concentration 2 g.l 1 nickel. By evaluation of egg weight were found very hight significant differences (P 0.001) among experimental group E3 and all other groups, hight significant difference (P 0.01) between experimental groups E3:E2. The egg yolk weight was in the order groups: 17.54; 16.24; 16.86; g. The lowest value of egg yolk weight was in the experimental group E3. By evaluation of egg yolk weight was found very hight significant difference (P 0.001) between control group C and experimental group E3, hight significant difference (P 0.01) between experimental groups E3:E2 and significant difference (P 0.05) between experimental groups E1:E3. By evaluation of percentage and egg yolk index were found no significant differences (P>0.05) between control and experimental groups. Úvod Nikel je prvok, ktorý sa zúčastňuje pri tvorbe krvi a ovplyvňuje hladinu inzulínu v krvi. Naviac ho obsahuje pečeň a perie. Jeho toxická dávka je pomerne vysoká a prejavuje sa nechutenstvom, znížením úžitkovosti a vyššou mortalitou. Zlúčeniny dvojmocného niklu sú karcinogénne ako pre ľudí tak aj pre zvieratá (Prokeš et al. 2005). Potrava s nízkym obsahom niklu, menej ako 0,1 mg.kg 1 sušiny vedie k symptómom deficiencie. Na nikel sa môže vytvoriť alergia, vonkajšie vystavovanie sa zliatinám niklu môže spôsobiť zápaly kože a poruchy v metabolizme horčíka a zinku (Anke et al. 1995). Silné pozitívne korelácie medzi hladinami ťažkých kovov v krmive a vo vajciach zistili autori Fakayode et al. (2003). V pokuse autorov Meluzzi et al. (1996) sa hladina niklu vo vajciach zvyšovala predlžovaním sa pokusu, znáška a kvalita vajec boli ťažkými kovmi významne negatívne ovplyvnené. Materiál a metodika Pokusné nosnice znáškového hybrida Isabrown vo veku 53 týždňov boli ustajnené v konvenčnej trojetážovej klietkovej batérii, kŕmené boli ad libitum, kompletnou kŕmnou zmesou pre chov nosníc na produkciu konzumných vajec HYD 10. Do experimentu bolo zaradených 20 nosníc, ktoré boli rozdelené do 4 skupín. V kontrolnej skupine zvieratá prijímali pitnú vodu bez akýchkoľvek prídavkov, v pokusných skupinách bol do pitnej vody pridaný NiCl 2 v rôznych koncentráciách. V pokusnej skupine P1 v koncentrácii 0,02 g.l 1, v pokusnej skupine P2 v koncentrácii 0,2 g.l 1 a v pokusnej skupine P3 v koncentrácii 2 g.l 1. Vo všetkých skupinách prijímali sliepky pitnú vodu ad libitum. Sledované ukazovatele : hmotnosť vajec, hmotnosť žĺtka, percentuálny podiel žĺtka, index žĺtka, farba žĺtka. V závere pokusu bola uskutočnená kompletná analýza vajec, analyzovaných bolo po 15 vajec z každej skupiny. V skupine P3 s najvyššou koncentráciou niklu bol počet vajec nižší, nakoľko vplyvom vysokej dávky sa u väčšiny sliepok v skupine znáška zastavila, prípadne znášali neštandardné vajcia. Rozdiely medzi jednotlivými ukazovateľmi v rámci pozorovaných skupín boli testované 12

14 jednofaktorovou analýzou variancie jednostupňového triedenia. Výsledky jednofaktorovej analýzy variancie boli doplnené Scheffeho testom. Pokus trval 30 dní. Výsledky a diskusia Zmeny hmotnosti vajec sú uvedené v tabuľke 1 a obr. 1. Hmotnosť vajec v jednotlivých skupinách sa v priebehu pokusu najvýraznejšie menila v tretej pokusnej skupine P3, v ktorej bol zaznamenaný najvýraznejší pokles hmotností s pomerne rýchlym zastavením znášky sliepok v tejto skupine. Pri vyhodnotení analyzovaných vajec v tomto ukazovateli je zrejmý pokles hmotnosti vajec od sliepok v jednotlivých skupinách podľa koncentrácie niklu vo vode. V kontrolnej skupine K bola hmotnosť 62,26g, v tretej pokusnej skupine P3 s koncentráciou niklu 2 g.l 1 bol výrazný pokles v porovnaní s kontrolnou skupinou aj s ďalšími pokusnými skupinami, hmotnosť analyzovaných vajec dosiahla len 50,97 g, v pokusnej skupine P2 bola zaznamenaná hmotnosť 64,90 g a v pokusnej skupine P1 bola hmotnosť vajec 59,11 g. Tieto výsledky sa zhodujú s výsledkami autorského kolektívu Meluzzi et al. (1996), ktorí podobne zaznamenali štatisticky významné negatívne ovplyvnenie znášky, hmotnosti vajec aj ich kvality ťažkými kovmi. Pri štatistickom vyhodnotení boli zaevidované veľmi vysoko významné rozdiely (P 0,001) medzi skupinami K : P3; P1 : P3; P2 : P3 a vysoko významné rozdiely (P 0,01) medzi skupinami P1 : P2. Hmotnosť žĺtka (tab.2, obr. 2) bola v poradí skupín : 17,54; 16,24; 16,86; 14,40 g. Ako vyplýva z hodnôt v tabuľke aj z obrázku, najnižšia hmotnosť žĺtka bola v tretej pokusnej skupine P3, čo súvisí s najvýraznejším poklesom hmotností celých vyprodukovaných vajec v skupine P3 s najvyššou koncentráciou niklu (2 g.l 1 ). V ostatných skupinách P2 a P3 s nižšími koncentráciami NiCl 2 boli hmotnosti žĺtkov nižšie ako v kontrolnej skupine, hmotnostné rozdiely žĺtkov neboli tak výrazné v porovnaní s kontrolnou skupinou ako je to zrejmé z výsledkov v skupine P3. Pri štatistickom vyhodnotení bol zaevidovaný veľmi vysoko významný rozdiel (P 0,001) medzi skupinami P3 : K, vysoko významný rozdiel (P 0,01) medzi skupinami P3 : P2 a významný rozdiel (P 0,05) medzi skupinami P1 : P3. Ako vyplýva z obrázku a z tabuľkových hodnôt (tab.3, obr. 3), v percentuálnom podiele žĺtka z hmotnosti celého vajca boli hodnoty v pokusnej skupine P3 s najvyššou koncentráciou niklu takmer zhodné s kontrolnou skupinou, len mierne nižší percentuálny podiel žĺtka bol v skupinách P2 (26,08 %) a P1 (27,50 %) čomu zodpovedá aj vyhodnotenie štatistickej významnosti rozdielov, ktoré boli medzi všetkými kombináciami skupín nevýznamné (P>0,05). V indexe žĺtka (tab.4, obr.4) boli hodnoty v poradí skupín : 45,96; 48,20; 46,87; 45,15. Podobne ako tomu bolo pri bielku, ani pri žĺtku nebol významný vplyv ani jednej koncentrácie niklu na zmeny tvaru, medzi všetkými kombináciami skupín bol rozdiel štatisticky nevýznamný (P>0,05). Farba žĺtka (tab.5, obr. 5) bola v poradí skupín : 6,80; 6,60; 7,13; 6,80 HLR, významný rozdiel (P 0,05) bol medzi skupinami P2 : P1. Tabuľka 1 Zmeny hmotnosti vajec (g) počas experimentu Ukazovateľ Skupina K P1(0,02 g.l 1 ) P2 (0,2g.l 1 ) P3 (2 g.l 1 ) x 62,26 59,11 64,90 50,97* SD 4,85 2,45 3,94 3,03 Hmotnosť vajca (g) CV 7,79 4,14 6,07 5,95 min 55,5 54,0 56,8 47,5 max 70,8 64,1 73,1 56,5 Hmotnosť vajca: *P 0,01 (P1 P2); P 0,001 (P3 K, P1, P2) 13

15 Obrázok 1 Dynamika zmien hmotnosti vajec 80 hm otnos ť vaj e c (g) K P1 P2 P3 Tabuľka 2 Zmeny hmotnosti žĺtka vajec (g) počas experimentu Skupina Ukazovateľ K P1(0,02 g.l 1 ) P2 (0,2 g.l 1 ) P3 (2 g.l 1 ) x 17,54 16,24* 16,86 14,40* SD 1,99 0,89 1,41 0,87 Hmotnosť žĺtka CV 11,33 5,49 8,36 6,03 (g) min 13,9 15,3 13,3 12,9 max 21,9 18,1 18,8 15,2 Hmotnosť žĺtka: *p<0,05 (P1 P3); p<0,01 (P3 P2); p<0,001 (P3 K) Obrázok 2 Dynamika zmien hmotnosti žĺtka hmot nosť žĺ tka ( g) K P1 P2 P3 skupiny 17,54 16,24 16,86 14,4 Tabuľka 3 Zmeny percentuálneho podielu žĺtka vajec (%) počas experimentu Ukazovateľ Percentuálny podiel žĺtka (%) Skupina K P1(0,02 g.l 1 ) P2 (0,2 g.l 1 ) P3 (2 g.l 1 ) x 28,13 27,50 26,08 28,29 SD 1,50 1,57 2,82 1,56 CV 5,34 5,70 10,80 5,51 min 24,87 24,65 20,00 26,33 max 30,93 31,09 30,63 30,38 14

16 Obrázok 3 Dynamika zmien percentuálneho podielu žĺtka percentuálny podiel žĺtka (%) K P1 P2 P3 skupiny 28,126 27,51 26,078 28,29 Tabuľka 4 Zmeny indexu žĺtka počas experimentu Ukazovateľ Index žĺtka Skupina K P1(0,02 g.l1) P2 (0, 2 g.l1) P3 (2 g.l1) x 45,96 48,20 46,87 45,15 SD 3,85 3,20 3,95 2,78 CV 8,39 6,64 8,43 6,15 min 40,48 42,86 39,53 39,02 max 52,63 55,56 55,26 47,37 Obrázok 4 Dynamika zmien indexu žĺtka 50 index žĺtka K P1 P2 P3 skupiny 45,96 48,2 46,87 45,15 Tabuľka 5 Zmeny farby žĺtka ( HLR) počas experimentu Ukazovateľ Skupina K P1(0,02 g.l1) P2 (0,2 g.l1) P3 (2 g.l1) x 6,80 6,60 7,13* 6,80 SD 0,41 0,51 0,52 0,42 Farba žĺtka CV 6,09 7,68 7,23 6,19 ( HLR) min max Farba žĺtka: *p<0,05 (P2 P1) 15

17 Obrázok 5 Dynamika zmien farby žĺtka farba žĺ tka ( HLR) 7,2 7 6,8 6,6 6,4 6,2 K P1 P2 P3 skupiny 6,8 6,6 7,13 6,8 Záver V priebehu pokusu bol sledovaný vplyv prídavku niklu v rôznych koncentráciách (0,02 g.l 1 ; 0,2 g.l 1 a 2 g.l 1 ;) na zmeny hmotnosti vajec a ukazovateľov kvality žĺtka hmotnosti žĺtka, percentuálneho podielu žĺtka, indexu žĺtka a farby žĺtka sliepok hnedovaječného znáškového hybrida Isa brown. Najvýraznejšie rozdiely v priebehu pokusu aj pri priemernom vyhodnotení boli zaznamenané u hmotnosti vajec medzi kontrolnou skupinou K a pokusnou skupinou P3 s najvyššou koncentráciou niklu (2 g.l 1 ). Ako vyplýva z hodnôt v tabuľke aj z obrázku, najnižšia hmotnosť žĺtka bola v tretej pokusnej skupine P3. Pri štatistickom vyhodnotení bol zaevidovaný veľmi vysoko významný rozdiel (P 0,001) medzi skupinami P3 : K, vysoko významný rozdiel (P 0,01) medzi skupinami P3 : P2 a významný rozdiel (P 0,05) medzi skupinami P1 : P3. V percentuálnom podiele žĺtka aj v indexe žĺtka boli rozdiely medzi skupinami zo štatistického hľadiska nevýznamné (P>0,05), pri farbe žĺtka bol významný rozdiel (P 0,05) medzi skupinami P2 a P1. Literatúra ANKE, M. ANGELOW, L. GLEI, M. MULLER, M. ILLING, H The biologial importance of nickel in the foodchain. In Fresenius Journal of Analytical Chemistry. vol. 352, 1995, num FAKAYODE, S. O. OLU OWOLABI, I. B Trace metal content and estimated daily human intake from chicken eggs in Ibadan, In Archives of Enviremantal Health, vol. 58, 2003, num. 4, p MELUZZI, A. SIMONCINI, F. SIRRI, F. VANDI, L. GIORDANI, G Feeding hens diets supplemented with heavy metals (chromium, nickel and lead). In Archiv fúr Geglugelkunde, vol. 60, 1996, num. 3, p PROKEŠ, J. et al. Základy toxikologie. Praha : Galen, ISBN X. 247 s. 16

18 KONTAMINÁCIA PÔDY Cd, Pb, Zn A Co PRI OBCI HONTIANSKE NEMCE THE SOIL CONTAMINATION WITH Cd, Pb, Zn AND Co BY THE HONTIANSKE NEMCE VILLAGE Árvay, J., Bajčan, D., Čéry, J., Musilová, J. Katedra chémie, Fakulta biotechnológie a potravinárstva, Slovenská poľnohospodárska univerzita v Nitre, Tr. A. Hlinku 2, Nitra, Slovenská republika Abstract The aim of this work is to show the importance of monitoring and of soil hygienic quality evaluation in Slovak Republic area. In the past, when on ecology was not such an emphasis, as it is nowadays, there was an uncontrolled emission of pollutants from different fields of anthropic activities. The consequences are manifested also nowadays, but immediate and expensive solutions are needed. In this work are presented the results of soil contamination research range of monitored locality Štiavnica Hills by heavy metals and their availability for plants in dependance at soil reaction. The chose of this locality relates with specifity of mentioned area, which is characteristic by antropic, but also natural (geochemical) contamination. In al l soil samples the analyses of water and changeable reaction were realiz ed. Als o the analyses on the heavy metals content in the leach of aqua regia (pseudototal leach). The results were prepared into content maps with software ArcView 3.2. As the result colourful maps showing content variability of elements on monitored area are presented. From the results flows that on monitored parcel no. 3603/1 ph KCl is in the range of weak and extremely acid and by all elements the valid hygienic limit determined by legislative norm 220/2004. Key words: soil contamination, heavy metals, mobility, alluvium, agricultural products quality, Úvod Štiavnické vrchy boli už v minulosti výbornou lokalitou na štúdium obsahov ťažkých kovov v pôdnych a rastlinných vzorkách. Oblasť je charakteristická častým výskytom hydrotermálne premene ných hornín obsahujúcich impregnácie sulfidov najmä pyritu, chalkopyritu, galenitu a pod. Z historického hľadis ka je región Štiavnických vrchov zaujímavý dlhodobou takmer tisícročnou banskou činnosťou. Táto oblasť je charakteristická dvoma typmi kontaminácie. Prvý je antropický a je spôsob ený ťažbou rúd a ich spracovaním. Druhý typ je prirodzený a je spôsobený zvetrávaním hornín ob sahujúcich sledované ťažké kovy. Úlohou tejto práce je podrobnejšie zhodnotiť hygienický stav sledovanej lokality pozemku a vyvodiť závery, či je alebo nie je sledované územie vhodné na pestovanie poľnohospodárskych produktov, ktoré slúžia na kŕmenie hospodárskych zvierat alebo na výživu ľudí. Materiál a metodika Záujmovou lokalitou bola parcela s identifikačným číslom 3603/1 s lokalizačnými koordinátmi 48 17,747 severnej šírky (φ) a 18 59,050 východnej dĺžky (λ). Západnú stranu pozemku obmýva Štiavnica. Tento pozemok s rozlohou 3,6 ha sme zamerali pomocou príručného navigačného prístroja GPS GARMIN 60 Cx. Následne sme pomocou programu OziExplorer na podklade dvojsekundového rastra v spojniciach vytvorili body odberov pôdnych vzoriek. Tieto body, ktorých bolo celkom 15, sme preniesli do GPS, pomocou ktorého sme sa navigovali na odberné miesta, kde sme odobrali pôdne vzorky z horizontu A (0,00 0,20 m). 17

19 Záverečné spracovanie získaných údajov a vytvorenie obsahových máp sme uskutočnili v prostredí programu ArcView 3.2. Pôdne vzorky boli upravené a následne analyzované na pseudototálny obsah ťažkých kovov v extrakte lúčavky kráľovskej (zákon 220/2004). Zisťovali sme aj výmennú pôdnu reakciu. Limitné hodnoty pre obsah ťažkých kovov vo výluhu lúčavky kráľovskej sú uvedené v tabuľke č. 1. Zelenou farbou sú vyznačené limitné hodnoty, s ktorými sme získané výsledky porovnávali. Tab. 1: Limitné hodnoty rizikových prvkov v poľnohospodárskej pôde podľa zákona 220/2004 (v mg.kg 1 suchej hmoty, rozklad lúčavkou kráľovskou) Pôdny druh Cd Pb Z n Co piesočnatá, hlinitopiesočnatá 0, piesočnatohlinitá, hlinitá 0, ílovitohlinitá, ílovitá, íl 1, Výsledky práce Mobilita, prístupnosť a správanie sa sledovaných ťažkých kovov v pôde ale aj v systéme pôda rastlina je v najväčšej miere závislá od pôdnej reakcie. V tejto práci sme zisťovali hodnotu výmennej pôdnej reakcie ph KCl, ktorá sa pohybovala v intervale 4,73 5,87 čo je možné slovne zhodnotiť ako pôdu slabo až silne kyslú. Plošné vyjadrenie zmien ph na pozemku znázorňuje obrázok č. 1. Obr. 1: Plošné znázornenie hodnôt ph KCl v h orizonte A (0,00 0,20 m) Obsah vybraných ťažkých kovov smel sledovali v extrakte lúčavky kráľovskej, ktorý prezentuje pseudototálny obsah ťažkých kovov v pôde. Pseudototálny z toho dôvodu, že toto extrakčné činidlo nie je schopné rozložiť silikátovú a alumosilikátovú frakciu a teda rizikové prvky obsiahnuté v týchto zložkách pôdy sa do výluhu nedostanú. Intervaly obsahov sledovaných ťažkých kovov vo vzorkách pôdy získaných z extraktu lúčavky kráľovskej sú uvedené v tabuľke č

20 Tab. 2: Obsah ťažkých kovov v extrakte lú čavky kráľovskej a percentuálne prekročenie limitných hodnôt stanovených zákonom 220/2004. Prekročenie Lúčavka limitu kráľovská ( zákon (mg.kg 1 ) 220/2004) (%) Cd 0,94 1,98 0,7 34,28 182,85 prvok Limit (mg.kg 1 ) Pb 55,4 173,4 70 Zn 43,6 163,0 150 Co 11,0 16,8 15 < 147,71 < 8,67 < 12,00 Priestorové znázornenie obsahu sledovaných rizikových prvkov v extrakte lúčavky kráľovskej znázorňujú mapky na obrázkoch 2 až 5. Obr. 2: Plošné znázornenie obsahu kadmia Obr. 3: Plošné znázornenie obsahu olova v horizonte A (0,00 0,20 m) v mg.kg 1 v horizonte A (0,00 0,20 m) v mg.kg 1 Obr. 4: Plošné znázornenie obsahu zinku Obr. 5: Plošné znázornenie obsahu kobaltu v horizonte A (0,00 0,20 m) v mg.kg 1 v horizonte A (0,00 0,20 m) v mg.kg 1 Záver Kontaminácia životného prostredia sa za posledné storočie stala hrozbou, ktorej je potrebné venovať zvýšenú aktívnu pozornosť, ktorá by mala viesť k eliminácií následkov ľudského konania. Úlohou tejto práce bolo čo najlepšie zhodnotiť stav sledovanej lokality pozemku, ktorá sa využíva na produkciu poľnohospodárskych plodín. Hoci sledované územie je podľa získaných výsledkov zaradené medzi rizikové (všetky sledované rizikové prvky mali niekoľkonásobne 19

21 prekročenú limitnú hodnotu stanovenú hygienickými normami) a hygienická kvalita dopestovaných komodít diskutabilná, je potrebné aplikovať také agrotechnické opatrenia, ktoré imobilizujú rizikové kovy v zložkách pôdy a následne zabránia ich prieniku do rastlín. Literatúra TOMÁŠ, J Stopové prvky v životnom prostredí. In : Cudzorodé látky v životnom prostredí. Zborník referátov z III. medzinárodnej konferencie, 2000, SPU Nitra, s , ISBN TÓTH, T. TOMÁŠ, J. LAZOR, P. CHLPÍK, J. JOMOVÁ, K. HEGEDUSOVÁ, A Rizikové prvky v pôdach a plodinách štiavnického regiónu. In : Zborník z 57. zjazdu chemických spoločností. Tatranské Matliare, sept ChemZi, Vol. 1/1, s , ISSN VOLLMANNOVÁ, A., BYSTRICKÁ, J., STANOVIČ, R., BAJČAN, D The risks of rezidual soil metallization in the Slovakia. In: Implementation of Landscape Ecology in New and Changing Conditions. The 14 th International Symposium on Landscape Research. Stará Lesná, 47 October 2006 ZMENY ZASTÚPENIA JEDNOTLIVÝCH ŠTRUKTÚR SEMENNÍKA POTKANA PO JEDNORAZOVEJ APLIKÁCII NIKLU. CHANGES OF TESTICULAR STRUCTURE RATE AFTER AN INTRAPERITONEAL ADMINISTRATION OF NICKEL IN RATS. Bábiková, L., Toman, R., Massányi, P., Hluchý, S., Golian, J., Lukáč, N. Slovenská poľnohospodárska univerzita v Nitre Abstract The purpose of this study was to assess an effect of nickel chloride on structures rate in the rat testis. Males received a single intraperitoneal dose of 15 mgnicl 2.kg 1 body weight. Ten animals served as an untreated control group. Fortyeight hours after nickel administration, animals of each group were killed and samples of testis were taken for morphometric analysis. Morphometry evaluation showed significant ( P<0.01) decrease in germinal epithelium volume from ± 1.91 % to ± 3.30 %. This decrease in germinal epithelium volume caused the significant (P<0.05) increase in tubule lumen volume to ± 1.91% in comparison with the control group ± 1.21 %. The interstitial tissue in nickel treated group increased to ± 3.32 % from ±1.00 % in control group. Results from this study report a negative impact of nickel on the structure of testis. Úvod Mnohé epidemiologické štúdie poukazujú, že nikel je karcinogénny prvok (Dunnick et al., 1995). Paksy et al. (1999) ďalej zaraďujú nikel medzi mutagénne a teratogénne prvky, ktorý pri vyšších koncentráciách spôsobuje vznik alergickej kontaktnej dermatitídy (Me nne, 1994). Nikel je prvok, ktorý sa vyskytuje v prírode v malom množstve. Jeho distribúcia v tele závisí od cesty expozície, chemickej formy a dĺžky expozície. Medzi cieľové orgány akumulácie niklu patria pľúca a oblička, v menšom množstve sa akumuluje v slezine, v pečeni, v srdci a v semenníkoch. Glen et al. (1970) ďalej poukazujú na prítomnosť 63 Ni podaného intraperitoneálne vo viacerých tkanivách myší a potkanov s najvyššou koncentráciu v obličkách po 72 hodinách od podania. Costa et al. (1982) uvádzajú, že celulárna transformácia a toxicita niklu závisí od jeho schopnosti prechodu cez bunky fagocytózou. Taktiež je dobre zdokumentované, že aminokyseliny viažúce nikel majú významnú úlohu v extracelulárnom transporte a pri vylučovaní niklu močom a môžu regulovať jeho príjem a cytotoxicitu in vitro (Saillenfait et al., 1993). 20

22 Cieľom našej práce bolo zistiť percentuálne zastúpenie jednotlivých štruktúr semenníka po intraperitoneálnom podaní chloridu nikelnatého laboratórnym potkanom. Materiál a metodika V experimente sa použili samci potkanov línie Wistar po 10 kusov v skupine. Pokusným zvieratám na zistenie účinku niklu sa podal roztok 15 mgnicl 2.kg 1 živej hmotnosti intraperitoneálne. Ako kontrolná skupina slúžilo 10 samcov bez podania niklu. Po 48 hodinách od podania sa zvieratá pokusnej ako aj kontrolnej skupiny bezbolestne usmrtili, odobrali a odvážili sa vzorky semenníka na histologické vyšetrenie. Za pomoci 540 bodovej testovacej mriežky sa kvantitatívnymi morfometrickými metódami zistilo percentuálne zastúpenie semenotvorného epitelu, lúmenu kanálika a intersticiálneho väziva. Pre získané údaje sa vypočítali základné štatistickovariačné hodnoty a rozdiely medzi pokusnou a kontrolnou skupinou sa otestovali Studentovým ttestom. Výsledky Výsledky morfmetrického hodnotenia semenníkov sú uvedené v tabuľke 1 a zobrazené na grafe 1. Relatívny podiel štruktúr semenníka potkana. Tabuľka 1 skupina x sd v minimum maximum Semenotvorný epitel (%) Kontrola 72,50 ** 1,91 2,63 69,85 76,38 Pokus 68,50 3,30 4,82 62,59 73,44 Lúmen kanálika (%) Kontrola 11,49 * 1,21 10,52 9,09 12,91 Pokus 13,46 1,95 14,52 8,98 15,64 Intersticiálne väzivo (%) Kontrola 16,03 1,00 6,25 14,53 17,25 Pokus 17,92 3,32 18,51 12,32 23,06 X priemer, sd smerodajná odchýlka, v variačný koeficient * P < 0,05, ** P < 0,01 Morfometrickou analýzou vzoriek semenníkov pokusných samcov potkanov sme zistili preukazné (P<0,01) zníženie relatívneho objemu zárodočného epitelu o 4 % oproti kontrole, čo malo za následok preukazné zvýšenie (P<0,05) objemu lúmenu kanálika z 11,49 % na 13,46 %. Intersticiálne väzivo v semenníkoch pokusných samcov sa mierne rozšírilo, avšak rozdiel oproti kontrolnej skupine bol nepreukazný. Graf 1 Percentuálne zastúpenie jednotlivých štruktúr semenníka kontrolných a pokusných zvierat po podaní niklu % Epitel Lúmen Väzivo kontrola pokus 21

23 Diskusia V semenníkoch pokusných samcov potkanov, ktorým sme podali intraperitoneálne nikel, sme zistili nepreukazné zvýšenie intersticiálneho väziva. Naopak relatívny objem semenotvorného epitelu preukazne klesol. V predchádzajúcej práci sme u potkanov po 48 1 hodinách od podania dávky 25 mg.kg niklu zaznamenali preukazné rozšírenie intersticiálneho väziva o 6,31% oproti kontrole a zníženie zárodočného epitelu z 72,50% na 68,28% (Bábiková et al., 2006). Massányi et al. (2007) sledovali štrukturálne zmeny semenníka myší po 1 jednorazovom podaní niklu (20 a 40 mg.kg ) a zistili nárast intersticiálneho väziva z 6,36% na 9,69% a 13,57% a zmenšenie semenotvorného epitelu z 79,95% na 75,12% a 70,17%. Rozšírenie intersticiálneho väziva popisujú aj Lukáč et al. (2007), ktorí sledovali vplyvy viacerých dávok kobaltu vo forme CoCl 2 podaného intraperitoneálne zlatým škrečkom (Mesocricetus auratus) a interval relatívneho objemu väziva sa pohyboval od 16,64 do 22,56 % u pokusných zvierat v porovnaní s kontrolným objemom 9,95%. Autori ďalej poukazujú na pokles percentuálneho zastúpenia zárodočného epitelu v dôsledku expozície kobaltom z kontrolných 72,48% na 58,58 až 67,48% v závislosti od dávky. Zistenia uvedených autorov potvrdzujú aj naše výsledky pôsobenia niklu. V našom prípade nastalo nepreukazné zvýšenie väziva v semenníku potkana z 16,03% na 17,92%. Avšak nastalo preukazné zníženie relatívneho objemu epitelu z kontrolných 72,50% na 68,50% u pokusných zvierat. Zníženie relatívneho objemu zárodočného epitelu uvádzajú aj autori, ktorí sledovali vo svojich prácach účinok kadmia na štrukturálne zmeny semenníka. Massányi et al. (1991) uvádzajú pokles epitelu z 80,8 % na 71,3 % a Toman et al. (2002) z 77,75 % na 67,11 %, pričom pokles objemu semenotvorného epitelu, ktorý nastal po aplikácii niklu, nebol taký výrazný ako po podaní kadmia. Morfometrickými analýzami sme zaznamenali preukazný nárast percentuálneho objemu lúmenu kanálika semenníka z 11,49% na 13,465%. Avšak vyššia dávka niklu (25 mg.kg 1 ) spôsobila pokles objemu lúmenu z 11,49% na 9,40% (Bábiková et al., 2006). Pokles lúmenu zaznamenal vo svojej št údií pri sledovaní účinkov kobaltu aj Lukáč et al. (2007), kde dávka 10 mg.kg 1 CoCl 2 spôsobi la pokles objemu lúmenu kanálika o 5,04% a pri nižšej dávke bol pokles výraznejší oproti kontrole (zo 17,57% na 11,87%). Naše výsledky sa zhodujú s výsledkami, ktoré uvádzajú Massányi et al. (2007), ktorí zistili nárast lúmenu o 1,5% pri dávke 20 mg.kg 1 NiCl 2 a o 2,57% pri dávke 40 mg.kg 1 niklu. Záver Výsledky práce poukazujú na fakt, že jednorazové podanie niklu spôsobuje zmeny v percentuálnom zastúpení jednotlivých štruktúr semenníka (semenotvorného epitelu, lúmenu kanálika a intersticiálneho väziva). Nikel spôsobil v semenníkoch samcov mierne zvýšenie relatívneho objemu intersticiálneho väziva, preukazný pokles relatívneho objemu zárodočného epitelu a preukazný nárast objemu lúmenu kanálika. Uvedené zmeny v zastúpení štruktúr semenníka po podaní niklu môžu viesť k poškodeniu fyziologického priebehu spermatogenézy. Literatúra BÁBIKOVÁ, L., TOMAN, R., HLUCHÝ, S, et al. (2006): Risk factors of food chain VI, COSTA, M., HECK, J.D., ROBINSON, S.H. (1982): J Toxicol Environ Health, 9, DUNNICK, J.K., ELWELL, M.R., RADOVSKY, A.E., et al. (1995): Cancer Res., 55, GLEN, O.O., MILLER,W.J., KING, W.A. et al. (1970): J Nutr., 100, LUKÁČ, N., MASSÁNYI, P., ZAKREWSKI, M, et al. (2007): J Environ. Sc. Health Part A, 42, MASSÁNYI, L., JANOVIČOVÁ, O., BAKITOVÁ, Ľ, et al. (1991): Poľnohospodárstvo, 9 10, MASSÁNYI, P., LUKÁČ, N., ZEMANOVÁ, J. et al. (2007): Acta Vet. Brno, 76, MENNE,T., (1994): Sci. Total Environ., 148, PAKSY, K.,(1999): Environ. Res. Section, 80,

24 SAILLENFAITH, A.M., PAYAN, J.P., SABATE, J.P., et al. (1993) Toxicol. Appl. Pharmacol., 123, TOMAN, R., MASSÁNYI, P., UHRÍN, V., (2002): Trace Elements and Electrolytes, 3, Práca bola finančne podporená Vedeckou grantovou agentúrou MŠ SR projektom VEGA č. 1/2417/05 a 1/3475/06. FAPZ SPU v Nitre, Katedra veterinárskych disciplín, [email protected] SUBCHRONICKÉ PÔSOBENIE NIKLU NA MORFOMETRICKÉ UKAZOVATELE SEMENNÍKA POTKANA SUBCHRONIC EFFECT OF NICKEL ON THE MORPHOMERIC PARAMETERS OF THE RAT TESTIS Bábiková, L., Toman, R., Massányi, P., Lukáč, N., Hluchý, S., Golian, J. Slovenská poľnohospodárska univerzita v Nitre Abstract The aim of this study was to evaluate an effect of longterm intake of nickel chloride on the rat reproductive system using the morphometry methods. Nickel was administered in a daily dose of 100 mg.l 1 NiCl 2 in a drinking water to male rats during 3 months. The nickeltreated group consisted of 10 rats and the same number of males served as an untreated control group. At the end of the experimental period, animals were killed and the samples of the testis were taken for the morphometry evaluation. Three months after nickel treatment, a significant increase (P<0.01) in interstitial tissue volume from ± 1.00% to ± 4.94% in the testis of Nitreated rats was observed. In the relative volume of germinal epithelium, an insignificant increase was found between control and experimental groups (72.50 ± 1.91% and ± 4.66%, respectively). Morphometry analysis of the lumen of seminiferous tubules showed stat istically significant decrease (P<0.001) from ± 1.21% to 5.91 ± 1.06% in comparison with control group. These findings show the negative effect of peroral nickel administration on the testis structures. Úvod Semenníky plnia dve dôležité funkcie: produkujú zárodočné bunky a syntetizujú steroidné hormóny, ktoré sú pod kontrolou gonadotropínov. Samčia plodnosť závisí od normálne prebiehajúcej spermatogenéz y, čo je proces pri ktorom nezrelé bunky podliehajú deleniu, diferenciácií a meióze vedúcej k vzniku haploidných predĺžených spermatíd. Je známych niekoľko environmentálnych kontaminantov, ktoré zasahujú rozličné vývojové štádia zárodočných b uniek a tým zap ríčiňujú reduk ciu počtu sperm ií (Saradha a Mathur, 2006). Medzi takéto prvky patrí aj nikel. Kakela et al. (1999) uvádzajú, že v semenníkoch potkanov dochádza po perorálnom podávaní Ni k zm enšeniu semenotvorných kanálikov a k zníženiu počtu spe rmatogónií. V semenníkoch laboratórnych potkanov spôsobujú soli niklu morfologické zmeny, ako je degenerácia semenotvorného epitelu, nádory semenníkov a funkčné poruchy (Mathur et al., 1977). V práci sme sa zamerali na kvantitatívne vyhodnotenie účinkov niklu podávaného dlhodobo na štruktúru semenníka potkanov. Materiál a metodika Na vyhodnotenie dlhodobého účinku niklu sme použili 10 samcov potkanov línie Wistar. Zvieratá prijímali počas 91 dní trvania pokusu nikel v dávke 100 mg.l 1 v pitnej vode. Na 23

25 porovnanie nám slúžilo 10 samcov bez podania niklu. Po ukončení pokusného obdobia sme zvieratá pokusnej aj kontrolnej skupiny bezbolestne usmrtili a odobrali vzorky semenníka na histologické spracovanie. Na mikroskopických preparátoch sme kvantitatívnymi morfometrickými metódami pomocou 540 bodovej testovacej mriežky hodnotili relatívny objem semenotvorného epitelu, lúmenu kanálika a intersticiálneho väziva. Hodnotenie sme uskutočnili komputerizovaným systémom pomocou PC morfometrického softwaru M.I.S. Quick Photo a mikroskopom Olympus AX 70. Pre získané údaje sme vypočítali základné štatistickovariačné hodnoty a rozdiely medzi pokusnou a kontrolnou skupinou sme otestovali Studentovým ttestom. Výsledky Výsledky kvantitatívneho hodnotenia sa uvedené v tabuľke 1 a v grafe 1. Percentuálny podiel semenotvorného epitelu, lúmenu kanálika a intersticiálneho väziva potkanov. Tabuľka 1 skupina x sd v minimum maximum Semenotvorný epitel (%) Kontrola 72,50 1,91 2,63 69,85 76,38 Pokus 73,18 4,66 6,37 69,51 85,77 Lúmen kanálika (%) Kontrola 11,49 *** 1,21 10,52 9,09 12,91 Pokus 5,91 1,06 17,92 4,35 8,01 Intersticiálne vazivo (%) Kontrola 16,03 ** 1,00 6,25 14,53 17,25 Pokus 20,69 4,97 24,02 8,23 26,15 x priemer, sd smerodajná odchýlka, v variačný koeficient ** P < 0,01 *** P < 0,001 Morfometrické analýzy semenníkov pokusných samcov potkanov ukázali štatisticky preukazné zvýšenie relatívneho objemu intersticiálneho väziva zo 16,03% na 20,69%, čo tvorilo rozdiel 4,66%. Tento rozdiel bol štatisticky preukazný (P < 0,01). Rozšírenie intersticiálneho väziva nespôsobilo pokles percentuálneho zastúpenia semenotvorného epitelu, ale jeho zanedbateľný nárast. Zmena sa prejavila v relatívnom objeme lúmenu kanálika, kde došlo k štatisticky významnému poklesu (P < 0,001) podielu lúmenu z 11,49% na 5,91%. Graf 1 Percentuálne zastúpenie jednotlivých štruktúr semenníka kontrolných a pokusných potkanov po dlhodobom podávaní niklu % epitel lúmen väzivo kontrola pokus 24

26 Diskusia Morfometrické analýzy semenníka po 91 dňoch podávania niklu v pitnej vode ukázali rozšírenie intersticiálneho väziva zo 16,03% na 20,69%, čo činilo rozdiel oproti kontrole o 4,66%. Rozšírenie väziva z 12,27% na 16,11% popísal aj Toman et al. (2002) v pokuse s králikmi, ktorí prijímali kadmium v dávke 1 mg Cd +2. kg 1 počas 5 mesiacov. V ďalšej svojej práci Toman et al. (2005) pozorovali po perorálnom podaní 10 mg.kg 1 ž.h. niklu myšiam rozšírenie väziva semenníka v dôsledku zmnoženia intersticiálnych buniek na periférii semenníka. Massányi et al. (2001) taktiež zistili rozrastanie väziva u potkanov týždeň po aplikácii kadmia z 19,20% na 28,70%, avšak po 23 týždňoch popisujú rozšírenie väziva až na 40,90%. V starších literárnych zdrojoch Paufler a Foote (1969) poukazujú na zvýšenie relatívneho objemu väziva z 8,9% na 47,20% u holandských králikov týždeň po aplikácii kadmia a po 13 týždni až 75,60%. Ďalším dôležitým prejavom pôsobenia niklu na semenníky bol štatisticky významný pokles relatívneho objemu lúmenu semenotvorného kanálika z 11,49% u kontroly na 5,91%. Môžeme konštatovať, že vplyvom niklu sa rozširuje objem väziva v semenníku, aj keď sa jeho rozšírenie neprejavilo zmnožením väzivových elementov na úkor objemu lúmenu kanálikov. Hodnoty relatívneho objemu lúmenu kontrolných potkanov sa zhodujú s hodnotami, ktoré uvádzajú Žitný a Hluchý (1991) u Novozélandského králika 11,43 14,97 %. Z nášho kvantitatívneho pozorovania sme zaznamenali rozšírenie intersticiálneho väziva, ktoré nespôsobilo pokles objemu zárodočného epitelu. Naopak sme pozorovali jeho nepreukazné zvýšenie z 72,50% na 73,18%. Tieto výsledky sú v rozpore s tvrdeniami autorov Toman et al. (1997), ktorí popísali pokles zárodočného epitelu oproti kontrole po dlhodobom podávaní kadmia z 77,75% na 75,42%. Avšak zmeny ktoré nastávajú po intraperitoneálnej aplikácii niklu sú rozdielne. V našej predchádzajúcej práci sme zistili pokles epitelu z 72,50% na 68,26% u potkanov po i.p. 25 mg.kg 1 niklu (Bábiková et al., 2006). Pokles epitelu zaznamenal aj Lukáč et al. (2007) po jednorázovej aplikácii rôznych dávok kobaltu. Zistil objem zárodočného epitelu semenníka zlatého škrečka (Mesocricetus auratus) 72,48%. Autori ďalej uvádzajú pokles epitelu pri dávke 20 mg.kg 1 CoCl 2 na 58,58%, 10 mg.kg 1 CoCl 2 67,84% 1 a dávka 5 mg.kg CoCl 2 spôsobila zníženie epitelu o 4%. Výsledky nášho pokusu poukázali na vplyv perorálne podaného niklu na jednotlivé štruktúry semenníka. Záver Zaznamenali sme zmeny v percentuálnom zastúpení semenotvorného epitelu, lúmenu kanálika a intersticiálneho väziva, ktoré sa prejavili nárastom intersticiálneho väziva, poklesom lúmenu kanálika a miernym zvýšením objemu zárodočného epitelu. Výsledky nášho experimentu potvrdzujú fakt, že hoci je nikel esenciálnym prvkom, jeho dlhodobý príjem v pitnej vode môže spôsobiť zmeny v relatívnom objeme jednotlivých štruktúr semenníka. Literatúra BÁBIKOVÁ, L., TOMAN, R., HLUCHÝ, S, et al. (2006): Risk factors of food chain VI, KAKELA,R., KAKELA, A, HYVARINEN, H. (1999): Comp. Biochem. Physiol.C., 1, LUKÁČ, N., MASSÁNYI, P., ZAKREWSKI, M, et al. (2007): J Environ. Sc. Health Part A, 42, MASSÁNYI, P., JANOVIČOVÁ, O., BAKITOVÁ, Ľ., et al. (1991): Poľnohospodárstvo, 37, MATHUR, A.K., DATTA, K.K, TANDON, S.K., et al. (1977): Bull Environ Contam Toxicol.,17, PAUFLER, S.K., FOOTE, R.H. (1969): J. Reprod.Fer.,19, SA RADHA, B., MATHUR, P. P. (2006): Environ. Toxicol. Pharmacol., 21, TOMAN, R., MASSÁNYI, P., UHRÍN, V. (2002): Trace Elem. Electrol., 19, TOMAN, R., MASSÁYI, P., HLUCHÝ, S. et al. (2005): Rizikové faktory potravového reťazca V., ŽITNÝ, J., HLUCHÝ, S.,(1991): Poľnohospodárstvo,37,

27 Práca bola finančne podporená Vedeckou grantovou agentúrou MŠ SR projektom VEGA č. 1/2417/05 a 1/3475/06. FAPZ SPU v Nitre, Katedra veterinárskych disciplín, [email protected] METALICKÁ ZÁŤAŽ ALUVIÁLNYCH PÔD V IPEĽSKOM REGIÓNE METALLIC LOAD OF ALLUVIAL SOILS IN REGION IPEĽ Bajčan, D.; Árvay, J.; Harangozo, Ľ.; Čéry, J.; Timoracká, M. Slovenská poľnohospodárska univerzita v Nitre Abstract Nowdays, a degree of contamination by heavy metals can be observed in the environment. Heavy metals have serious effects on all living organisms because they can accumulate in lethal or sublethal concentrations in the various parts of food chain and so they can cause different health problems like cardiovascular and cancer deseases. This work is focused to the rate of some heavy metals contamination in agricultural alluvial soils from specific area of the region Ipeľ alluvium of the river Štiavnica. Soils in alluvium of Štiavnica are strongly contaminated by heavy metals due to hundreds of years mine activities in region of Banská Štiavnica. The mobile forms of risky elements easily pass trough to the agricultural plants groving on contaminated soils. The soil samples were collected in the years and the content of Cd, Pb, Zn, Cu and Cr was analyzed by AAS. The result showed that alluvial soils are strongly contaminated by Pb, Zn and Cd, moderately contaminated by Cu and noncontaminated by Cr. Key words: contamination, heavy metals, river Štiavnica, alluvial soils Úvod Medzi kontaminanty s najväčším výskytom, ktorým sa v súčasnosti venuje veľká pozornosť, patria aj ťažké kovy (ďalej ŤK). Ťažké kovy patria medzi nedegradovateľné kontaminanty, ktoré sa vyznačujú rozdielnym zdrojom pôvodu, vlastnosťami ako aj pôsobením na živé organizmy (Tóth a kol., 2005). K ŤK patria biologicky nezastupiteľné mikroelementy /napr. Cu, Zn, Mn, Co, Cr atď./ ako i početné neesenciálne chemické prvky /Cd, Pb, Hg atď./ (Vollmannová a kol., 2007). V pôdach sa nachádzajú v rôznych koncentráciách, oxidačných stup ňoch i väzbách. Ich riziká spočívajú v ich ekotoxicite i kumulácii v biotických a abiotických zložkách prostre dia. Toxické sú aj biologicky nezas tupiteľné mikroelementy, ak prekročia určitú koncentráciu (Tomáš, 2000; Vollmannová a kol., 2003). Nadmerný príjem rizikových k ovov potravou môže spôsobiť rôzne problé my a ochorenia, od menej závažnýc h, ako sú alergické reakcie, cez záva žné, ako poškodenia re spiračného, kardiovaskulárneho a nervového systém u, až po smrteľné, ako sú srdcovocievne a nádorové ochorenia (Bencko, 1995; Musilo vá a kol., 2006; KabataPen dias a Pendias, 2001). Z toho dôvodu je nevyhnutné pri výrobe hygienicky bezpečných potravín neustále monitorovať obsah týchto ŤK už v poľnohospodársky využívanej pôde.v prípade potreby je nevyhnutné vykonať opatrenia na minimalizáciu vstupu rizikových prvkov do potravového reťazca ( Byst rická a kol., 2006).Ipeľský región sa nachádza na juhozápade stredné ho Slovenska. Vyznačuje sa intenzívnou poľnohospodárskou činnosťou bez významnej priem yselnej výroby, ktorá by mohla byť v súčastnosti zdrojom kontaminácie ŤK. Jediný výraznejší zdroj znečistenia poľnohos podárskych pôd rizikovými prvkami predstav uje rieka Štiavnica, ktorá pramení v oblasti Štiavnickýc h vrchov. Táto rieka tečie pozdĺž južnej časti Banskej Štia vnice, kde sa do nej dostávajú priesaky z bansk ých šácht a háld. Tým sa do tejto rieky dostáva značné množstvo rizikových kovov, ktoré pri záplavách kontaminovali priľahlé aluviálne pôdy (Čurlík a kol., 2005). Je preto veľmi dôležité monitorov ať hygieniský stav pôd, ako aj sledovať transfer ŤK do poľnohospodárskych plodín v uvedenej oblasti. 26

28 Materiál a metodika Sledovanie obsahu rizikových prvkov v pôdach sa uskutočnilo na vybraných stanovištiach (pôdneho typu fluvizem) Ipeľského regiónu v povodí rieky Štiavnica, pričom sledované pôdy boli poľnohospodársky využívané. Pôdne charakteristiky záujmových území sú uvedené v Tab.1. Pri odbere a úprave pôdnych vzoriek sme postupovali podľa Záväzných metodík rozborov pôd (Fiala, 1999). Pôdne vzorky sme odoberali v roku 2004 z hĺbky 0 0,2 m (orné pôdy) a 0,05 0,10 m (trvalé trávne porasty). V pôdach sme stanovovali nasledovné rizikové ťažké kovy: Cu, Cr, Cd, Zn a Pb. Analytickou metódou stanovenia bola plameňová atómová absorpčná spektrometria. Tab. 1 Lokalizácia odberu pôdnych vzoriek a ich charakteristika Stanovište Kataster obce Pôdny typ Pôdny druh BPEJ A1 Tupá fluvizem glejová stredne ťažká A2 Horné Semerovce fluvizem glejová stredne ťažká A3 Hokovce fluvizem modálna stredne ťažká A4 Terany fluvizem modálna stredne ťažká A5 Hontianske Tesáre fluvizem modálna stredne ťažká A6 Hontianske Nemce fluvizem glejová stredne ťažká A7 Prenčov fluvizem modálna stredne ťažká A8 Dudince fluvizem modálna stredne ťažká A9 Dudince fluvizem modálna stredne ťažká A10 Hontianske Tesáre fluvizem modálna stredne ťažká A11 Hontianske Tesáre fluvizem modálna ľahká A12 Hrkovce fluvizem glejová ťažká A13 Dudince fluvizem modálna stredne ťažká A14 Dudince fluvizem modál na stredne ťažká A15 Hontianske Nem ce fluvizem glejová stredne ťažká Výsledky a diskusia Limitné ho dnoty rizikových látok v poľnohospodárske j pôde (vzťahujúce sa k obsahu prvku v pôde vo výluhu lúčavky kráľovskej) u rčuje Zá kon č. 220/2004 Z.z. o ochrane a využívaní poľnohospodárskej pôdy. Při prevýšení limitnej hodnoty niektorého prvku v pôde sa následne stanoví ob sahu prvku v pôde vo vý luhu 1 mol.dm 3 dusi čnanu amónneho, kto rý sa následne porovnáva s kritickou hodn otou pre d aný rizikový prvok. V Tab. 2 uvádzame výsledky stanovení obsahov vyb raných rizikových prvkov vo výluhu lúčavky kráľovskej v sledovaných poľnohospodárskych pô dach. Z výsledko v je zrejmé, že pôdy na všetkých sledovaných stanovištia ch sú vysoko kontaminovan é Cd, P b a Zn (priem. ho dnota K L >10), st redne kontaminované Cu (2< priem. hodnota K L<5) a nekontaminované Cr (priem. hodnota K L <1). Naviac na väčšine stanovíšť obsah Zn a Cd vo vý luhu 1 mol.dm 3 dusičnanu amónneho prekročil kritickú hod notu a obsah Pb a Cu vo výluhu 1 mol.dm 3 dusičnanu amónneho prekročil kritickú hodnotu na 1/3, resp. 1/7 sledovaných stanovíšť (Tab. 3). Naše výsledky veľmi dobre korešpondujú s výsledkami Čurlíka a kol. (2005), ktorí rovnako zistili vysoké obsahy Cu, Cd, Pb a Zn v pôdach povodia rieky Štiavnica. 27

29 Tab. 2 Pseudototá lne obsahy ť ažkých kovov v pôdach v mg.kg 1 vo výluhu lúčavky kráľ ovskej Stanovište Cu Cd Pb Zn Cr K L K L K L K L K L A ,45 8,26 11, , ,53 17,3 0,25 A2 83,2 1,39 7,50 18, , ,9 19,7 0, 28 A ,80 9,04 22, , ,2 15,9 0, 23 A ,35 5,79 14, , ,1 15,8 0,23 A5 93,2 1,55 1,12 2,80 74,2 1, ,84 28,7 0, 32 A ,28 17,6 25, , ,1 30,6 0, 44 A ,00 6,68 16, , ,9 9,60 0,14 A ,98 8,74 21, , ,6 15,1 0, 22 A ,58 10,2 25, , ,1 17,0 0,24 A ,78 3,04 7, , ,6 21,0 0,30 A ,53 0,99 2,48 40,2 1, ,29 20,8 0,42 A ,70 6,14 8, , ,93 28,7 0,29 A13 89,4 1,49 11,8 16, , ,4 23,6 0,34 A14 70,4 1,17 9,18 13, , ,33 27,2 0,39 A ,40 17,8 44, , ,2 33,8 0,48 Priemer 132 2,30 8,26 16, , ,1 21,7 0,30 K L koeficient prekročenia limitnej hodnoty rizikových prvkov v pôde určenej zákonom č. 220/2004 xxxx obsah prvku v pôde prevyšuje limitnú hodnotu rizikového prvku v poľnohospodárskej pôde Na základe týchto výsledkov by pôdna služba mala vypracovať návrhy na odstránenie, príp. minimalizáciu znečistenia sledovaných pôd a spôsob hospodárenia na nich. Tab. 3 Obsahy ťažkých kovov v pôdach vo výluhu 1 mol.dm 3 dusičnanu amónneho v mg.kg 1 Stanovište Cu Zn Cd Pb K K K K K K K K A1 0,305 0,31 2,80 1,4 0,145 1,45 0,025 0,25 A2 0,105 0,11 14,8 7,4 0,444 4,44 0,030 0,3 A3 0,165 0,17 9,45 4,73 0,231 2,31 0,055 0,55 A4 0,327 0,33 8,85 4,43 0,235 2,35 0,160 1,6 A5 0,26 0,26 0,45 0,23 0,021 0,21 0,010 0,1 A6 0,17 0,17 2,10 1,05 0,206 2,06 0,060 0,6 A7 1,54 1, ,5 1,52 15,2 19,7 197 A8 0,232 0,23 77,8 38,9 1,10 11,0 0,180 1,8 A9 0,295 0, ,11 11,1 0,180 1,8 A10 0,665 0,67 9,95 4,98 0,200 2,0 0,025 0,25 A11 0,25 0,25 0,65 0,33 0,004 0,04 0,010 0,1 A12 0,14 0,14 12,3 6,15 0,495 4,95 0,085 0,85 A13 0,485 0,49 0,35 0,18 0,099 0,99 0,035 0,35 A14 0,39 0,39 0,15 0,08 0,103 1,03 0,020 0,2 A15 1,21 1, ,0 2,74 27,4 10,3 103 Kritická hodnota 1,0 2,0 0,1 0,1 K K koeficient (násobok) prekročenia kritickej hodnoty xxxx obsah prvku v pôde vo výluhu dusičnanu amónneho prevyšuje kritickú hodnotu Záver Takmer tisíc rokov trvajúca banská činnosť má aj niekoľko desaťročí po jej skončení nepriaznivý vplyv na hygienický stav aluviálnych pôd povodia rieky Štiavnica v Ipeľskom regióne. Z výsledkov analýz rizikových ťažkých kovov v poľnohospodárskych pôdach môžeme 28

30 vyvodiť záver, že sledované aluviálne pôdy sú vysoko kontaminované Cd, Pb a Zn, stredne kontaminované Cu a nekontaminované Cr. Takéto pôdy by sa nemali využívať na pestovanie plodín určených na výrobu potravín, prípadne krmovín pre hospodárske zvieratá. Ich možné využitie je v pestovaní plodín pre výrobu zložiek do biopalív (kukurica, repka) alebo pestovanie drevín pre produkciu biomasy ako obnoviteľného zdroja energie. Literatúra 1. BENCKO, V. CIKRT, M. LENER, J Toxické kovy v životním a pracovním prostředí člověka. Praha: Grada, 1995, 282 s. ISBN X 2. BYSTRICKÁ, J. TOMÁŠ, J. MUSILOVÁ, J Kontaminácia pôd Stredného Spiša kadmiom, olovom a meďou. In: Environmentálne inžinierstvozborník z 3. vedeckej konf. s medzinárodnou účasťou. Košice: TU v Košiciach, s ISBN ČURLÍK, J. ŠEFČÍK, P. GLUCH, A. POLC, R Ipeľský región orientačný prieskum geologických činiteľov životného prostredia, Pedogeochemická mapa (Čiastková záverečná správa). Bratislava: MŽP SR, ŠGÚDŠ Bratislava, 2005, 42 s. 4. FIALA, K. a i Záväzné metódy rozborov pôd. Čiastkový monitorovací systém pôda. Výskumný ústav pôdoznalectva a ochrany pôdy v Bratislave, Edičné stredisko VÚPOP, 142 s. ISBN KABATAPENDIAS, A. PENDIAS, H Trace Elements in Soil and Plants. 3. vydanie. London: CRC Press, 2001, 413 p. 6. MUSILOVÁ, J HARANGOZO, Ľ. TREBICHALSKÝ, P Riziká vstupu ťažkých kovov do potravinových surovín z lokálne znečistených pôd Podunajskej nížiny. In: Bezpečnosť a kvalita surovín a potravín. Nitra: SPU, 2006, s ISBN TOMÁŠ, J Stopové prvky v životnom prostredí. In: Cudzorodé látky v životnom prostredí. Zborník referátov z III. medzinárodnej konferencie, sept. 2000, Nitra: SPU Nitra, 2000, s.1018, ISBN TÓTH, T. POSPÍŠIL, R. PARILÁKOVÁ, K. MUSILOVÁ, J. BYSTRICKÁ, J Distribúcia ťažkých kovov v pôdach aplikáciou substrátu po výrobe biokalu. ChemZi, 1, (1), 2005, s VOLLMANNOVÁ, A. TÓTH, T. TOMÁŠ, J. JOMOVÁ, K The affection of intake of some micronutrients by grain of bean grown on extremely acid soil. In: Chemické listy, roč. 97, 2003, č. 8, s VOLLMANNOVÁ, A. MUSILOVÁ, J. BYSTRICKÁ, J Safety of some forage plants grown on the metallic burden soil from the aspect of risk element content. In: 27 th International Symposium Industrial toxicology 07. Bratislava: STU Bratislava, 2007, pp ISBN Zákon č. 220/2004 Z.z. o ochrane a využívaní poľnohospodárskej pôdy a o zmene zákona č. 245/2003 Z.z. o integrovanej prevencii a kontrole znečisťovania životného prostredia a o zmene a doplnení niektorých zákonov. Zbierka zákonov, čiastka 96, s Poďakovanie Tento príspevok vznikol vďaka finančnej podpore Grantovej agentúry SPU, grantu č. 719/05130 a Vedeckej grantovej agentúry MŠ SR a SAV, grantu VEGA č. 1/2428/05. Adresa autora: RNDr. Daniel Bajčan Katedra chémie, Fakulta biotechnológie a potravinárstva SPU v Nitre Tr. A. Hlinku 2, Nitra, [email protected], tel: 037/

31 LIPID METABOLISM CHANGES RESULTED TO LIVER STEATOSIS: CORRELATION WITH HISTOLOGICAL SEVERITY OF DISEASE IN CHRONIC HEPATITIS B AND C. Bartoš, V. 1,3, Krkoška, D. 2, Slávik, P. 3, Lauko, Ľ. 3, Szépeová, R. 4 1.Institute of Histology and Embryology JLF UK in Martin [email protected] 2.Clinic of Infectology JLF UK and MFN in Martin 3. Institute of Pathology JLF UK and MFN in Martin 4.Clinic of Children and Adolescents JLF UK and MFN in Martin INTRODUCTION : Chronic hepatitis B (CHB) and C (CHC) are histologically often accompanied by steatosis of hepatic parenchyma, that can be a result of the influence of both, viral and environmental factors. In the former type, a treatment of choice is the antiviral therapy, while the later one can be decreased owing to administration of medicaments with antisteatotic effect. Although it is considered to be a negative histomorphological parameter, the data about a relationship between steatosis and other pathological features in these nosological entities are still controverse. Therefore, its effect to outcome and overall prognosis of patients with these disorders is still unclear. THE AIM OF THE STUDY : The aim of our retrospective study was the evaluation of liver steatosis prevalence, and its impact on degree of histological necroinflammatory activity (grading) and portal fibrosis (staging) in chronically HBV or HCV infected individuals. MATERIAL AND METHODS : A set of 121 consecutive patients (69 males, 52 females, 37,5 yr. average) with either CHB (n=76) or CHC (n=45) who underwent a core needle liver biopsy during 5 years period ( ) were included in this study. Age range of patients varied between 1 70 years including 18 children (14x CHB and 4x CHC). None case of HB V/HCV coinfection was recorded. The biopsy samples were fixed in buffered formalin, embedded in paraffin blocks, stained with hematoxylineosin and special histochemical methods and after complete processing examined by pathologists (all cases in Institute of Pathology in Martin). Histol ogical grading and staging of hepatitis were evaluated according to Ishak s modified Index Histological Activity (mhai) criteria, degree of steatosis was classified in 5 groups proposed by Wyatt. RESULTS : In CHC and CHB, steatosis occured in 47 (61, 8 %), and 20 (44,4 %) of cases, retrospectively. The most frequent present degree of steatosis was between 310 % in both groups. Microvacuolar form predominated in lower degrees (S I, II), macrovesicular form in higher degrees (S III, IV). In CHC, we revealed a significant correlation between the extent of steatosis and grading (p=0,006), but not between steatosis and staging (p=0,6). A significant association was also present between steatosis and age of patients (p=0,002). In CHB, we did not reveal a significant relationship of steatosis neither to grading (p=0,4) nor to staging (p=0,5). A correlation between steatosis and age was near to statistical significance (p=0,06). CONCLUSION : In our study, liver steatosis was a frequent histological findings in both disorders. In HBVinfected individuals, we did not demonstrate significant association of steatosis with necroinflammatory activity or portal fibrosis. In HCVinfected patients, we revealed an association between steatosis and necroinflammatory activity, but not between steatosis and portal fibrosis. Althought it is very difficult to differentiate a viralinduced and metabolici nduced fatty changes, this histopathological finding should be concerned in therapeutic strategies and management of patients in clinical practice. 30

32 Tables Tab. 1 Steatosis in CHC and CHB prevalence of individual degrees (N number of cases, S 0IV, steatosis degrees, S 0 steatosis not present) N S 0 (not pres) S I (12%) S II (310 %) S III (1130 %) S IV (>30 %) CHB (55,6 %) 3 (6,7 %) 7 (15,5 %) 5 (11,1 %) 5 (11,1 %) CHC (38,2 %) 6 (7,9 %) 28 (36,8 %) 12 (15,8 %) 1 (1,3 %) Tab. 2. Correlation between steatosis and histological necroinflammatory activity in CHC {p=0,006} (G 14 necroinflammatory activity degrees, S 0IV, steatosis degrees, S 0 steatosis not present) S 0 (not pres) S I (12 %) S II (310 %) S III (1130 %) S IV (>30 %) G G G G HEPATIC STEATOSIS AS A RISK FACTOR FOR REGENERATION LIVER POTENTIAL: ANALYSIS OF HISTOLOGICAL, BIOCHEMICAL AND MR SPECTROSCOPICAL FINDINGS. Bartoš, V. 1,4, Urdzik, J. 2, Bittšanský, M. 3, Slávik, P. 4, Fani, M. 2, Drgová, A Institute of Histology and Embryology JLF UK in Martin [email protected] 2. II. Clinic of Surgery JLF UK and MFN in Martin 3. Clinic of Radiodiagnostics JLF UK and MFN in Martin 4. Institute of Pathology JLF UK and MFN in Martin 5. Institute of Medical Biochemistry JLF UK in Martin INTRODUCTION : Liver steatosis is defined as a pathological accumulation of lipids in hepatocytes. It is often related to excessive alcohol intake, but recently is wellknown a nosological entity nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD). Primary form of NAFLD is especially caused by overweight or obesity, and there have been also reported association of hepatic steatosis with BMI (body mass index) of patients in many studies. Thus, in most cases, this frequent phenomenon reflects the various forms of impairment of the alimentary processes. Approximately 20 to 25 percent of slovak population suffer from NAFLD. The gold standard for diagnosis is considered a histological examination of hepatic tissue, but steatosis can be also detected noninvasivelly by imaging investigation methods (e.g. nuclear magnetic resonance, ultrasonography, computed tomography) or by biochemical evaluation of liver sample. THE AIM OF THE STUDY : The aim of this contribution was a presentation of our first experiences concerning a qualitative and quantitative evaluation of hepatic steatosis by 3 distinct examination procedures (histological, MR spectrosopical, and biochemical method). We compared these findings with each other and also BMI of patients with microscopically detected extent of steatosis. 31

33 MATERIAL AND METHODS : 22 patients (13 males, 9 females, average 61 yr) were included in the present study. All individuals suffered from primary or secondary liver tumors and were admitted to hospital (during 2006) to realize a surgical partial hepatic resection. The biopsy samples were fixed in buffered formalin, embedded in paraffin blocks, stained with hematoxylineosin and special histochemical methods and after complete processing examined in light miscoscopy by pathologists (in Institute of Pathology in Martin). We evaluated a steatosis (in nontumorous parts of the parenchyma) and other histomorphological parameters according to NAFLD scoring system proposed by Mendler. We categorised 4 grades of steatosis : I. (<5%), II. (533%), III. (3366%) and IV. (>66%). In 7 cases, there was performed a biochemical analysis of lipid substances from small liver specimen according to modified Flochs` method. In 9 cases, the extent of hepatic steatosis was detected in vivo by proton MR spectroscopy prior to operation. BMI wa s calculated by divi ding patients` weight (in kilograms) by h eight (in meters) squared. RESULTS : Histologically, we revealed 16 cases (72,7 %) of grade I. (including 5 patients with detected no fat acummulation), 4 cases (18, 2 %) of grade II., 2 cases (9,1 %) of grade III. and none case of grade IV. Clinically, we demonstrated 4 individuals (18,2 %) with BMI >30 (obesity), 6 individuals (27,3 %) with BMI 2529,9 (overweight) and 12 individuals (54,5 %) with BMI 18,524,9 (norm). The occurence of microscopically verified grade of steatosis in relationship to patients` BMI is presented in tab 1. In comparision of all three investigation procedures, there were just minimal differences in biochemical and spectroscopical findings (max. 2,9 %). On the contrary, we demonstated a significant discrepancies of the microscopical data with both previous methods (tab 2.). These can be explained by focal localisation of fatty changes in the liver. CONCLUSION : The tissue areas affected by steatosis are considered to be a nonfunctional part of the parenchyma that decrease functional hepatic reserve. An examination of steatosis grade prior to surg ical resection or immediatelly after operation in relation to the residual volum e is of great importance. Recently, there are following dis putable questions in surgical pra ctice. Does liver steatosis or steatohepatitis present a higher risk for postresectional hepatic dysfuntion or postoperative complications? Could BMI at least partially predict their occurence or suppose a liver regeneration status after operation? What is a concordance in the percetage of steatosis detected h istologically and by noninvasive methods? These questions will be focused on in futher steps of our prospective study. Tables This study was supported by Grant UK/270/2006. Tab 1. Relationship of BMI and microscopically verified steatosis prevalence of individual cases (B MI bod y mass index, grade I IV histological grades of steatosis) BMI (18,524,9) BMI (2529,9) BMI ( >30) grade I grade II grade III grade IV

34 Tab 2. Percentage of steatosis comparision of findings detected by 3 distinct methods (Mmales, Ffemales, IIII histological grades of steatosis) Sex age histology spectroscopy biochemistry M 73 I. (1 %) 1,6 % 0,5 % F 62 I. (3 %) 1,7 % 1,8 % M 66 II. (25 %) 1,4 % unrealized M 66 I. (0 %) 0,2 % 0,6 % M 55 I. (4 %) unrealized 3,0 % M 72 I. (1 %) 1,9 % unrealized F 41 II. (10 %) 0,3 % unrealized M 73 I. (2 %) 0,4 % 1,0 % M 57 III. (45 %) 5,2 % 2,3 % GENETIC DIVERSITY AMONG HORSE POPULATIONS USING MICROSATELLITE MARKERS Burócziová M. 1, Říha J. 1, Židek R. 2, Trandžík J. 2, Jakabová D. 2 1 Mendel University of Agriculture and Forestry, Brno, Czech Republic 2 State Breeding Institute, Nitra, Slovak Republic Abstract In the present study was estimate the genetic diversity and relationships among nine horses breeds in Czech and Slovak Republic. In conclusion, the main objective of study was to show the level of genetic distance among the horse breeds with different history of breeding of each country. Furthermore, it should be clarified whether these populations and subpopulations are distinct enough from each other to justify defining separate breeds. This research concerns the variability of microsatellite markers in genotypes of horse. We compared the genetic diversity and distance among nine horse breeds Czech and Slovak Warmblood both of Czech origin, Slovak Warmblood of Slovak origin, Hucul, Hafling, Furioso, Noriker, Silesian Noriker and BohemianMoravian Belgian Horse. In total, 932 animals were genotyped for 17 microsatellites markers (AHT4, AHT5, ASB2, HMS3, HMS6, HMS7, HTG4, HTG10, VHL20, HTG6, HMS2, HTG7, ASB17, ASB23, CA425, HMS1, LEX3) recommended by the International Society of Animal Genetics. In the different population size, the allele frequencies, observed and expected heterozygosity, test for deviations from HardyWeinberg equilibrium and Polymorphism information content have been calculated for each breed. We analyzed genetic distance and diversity among them on the base of the dataset of highly polymorphic set of microsatellites representing all autozomes using set of PowerMarker v3.25 analysis tools and Structure 2.2. programme for results comparison. Introduction Introduct on genetic characterization is important to guard breed integrity and conserve breed identity. Furthermore, it is a prerequisite for managing genetic resources (Bjørnstad&Røed 2002). Molecular techniques have been widely used to analyse phylogenetic 33

35 relationships among various animal groups and different breeds. Microsatellite loci comprise an attractive potential resource to determine population histories and evolutionary processes, as these loci permit simple and accurate typing in combination with high levels of polymorphism and widespread distribution in the genome. The usefulness of microsatellite markers has been documented in many previous equine population genetic studies (e.g. Cañon et al. 2000; ArangurenMéndez et al. 2001; Bjørnstad&Røed 2001; Cunningham et al. 2001). The present study is focused on using microsatellite markers to characterise genetic structure of horse populations in Czech Republic and Slovak Republic. Material and Methods Hair, blood and sperm samples were collected from 932 unrelated individuals of Czech Warmblood, Slovak Warmblood, Slovak Warmblood origin from Slovakia, Hucul, Hafling, Furioso, Noriker, Silesian Noriker and BohemianMoravian Belgian Horse. Genomic DNA was isolated using the JETQUICK Tissue DNA Spin Kit and JETQUICK Blood&Cell Culture DNA Spin Kit (Genomed GmbH, Germany), by following the Protocol Handbook. Determination of microsatellites was performed using the PCR reaction with 17plex horse genotyping kit designed by Applied Biosystems StockMarks (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). The genotyping of microsatellite markers was performed on ABI PRISM 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) by fluorescent fragment analysis and detected by software GeneScan 3.7 NT. Alleles were asigned by GENOTYPER. Alleles were assingned to alphabetical symbols (B, C, F, G, H, I, J, K, L, M, N, O, P, Q, R, S). Genetic variability of each horse breeds was calculated as number of alleles (N A ) per microsatellite, observed heterozygosity (H o ), expected heterozygosity (H E ), Polymorphism information content (PIC) under HardyWeinberg equilibrium (Table 1). PowerMarker v was used for noted analysis. Nei s standard distance was measured for graphs construction using PhyloDraw V0.82 programme and Structure 2.2 programme for figure construction. The breeds were divided into two subgroups war mbloods (Czech Warmblood, Slovak Warmblood, Slovak Warmblood origin from Slovakia, Hucul, Furioso) and coldbloods (Noriker, Silesian Noriker BohemianMoravian Belgian horse, Hafling). Results and Discussion The total number of alleles was 168 across the 17 microsa tellites. The number of alleles per locus ranged from 6 (HMS6) to 15 (ASB17). In the data set of all individuals, the average number of alleles was The average observed heterozyg osity of warmblood horses ranged from (Czech W armblood) to (Furioso), in the coldblood populations varied from (BohemianMoravian Belgian Horse) to (Table 1). Gene diversity (H e ) varied in warmblood horses fr om (Hucul) to (Slovak Warmblood origin from Slovakia ) and coldblood breeds from (Hafling) to (Noriker). The Polymorphism information content PIC ranged from (Hafling) to (Slovak Warmblood origin from Slovakia). 34

36 Table 1 Average number of alleles per locus, Heterozygosity H o observed. H e expected heterozygosity, Average polymorphism information content PIC Breed Average no. of alleles per locus Ho He PIC Czech Warmblood (CW) Slovak Warmblood (SW) Slovak Warmblood origin from Slovakia (SWSR) Hucul (HUC) Furioso (FUR) Hafling (HFLG) Noriker (NOR) Silesian Noriker (SLN) BohemianMoravian Belgian Horse (BMBH) Figure 1 The diversity and population structure of nine horse breeds using Structure 2.2. programme.each individual is represented by one thin vertical line and each breed is characterized by one color. SW CW NOR BMBH SLN HFLG HUC FUR SWSR Graph 1 The UPGMA dendograms was construced from Nei s standard genetic distance (1972), summarizing genetic distance among 932 horses based on 17 microsatellites. 35

37 The Bayesian approach detects not only population structures by the identification of clusters, but also allows a probabilistic estimate of the proportion with which an individual belongs to one of the inffered clusters (GlowatzkiMullis et al. 2005). However, a many andmixtures of different memberships were found in breeds. Hafling horses had partial membership with BohemianMoravian Belgian Horse what was unexcepted result.we identified a potential outbreeding in these two breeds as a result of deficient pedigree verification or non correct purebreeding. The Czech Warmblood, Slovak Warmblood, Slovak Warmblood origin from Slovakia and Furioso clustered together. Warmblood horses in Czech and Slovak Republic are formed from local breeds with high introgression of European Warmblood, in Czech Republic is unbalanced mating and in Slovakia is mating based on the Furiosso breed (Figure 1). Graph 1,2 shows high similarity among Czech Warmblood, Slovak Warmblood, Slovak Warmblood origin from Slovakia and Furioso populations because of opened populations for a number of generations and similar history of breeding programs. Another possible reason of high diversity is a small effort for breeding programe in these populations. Graph 1 shows the Hucul breed is the most homogenous from all of the breeds, as we expected. The Hucul stud book is considered as closed, pureblooded breeding is using strictly pure lines of Hucul breed. Graph 2 The neighbourjoining trees was construced from Nei s standard genetic distance (1972) mine horse populations. This work was supported by grant FRVS FR References ArangurenMéndez J., Jordana J. & Gomez M., Genetic diversity in Spanish donkey breeds using microsatellite DNA markers. Genetics Selection Evolution 33: Bjørnstad G., Røed K. H, Evaluation of factors affecting individual assignment precision using microsatellite data from horse breeds and simulated breed crosses. Animal Genetics 33: Cañon J., Checa M.L., VegaPla J.L., Vallejo M. & Dunner S., The genetic structure of Spanish Celtic horse breeds inferred from microsatellite data. Animal Genetics 31: Cunningham E. P., Dooley J. J., Splan R. K., Bradley D. G. (2001) Microsatellite diversity, pedigree relatedness and the contributions of founder lineages to thoroughbred horses. Animal Genetics 32, GlowatzkiMullis M. L., Muntwyler J., Pfister W., Marti E., Rieder S., Poncet P.A., Gaillard C. (2007) Genetic diversty among horse populations with a special focus on the Frenches Montagnes breed. Animal Genetics 37,

38 Liu K., Muse S. V., PowerMarker: Integrated analysis enviroment for genetic marker data. Bioinformatics 21(9): Software PowerMarker 3.25 available at: Pritchard J.K., Stephens M., Donnelly P. (2000) Inference of population structure using multilocus genotype data. Genetics 155, Software Structure 2.2 available at: Contact address: Monika Burocziova MSc., Mendel University of Agriculture and Forestry Brno, Zemedelska 1, Brno, , Czech Republic, phone: STANOVENIE RIZIKOVÝCH PRVKOV V PÔDACH LOKALÍT BREKOV A DUNAJSKÁ STREDA VYUŽITÍM SELEKTÍVNEJ SEKVENČNEJ EXTRAKCIE PODĽA ZIEHENA A BRÜMMERA THE ASSESSMENT OF TRACE ELEMENTS IN SOILS OF AREAS BREKOV AND DUNAJSKÁ STREDA WITH USED SEQUENTIAL EXTRACTION BY ZIEHEN AND BRÜMMER J. Čéry, T. Tóth, S. Melicháčová, M. Timoracká Katedra chémie, Fakulta biotechnológie a potravinárstva, Slovenská poľnohospodárska univerzita v Nitre, Slovenská republika Abstract Total content of heavy metals included whole forms, where risky element is occur in soil. Greater value has determined total content of risky element in most pollution soils, where are higher rate of correlation among content of elements in soil and plant. By the specific conditions (variety of soil reaction) could most slight changeable fraction of heavy metals get into the changeable fraction, what can negatively affected the food chain. For determination of specific bounds of risky elements in soil, we had utilized selective sequential extraction by Ziehen and Brumer. Specific bounds are composed by followed fractions: mobile fractions of heavy metals, pot ential mobile form of heavy metals, fraction which is bind at Mn oxides, fraction which is bind at organic matter, fraction which is bind at Fe oxides and residual fraction. Results confirmed generally valid rule, that potential availability of heavy metals to plants is in negatively correlation with value of soil reaction and it is negatively affected by changeable soil reactions. Úvod Ekologické správanie sa stopových prvkov v pôde je len v malej miere určované ich celkovým obsahom a vo vyššej miere ich mobilnými frakciami. Ich vlastnosti korelujú s pôdnou hodnotou ph, voľných oxidov, ílu a humusu, redukčnooxidačným potenciálom, atď. Selektívna sekvenčná extrakcia (SSE) umožňuje postupnou extrakciou z jednej navážky pôdy extrahovať rôznymi extrakčnými činidlami frakcie ťažkých kovov s charakteristickou väzbou na jednotlivé pôdne komponenty. SSE je exaktná a reprodukovateľná technika, s určitou toleranciou, čo sa týka selektivity extrahovaných frakcií. SSE neumožňuje špecifikovať presné zlúčeniny ťažkých kovov, stanovuje len ich podiel viazaný definovaným spôsobom s určitými zložkami pôdy Yong (1992). Sekvenčná analýza sa opiera o teoretické výskumy väzieb stopových prvkov v pôde. Jej význam spočíva v tom, že umožňuje všestranné hodnotenie špecifikácie väzieb stopových prvkov v rôznych pôdnych typoch a ich substrátových formách, a tým aj posúdenie možností ich ovplyvnenia. 37

39 Materiál a metódy V uvádzanej práci sme sledovali dva pozemky, ktoré sú poľnohospodársky intenzívne využívané. Reprezentujú dve rozdielne oblasti, ktoré sú charakteristické rôznym stupňom kontaminácie, rôznymi pôdnymi vlastnosťami a rôznou lokalizáciou. Ide o pozemok z južného Slovensk a (okres Dunajská Streda) a o pozemok z východného Slovenska (okres Humenné). Vzor ky pôdy sme odobrali z hĺbky 0 0,1 m a 0,1 0,3 m podľa metodiky Linkeša (1997) pre Monitoring pôd Slovenskej republiky za pomoci GPS lokalizácie a navigácie z určených odberných miest. Pre túto prácu boli zámerne vybrané vzorky pôdy s rôznym obsahom ťažkých kovov a pôdnou reakciou, aby bolo možné jednoznačne poukázať na vplyv ph pôdy na mobilitu a hlavne bioprístupnosť rizikových prvkov pre rastliny. Pre hodnotenie reálneho hygienického stavu nie je dôležitý totálny obsah týchto prvkov v pôde, ale tie formy, ktoré sú pre rastliny z pôdy bioprístupné. Prvý záujmový pozemok sme vybrali z lokality Dunajská Streda, ktorý sa nachádza približne 750 m severne od mesta Dunajská Streda. Lokalizačné koordináty pozemku sú: 47 59,722 severnej šírky (φ) a 17 38,053 východnej dĺžky (λ). Jeho rozloha je 9,1 ha. Na pozemku bolo určených 6 odberných miest. Parcelné identifikačné číslo je 6101/2. Bonitovaná pôdnoekologická jednotka tohto pozemku je Pôdny typ ČMč c černozem čiernicová karbonátová a pôdny druh stredne ťažká hlinitá. Druhý pozemok sa nachádza na východnom Slovensku v okrese Humenné, v extraviláne mesta Humenné, približne 500 m juhozápadne od mesta Humenné. Lokalizačné koordináty pozemku sú: 48 55,273 severnej šírky (φ) a 21 52,119 východnej dĺžky (λ). Jeho rozloha je 13,4 ha. Na pozemku bolo určených 8 odberných miest. Parcelné identifikačné číslo je 6806/1. Bonitovaná pôdnoekologická jednotka tohto pozemku je Pôdny typ FMG fluvizem glejová a pôdny druh ťažká ílovitohlinitá. Selektívna sekvenčná analýza sa opiera o teoretické výskumy väzieb stopových prvkov v pôde a umožňuje všestranné hodnotenie väzieb stopových prvkov na rôzne pôdne komponenty.. Selektívnou sekvenčnou extrakciou sme stanovili sedem frakcií. I. frakcia mobilná (NH 4 NO 3, c = 1 mol.dm 3 ) II. frakcia ľahko mobilizovateľná (NH 4 OAc, c = 1 mol.dm 3, ph 8,0) III. frakcia okludovaná na oxidy Mn (NH 2 OHHCl, c = 0,1 mol.dm 3 + NH 4 OAc, c = 1 mol.dm 3, ph 6,0) IV. frakcia viazaná na organickú hmotu (NH 4 EDTA, c = 0,025 mol.dm 3, ph 4,6) V. frakcia viazaná na amorfné oxidy Fe (oxalát amónny, c = 0,2 mol.dm 3, ph 3,25) VI. frakcia viazaná na kryštalické oxidy Fe (kys. askorbová c = 0,1 mol.dm 3 + oxalát amónny, c = 0,2 mol.dm 3, ph 3,25) VII. frakcia reziduálna frakcia (HNO 3 + HF + HClO 4 ) V pôdnych vzorkách sme stanovili obsah sledovaných rizikových prvkov (Cd, Zn, Ni, Cr, Cu, Pb a Co) hlavných pôdnych jednotiek: čiernozem (ČMč) (oblasť Dunajská Streda), fluvizem glejová (FMG) (oblasť Humenné). Pre hodnotenie rizika mobility a prechodu 38

40 rizikových prvkov sme vykonali analýzy na zistenie výmennej pôdnej reakcie ph/kcl ako dôležitého faktora, ovplyvňujúcich správanie sa rizikových prvkov v systéme pôda rastlina. Analytickou koncovkou bola atómová absorpčná spektrofotometria (AAS). Výsledky a diskusia Na pozemku Dunajská Streda sa hodnoty výmennej pôdnej reakcie pohybovali v intervale 7,57 7,84. Z uvedeného úzkeho spektra hodnôt vyplýva, že v danej lokalite sú pôdy alkalické až silne alkalické. V I. a II. frakcii (horizont A) (Obr.1) v oblasti Dunajská Streda vylúhovateľnosť kovov v % z celkového obsahu klesá v nasledovnom poradí: Cd > Co > Zn > Pb > Ni > Cu > Cr (I.frakcia), Cd > Co > Zn > Ni > Cr > Pb > Cu (II.frakcia). Najväč ší podiel z celkového obsahu tvorí Cd: 11% (I.frakcia), 25 % (II.frakcia) v pôde (horizont A) z oblasti Dunajská Streda. V horizonte B (Obr.2) prístupné formy sledovaných rizikových prvkov klesajú v poradí: Cd > Co > Pb > Zn > Ni > Cr > Cu (I.frakcia), Cd > Co > Zn > Ni > Pb > Cr > Cu (II.frakcia). Z celkového obsahu najväčší podiel tvorí Cd: 8,5% (I.frakcia), 25,28 % (II.frakcia) v pôde (horizont A) z oblasti Dunajská Streda. Najnižší podiel tvorí Cu, čo predstavuje 0,8 % z celkového obsahu (I.frakcia, II.frakcia). Frakcie okludované na oxidy Mn, viazané na organické látky a viazané amorfnými oxidmi Fe predstavujú potenciálne prístupné formy rizikových prvkov pre rastlinu. V horizonte A (oblasť Dunajská Streda) potenciálne prístupné formy rizikových prvkov klesajú v poradí: Pb > Cd > Zn > Ni > Co > Cr > Cu (III.frakcia), Cd > Cu > Pb > Co > Zn > Ni > Cr (IV.frakcia), Cu > Ni > Pb > Co > Cr > Zn > Cd (V.frakcia). V horizonte B možno sledované kovy zoradiť v nasledovnom poradí: Pb > Cd > Ni > Co > Cr > Zn > Cu (III.frakcia), Cd > Pb > Cu > Co > Ni > Zn > Cr (IV.frakcia), Cu > Ni > Pb > Cd > Cr > Co > Zn (V.frakcia). Frakcia kovov viazaná na kryštalické oxidy Fe a reziduálna frakcia predstavuje najmenej mobilné formy vo vzťahu pôda rastlina. Reziduálna frakcia predstavuje zmes silných kyselín, ktoré sa používajú na rozrušenie pevných väzieb ťažkých kovov prevažne so silikátovými väzbami a iným rezistentným materiálom. Rad kovov (horizont A) v oblasti Dunajská Streda klesá v poradí: Cr > Ni > Zn > Co > Cu > Pb > Cd (VI.frakcia), Cr > Zn > Ni > Pb > Co > Cu > Cd (VII.frakcia), (horizont B): Cr > Ni > Co > Zn > Cu > Pb > Cd (VI.frakcia), Cr > Zn > Ni > Co > Pb > Cu > Cd (VII.frakcia). 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% Cd Pb Cu Cr Zn Ni Co VII.frakcia VI.frakcia V.frakcia IV.frakcia III.frakcia II.frakcia I.frakcia Obr.1 Výsledky sekvenčnej analýzy rizikových prvkov v jednotlivých frakciách v oblasti Dunajská Streda, horizont A 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% Cd Pb Cu Cr Zn Ni Co VII.frakcia VI.frakcia V.frakcia IV.frakcia III.frakcia II.frakcia I.frakcia 39

41 Obr.2 Výsledky sekvenčnej analýzy rizikových prvkov v jednotlivých frakciách v oblasti Dunajská Streda, horizont B Pozemok z okresu Humenné sa vyznačoval podstatne širším intervalom hodnôt ph/kcl 4,08 5,75. Pôdu tohto pozemku je možné charakterizovať ako slabo kyslú až extrémne kyslú. Mobilné formy kovov obsiahnuté v I. a II. frakcii (horizont A) (Obr.3) klesajú v nasledovnom poradí: Cd > Zn > Ni > Pb > Co > Cu > Cr (I.frakcia), Cd > Zn > Co > Pb > Cu > Ni > Cr (II.frakcia). Najväčšie množstvo rizikových prvkov z celkového obsahu tvorí Cd: 35 % (I.frakcia), 11,92 % (II.frakcia) v pôde (horizont A) z oblasti Humenné. V horizonte B (obr.4) mobilné formy sledovaných rizikových prvkov klesajú v poradí: Cd > Zn > Ni > Co > Pb > Cu > Cu (I.frakcia), Cd > Zn > Co > Ni > Cu > Pb > Cr (II.frakcia). Z celkového obsahu najväčší podiel tvorí Cd: 32,5 % (I.frakcia), 11,94 % (II.frakcia) v pôde (horizont A) z oblasti Humenné. Potenciálne prístupné formy ťažkých kovov, ktoré sú zastúpené v III, IV,V. frakcii sú v horizonte A zoradené v nasledovnom poradí: Pb > Co > Cd > Cr > Ni > Cu > Zn (III.frakcia), Pb > Co > Cu > Cd > Ni > Cr > Zn (IV.frakcia), Cu > Pb > Co > Cd > Cr > Ni > Zn (V.frakcia). V horizonte B možno sledované kovy zoradiť: Pb > Co > Cd > Ni > Cr > Cu > Zn (III.frakcia), Pb > Co > Cu > Cd > Ni > Cr > Zn (IV.frakcia), Cd > Pb > Cu > Co > Cr > Ni > Zn (V.frakcia). Najväčší podiel z celkového obsahu u kovoch viazaných na Mn oxidy a v kovoch viazaných na organickú hmotu má Pb v horizonte A 9,95 % (III.frakcia), 24,88 % (IV.frakcia), horizonte B 7,04 % (III.frakcia), 19,59 % (IV.frakcia). Reziduálna frakcia a kovy viazané na kryštalické Fe oxidy v horizonte A klesajú v poradí: Co > Pb > Ni > Cr > Cu > Zn > Cd (VI.frakcia), Cr > Zn > Ni > Cu > Co > Cd > Pb (VII.frakcia). V horizonte B možno sledované kovy klesajú v poradí: Co > Ni > Cu > Zn > Cd > Cr > Pb (VI.frakcia), Cr > Zn > Ni > Cu > Co > Pb > Cd (VII.frakcia). 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% Cd Pb Cu Cr Zn Ni Co VII.frakcia VI.frakcia V.frakcia IV.frakcia III.frakcia II.frakcia I.frakcia Obr.3 Výsledky sekvenčnej analýzy rizikových prvkov v jednotlivých frakciách v oblasti Humenné, horizont A 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% Cd Pb Cu Cr Zn Ni Co VII.frakcia VI.frakcia V.frakcia IV.frakcia III.frakcia II.frakcia I.frakcia Obr.4 Výsledky sekvenčnej analýzy rizikových prvkov v jednotlivých frakciách v oblasti Humenné, horizont B 40

42 Záver Z hodnotenia frakcií Cd, Zn, Ni, Cr, Cu, Pb a Co z dvoch sledovaných oblastí vyplýva priamy vplyv ph na mobilitu, a hlavne bioprístupnosť rizikových prvkov pre rastliny. Pôdy z oblasti Humenné (ph 4,08 5,75) majú sumu obsahov najmobilnejších frakcií v oboch horizontoch vyššiu oproti porovnávanej pôde oblasti Dunajská Streda (ph 7,57 7,84). Skúmané pôdy preto z hľadiska celkového obsahu najmobilnejších frakcií ťažkých kovov môžeme zoradiť v poradí FMG > ČMč. Cd, Co a Pb má najvyššie zastúpenie v mobilnej a ľahko mobilizovateľnej frakcie v horizontoch A, B v oboch skúmaných oblastiach, čo môže mať veľmi výrazný vplyv na bioprístupnosť prvkov v potravovom reťazci. Výsledky potvrdzujú všeobecne platné pravidlo, že potenciálna prístupnosť ťažkých kovov rastlinám je v nepriamej úmere s hodnotou pôdnej reakcie. Literatúra Linkeš, V Monitoring pôd Slovenskej republiky. In: Súčasný stav monitorovaných vlastností pôd. VÚPÚ, Bratislava, 1997, 128 s.. Yong, R.N. Mohamed, A.M.O. Warkentin, B Principles Contaminant Transport in soil. Elsevier, 1992 Táto práca vznikla vďaka finančnej podpore projektu VEGA č. 1/2428/05 Kontaktná adresa: Ing. Juraj Čéry SPU, FBP, Katedra chémie, [email protected] VPLYV NIKLU A ZINKU NA NUMERICKÉ ZMENY CHROMOZÓMOV KRÁLIKA EFFECT OF NICKEL AND ZINC ON RABBIT NUMERICAL CHROMOSOMAL ABBERATIONS Čurlej J 1,2., Massanyi P 2., Chrenek P 1. 1 Oddelenie genetiky a reprodukcie hospodárskych zvierat, Slovenské centrum poľnohospodárskeho výskumu, Hlohovská 2, Nitra, Slovenská Republika 2 Katedra fyziológie živočíchov, Fakulta biotechnológie a potravinárstva, Slovenská poľnohospodárska univerzita v Nitre, Trieda A. Hlinku 2, Nitra, Slovenská Republika Abstract The aim of the study was to determine any negative effects of nickel and zinc on rabbit numerical chromosomal abberations. Nickel and zinc were added in specific concentrations: P1: 17,5 g NiCl 2 ; P2: 35 g NiCl 2 ; P3: 17,5 g NiCl g ZnCl 2 ; P4: 35 g NiCl g ZnCl 2 to 100 kg of complete feed and feeding during three months in four groups. Chromosomes in metaphase stage were isolated from cultivated blood lymphocytes, synchronised by addition of colcemide. Experimental animals from P2 group exhibited statistical high difference (p<0,001) in aneuploid cells occurence in comparision to control group. Rabbits from P4 group shown on statistical difference (p<0,05) in chromosomal aneuploidy in comparision to control one. Our results point on negative effect of NiCl 2 added in concentration 35g/100kg of complete feed which led to increase of chromosomal abberations, on the other hand ZnCl 2 in concentration 30g/100 kg of complete feed stand a role as a particular inhibitor of negative NiCl 2 effect. Key words: Rabbit, Nickel, Zinc, Aneuploidy Abstrakt Cieľom experimentu bolo zistiť možný negatívny vplyv pôsobenia niklu a zinku na výskyt numerických chromozomálnych aberácii králikov, kovy boli pridané v koncentráciách P1: 17,5 g NiCl 2 ; P2: 35 g NiCl 2 ; P3: 17,5 g NiCl g ZnCl 2 ; P4: 35 g NiCl g ZnCl 2 na 100 kg kŕmnej zmesi a podávané počas troch mesiacov králikom zadelených do štyroch skupín P1P4. Metafázne chromozómy boli izolované z kultivovaných lymfocytov krvi, synchronizované prídavkom cytostatika kolcemid. Experimentálna skupina P2 vykázala vysoko preukazný 41

43 rozdiel (p<0,001) v aneuploidii v porovnaní s kontrolnou skupinou zvierat. Zvieratá zadelené do P4 skupiny vykázali preukazne vyššie zastúpenie aneuploidných buniek (p<0,05) voči kontrolnej skupine. Z našich výsledkov vyplýva, že koncentrácia 35g NiCl 2 podávaná počas 3 mesiacov výrazne negatívne ovplyvňuje chromozomálne aberácie, na druhej strane koncentrácia 30g ZnCl 2 čiastočne pôsobila ako inhibítor negatívneho pôsobenia niklu. Kľúčové slová: králik. nikel. zinok. aneuploidia Úvod Ťažké kovy patria medzi významné rizikové faktory životného prostredia. Malé množstvá týchto kovov sú bežnou súčasťou životného prostredia, potravín a zároveň sú nevyhnutnými pre zdravie jedincov. V dôsledku rozvoja priemyslu hladiny ťažkých kovov v životnom prostredí vzrastajú, ich vysoké dávky môžu vyvolávať akútnu či chronickú toxicitu (otravy). Toxicita vyvolaná ťažkými kovmi môže viesť k poruchám centrálnej nervovej sústavy, k poruchám krvotvorby, poškodeniu pľúc, obličiek, pečene a ďalších vitálnych orgánov. Dlhodobá expozícia voči týmto kovom môže viesť k psychickým, svalovým a neurologickým degeneratívnym procesom imitujúcim ochorenia ako sú Alzeimer, Parkinson, Svalová dystrofia a Skleróza multiplex. Rovnako dlhodobé pôsobenie ťažkých kovov môže viesť k tvorbe nádorových ochorení (Baldwin a kol. 1999). Ťažké kovy sa stávajú toxickými ak ich organizmus nedokáže využiť či vylúčiť, akumulujú sa v mäkkých tkanivách. Vstupnými bránami pre ťažké kovy sa stávajú potraviny, voda, vzduch respektíve sú absorbované pokožkou pri kontakte s nimi vo forme poľnohospodárskych, priemyselných či farmaceutických prípravkov. Jedným z aktuálnych ťažkých kovov je aj zinok a nikel. Zinok je súčasťou viac ako 200 enzýmov tela, vrá tane RNA a DNA polymeráz (Baldwin a kol. 1999, mmanual/section1/chapter4.htm). Jeho funkcia ako cytoprotektívum je v súčasnosti v centre záujmu mnohých výskumných úloh. Nikel ako esenciálny prvok je žiadúci len v malých množstvách. Nadbytočný príjem niklu spôsobuje poškodenie chromozómov a ďalších bunkových štruktúr, mení aktivitu hormónov a enzýmov, pôsobí na permeabilitu membrány a imunitný systém. Nadbytočný príjem niklu spôsobuje poškodenie chromozómov a dalších bunkových bunkových štruktúr, mení aktivitu hormónov a enzýmov, pôsobí na premeabilitu membrány a imunitný systém. Rovnako môže vyvolávať zmeny v metabolizme cukrov, tlaku krvi, rezistencii na stres, indexe rastu, vývine kostí a odolnosti voči infekciám. Toxicita niklu závisí od chemickej formy v ktorej sa prvok nachádza (Williams et al. 1999). Cieľ Cieľom experimentu bola cytogenetická analýza negatívneho pôsobenia niklu a zinku v rôznych koncentráciách analýzou metafáznych chromozómov izolovaných od králikov zo štyroch experimentálnych skupin P1P4, kŕmených presne definovanou koncentráciou ZnCl 2 a NiCl 2. Materiál a metódika V našich experimentoch sme použili králiky brojlerových línií novozélandského a kalifornského plemena z chovu SCPV Ústav malých hospodárskych zvierat Nitra. Králiky boli ustajnené v uzavretých priestoroch v jednopodlažných individuálnych kovových klietkach štandardných rozmerov. Zvieratá zadelené do skupín P1P4 boli kŕmené komplexnou kŕmnou zmesou KK V1 s prídavkom nikla a zinku v rôznych koncentráciách podľa skupiny po dobu troch mesiacov: P1 17,5 g NiCl 2 na 100 kg KZ P2 35 g NiCl 2 na 100 kg KZ P3 17,5 g NiCl g ZnCl 2 na 100 kg KZ P4 35 g NiCl g ZnCl 2 na 100 kg KZ Vodu mali k dispozícií z automatických napájačiek. Izolácia a kultivácia lymfocytov periférnej krvi 42

44 Odobratú krv z ucha sme pridali do 2ml média PB MAX Karyotyping (Gibco BRL) a kultivovali 72 hodín. Jadrá buniek sme synchronizovali cytostatikom KaryoMAX Colcemid Solution (Gibco BRL) počas 60 minút po čom nasledovala hypotonizácia 0,075M roztokom KCl po dobu 20 minút. Na fixáciu sme použili fixátor (metano l : kys. octová v po mere 3:1) 3x. Po poslednej centrifugácii sme odstránili prebytočný supernatant. Takto pripravený pelet buniek sme použili na chromozomálnu analýzu. Príprava preparátov na analýzu Na vopred vyčistené a vychladené podložné sklíčko sme aplikova li 2 až 3 kvapky resuspendovaného peletu buniek. Na GiemsaRomanowski farbenie sme použili 2 % roztok Giemsa. Pripravené prepa ráty sme vložili do kyvety s farbivom a farbivo nechali pôsobiť 5 minút. Po uplynutí 5 minút sme preparáty opláchli destilovanou vodou a nechali uschnúť. Analýza vzoriek Vzorky sme analyzovali použitím fluorescenčného mikroskopu Leica pri 40 násobnom zväčšení. Od každého králika sme získali viac ako 30 záberov metafáznych chromozómov, ktoré boli prenesené prostredníctvom kamery pripojenej k mikroskopu do počítača, kde sme následne rátali počty chromozómov 30. metafáz od každého jedinca. Štatistické spracovanie výsledkov Na hodnotenie chromozomálnej aneuploidie sme použili chíkvadrát test. Výsledky Získané výsledky poukazujú na vysoko preukazný rozdiel (p<0,001) v zastúpení aneuploidných buniek medzi pokusnou skupinou P2 a kontrolnou skupinou (44,44 vs. 26,77%) a na preukazný rozdiel (p<0,05) medzi pokusnou skupinou P4 a kontrolnou skupinou (40 vs. 26,77%). Pokusné skupiny králikov P1 a P3 nevykázali preukazný rozdiel v zastúpení aneuploidných buniek v porovnaní s kontrolou. Na aneuploidii sa podieľali bunky zo skupiny hypodiploidné. Tabuľka 1. Numerické chromozomálne aberácie v jednotlivých pokusných skupinách Skupina zvierat Aneuploidia (%) Hypodiploidia Hyperdiploidia Suma (%) Diploidia (%) Polyploidia (%) Pokusné skupiny zvierat P1 66, , ,33 P2 55, , ,44 a P3 68, , ,25 P b Kontrolné skupiny zvierat N 71,75 1,67 26, ,77 c a vs c (p<0,001), b vs c (p<0,05) Záver Na základe získaných výsledkov možno konštatovať, že príjem niklu vo forme NiCl 2 a koncentrácii 35g na 100 kg kŕmnej zmesi negatívne vplýva na zvýšený výskyt numerických chromozomálnych aberácii už po trojmesačnom kŕmení. Prídavok zinku vo forme ZnCl 2 a koncentrácii 30g na 100 kg kŕmnej zmesi čiastočne pôsobí ako protektor voči negatívnemu pôsobeniu niklu. Literatúra Baldwin DR, Marshall WJ. Heavy metal poisoning and its laboratory investigation (review article). Annals of Clinical Biochemistry 1999; 36:

45 The Merck manual of diagnosis and therapy: Metal nutrients and toxicity, Williams F, Robertson R, Roworth M. Scottish Centre for Infection and Environmental Health: Detailed profile of 25 major organic and inorganic substances. 1 st ed. Glasgow: SCEIH; [email protected]; [email protected]; [email protected] VÝSKYT POTENCIÁLNE TOXINOGÉNNYCH DRUHOV RODU ASPERGILLUS A JEHO TELEOMORF V POTRAVINÁRSKEJ PŠENICI DOMÁCEHO PÔVODU V ÚRODE 2006 OCCURRENCE OF POTENTIALLY TOXIGENIC SPECIES OF GENUS ASPERGILLUS AND ITS TELEOMORPHS IN FOOD WHEAT OF SLOVAK ORIGIN HARVESTED IN 2006 Dovičičová, M., Tančinová, D., Labuda, R. Katedra mikrobiológie, Fakulta biotechnológie a potravinárstva, Slovenská poľnohospodárska univerzita, Tr. A. Hlinku 2, Nitra; [email protected] Abstract From the total number of 147 identified isolates of genus Aspergillus and its teleomorphs isolated during mycological investigation of wheat of Slovak origin harvested in year 2006, 116 belonged to potentially toxigenic species. Totally 65 isolates of Aspergillus clavatus, A. flavus, A. niger, A. ochraceus, A. versicolor, Emericella nidulans, Eurotium amstelodami and E. chevalieri were tested in vitro for production of selected mycotoxins by means of thin layer chromatography. Production of cyclopiazonic acid was detected in 16 isolates, while patulin and sterigmatocystin each in two isolates. None of isolates tested showed production of aflatoxin B 1 and ochratoxin A in amounts detectable by the method used in this study. Key words: wheat, Aspergillus, mycotoxins, thin layer chromatography Úvod Podľa odhadu organizácie pre potraviny a poľnohospodárstvo (FAO) je každoročne takmer 25 % z celkovej svetovej produkcie obilnín kontaminovaných mykotoxínmi [15]. Detekcia hubových kontaminantov v potravinách je preto dôležitá pre potvrdenie bezpečnosti a vysokej kvality potravín. Počas skladovania obilných zŕn je rast vláknitých mikroskopických húb a produkcia mykotoxínov výsledkom kombinácie viacerých faktorov, ako sú poškodenie rastlinného materiálu, teplota, plyny (O 2 a CO 2 ), vlhkosť, veľkosť inokula, doba skladovania a prítomnosť iných mikroorganizmov [1,6]. Medzi skladové huby v podmienkach mierneho pásma patria najčastejšie druhy rodov Aspergillus a Penicillium [7,12]. Ich mykotoxíny sa nachádzajú v potravinách a nepodliehajú degradácii pri bežnom priemyselnom spracovaní alebo pri varení, pretože sú termostabilné [4]. Pojmom mykotoxín sa označujú farmakologicky aktívne sekundárne metabolity vláknitých mikroskopických húb, chrakteristické toxickým účinkom na stavovce [2]. Produkcia jednotlivých mykotoxínov sa všeobecne vzťahuje na relatívne nízky počet druhov a môže byť druhovo alebo kmeňovo špecifická [5]. Mykotoxíny môžu byť prítomné v mycéliu a spórach mikroskopickej huby (intracelulárne); alebo sú vylučované do prostredia v okolí huby (extracelulárne) [5]. Tvorbe mykotoxínov v potravinách sa dá zabrániť prevenciou rastu ich producentov [3]. Prehľad mykotoxínov, produkovaných druhmi rodu Aspergillus vrátane teleomorf je obsiahnutý v prácach Frisvad et Thrane Frisvad et al. [8], Klich [9], Samson et al. [17] a i. Cieľom práce bola detekcia toxinogénnych druhov rodu Aspergillus, vrátane príslušných teleomorf a testovanie vyizolovaných izolátov na schopnosť produkovať vybrané mykotoxíny v podmienkach in vitro. 44

46 Materiál a metodika Vzorky pšenice letnej (Triticum aestivum L.) pochádzali z viacerých regiónov Slovenska. Celkovo bolo analyzovaných 6 vzoriek dopestovaných konvenčným spôsobom a 12 vzoriek ekologickým spôsobom v sezóne 2005/ Izoláty vláknitých mikroskopických húb boli získané z analýz endogénnej a povrchovej mykoflóry a mykoflóry šrotovaného zrna. Endogénna kontaminácia bola zisťovaná po priamej kultivácii povrchovo sterilizovaných pšeničných zŕn na DRBC (agar s dichlóranom, chloramfenikolom a bengálskou červenou; Merck, Nemecko; 100 zŕn) a DYSG (agar s dichlóranom, chloramfenikolom, kvasničným extraktom a glycerolom [11]; 100 zŕn). Povrchová sterilizácia prebiehala pôsobením 0,4 % roztoku chloramínu po dobu dvoch minút. Následne boli zrná tri krát prepláchnuté sterilnou destilovanou vodou. Na vyšetrenie povrchovej mykoflóry a mykoflóry šrotovaného zrna bola použitá platňová zrieďovacia metóda; na získanie základného riedenia bolo 20 g celého resp. šrotovaného 3 pšeničného zrna vytrepaných na horizontálnej trepačke v 180 cm sterilnej peptónovej vody, obsahujúcej 0,02 % Tweenu 80. Príslušné riedenia boli v množstve 1 ml povrchovo naočkované na DRBC a agar so sladinovým extraktom. Kultivácia prebiehala vo všetkých prípadoch 5 7 dní v tme pri teplote 25 ± 1 C. Ako identifikačné živné pôdy boli pre zástupcov rodu Aspergillus a príslušných teleomorf použité CYA (Czapkov agar s kvasničným extraktom [13]), CY20S (Czapkov agar s kvasničným extraktom a 20 % sacharózy [13]) a MEA (agar so sladinovým extraktom [17]). Identifikácia prebiehala podľa Klich [13], a Samson et al. [17]. V čistých kultúrach kmeňov potenciálne toxinogénnych druhov bola v in vitro podmienkach stanovovaná schopnosť produkovať vybrané mykotoxíny pomocou tenkovrstvovej chromatografie (TLC). Z čistých kultúr boli lancetou z kolónií vyrezané tri kúsky mycélia so živnou pôdou (CYA pre intracelulárne toxíny a YES pre extracelulárne toxíny; agar s kvasničným extraktom a sacharózou [17]) s celkovou plochou približne 1 cm 2. Výseky boli prenesené do 2 ml Eppendorfovej skúmavky, následne bolo pridaných 0,5 ml chloroformmetanolovej zmesi (2:1 v/v) a obsah skúmavky bol 2 minúty trepaný na vortexe. 20 µl tekutej fázy bolo nanesených na chromatografickú platňu. Ako vyvíjacia sústava bola použitá zmes toluénu, etylacetátu a kyseliny mravčej (5:4:1 v/v/v). Vizualizácia extrahovaných metabolitov a príslušných štandard prebiehala priamo pod UV svetlom (365 nm; aflatoxín B 1, ochratoxín A a sterigmatocystín), resp. pri dennom svetle po pôsobení Ehrilochovho činidla (kyselina cyklopiaz onová). Vizualizácia patulínu bola dosiahnutá nanesením 0,5 % metylbenz otiazolum hydrochloridu (MBTH, M erck, Nemecko) a následným zahria tím na teplotu 130 C po dobu 8 minút. Podrobný popis stanovenia toxinogenity a vizualizácie metabolitov pomocou TLC je uvedený v prácach Sa msona et al. [18]a Labudu et Tančinovej [ 19]. Výsledky a diskusia Zo 147 izolovaných a identifikovaných izolátov rodu Aspergillus vrátane príslušných teleomorf bolo 116 izolátov zaradených do deviatich potenciálne toxinogénnych dru hov. 112 izolátov bolo získaných z o pšeni ce dopestovanej v ekologickom systéme a 4 izoláty v konvenčnom systéme hospodá renia. Päťdesiat izolátov pochádzalo z vnútr a zrna (endogénna kontaminácia), štyridsa ť jeden bolo súčasťou povrchovej kontaminácie (o plach ) a dvadsaťpäť bolo izolovaných zo šrotu ( Tab. 1). Nálezy uvedených druhov na povrchu resp. vo vnútri pšeničného zrna sú v súlade s viacerými autormi, podľa ktorých tieto druhy patria do ekologickej skupiny tzv. skladových húb a môžu byť izolované ako súčasť mykoflóry pšenice [12,14,17]. Výnimkou je izolát rodu Emericella, pretože ako uvádzajú Frisvad et al. [9], je nepravdepodobné, aby druhy tohto rodu kontaminovali potraviny. Najväčšie zastúpenie mali izoláty druhu Aspergillus flavus. V práci Jesenskej [12] sa uvádza, že tento druh možno v závislosti od vplyvu viacerých faktorov izolovať z 0 46 % obilných zŕn. Druhým najpočetnejším druhom bol Eurotium amstelodami. Ide o xerofilný druh, ktorý podľa Jesenskej [12] kontaminuje častejšie úlomky zŕn ako celé zrná. Analýzy v tejto štúdii boli vykonávané z neporušených pšeničných zŕn. Pre produkciu mykotoxínov v in vitro podmienkach bolo pomocou tenkovrstvovej chromatografie vyšetrených celkovo 65 kmeňov ôsmych druhov (Tab. 2). Pri dvoch z troch 45

47 izolátov Aspergillus clavatus bola zistená produkcia patulínu. Patulín je všeobecne veľmi toxický pre prokaryotické aj eukaryotické organizmy, jeho toxicita pre ľudí však nebola doteraz presvedčivo dokázaná. Tab. 1. Potenciálne toxinogénne druhy rodov Aspergillus a teleomorf (Eurotium a Emericella) izolované z potravinárskej pšenice, žatva 2006 Počet detegovaných izolátov Druh Endogénna kont. Oplach zrna Šrotované zrno Celkovo DRBC DYSG DRBC SL DRBC SL E K Aspergillus cl avatus 3 E 3 Aspergillus flavus 2 E 5 E 12 E 2 E 8 E 11 E 40 Aspergillus fumigatus 2 E 1 K 2 1 Aspergillus ni ge 2 E 2 E + 1 K 4 1 Aspergillus ochraceu 1 E 1 K 1 1 Aspergillus versicolo 1 K 2 E 2 1 Emericella nidula ns 1 E 1 Eurotium amstelodam 4 E 21 E 7 E 1 E 2 E 1 E 36 Eurotium chevalier i 6 E 8 E 6 E 3 E 23 E ekologický sy stém hospodárenia; K konvenčný systém hospodárenia SL sladinový agar; DRBC agar s dichlóranom, chloramfenikolom a bengálskou červenou Aflatoxíny, kyselina cyklopiazonová, ochratoxín A a sterigmatocystín patria medzi potenciálne karcinogény a toxicky pôsobia na jednotlivé vnútorné orgány stavovcov [9]. Zo štyridsiatich testovaných izolátov Aspergillus flavus ani jeden izolát nepreukázal tvorbu aflatoxínu B1 a šestnásť izolátov preukázalo tvorbu kyseliny cyklopiazonovej. Produkcia aflatoxínu B 1 sa nepreukázala ani pri izolátoch Aspergillus flavus z častí a produktov kukurice pochádzajúcej z južného Slovenska, testovaných v práci Pieckovej et Jesenskej [16]. Taktiež v štúdii Tančinovej et Labudu [19] izoláty Aspergilus flavus z viacerých surovín rastlinného pôvodu neprodukovali aflatoxín, avšak kyselinu cyklopiazonovú produkovalo 24 z 27 testovaných izolátov. Kyselina cyklopiazonová pri vysokej koncentrácii spôsobuje fokálnu nekrózu vo väčšine vnútorných orgánov stavovcov a má škodlivé účinky na kanáliky a orgány tvorené kanálikmi [9]. Pri jednom z troch izolátov Aspergillus versicolor a pri jedinom izoláte Emericella nidulans bola potvrdená produkcia sterigmatocystínu. Potenciál sterigmatocystínu spôsobovať ochorenia je limitovaný jeho nízkou rozpustnosťou vo vode a žalúdočných šťavách [9]. Pri izolátoch Aspergillus niger, A. ochraceus, Eurotium amstelodami a E. chevalieri sa produkcia relevantných toxínov nepotvrdila. Tab. 2. Toxinogenita izolátov testovaná metódou tenkovrstvovej chromatografie Druh Počet Z toho Zisťovaný Vyhodnotenie izolátov testovaných toxín + ± A. clavatus 3 3 PAT Af B 40 1 A. flavus CPA A. nige OA 10 A. ochraceus 2 1 OA 1 A. versicolo 3 2 SC 1 1 Em. nidulans 1 1 SC 1 Eu. amstelodami 36 2 SC 2 Eu. chevalier 23 6 SC 6 + produkcia toxínu na TLC potvrdená Af B 1 aflatoxín B 1 ± produkcia toxínu na TLC neistá CPA kyselina cyklopiazonová produkcia toxínu na TLC nepotvrdená OA ochratoxín A PAT patulín SC sterigmatocystín 46

48 Záver Nálezy relatívne veľkého počtu (116) izolátov potenciálne toxinogénnych druhov rodu Aspergillus a príslušných teleomorf v pšenici vo všeobecnosti naznačujú potrebu hodnotenia mykotoxikologickej kvality uskladneného obilia pred použitím na potravinárske účely pomocou rýchlych a exaktných metód (napr. HAPLC). Úlohou do budúcnosti ostáva tiež objasnenie príčin podstatne vyššieho výskytu týchto izolátov vo vzorkách dopestovaných v ekologickom systéme hospodárenia (112 izolátov) v porovnaní s konvenčným (4 izoláty). Tento príspevok vznikol s podporou projektu VEGA č. 1/3456/2006. Literatúra 1. Abramson D Mycotoxin formation and environmental factors. In: K. K Sinha and D. Bhatnagar, ed.: Mycotoxins in Agriculture and Food Safety. New York : Marcel Dekker, Inc., pp Bennett JW, Klich MA Mycotoxins. In: Clin. Microbiol. Rev., 16, 2003, pp Betina V. Mykotoxíny. Chémiabiológiaekológia. Bratislava : ALFA, s. ISBN Creppy EE Update of survey, regulation and toxic effects of mycotoxins in Europe. In: Toxicol Lett., 127, 2002, 1 3, pp D mello JPF, Macdonald AMC Mycotoxins. In: Animal Feed Science Technology, 69, 1997, pp FAO (Food and Agriculture Organization). Manual of the Application of the HACCP System in Mycotoxin Prevention and Control. In: FAO Food and Nutrition Paper 73. Food and Agricultural Organization, Rome, Filtenborg O, Frisvad JC, Thrane U. Moulds in food spoilage. In: International Journal of Food Microbiology. 33: Frisvad JC, Thrane U. Mycotoxin production by common filamentous fungi. Centraalbureau voor Schimmelcultures, Frisvad JC, Thrane U, Samson RA, Pitt JI Important mycotoxins and the fungi which produce them. In: Advances in Food Mycology. 571, 2006, Labuda R, Tančinová D Fungi recovered from slovakian poultry feed mixtures and their toxinogenity. In: Ann Agric Environ Med., 13, 2006, pp Lund F, Frisvad JC Penicillium verrucosum in wheat and barley indicates presence of ochratoxín A. In: J. Appl. Microbiol., 95:, 2003, pp Jesenská Z Mikroskopické huby v požívatinách a v krmivách. Bratislava : Alfa, s. 13. Klich MA Identification of common Aspergillus species. Utrecht : Centraalbureau voor Schimmelcultures, p. ISBN Malíř F, Ostrý V. et al Vláknité mikromycety (plísně), mykotoxiny a zdraví člověka. Brno : Národní centrum ošetřovatelství a nelékařských zdravotnických oborů, s. ISBN Peraica M, Domijan AM, Jurjević Ž, Cvjetković B.2002.Prevention of exposure to Mycotoxins from food and feed. In: Arh Hig Rada Toksikol., 53, 2002, pp Piecková E, Jesenská Z Fusarium moniliforme, F. subglutinans and Aspergillus flavus in maize products in Slovakia. In: Czech Mycol., 53, 2001, pp Samson RA, Hoekestra ES, Frisvad JC, Filtenborg O Introduction to food and airborne fungi. Utrecht : Centraalbureau voor Schimmecultures, p. ISBN Samson RA, Hoekestra ES, Lund F, Filtenborg O, Frisvad JC. Method for the detection, isolation and characterisation of foodborne fungi. In: Samson, R. A., Hoekstra, E. S., Frisvad, J. C. & Filtenborg, O. (eds), Introduction to food and airborne fungi. Utrecht : Centraalbureau voor Schimmecultures, pp

49 19. Tančinová D, Labuda R Mykotická kontaminácia vybraných surovín rastlinného pôvodu. In: Kolektív autorov, Výživná a technologická kvalita rastlinných produktov a ich potravinárske využitie. Nitra : SPU Nitra, s KVANTITATÍVNE HODNOTENIE OBLIČIEK CLETHRIONOMYS GLAREOLUS Z EKOSYSTÉMOV V NOVÁKOCH QUANTITATIVE ANALYSIS OF KIDNEYS OF CLETHRIONOMYS GLAREOLUS FROM ECOSYSTEMS IN NOVAKY 1 Drábeková, J., 2 Jančová, A., 3 Massányi, P., 3 Lukáč, N. 1 Katedra matematiky, Fakulta ekonomiky a manažmentu, SPU Nitra 2 Katedra zoológie a antropológie, Fakulta prírodných vied, UKF Nitra 3 Katedra fyziológie živočíchov, Fakulta biotechnológie a potravinárstva, SPU Nitra Abstract This work presents histological analysis of kidney tissue. We evaluated microscopical kidney structures of species Clethrionomys glareolus (Muridae, Rodentia). Samples for histological preparations were taken from adult individuals, which were in a very good physical condition and sexual active. They come from ecosystems that are situated close to thermal power station Novaky. For quantitative analysis morphometrical image analyzer softwer (Micro Image ver. 4.0) was used according to micromorphological criteria. The diameter of renal corpuscle, glomeruli, Bowman s capsule, tubules as well as height of tubular epithelium, surface of tubules and lumen, perimeter of tubules and lumen were evaluated. Quantitative analysis of experimental data accorded the differences between male and female. There were significant (P<0.05) distinctions in the diameter of Bowman s capsule, the diameter, surface and perimeter of tubules. Úvod Clethrionomys glareolus (Schreber, 1780) z čeľade Muridae (Rodentia) je fylogeneticky mladým organizmom a považuje sa za vhodného bioindikátora antropogénneho zaťaženia pevninských ekosystémov. Jeho vhodnosť dokazuje skutočnosť, že škodliviny na Clethrionomys glareolus pôsobia podobne ako na človeka a chorobné príznaky sú pri týchto živočíchoch veľmi skoro a ľahko pozorovateľné. Dôležitou súčasťou skúmania vplyvu emisií na živočíšny organizmus by malo byť aj histologické posúdenie zmien na parenchymatóznych orgánoch, pretože morfologické príznaky predchádzajú klinické. Medzi mimoriadne senzitívne orgány na kumuláciu cudzorodých látok v prostredí patria aj obličky. Ovplyvnenie ich štruktúry môže mať za následok renálne dysfunkcie či zlyhanie základných procesov fyziológie močovej sústavy. Obrázok 1: Clethrionomys glareolus (Schreber, 1780) z čeľade Muridae (Lindsey, 2004) Materiál a metodika Obličky z ktorých boli odobraté vzorky na histologické analýzy pochádzajú z adultných, sexuálne aktívnych jedincov Clethrionomys glareolus, ktoré boli vo veľmi dobrej telesnej kondícii. Boli získané z ekosystémov v blízkosti tepelnej elektrárne v Novákoch pomocou štandardných teriologických metód a postupov. Vzorky z obličiek sa fixovali v 10% formole, následne sa odvodnili vzostupným radom alkoholov (70%, 80%, 96%, 100%), presýtili 48

50 benzénom a zaliali do parafínu. Zaliate bločky sa následne narezali na sánkovom mikroskope a rezy hrubé 10 µm boli farbené hematoxylínom a eozínom (Vacek, 1974). Z preparátov sa zhotovili mikrofotografie (Olympus, Provis Ax, Japan) a tie sme na základe mikromorfologických kritérií kvantitatívne zhodnotili (Weibel et al., 1966). Pri týchto analýzach bol využitý softwér Micro Image ver Zisťovali sme priemer glomerulov, Bowmanovho púzdra, priemer obličkového telieska, priemer tubulov, výšku epitelu tubulov, plochu tubulov, obvod tubulov, plochu lumenu tubulov, obvod lumenu tubulov. Zo získaných hodnôt sme vypočítali základn é variačnoštatistické ukazovatele (aritmetický priemer x, medián ~ x, minimum xmin, ma ximu m xmax, smerodajnú odchýlku ± s, variačný koeficient v k ) využitím PC programu Excel. Korelačné koeficienty a štatistickú preukaznosť výsledkov sme zisťovali pomocou analýzy roz ptylu a programu S AS 9.1. Výsledky a diskusia Na zhotovených mikrofotografiách sme pozorovali základnú stavebnú a funkčnú jednotku obličky, nefrón ( nepho num), a intrarenálne vývodné močové cesty. Obličkové tel ieska [1] ( corpusculum renis) boli zl ožené z Bo wmanovho puzdra ( capsula glomerula) a klbka navzájom anastomozujúcich kapilár [ (glomerulum). Ďalšia časť nefrónu, močový kanálik [2] 1] [ 2] (tubulus renis) bol tvorený jednou vrstvou epitelových buniek. [ 2] Obrázok 2: Mikrofotografia obličky samca Clethrionomys glareolus (vlastn ý archív) Pomocou softwéru Micro Image (ver. 4.0) sme na mikrofotografiách merali jednotlivé časti obličkového telieska. Hodnotili sme 25 obličkových teliesok u samíc a 12 obličkových teliesok u samcov druhu Clethrionomys glareolus. Údaje sú zaznamenané v tabuľke 1. Vzhľadom na fakt, že obličkové telieska nemali guľovitý tvar, pri meraní priemeru jednotlivých častí obličkového telieska udávame v tabuľke 1 menší aj väčší priemer eliptického tvaru glomerula, Bowmanovho puzdra aj celého obličkového telieska. Tabuľka 1: Základné matematickoštatistické údaje (µm) jednotlivých častí obličkového telieska u oboch pohlaví sledovaného druhu Clethrionomys glareolus. Glom 1 Glom 2 BowP 1 BowP 2 ObT 1 ObT 2 samice x x~ x min x max ± s v k samce * * x x~ x min x max ± s v k

51 Glom 1 menší priemer glomerula, Glom 2 väčší priemer glomerula, BowP 1 menší priemer Bowmanovho puzdra, BowP 2 väčší priemer Bowmanovho puzdra, ObT 1 menší priemer obličkového telieska, ObT 2 väčší priemer obličkového telieska, * štatistický rozdiel na hladine α = 0, 05 Eliptický tvar glomerula nadobúdal u samíc druhu Clethrionomys glareolus priemerné hodnoty od 41,10 µm do 49,38 µm a u samcov v rozmedzí od 45,67 µm do 52,40 µm. Jančová et al. (1999, 2001) kvantifikovali obličky dvoch druhov z čeľade Muridae z lesných a močiarnych ekosystémov v Mochovciach. Druh Apodemus flavicolis vykazoval pri ich meraniach priemer glomerulov od 46, 690 µm do 80,04 µ m a u druhu Apodemus sylvaticus sa namerané hodnoty pohyboval i v rozmedzí od 63, 365 µm do 73,370 µm. Lukáč et al. (2004, 2006) pozorovali vplyv experimentálneho podania olova na štruktúru obličiek laboratórnych myší. Uvádzajú, že kontrolná skupina myší mala priemer glome rulov 50,58 ± 9,45 µm. V experimentálnych skupinách sa priemer glomerulov pohyboval v inte rvale od 51,80 µm až 53,73 µm. Ich hodnoty sa pohybovali v približne rovnakom variačnom roz pätí ako naše (tabuľka 1). Najväčší priemer obličkového telieska sme namerali 74,80 µm u samcov druhu Clethrionomys glareolus, čo je porovnateľná hodnota s údajmi, ktoré zistil Lukáč et al. (2004, 2006). Avšak všetky ostatné hodnoty, zistené pri kvantifikovaní obličkových telie sok, sú menšie ako údaje popisované v práca ch spomínaných autorov. Morfometriou obličiek sa zaoberal aj Massányi et al. (2006). Sledoval i vplyv olova na štruktúru obličiek labora tórnych po tkanov. Vo svojej práci u vádzajú, že po experimentálnom podaní olova sa štatisticky preukazne zvýšil priemer obličkového te lieska, glomerula aj Bowmanovho puzdra. Všetky ich zistené údaje majú vyššie hodnoty ako t ie ktoré sme namerali. L uká č et al. (2006) skúmali tiež vply v ortuti na štruktúru obličiek potkanov a zistili signifikantne nižšie hodnoty priemerov obličkového telieska aj glomerula v experimentálnej skupine. Z predchádzajúcich údajov vyplýva, že mikroskopická štruktúra obličky sa pod vplyvom olova a ortuti mení. Môžeme teda predpokladať zmeny v štruktúre obličiek zvierat žijúcich v prostredí znečistenom rôznymi emisiami. Na zhotovených mikrofotografiách sme kvantifikovali aj močové kanáliky. Prevažne sme sa zamerali na ich proximálny segment. Hodnotili sme 219 kanálikov u samíc a 103 kanálikov u samcov druhu Clethrionomys glareolus. Údaje sú zaznamenané v tabuľke 2. Vzhľadom na oválny tvar kanálikov, v tabuľke 2 udávame menší aj väčší priemer kanálikov. Keďže sme pozorovali rôznu výšku epitelu v rámci jedného kanálika udávame v tabuľke tiež najnižšiu aj najvyššiu hodnotu výšky epitelu. Tabuľka 2: Základné matematickoštatistické údaje (µm) sledovaných častí obličkového kanálika u oboch pohlaví druhu Clethrionomys glareolus. PT1 PT2 VE1 VE2 plochat obvodt plochal obvodl samice x x~ x min x max ± s v k samce * * * x x~ x min x max ± s v k

52 PT 1 menší priemer tubulov, PT 2 väčší priemer tubulov, VE 1 menšia výška epitelu, VE 2 väčšia výška epitelu, plochat plocha tubulov, obvodt obvod tubulov, plochal plocha lumenu, obvodl obvod lumenu, * štatistický rozdiel na hladine α = 0, 05 Hodnoty priemeru močových kanálikov sa u samíc druhu Clethrionomys glareolus pohybovali v rozmedzí od 30,22 µm do 38,24 µm a u samcov od 30,68 µm do 40,50 µm. Tieto hodnoty sú nižšie ako hodnoty, ktoré namerali Lukáč et al. (2004, 2006) u laboratórnych myší (61,34 µm až 61,78 µm) či v kontrolnej alebo experimentálnej skupine. Taktiež morfometrické merania močových kanálikov potkanov, ktoré robili Lukáč et al. (2006) resp. Massányi et al. (2006) dosahujú vyššie hodnoty. S prácami spomínaných autorov by sa dala porovnávať len výška epitelu tubulov (tabuľka 2), ktorá dosahuje nimi zistené hodnoty. Vzhľadom na porovnateľné vyššie hodnoty, ktoré nám vychádzali u samcov (tabuľka 1, tabuľka 2), sme tieto údaje podrobili analýze rozptylu, testom mnohonásobného porovnania (Duncanov, Scheffeho), a zistili sme že rozdiely medzi pohlavím sú na hladine α = 0, 05 pri niektorých sledovaných ukazovateľoch štatisticky preukazné. Táto štatistická významnosť bola potvrdená pri meraniach priemerov Bowmanových puzdier a pri meraniach priemerov, plôch aj obvodov močových kanálikov. Korelačné koeficienty (Pearsonov, Spearmanov) nám ukazovali prevažne strednú závislosť medzi získanými morfometrickými hodnotami a pohlavím. Štatisticky signifikantné však boli len pri tých istých údajoch ako pri analýze rozptylu. Sú to však prvotné výsledky a na sformulovanie záverov treba v morfometrickej analýze obličiek drobných zemných cicavcov pochádzajúcich z oblastí s rôznym emisným zaťažením naďalej pokračovať. Práca je podporovaná projektmi VEGA 1/2364/05, VEGA 1/2417/05, CGA UKF VI/2/2006, APVV Literatúra Jančová, A., Ligač, S., Massányi, P., Uhrín, V., Morfologická analýza semenníkov a prisemenníkov ryšavky Apodemus sylvaticus a Apodemus flavicolis ( Muridae). Slovenský veterinársky časopis, 24, 3: Jančová, A., Massányi, P., Uhrín, V., Morfometrická analýza obličiek Apodemus sylvaticus a Apodemus flavicolis. Zborník Nové poznatky v morfológii, 39. kongres Slovenskej anatomickej spoločnosti s medzinárodnou účasťou, Martin, Lindsey, J.K., Clethrionomys glareolus (Schreber 1780). nl/~jlindsey/commanster/mammals/amammals/clethrionomys.glareolus.html Lukáč, N., Massányi, P., Toman, R., Sládečka, A., Štrukturálne zmeny obličiek myší po experimentálnom podaní olova. Zborník z konferencie Rizikové faktory potravového reťazca IV, SPU, Nitra, Lukáč, N., Massányi, P., Toman, R., Trandžík, J., Capcarová, M. Stawarz, R., Cigánková, V., Jakabová, D., Kožáková, I., Forgács, Z., Somosy, Z., Prejavy toxicity olova a ortuti. In: Kováčik, J., et al.: Biologické aspekty zvyšovania kvality surovín a potravín živočíšneho pôvodu. Vedecká monografia, SPU, Nitra, Massányi, P., Lukáč, N., Makarevich, A.V., Chrenek, P., Forgacs, Z., Zakrewski, M., Stawarz, R., Toman, R., Lazor, P., Flesarova, S., Leadinduced alterations in rat kidneys and testes in vivo. Journal of Enviromental Science and Health Part A 41, 16. Vacek, Z., Histológia a histologická technika. Martin, Osveta, s.388. Weibel, E.R., Kistler, G.S., Scherle, W.F., Practical stereological methods for morphometric cytology. J. Cell Biol., 30, Kontaktná adresa: RNDr. Janka Drábeková, PhD. Katedra matematiky FEM SPU Tr.A.Hlinku 2, Nitra [email protected] RNDr. Alena Jančová, PhD. Katedra zoológie a antropológie FPV UKF Nábrežie mládeže 91, Nitra [email protected] 51

53 VYUŽITÍ BLÍZKÉ INFRAČERVENÉ REFLEKTANČNÍ SPEKTROSKOPIE PRO STANOVENÍ OBSAHU HISTAMINU VE TVARŮŽCÍCH APPLICATION OF NEARINFRARED REFLECTANCE SPECTROSCOPY TO THE ANALYSIS OF HISTAMINE CONTENT IN CAKE OF CHEESE Dračková, M., Standarová, E., Kordiovská, P., Borkovcová, I., Janštová, B., Navrátilová, P., Vorlová, L., Bartáková, K. Ústav hygieny a technologie mléka, Fakulta veterinární hygieny a ekologie, VFU Brno Abstract Nearinfrared reflectance (NIR) spectroscopy was used to analyze histamine content in cake of cheese. A set of 96 samples stored at 5 ºC during 7 weeks was used for instrument calibration by partial least squares (PLS) method. Spectra were measured in the reflectance mode with a compressive cell between and 4000 cm 1, averaging 100 scans. The following statistical values were obtained: correlation coefficient (R) = and standard error of calibration (SEC) = The calibration model developed was verified by cross validation. To validate the calibration, the same set of samples was used. Standard error of validation was 30.8 and R for the regression of measurements by reference method versus measurements by NIR spectroscopy was There was no significant difference between calibration and cross validation. Úvod Biogenní aminy vznikají v potravinách bohatých na bílkoviny působením mikrobiálních dekarboxyláz, dále při výrobě, zrání a skladování fermentovaných potravin např. sýrů, ryb, masných výrobků, vína, piva, kyselého zelí a výrobků ze sóji (HernándezJover et al., 1997; Bodmer et al., 1999). Bigenní aminy jsou rovněž dávány do souvislosti s kažením potravin a lze na ně pohlížet jako na indikátor kažení (Vale a Glória, 1998). Potraviny s nízkým obsahem biogenních aminů nepředstavují pro konzumenta vážné riziko, ale konzumace potravin obsahujících vysoké koncentrace těchto látek může způsobovat u citlivých jedinců toxické účinky (Vale a Glória, 1998; NovellaRodríguez et al., 2000). Po rybách je sýr nejčastější potravinou, která může být příčinou otrav způsobených histaminem (Valsamaki et al., 2000). Sýry a jiné fermentované potraviny představují ideální prostředí pro tvorbu aminů. Sýry obsahují dostatečné množství volných aminokyselin, vzniklých převážně proteolýzou kaseinu a mikrobiální enzymy. Představují vhodné prostředí pro růst mikroorganismů s optimálními podmínkami pro jejich činnost jako ph, aktivita vody, koncentrace solí, teplota skladování, doba zrání a přítomnost kofaktoru pyridoxalfosfátu (Schneller et al., 1997; Pinho et al., 2001; Standara et al., 2000). Biogenní aminy vznikají hlavně enzymovou dekarboxylací aminokyselin mikroorganismy. Schopnost různých bakterií produkovat aminy je velmi rozdílná (Kebary et al., 1999; Valsamanaki et al., 2000). Pro stanovení biogenních aminů jsou používány metody kapalinové chromatografie. Spektroskopie v NIR oblasti se v potravinářství a zemědělství uplatňuje už od 60. let. NIR spektroskopie se používá zejména pro stanovení hlavních složek, tzn. sušiny, bílkovin, tuku a sacharidů. Aplikace NIR spektroskopie je však mnohem širší a zahrnuje i stanovení senzorických a fyzikálně chemických parametrů. Úspěšnost při využití NIR spektroskopie závisí nejen na kvalitě přístroje a jeho konstrukci, ale také na referenční metodě, standardní přípravě vzorku, jeho homogenitě a v neposlední řadě na kalibrační metodě (Čurda et al., 2002; RodriguezOtero et al., 1997; Tsenkova et al., 1999). Cílem práce bylo vytvoření kalibračního modelu pro stanovení obsahu histaminu ve tvarůžcích pomocí FTNIR spektroskopie. Materiál a metodika Vzorky tvarůžků byly skladovány po dobu 7 týdnů při chladírenské teplotě 5 C. K analýzám byly odebírány vzorky (n = 96) v týdenních intervalech (tj. nultý až 7. týden). 52

54 Obsah histaminu byl stanoven metodou HPLC s předkolonovou derivatizací dansylchloridem dle Paulsen et al. (1997). Analýzy byly prováděny na kapalinovém chromatografu Alliance 2695 (Waters, USA) s detektory PDA 2996 a fluorescenčním detektorem Separace po DCl derivatizaci byla prováděna gradientovou elucí (složení mobilních fází a eluční profil viz. Paulsen et al., 1997) na koloně Polaris C 18 (Varian, USA), 150 mm x 4,6 mm, velikost částic 3 µm s předkolonkou Meta Guard Polaris C 18 (Varian, USA), 30 mm x 4,6 mm, 3 µm temperována na 35 ºC, průtok mobilní fáze 1 ml.min 1. Eluované dansylderiváty byly detekovány měřením fluorescence za užití 330 nm a 500 nm jako excitačních a emisních délek a současně fotometricky při 254 nm. Měření bylo vyhodnoceno na programu Empower fluorescence software (Waters, USA). Histamin byl identifikován srovnáním retenčního času s retenčním časem standardu. Pro kvantifikaci byla užita metoda interního standardu postupem podle Komprdy et al.(2007). Vzorky byly homogenizovány mletím a proměřeny na spektrometru NIR Nicolet Antaris (Thermo electron Corporation, Madison, USA) ve spektrálním rozsahu cm 1 se 100 scany. Čas snímání jednoho spektra se pohyboval okolo 1,5 min. Spektra (Obr. 1) byla měřena na integrační sféře v režimu reflektance s kompresní kyvetou. Každý vzorek byl proměřen třikrát a pro kalibraci bylo použito průměrné spektrum (Obrázek 1). Naměřená data byla zpracována pomocí programu TQ Analyst verze (Thermo electron Corporation, Madison, USA). 2,10 Signature: Not signed 2,05 2,00 1,95 1,90 1,85 1,80 Absorbance 1,75 1,70 1,65 1,60 1,55 1,50 1,45 1,40 1,35 1, Wavenumbers (cm1) Obrázek 1. Spektra tvarůžků Výsledky byly vyhodnoceny pomocí statistického a grafického softwaru STAT Plus. Pro srovnání hodnot naměřených pomocí FTNIR s hodnotami zjištěnými v laboratoři byl použit párový Ttest (Matoušková et al., 1992). Výsledky a diskuse Rozpětí referenčních hodnot pro obsah histaminu je vyjádřeno jako směrodatná odchylka průměru (Tab. 1). Tabulka č. 1 Referenční hodnoty parametr n x median min max SD histamin (mg.kg 1 ) ,75 162,00 64,92 341,52 114,71 n počet vzorků, x průměr, min a max minimální a maximální hodnota, SD směrodatná odchylka Pomocí diagnostických nástrojů (Spectrum Outlier a Leverage) byly pro vytvoření kalibračního modelu odstraněny odlehlé standardy, u kterých byla nepřesně stanovena referenční hodnota nebo se objevila spektrální odchylka ve změřeném spektru (Tab.2). Kalibrační model byl vytvořen pomocí PLS algoritmu (partial least squares) a bez derivace 53

55 spekter. Důležitým diagnostickým nástrojem je závislost PRESS (predicted resiudual error sum of squares) na počtu PLS faktorů použitých ke kalibraci, který umožňuje odhadnout optimální počet faktorů (Čurda et al. 2002; Jankovská a Šustová 2003). Hodnota PRESS je indikátorem chyby kalibrace PLS metody. Kalibrační a validační výsledky pro sledované parametry jsou uvedeny v tabulce 2. Tabulka č. 2 Kalibrační a validační výsledky parametr n PLS kalibrace validace faktory R SEC R SECV histamin (mg.kg 1 ) ,930 26,8 0,907 30,8 R korelační koeficient, SEC směrodatná odchylka kalibrace, SECV směrodatná odchylka validace, n počet vzorků po odstranění odlehlých standardů Pro vytvoření validačního modelu metodou křížové validace byla použita stejná sada vzorků jako při kalibraci. U modelu se jedná o pevnou závislost mezi hodnotami referenčními a hodnotami predikovanými. Průběh těchto závislostí pro histamin je patrný z grafu č dnoty (mg/kg) predikované ho y = 0,8653x + 21,526 R = 0,9302 y = 0,8449x + 25,317 R = 0, laboratorní hodnoty (mg/kg) kalibrace validace kalibrace validace Graf 1. Kalibrační a validační model pro histamin Zjištěné výsledky byly statisticky zhodnoceny pomocí programu STAT Plus (Matoušková et al., 1992). Mezi referenčními hodnotami (HPLC) a vypočítanými hodnotami pomocí FTNIR nebyly nalezeny statisticky významné rozdíly (p = 0,05). Stanovením biogenních aminů v mléčných výrobcích se zabývala celá řada autorů. Biogenní aminy byly detekovány v mnoha druzích sýrů např. Ementál, Gouda, Ras, Feta, španělské tradiční sýry, Azeitão a další (Pinho et al., 2001; Vale a Glória, 1998; RoigSagués et al., 2002; Valsamaki et al., 2000; Kebary et al., 1999). Podstatné rozdíly v zastoupení biogenních aminů můžeme sledovat u zrajících a nezrajících sýrů. NovellaRodríguez et al. (2000) detekovali u 10ti vzorků zrajících a 10ti vzorků nezrajících sýrů odebraných z obchodní sítě rozdílné hodnoty aminů. Velký vliv na tvorbu biogenních aminů má také teplota zrání. Byl sledován nárůst aminů u sýrů přepravovaných 2 dny při 4 C a 25 C. Všechny vzorky byly dále uchovávány 2 týdny při 4 C a další 2 týdny při 25 C. Po detekci aminů vzniklých během přepravy došlo k dvojnásobnému zvýšení u sýrů přepravovaných při 25 C. Na konci pokusu, kdy byly vzorky vystaveny stejné teplotě po čtyři týdny byla celková množství biogenních aminů u všech vzorků přibližně stejná. Byla naměřena nejvyšší koncentrace histaminu, dále následoval tyramin a kadaverin (Pinho et al., 2001). 54

56 NIR spektroskopie nabízí řadu výhod oproti tradičním chemickým metodám. Jedná se o fyzikální, nedestruktivní metodu, kde příprava vzorků je minimalizována nebo zcela eliminována. Další výhody představují úspora práce, času a materiálu, snadná obsluha a možnost měření vzorků i přes transparentní obaly. Jedno spektrum je použitelné ke kvantitativnímu stanovení více složek i kvalitativní analýze (BüningPfaue, 2003; Šustová a Janovská, 2002). Ve spektrech NIR dominují pásy lehkých atomů, jejichž vazby vibrují s vysokou frekvencí (hla vně CH, NH a OH). Spektra v této oblasti jsou spektra vibrační, která poskytují informaci o struktuře a vazebných poměrech molekuly stejně dobře, jako je tomu v případě spekter ve střední infračervené oblasti (MIR) (Bokobza., 2002). Rozdíl je v tom, že NIR spektra jsou daleko komplikovanější a nemohou být interpretovány tak jednoduše jako je tomu v případě ostrých a dobře rozlišených pásů, které většinou odpovídají fundamentálním vibracím v MIR spektrech, kde poměrně snadno nalézáme analytické pásy, které většinou využijeme s pomocí univariantní kalibrace pro stanovení kvantity nebo pomocí search programů pro stanovení kvality látek (Jankovská, 2004). Ve vzorcích je interpretace složitých NIR spekter těžká, protože přítomnost odlišných struktur v chemických sloučeninách je výsledkem překrytí pásů a specifické pásy ve spektrech mohou získat informaci z více než jednoho typu vibrací molekul (Sivakesava and Irudayaraj, 2002). NIR absorbance pro různé základní funkční skupiny může korelovat s hlavními složkami. Informace obsažená v NIR spektrech může být v současné době získána s pomocí chemometrických metod, které pracují s celospektrální iformací (Čurda et al., 2002). Závěr Sýr představuje ideální prostředí pro produkci aminů, avšak koncentrace aminů se značně liší v závislosti na faktorech jako jsou typ sýru, stáří a složení mikroflóry. V rámci každého druhu existují velké rozdíly, zvláště u sýrů ze syrového mléka. Výskyt biogenních aminů (tyraminu, histaminu, putrescinu, kadaverinu ) je vždy znakem špatné hygienické kvality suroviny nebo důsledek kontaminace v průběhu zrání a skladování. Je důležité předejít tvorbě biogenních aminů, jejichž výskyt je spojen se zdravotním rizikem. NIR spektroskopie je v současné době stále více využívána k analýze potravin a našla své uplatnění také v oblasti mlékařství. Byl vytvořen kalibrační model pro stanovení obsahu histaminu ve tvarůžcích. Výsledky byly posouzeny na základě korelace mezi referenčními a vypočtenými hodnotami z kalibračních rovnic a na základě směrodatných odchylek kalibrace a validace (SEC, SECV). FTNIR spektroskopie tak může představovat metodu pro rychlou a jednoduchou analýzu. Literatura Literatura u autora. Práce vznikla za finanční podpory výzkumného záměru MSM Veterinární aspekty bezpečnosti a kvality potravin. Kontaktní adresa MVDr. Michaela Dračková, Ph.D., Ústav hygieny a technologie mléka, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno, Palackého 1/3, Brno, Česká republika, [email protected]. 55

57 VÝSKYT TOXINOGÉNNYCH DRUHOV RODU PENICILLIUM V POTRAVINÁRSKEJ PŠENICI OCCURRENCE OF TOXIGENIC PENICILLIUM SPECIES IN WHEAT Felšöciová, S., Labuda, R., Tančinová, D., Katedra mikrobiológie, FBP, SPU, Nitra Abstract Wheat samples from the conventional (6) and ecological (12) agriculture harvested during the season 2006 were surveyed for fungal contamination. The species of genus Penicillium were isolated on Dichloran rose bengal agar and malt extract agar and incubated for 7 days at 25 C ±1 C in the dark. A total of 3 potentially toxigenic species were identified from the conventional agriculture, namely P. raistrickii (56% positive samples) P. griseofulvum (33%) and P. verrucosum (11%). A total of 7 potentially toxigenic species were identified from the ecological agriculture, namely P. carneum/paneum (10%positive samples), P. citrinum (7%), P. crustosum (21%), P. chrysogenum (34%), P. griseofulvum (10%), P. melanoconidium (3%), P. verrucosum (14%). Their choosed mycotoxin production ability was tested on thin layer chromatography plates. Their production was confirmed for nearly all the mycotoxins tested. Úvod V súčasnosti sa venuje zvýšená pozornosť na potravinovú bezpečnosť, s čím súvisí aj indikácia rizikových faktorov v komponentoch vstupujúcich do potravového reťazca. Jedným z rizikových faktorov je výskyt potenciálne toxinogénnych druhov mikroskopických húb, ktorých životný cyklus je viazaný aj na cereálne substráty. Mykotická kontaminácia obilnín je najvyššia v období zberu. Uskladňované zrná prinášajú so sebou do skladu obrovské množstvá mikroorganizmov (baktérie, kvasinky, vláknité mikroskopické huby), ale počas optimálnych podmienok skladovania ich počet klesá (Lacey a Magan, 1991). Je známe, že zrno infikované mikroskopickými hubami môže obsahovať určité toxické metabolické produkty húb zvané mykotoxíny. Z ekonomického hľadiska môžu mykotoxíny spôsobiť výrazné hospodárske straty producentom a obchodníkom so zrnom, predstavujú potencionálne ohrozenie ľudského zdravia a taktiež môžu spôsobiť ochorenia alebo úhyn hospodárskych zvierat. K mykotoxinogénnym hubám významným v potravovom reťazci patria aj zástupcovia rodu Penicillium, ktorý zaraďujeme k tzv. skladovým hubám (Magan et al, 2003). Cieľom bolo zhodnotiť výskyt potenciálne toxinogénnych izolátov penicilií a frekvenciu ich výskytu v pšenici potravinárskej v dvoch odlišných typoch obhospodarovania pôdy a testovať ich na schopnosť produkovať príslušné mykotoxíny v podmienkach in vitro. Materiál a metódy V pokusnom roku 2006 bolo analyzovaných 6 odrôd pšenice potravinárskej z dvoch odberových miest z konvenčného poľnohospodárstva a 12 vzoriek pšenice z ekologického poľnohospodárstva. Boli použité tri spôsoby izolácie: endogénna, oplach a šrot. Endogénna kontaminácia na stanovenie priamej kontaminácie povrchovo sterilizovaných zŕn v NaOCl (0,4%) bola sledovaná na agaroch DRBC(agar s dichlóranom, bengálskou červeňou a chloranfenikolom) a DYSG (agar s dichlóranom, kvasničným extraktom, sacharózou a glycerolom), pričom bola použitá metóda priameho ukladania pšeničných zŕn na agarové platne. Nahromaďovacie kultúry mikroskopických húb z oplachu a šrotu boli pripravené na agaroch DRBC a agare so sladinovým extraktom s prídavkom 100 mg chloramfenikolu. 2 4 Očkovanie bolo povrchové s riedeniami 10 až 10 v trojnásobnom opakovaní. Kultivácia prebehla pri 25 C 5 7 dní v tme (Samson et al., 2002b). Izoláty penicilií boli z izolačných agarov preočkované na identifikačné agary: CYA (Czapkov agar s kvasničným extraktom), MEA (agar so sladinovým extraktom), CREA (agar 56

58 s kreatí nom a sacharózou) a YES (kvasničný extrakt so sacharózou). Kultivácia prebehla pri 25 C 57 dní v tm e. Identifikácia jednotlivých druhov bola robená podľa kľú ča: Sams on et al. (2002). Schopnosť izolátov produkovať citrinín (C), cyklopiazónovú kyselinu (CPA), grizeofulvín (G), ochrat oxín ( OA), patulín (P), penitrém A (PA) a roquefortín C( RC) bola stanovená tenkovrstvovou chromatog rafiou ( TLC) v podmienkach in vitro (Samson et al., 2002b). Agarové výse ky z CYA ( pre intracelulárne mykotoxíny) alebo z YES (extracelulárne mykotoxíny) boli zmiešané s extrakčným činidlom chlorofom metanol (2:1). Extrakcia toxínov prebehla na Vortexe (V1 plus, Boeco, Germany) 2 3 min. Na štart chromatografickej platne (Alugram sil G, Germany) boli nanášané extrakty v množstve 10 µl. Po vysušení boli mykotoxíny vyvíjané v chromatografickej sústave TEF (toluén, etylacetát, kyselina mravčia, 5: 4:1) a po vysušení detekované na základe fluorescencie a retenčných hodnôt použitých štandard. Mykotoxíny ako citrinín, grizeofulvín a ochratoxín A boli vizualizované pod UV svetlom 365 nm.pri dennom svetle boli vizualizované:cyklopiazónová kyselina po nanesení Erlichovho činidla; patulín po nanesení 0,5% MBTH (3metyl2benzotiazoliónhydrazón hydrochlorid) v metanole, zahriatí pri 130 C, 8 min.; penitrém A po nanesení 20% AlCl 3 v 60% etanole a zahriatí pri 130 C, 8 min.; roquefortín C po nanesení Ce(SO 4 ) 2 a zahriatí pri 130 C, 8 min. Výsledky a diskusia Najčastejšie sa vyskytujúcimi toxinogénnymi druhmi mikromycétov na území Európy sú druhy rodov Aspergillus, Penicillium a Fusarium (Creppy, 2002). Druhy rodu Penicillium sú často prítomné ako kontaminanty poľnohospodárskych produktov počas sušenia a následného skladovania (Creppy, 2002). Podľa Jesenskej (1987) sa z rodu Penicillium najčastejšie vyskytujú ak o skladové huby P. chrysogenu m, P. viridicatum, P. rugulosum, P. purpurogenum, P. brevicompactum a iné. Zo šiestich vzoriek pšenice z konvenčného poľnohospodárstva boli vyizolované 3 druhy potenciál ne toxinogénnych penicilií: P. crustosum, P. griseofulvum a P. raistric kii (Tab. 1). Zo zŕn pšeni ce neb oli žiadne peniciliá vyizolo vané ako endogénne sa vyskytujúce. P. griseofulvum bol vyizolovaný z oplachu aj šrotu a P. raistrickii z oplachu. Z celkového p očtu izolátov 9 najvyšší percentuálny podiel predstavoval P. raistrickii (56%), nasledoval P. griseofulvum (33%) a P. crustosum (11%). Tabuľ ka 1. Frekvencia výsk ytu a počet izolátov vyizolovan ých druhov rodu Penicillium z konvenčného poľnohospodárstva Endogénna k ontam. Oplach Šrot Celkový % Druh Poz. Frekv Počet Poz.vzo Frekv. Počet Poz Frekv Počet počet podiel vzor.(%) izolátov rky (%) izolátov.vzorky (%) izolátov izolátov izolátov ky P. cru P. gris P. rai Penicillium crustosum, P. griseofulvum, P. raistrickii Z ekologického poľnohospodárstva bolo analyzovaných 12 vzoriek pšenice a z nich bolo vyizolovaných 7 druhov potenciálne toxinogénnych penicilií: P. carneum/paneum, P. citrinum, P. crustosum, P. chrysogenum, P. griseofulvum, P. melanoconidium a P. verrucosum (Tab. 2). V tomto prípade zo všetkých troch spôsobov izolácie (endogénna, oplach, šrot) boli vyizolované peniciliá. Najvyššia diverzita bola zaznamenaná z oplach u (5 druhov) a 3 druhy pochádzali z endogénnej kontaminácie a šrotu. Z celkového počtu izolátov 29, najvyššie percentuálne podiely predstav ovali: P. chrysog enum (34%) a P. crust osum (21%). Tieto druhy boli vyizolované z endogénnej kontaminácie, oplachu aj šrotu. Riziko možnej kontaminácie pšenice potravinárskej predstavuje P. verrucosum (14%), ktorý bol vyizolovaný z oplachu. Elmholt (2003) zistil výskyt Penicillium verrucosum v 51% vzoriek obilnín (raž a pšenica) pred sušením 57

59 a uskladnením. Na základe získaných výsledkov upozorňuje na dôležitosť venovať zvýšenú pozornosť pozberovej manipulácii ako i skladovaniu obilnín, najmä ak boli identifikovaní potencionálni producenti mykotoxínov. Tabuľka 2. Frekvencia výskytu a počet izolátov vyizolovaných druhov rodu Penicillium z ekol. poľnohospodárstva Endogénna kontam. Oplach Šrot Celkový % Druh Poz. vzor ky Frekv.(%) Počet izolátov Poz.vzo rky Frekv. (%) Počet izolátov Poz.vzor ky Frekv. (%) Počet izolátov počet izolátov P. cit podiel izolátov P.cru P.chry P.gris P.mel P.car P. ver P. citrinum, P. crustosum, P. chrysogenum, P. griseofulvum, P. melanoconidium, P.carneum/paneum, P. verrucosum Obilné zrná sú veľmi vhodným substrátom na produkciu mykotoxínov a zistilo sa veľa ochorení, ktoré súviseli s konzumovaním výrobkov alebo so skrmovaním splesnených obilných zŕn (Jesenská, 1987). Z konvenčného poľnohospodárstva boli testované izoláty 3 potenciálne toxinogénnych druhov (Tab. 3). Izolát P. crustosum z oplachu produkoval penitrém A aj roquefortín C, izoláty P. griseofulvum z oplachu a sučasne zo šrotu produkovali kyselinu cyklopiazonovú, grizeofulvín, patulín a roquefortín C. Grizeofulvín produkoval P. raistrickii, ktorý bol vyizolovaný z oplachu. Tabuľka 3. Testované izoláty penicilií z konvenčného poľnohospodárstva vyizolované z oplachu a šrotu na schopnosť produkovať sledované mykotoxíny v podmienkach in vitro Testovaný Oplach Šrot Druh CA G P PA R C A G P RC P. crustosum 1*/1** 1/1 P. griseofulvum 1/1 1/1 1/1 1/1 /1 1/1 1/1 1/1 P. raistrickii 1/1 * počet pozitívnych izolát or; ** počet testovaných izo látov CA cyklopiazónová kyselina, G grizeofulvín, P patulín, PA penitrém A, RC roquefortín C Z ekologického poľnohospodár stva bolo testovaných 7 druhov potenciálny ch producent ov mykotoxínov (Tab. 4). Išlo o izoláty P. crustosum, ktoré zo všetkých troch spôsobov izolácie produkovali penitrém A aj roquefortín C. 3 izoláty P. griseofulvum boli vyizolované len z endogénnej kontaminácie. Potvrdila sa ich produkcia na všetky 4 sledované mykotoxíny: kyselinu cyklopiazónovú, grizeofulvín, patulín a roquefortín C. Izoláty P. chrysogenum z oplachu aj šrotu produkovali roquefortín C. Z oplachu penitrém A produkoval P. melanoconidium, patulín P. carneum/paneum. Z 3 izolátov P. verrucosum len 1 produkoval citrinín, ochratoxín A neprodukoval žiaden z nich. 2 izoláty P. citrinum zo šrotu produkovali citrinín. Tančinová a Labuda (2006) sledovali mykotickú kontamináciu zrnín počas skladovania. Z analyzovaných vzoriek skladovaných komodít a pšeničných otrúb vyizolovali a identifikovali zástupcov 30 rodov mikroskopických húb. Jedným z najčastejšie sa vyskytujúcim bol rod Penicillium. Izoláty potencionálne toxinogénnych druhov testovali na ich schopnosť produkovať príslušné mykotoxíny TLC metódou v podmienkach in vitro. Citrinín produkovalo 58

60 47 izolátov z 56, kyselinu cyklopiazónovú 69 izolátov zo 73, grizeofulvín 40 z 45, ochratoxín A (OA) 18 z 28, patulín 48 izolátov z 53 a všetky testované izoláty produkovali penitrém A. P. verrucosum je hlavným producentom OA v skladovaných cereáliách (Lund a Frisvad,2003). Jeho výskyt a následnú produkciu OA v cereálnych zrnách sledovali aj Elmholt a Rasmussen (2005). Išlo o 37 kombinovaných cereálnych vzoriek s vyššou a nižšou vlhkosťou. Až 82 % nevysušených vzoriek bolo kontaminovaných druhom P. verrucosum. Pšenica špaldová bola najviac kontaminovaná, nasledoval ovos, potravinárska pšenica a jačmeň. Napriek mnohým vlhkým cereálnym zrnám kontaminovaných P. verrucosum len 2 izoláty prekračovali maximálny limit EU pre zrno (5 ng OA/g). Tabuľka 4. Testované izoláty penicilií z ekologického poľnohospodárstva vyizolované z endogénnej kontaminácie, oplachu a šrotu na schopnosť produkovať sledované mykotoxíny v podmienkach in vitro Testovaný Endogénna kontamin. Oplach druh CA G P PA RC C OA P PA RC C PA RC P. citrinum 2/2 P. crustosum 1*/1** 1/1 2/2 2/2 2/2 2/2 P. chrysogenum 1/1 1/1 P. griseofulvum 3/3 3/3 3/3 3/3 P.melanoconidium 1/1 P.carneum/paneum 2/2 P. verrucosum 1/3 0/3 * počet pozitívnych izolátov ; ** počet testovaných izolátov C citrinín, CA cyklopiazónová kyselina, G grizeofulvín, OA ochratoxín A, P patulín, PA penitrém A, RC roquefortín C Záver Z analyzovaných vzoriek potravinárskej pšenice z konvenčného a ekologického poľnohospodárstva bolo vyizolovaných 8 toxinogénnych druhov rodu Penicillium: P. carneum/paneum, P. citrinum, P. crustosum, P. chrysogenum, P. griseofulvum, P. melanoconidium, P. raistrickii a P. verrucosum. Z oboch poľnohospodárstiev najvyššia biodiverzita bola z oplachu. Z konvenčného poľnohospodárstva z endogénnej kontaminácie nebol vyizolovaný žiaden izolát. Z 22 testovaných izolátov 20, t.j. 91% izolátov produkovalo minimálne 1 mykotoxín v podmienkach in vitro TLC metódou. Tento príspevok vznikol s podporou projektu VEGA 1/3456/06 Literatúra: Creppy, E.E. Update of survey, regulation and toxic effects of mycotoxins in Europe. In Toxikology Letters, 127, 2002, pp Elmholt, S. Rasmussen, P.H. Penicillium verrucosum occurrence and Ochratoxin A contents in organically cultivated grain with special reference to ancient wheat types and drying praktice. Mycopathologia 159,2005, pp Jesenská, Z. Mikroskopické huby v požívatinách a v krmivách, 1. vyd.,alfa, Bratislava, 1987, 320 s. Lacey,J. Magan, N. Fungi colonizing cereal grain: their occurence and water and temperature relationschips. In: Chelkowski J. (ed) Cereal Grain Mycotoxins, Fungi and Quality in Storage, Chapter 5 Elsevier, Amsterdam, 1991, pp Lund F. Frisvad J.C. Penicillium verrucosum in wheat and barley indicates presence of ochratoxin A. J. Applied Microbiology 95, 2003, pp Magan, N Hope, R. Cairns, V. Aldred, D. Post harvest fungal ecology: Impact of fungal growth and Mycotoxin accumulation in stored grain. In: European Journal of Plant Pathopogy, 109, 2003, pp Samson, R.A.Hoekstra, E.S. Frisvad, J.C. Filtenborg, O. Introduction to food and airborne fungi. Centraalbureau voor Schimmelcultures, Utrecht, 2002a, 389 p. ISBN Šrot 59

61 Samson, R. A. et al. Methods for the detection isolation and characterisation of food and airborne fungi. In: Samson, R.A. et al. Introduction to food and airborne fungi. Centraalbureau voor Schimmelcultures, Utrecht, 2002b, 389 p. ISBN Tančinová,D. Labuda,R.: Mykotická kontaminácia vybraných surovín rastlinného pôvodu. Monografia: Výživná a technologická kvalita rostlinných produktov a ich potravinárské využitie. SPU Nitra, 2006, s ISBN DOES ULTRAVIOLET RADIATION INFLUENCE ON HEAVY METAL BIOAVAILABILITY IN AQUATIC ECOSYSTEMS? Formicki G., Stawarz R., Zamachowski W., Zakrzewski M., Łaciak T. Cracow Pedagogical University, Institute of Biology, Departament of Zoology, ul. Podbrzezie 3, Kraków Poland. Abstract In different aquatic ecosystems toxicity of metals can vary widely. This is generally attributed to the influence of water chemistry. Heavy metals in aquatic ecosystems form complexes with inorganic, and organic ligands, which decrease their bioavailability. Uptake of heavy metals by aquatic animals depends also on genetic variability and physiological state of the organisms i.e. the way of oxygen uptake and maintaining of ionic balance, nourishing preferences, state of health etc. Little is known about the influence of physical factors on heavy metals uptake. This work is a survey of literature and our own research concerning the influence of UV radiation on bioavailability and uptake of heavy metals by aquatic animals. We conclude that ultraviolet radiation may influence the bioavailability of heavy metals by modification of structure and chemical activity of ligands such as DOC dissolved in water. Direct exposure to UV of animals, which maintain ionic balance thanks to skin functions, may influence structure and/or affinity of specific metal transport systems to cations. Moreover UV by its influence on general physiological condition of animals may also have indirect effect on metals uptake or removal. Introduction There are several sources of contamination with heavy metals in the environment. Anthropogenic sources include smelter emission and the application of fertilisers, pesticides and sewage sludge to land (Vidovic et al., 2005). Exposure of aquatic animals to heavy metals often results in increased mortality. Some metals such as cadmium, lead, mercury or copper show toxic properties in very low concentration (Company et al., 2004). The harmful effects result from generation of reactive oxygen species, DNA damage, disruption of ionic homeostasis (Grosell et al., 2004), enzyme inactivation due to strong bonds with SH groups and alteration of many physiological parameters (Hansen et al., 2007). In different aquatic ecosystems toxicity of metals can vary widely. This is generally attributed to the influence of water chemistry. Heavy metals in aquatic ecosystems form complexes with inorganic, and organic ligands, which decrease their bioavailability (Santore et al., 2002). Additionally the acidification of water influences the bioavailability of heavy metals. Aquatic animals living in low alkalinity lakes generally have higher body burdens of heavy metals than animals from waters with higher ph (Spry, Wienner, 1991). Another important factor is genetic variability and physiological state of the organism i.e. the way of oxygen uptake and maintaining of ionic balance, nourishing preferences, state of health etc. Little is known about the influence of physical factors on heavy metals uptake. Some studies indicate significant influence of temperature on the uptake of heavy metals from aquatic environment (Ferrari et al., 1993). It is also known that various physical factors may affect metabolic rate, immunity, ionic content, and physiological fitness of animals. This in turn may influence their resistance to different factors (Jokinen et al., 2001). The present work is a short 60

62 survey of literature and our own studies concerning the influence of UV radiation on availability of heavy metals. UV radiation and water chemistry Bioavailability of heavy metals is mainly related to water hardness (Ca2+, Mg2+), salinity, alkalinity, ph, level of sulphides and carbonates, the presence of complexing agents, and dissolved organic carbon (DOC) (Soumya, Wood, 2004). Some of them make strong bonds with metal cations, which makes them less available to aquatic animals. Bioavailability depends also on competitions between ionic forms of heavy metals and other cations for the binding sites. For instance Cd ions compete for the Ca2+ binding sites on aquatic organisms with Ca2+, Zn2+, Mg2+, H+, Na+ (Soumya, Wood, 2004). Among other factors, dissolved organic carbon significantly reduces the bioavailability of heavy metals. Voets et al. (2004) found that fish grown in water containing DOC and cadmium had lower level of cadmium that fish exposed to water containing exclusively cadmium. Other studies established that UV has influence on DOC. The energy of ultraviolet radiation passing through water is absorbed by DOC, what results in UV attenuation and decomposition of some components of DOC (Naganuma et al., 1996). This may influence the heavy metalsdoc bonds. Thus we conducted the experiment that aimed at determination whether UV radiation had influence on cadmium availability to pond snail (Lymnaea stagnalis) in the presence of DOC. We measured availability of Cd as its content in digestive gland of the snails. We also measured catalase activity, copper and zinc level in digestive gland as nonspecific indicators of stress mediated by cadmium (Hansen et al., 2007). Our study indicated a decrease of Cd and Cu concentration, increase of Zn concentration and reduction of CAT activity in snails coming from water containing DOC (43 mg L1) and Cd ions (1 mg L1) in comparison with snails from water containing exclusively cadmium. This effect was even stronger in water containing DOC + Cd and exposed to UV. Thus, it seems that the fluctuations of tested parameters in our studies indicate a protective effect of DOC against Cd ions. Our studies indicate that UV seems to intensify this effect. The decrease Cd availability after UV irradiation, might have been a result of increase of affinity of DOC to Cd2+ and increase of the strength of DOCCd2+ binding. We suggest that UV exposure of DOC water results in partial decomposition of DOC molecules. In this way more ligands of shorter chains occur in water, and these ligands most probably form new complexes with free metal ions. It is also possible that absorbed energy of UV excited electrons of DOC components to a higher level and this influenced the stability complexes and modified the affinity of ligands to metal ions. This may explain why Cd is less available in DOC water exposed to UV (Formicki at al., 2007), although the mechanism of UV influence on heavy metalsdoc binding needs further studies. UV radiation and physiological condition of aquatic animals In aquatic animals heavy metals are mainly taken up through respiratory epithelia. This uptake is directly related to the toxic effect of heavy metals as their cations inhibit the Na/K ATPase in the basolateral membrane of respiratory epithelium. Inhibition of sodium and chloride uptake initiates a cascade of effects such as swelling of cells (Kleinzeller et al., 1990), hypoxia, and disturbances in acid base balance and osmoregulation (Grosell et al., 2004). Numerous aquatic species take up oxygen and ions through the body wall. Thus there is a possibility of interactions between UV radiation and ionic uptake. Indeed some data suggest that UV may influence an uptake of metal ions from aquatic environment. Rai et al. (1998) found that in cyanobacterium UV radiation alters permeability of membranes and acts synergistically with Cu and Pb ions on NH4+ and PO43 uptake. The authors related this effect to the increased uptake of Cu and Pb ions in the presence of UV. Taking above into consideration we studied the influence of UV radiation on Cu2+, Pb2+, and Cd2+ uptake and depuration in common frog tadpoles in which skin plays essential role in gas exchange and ionic balance. Our studies indicated that UV radiation decreased lead, copper and cadmium uptake from water. On the other hand exposure of tadpoles to UV radiation during 61

63 3 days of recovery had no effect on copper, lead and cadmium depuration. Nevertheless we ob served significant increase of cadmium removal in tadpoles exposed to UV after 2 and 4 weeks of recovery (Formicki et al., 2006; Zakrzewski et al., 2007; Formicki et al., in print). The mechanism of observed UV action is unclear and needs further studies. Although it seems that it can not be related to the increase of permeability of biological membranes to heavy metals. In our opinion UV influence on metal ions uptake from aquatic environment is probably related to modification of functioning or damage to metal transporters such as DMT and Ctr. This may be confirmed by other studies indicating that UV inhibits expression of genes and decreases ATPase activity (Misra et al., 2002). These probably result in reduction of cations uptake as indicated in our studies. The UV influence on cadmium depuration may be quite simple. We have reported fast rate of heavy metals removal in common frog tadpoles several times (Formicki et al., 2006; Zakrzewski et al., 2007; Formicki et al., in print). Fast rate of heavy metals removal is probably related to the fast rate of developmental processes and gradual rebuilding of body structures. It is known that metamorphosis is faster in tadpoles living in unfavourably conditions (Duellman, Trueb 1986). UV exposure most probably induces faster rate of development of body structures and related removal of heavy metals. Conclusions Ultraviolet radiation may influence the bioavailability of heavy metals by modification of structure and chemical activity of ligands such as DOC in water. Direct exposure to UV of animals, which maintain ionic balance thanks to skin functions, may influence structure and/or affinity of specific metal transport systems to cations. Ultraviolet influence on general physiological condition of animals may also have indirect effect on metals uptake or removal. Theoretical models of heavy metals bioavailability are based mainly on water chemistry. We conclude that physical factors, especially UV, should be taken into consideration in such models. References 1. Company R, Serafim A, Bebianno MJ, Cosson R, Shillito B, Fiala Médioni A Effect of cadmium, copper and mercury on antioxidant enzyme activities and lipid peroxidation in the gills of the hydrothermal vent mussel Bathymodiolus azoricus. Marin Environ Res 58: Duellman E. D., Trueb L Biology of amphibians. McGraw Hill Book Company, New York, St Louis, San Francisco. 3. Ferrari L, Saliban A, Muino CV Selective protection of temperature against cadmium acute toxicity to Bufo arenarum tadpoles. Bull Environ Contam Toxicol 50: Formicki G, Stawarz R, Zamachowski W Combined effects of lead ions and UV radiation on general metabolism in common frog Rana temporaria Linnaeus, 1758 larvae. Ecol Chem Eng 13: Formicki G., Stawarz R., Kłyczek A. Ultraviolet radiation influence on copper ions accumulation and depuration in common frog larvae (rana temporaria l.).ecol Chem Eng (in print) 6. Grosell M, McDonald MD, Walsh PJ, Wood CM Effects of prolonged copper exposure in the marine gulf toadfish (Opsanus beta) II: copper accumulation, drinking rate and Na+/K+ ATPase activity in osmoregulatory tissues. Aquat Toxicol 68: Hansen B.H., Rømma S., Garmo Ø.A., Pedersen S.A., Olsvik P.A., Andersen R.A., Induction and activity of oxidative stressrelated proteins during waterborne Cd/Znexposure in brown trout (Salmo trutta). Chemosphere, 67 (11), Jokinen EI, Salo HM, Markkula SE, Immonen AK, Aaltonen TM Ultraviolet B irradiation modulates the immune system of fish (Rutilus rutilus, Cyprynidae) Part III: Lymphocytes. Photochem Photobiol 73:

64 9. Kleinzeller A, Booz GW, Mills JW, Ziyadeh FN pcmbs induced swelling of dogfish (Squalus acanthias) rectal gland cells: role of the Na +,K + ATPase and the cytoskeleton. Biochim Biophys Acta Biomembranes 1025: Misra R.B., Suresh Babu G., Ray R.S., Hans R.K.: Ecotox. Environ. Safety, 2002, 52, Naganuma T., Konishi S., Inoue T., Nakane T. and Sukizaki S., Photodegradation or photoalteration? Microbial assay of the effect of UVB on dissolved organic matter. Marine Ecology Progress Series, 135, Rai LC, Tyagi B, Rai PK, Mallick M Interactive effects of heavy metals (Cu and Pb) on nitrogen and phosphorus metabolism of a N2fixing cyanobacterium Anabaena doliolum. Environ Exp Bot 39: Santore R.C., Mathew R., Paquin P.R., DiToro D., Application of the biotic ligand model to predict zinc toxicity to rainbow trout, fatheat minnow, and Daphnia magna. Comparative Biochemistry and Physiology Part C, 133, Soumya N., Wood C.M., Biotic ligand model, a flexible tool for developing water sitespecific water quality guidelines for metals. Environmental Science and Technology, 38 (23), Spry DJ, Wiener JG Metal bioavailability and toxicity to fish in low alkalinity lakes: A critical review. Environ Pollut 71: Vidovic M, Sadibasic A, Cupic S, Lausevic M Cd and Zn in atmospheric deposit, soil, wheat, and milk. Environ Res 97: Voets J., Bervoets L., Blust R., Cadmium bioavailability and accumulation in the presence of humic acid to zebra mussel, Dreissena polymorpha. Environmental Science and Technology, 38 (4), Zakrzewski M., Formicki G., Stawarz R., Massanyi P Cadmium depuration in common frog tadpoles exposed to ultraviolet radiation. International Congress of Toxicology, Montreal, Canada, July 1519, Abstracts KONTAMINÁCIA VLHKÉHO KUKURIČNÉHO ZRNA MYKOTOXÍNMI NATURAL CONTAMINATION WITH MYCOTOXINS IN HIGH MOISTURE CORN 1 Gálik, B., 1 Bíro, D., 1 Juráček, M., 1 Šimko, M., 2 Golian, J., 1 Michálková, J. 1 Fakulta agrobiológie a potravinových zdrojov 2 Fakulta biotechnológie a potravinárstva Slovenská poľnohospodárska univerzita v Nitre Abstract In this study, the mycotoxins contamination was examined in fresh and ensiled high moisture corn. The maize corn was harvested in dry matter content 613,3 g.kg 1 and mechanically processed with Murska crimper 1000 HD. After 6 months of storage, silage plastic bins with the capacity 50 dm 3 were opened and average laboratory samples were tested for mycotoxins contamination: zearalenone, deoxynivalenol, T2 toxin, fumonisins, aflatoxins and ochratoxins. We detected the highest concentrations of fumonisins (117,1 µg.kg 1 ) and zearalenone (43,5 µg.kg 1 ) in the fresh matter of high moisture crimped corn. We didn t detect occurrence of deoxynivalenol in level of mg.kg 1. We found the lowest concentration of ochratoxins and aflatoxins. After the fermentation process, we detected the highest concentrations of trichothecenes: T2 toxin (232,17 µg.kg 1 ) and deoxynivalenol (0,13 mg.kg 1 ) in silage of high moisture crimped corn without additives. We found lower values in comparison to limited concentrations of mycotoxins valid in European Union and in the U.S.A.. Keywords: mycotoxins, occurrence, high moisture corn, silage 63

65 Abstrakt Cieľom práce bolo sledovanie mykotoxickej kontaminácie čerstvého a fermentovaného vlhkého miaganého kukuričného zrna. Kukuričné zrno zberané pri obsahu sušiny 613,3 g.kg 1 bolo bezprostredne po kombajnovom zbere pomiagané na miagači Murska 1000 HD. V čerstvej hmote a silážach po zakonzervovaní v silážnych kontajneroch s objemom 50 dm 3 bola v priemerných laboratórnych vzorkách sledovaná koncentrácia zearalenonu, deoxynivalenolu, T2 toxínu, fumonizínov, aflatoxínov a ochratoxínov. V čerstvom vlhkom miaganom kukuričnom zrne sme zaznamenali najvyššiu koncentráciu fumonizínov (117,1 µg.kg 1 ) a zearalenonu (43,5 µg.kg 1 ). V rozsahu hodnôt mg.kg 1 sme nezistili prítomnosť deoxynivalenolu. Najnižšia koncentrácia bola zaznamenaná v obsahu ochratoxínov a aflatoxínov. Po ukončení fermentačného procesu sme v silážach vlhkého miaganého kukuričného zrna bez prídavku aditív zistili najvyššie koncentrácie trichothecénov: T2 toxínu (232,17 µg.kg 1 ) a deoxynivalenolu (0,13 mg.kg 1 ). V porovnaní s limitnými koncentráciami mykotoxínov v krmivách platných v Európskej únii a Spojených štátoch amerických sme zistili nižšie hodnoty. Kľúčové slová: mykotoxíny, výskyt, vlhké kukuričné zrno, siláž Úvod Jedným z faktorov rozhodujúcich o efektivite živočíšnej produkcie je aj kvalita skrmovaných krmív. Už v roku 1974 Herting a Drury publikovali, že krmivá vyznačujúce sa nízkou hygienickou kvalitou negatívne ovplyvňujú tak zdravotný stav ako aj výšku dosahovanej úžitkovosti hospodárskych druhov zvierat. Z pohľadu ich kvality a biologickej bezpečnosti predstavuje v súčasnosti globálny problém kontaminácia mykotoxínmi (Leibetseder, 1995; Kačaniová, 2003 a Tapia et al., 2005). Nedělník a Moravcová (2006) považujú práve kontamináciu krmív mikroskopickými hubami a mykotoxínmi za limitujúci faktor ich kvality z pohľadu hospodárskych zvierat. Jedná sa o sekundárne metabolity vláknitých mikroskopických húb, ktoré sa vyznačujú najmä karcinogénnymi, mutagénnymi, neurotoxickými, immunotoxickými a teratogénnymi prejavmi v živočíšnom organizme (Yiannikourisa, Jouany, 2002). Ich nebezpečenstvo spočíva aj v ich schopnosti penetrácie do potravového reťazca prostredníctvom živočíšnych produktov (Steyn, 1998 a Scudamore, 1998). Mykotoxíny sú produkované širokým spektrom mikroskopických húb a vyskytujú sa v celej škále poľnohospodárskych plodín (Charmley et al., 1995). Svetová organizácia pre poľnohospodárstvo a výživu (FAO) odhaduje, že približne 2530 % celosvetovej produkcie potravových plodín je kontaminovaných mykotoxínmi. V súčasnosti je vo svete známych viac ako 400 druhov rozličných mykotoxínov produkovaných viac ako 1000 rodmi mikroskopických húb. Najzávažnejšími a súčasne najčastejšie sa vyskytujúcimi rodmi sú Alternaria, Aspergillus, Ceratocystis, Fusicoccum, Fusarium a Penicillium sp. (Nedělník a Moravcová, 2006). V objemových krmivách sú najčastejšie vyskytujúcimi sa mykotoxínmi aflatoxíny, deoxynivalenol, zearalenon, T2 toxín a fumonizíny. Za limitujúci faktor pre rast a rozmnožovanie mikroskopických húb možno považovať obsah vlhkosti, pri mykotoxínoch ph (Lacey et al., 1991, Whitlow a Hagler, 2002). Fumonizíny sa vo vyšších koncentráciách najčastejšie vyskytujú v kukurici a jej produktoch. Ich toxické účinky sa prejavujú predovšetkým u koní a ošípaných, ktoré sú na ne najcitlivejšie. Rovnakým rodom mikroskopických húb sú produkované trichothecény (deoxynivalenol, nivalenol, T2 toxín). Jedná sa o skupiny toxínov, ktorých prejavy sa spájajú s gastroenteritídou a intestinálnymi hemorágiami u ošípaných (Danicke, 2002 a Bottalico et al., 2002). Ďalší toxín, zearalenone, sa často vyskytuje spoločne s deoxynivalenolom a je charakteristický estrogénnymi účinkami (Alldrick, Hajšelová, 2004). Skupinu aflatoxínov a ochratoxínov možno v podmienkach Slovenska označiť za mykotoxíny produkované skladovými druhmi mikroskopických húb. Jednou z možností eliminácie nežiadúcej časti epifytnej mikroflóry a tým nepriamo aj mykotoxínov je aplikácia konzervačných aditív. Jedná sa hlavne o prípravky, ktorých účinnými zložkami sú organické kyseliny, resp. ich soli vyznačujúce sa výraznými fungicídnymi a baktericídnymi vlastnosťami (Bíro, Juráček 2003, Pyrochta, Doležal et al., 2005). 64

66 Materiál a metodika V poloprevádzkových podmienkach sme konzervovali kukuričné zrno zberané pri vyššom obsahu vlhkosti (zrnový hybrid Latizana), pestované v rovnakých agroekologických podmienkach. Zrno kukurice bolo zberané pri obsahu sušiny 613,3 g.kg 1. Následne bolo zrno kukurice mechanicky spracované na miagači Murska 1000 HD. Takto upravené vlhké miagané kukuričné zrno sme hermeticky natlačili a uzatvorili v silážnych kontajneroch s objemom 50 dm 3. Počas konzervačného procesu (trvanie 6 mesiacov) boli kontajnery uskladnené v Laboratóriu konzervovania krmív Katedry výživy zvierat FAPZ SPU v Nitre pri teplote C. Po ukončení konzervačného fermentačného procesu boli kontajnery otvorené a v priemerných laboratórnych vzorkách sme stanovili koncentráciu sledovaných mykotoxínov. Pre screeningovú determináciu sme využili imonoenzymatický kvantitatívny test s použitím analyzátora Elisa Reader (Noack, SR). Testovacia súprava (testovací kit) obsahovala základnú sadu reagentov a riediacu sadu štandardných roztokov. Koncentráciu konkrétneho toxínu sme zistili prostredníctvom spektrofotometra (ELISA Reader) pri vlnovej dĺžke 650 nm. Príprava vzorky V čerstvom kukuričnom zrne a v silážach sme sledovali koncentráciu deoxynivalenolu (DON) extrakcia: 10g vzorky ml dest. vody, fumonisínu (FUM) extrakcia: 5g vzorky + 25 ml 70% metanolu a riedenie extraktu dest. vodou v pomere 1:7, zearalenonu (ZON) extrakcia: 5g vzorky + 25 ml 70% metanolu, riedenie extraktu v pomere 1:5, aflatoxínu (AFL) extrakcia: 5g vzorky + 25 ml 70% metanolu ochratoxínu (OT) extrakcia: 10g vzorky + 40 ml 50% metanolu a T2 toxínu (T2 ) extrakcia vzorky: 5g vzorky + 25 ml 50% metanolu. Extrahované laboratórne vzorky sme po dôkladnom trepaní prefiltrovali a pripravili na test. Meranie koncentrácie sme realizovali podľa metodiky dodávateľa prístroja (fi. Noack, SR). Výsledky boli štatisticky spracované v prostredí štatistického programu Statgraphics verzia 5.0.1, jednofaktorovou analýzou variancie (ANOVA), aritmetický priemer, smerodajná odchýlka a variačný koeficient, pre porovnanie priemerov bol použitý LSD test. Výsledky a diskusia V čerstvom vlhkom miaganom kukuričnom zrne sme zo sledovaných mykotoxínov (tabuľka 1) zaznamenali najvyššiu koncentráciu fumonizínov (117,1µg.kg 1 ) a druhú najvyššiu konce ntráciu zearaleno nu, ktorý je charakte ristický svojimi estrogénnymi účinkami prejavujúcimi sa poruchami estrálneho cyklu (Weaver et al., 1986). Priemerná hodnota zearalenonu bola 43,5 µ g.kg 1. Na hladine koncentrácie mg.kg 1 sme nezistili prítomno sť DON. Najnižšia koncentrácia bola zaznamenaná v obsahu O T (0,3 µg.kg 1 ) a AFL (2,4 µg.kg 1 ). Po ukončení fermentačného procesu sme v silážach vlhkého miaganého kukuričného zrna bez prídavku aditív zistili najvyššie koncentrácie trichothecénov (T2 toxín a DON). Koncentrácia T2 toxínu bola 232,17 µg. kg 1, s rozpätím od 219,3 do 257,3 µg.kg 1. V obsahu deoxynivalenolu, ktorý je roz hodujúcim faktorom zníženého príjmu krmiva u zvierat (B ondy a Pestka, 2000), sme zistili priemernú koncentráciu 0, 13 m g.kg 1. Fumonizíny spôsobujú predovšetkým poškodenie pe čene a nervového tkaniva. Richar d et al. (1996) u dojníc zistili pokles príjmu krmiva a produkcie mlieka. V jeho obsahu sme zistili priemernú konc entráciu 1 70,2 µg.kg. V obsahu mykotoxínov skladových húb, za ktoré je mož né v klimatických podmienkach SR považovať aflatoxíny a ochratoxín, sme zaznamenali najnižšie hodnoty. Jedná sa o toxické metabolity produkované mikroskopickými hubami rodu Aspergillus a Penicillium. V obsahu AFL bola priemerná hodnota 2,47 µg.kg 1 a v obsahu ochratoxínu sa koncentrácia pohybovala od 2,0 do 2,8 µg.kg 1. Pri porovnaní obsahu mykotoxínov v čerstvom a konzervovanom vlhkom miaganom kukuričnom zrne sme zistili výrazné zvýšenie koncentrácie trichothecénov v silážach, menej výrazné zvýšenie koncentrácie OT a AFL a pokles ZON a FUM. Whitlow et al. (1998) počas 9 tich rokov analyzovali mykotoxíny v siláži kukurice a v kukuričnom zrne, kde zaznamenali 65

67 výskyt AFL (>10µg.kg 1 ) 8 a 9 %, DON (>500 µg.kg 1 ) 51 a 52 %, ZON (>300 µg.kg 1 ) 17 a 3 %, Ttoxínu (>200µg.kg 1 ) 5 a 4 %, FUM (>1mg.kg 1 ) 31 a 60 %. Vo väčšine krajín Európskej únie neexistujú najvyššie prípustné množstvá pre jednotlivé mykotoxíny v krmivách (na rozdiel od potravín). Existuje iba odporúčanie Európskej Komisie z augusta 2006, ktoré však nezohľadňuje všetky druhy krmív ako aj druhy a kategórie zvierat. V Spojených štátoch je limitná koncentrácia pre ZON vo všetkých krmivách a pre všetky druhy a kategórie zvierat 500 µg.kg 1, tiež pre T2 toxín. Pre fumonizíny platí v USA maximálna hodnota 5000 µg.kg 1 a µg.kg 1 pre deoxynivalenol. Hodnoty mykotoxínov v čerstvom a fermentovanom vlhkom miaganom kukuričnom zrne neprekročili uvádzané limitné koncentrácie. Tabuľka 1 Výskyt mykotoxínov v čerstvom a konzervovanom vlhkom kukuričnom zrne n = 3 Sušina FUM AFL ZON T 2 OT DON g.kg 1 µg.kg 1 mg.kg 1 Č. x 613,3 117,1 2,4 43,5 4,3 0,3 * Silážované zrno x 603,8 70,2 2,47 38,97 232,17 2,33 0,13 min 599,3 33,4 2,3 23,5 219,3 2,0 0,1 max 610,7 121,6 2,7 49,5 257,3 2,8 0,2 s 6,087 45,877 0,208 13,684 21,768 0,416 0,058 v 1,008 65,352 8,439 35,117 9,376 17,843 43,301 Č čerstvé vlhké kukuričné zrno, * nedetekované, FUM fumonizíny, AFL aflatoxíny, ZON zearalenon, DON deoxynivalenol, T2 toxín, OT ochratoxíny Záver V čerstvom vlhkom miaganom kukuričnom zrne sme zo sledovaných mykotoxínov zaznamenali najvyššiu koncentráciu fumonizínov a druhú najvyššiu koncentráciu zearalenonu. Na hladine koncentrácie mg.kg 1 sme nezistili prítomnosť DON. Najnižšia koncentrácia bola zaznamenaná v obsahu OT a AFL. Po ukončení fermentačného procesu sme v silážach vlhkého miaganého kukuričného zrna sme zistili prítomnosť všetkých testovaných mykotoxínov (DON, ZON, T2 toxín, FUM, AFL, OT). Najvyššiu koncentráciu sme zistili v obsahu T2 toxínu a DON, pričom najnižšia koncentrácia bola zaznamenaná v obsahu OT a AFL. V porovnaní s uvádzanými limitnými koncentráciami sme zaznamenali nižšie hodnoty. V priebehu silážneho fermentačného procesu je možné výrazne ovplyvniť obsah tzv. skladových druhov mikroskopických húb produkujúcich aflatoxíny a ochratoxíny, najmä dodržiavaním zásad správnej výrobnej praxe. Pri porovnávaní obsahu mykotoxínov v čerstvom a konzervovanom vlhkom miaganom kukuričnom zrne sme zistili výrazné zvýšenie koncentrácie trichothecénov v silážach. Táto práca vznikla za podpory projektu VEGA 1/2429/05 Efektívnejšie využitie domáceho kŕmneho potenciálu pri produkcii bezpečných živočíšnych potravín a eliminácii ekologických rizík. Literatúra Alldrick, A.J., Hajšelová, M Zearalenoe. In Magan, N., Olsen, M.: Mycotoxins in food, 1. edt., Cambridge: Woodhead Publishing Ltd., 440 p., ISBN , p Bíro, D., Juráček, M Conservation of maize corn with high moisture by organic acids. In 11th International Scientific Symposium: Forage Conservation. VÚŽV: Nitra, 2003, p

68 Bottalico, A., et al Toxigenic Fusarium species and mycotoxins associated with head blight in small grain cereals in Europe. In European Journal of Plant Pathology, 2002, vol. 108, p Bondy, G.S., Pestka, J.J Immunomodulation by fungi toxin. In Journal of Toxicology and Enviromental Health, vol. 3, 2000, p Danicke, S Effect of Fusarium toxin contaminated wheat grain and detoxifying agent on rumen physiological parameters and in sacco dry matter degradation of wheat straw and lucerne hay in wethers. In Journal of Animal and Feed Science, vol. 11, p Herting, D.C., Drury, E.E Antifungal activity of volatile fatty acids on grains. In Cereal chemistry, vol. 51, 1974, p Charmley, L.L., Trenholm, H.L., Prelusky, D.B Mycotoxins: their origin, impact and importance: insights into common methods of control and elimination. In Lyons, T.P., Jacques, K.A.: Biotechnology in the feed industry, Nottingham University Press: Nottingham, 1. vyd., 1995, 465 p., ISBN , p Kačániová, M Feeding soybean colonization by microscopic fungi. In: Trakya Univ. J. Sci., vol 4, 2003, p Lacey, J Natural occurrence of mycotoxins in growing and conserved forage crops. In Smith, J.E., Henderson, R.E.: Mycotoxins and animal food, 1991, 1. edt.., Boca Raton Florida: CRC Press, p Leibetseder, J The European perspective on mycotoxins. In Lyons, T.P., Jacques, K.A.: Biotechnology in the feed industry, Nottingham University Press: Nottingham, 1. edt., 1995, 465 p., ISBN , p Nedělník, J., Moravcová, H Mycotoxins and forage crops problem of the occurrence of mycotoxins in animal feeds. In 12th International Symposium: Forage Conservation, VFU: Brno, 2006, p Richard, J.L., Meerdink, G., Maragos, C.M. et al Absence of detectable fumonisins in the milk of cows fed Fusarium proliferatum (Mathushima)Nirenberg culture material. In Mycopathologia, vol. 133, 1996, p Scudamore, K.A., Livesey, C.T Occurrence and significance of mycotoxins in forage crops and silage: a review. In Journal of the Science of Food and Agriculture, vol. 77, 1998, p. 117 Tapia, M.O., Stern, M.D., Soraci, A.I., et al Patulinproducing molds in corn silage and high moisture corn and effects of patulin on fermentation by ruminal microbes in continouous culture. In Animal Feed Science and Technology, vol. 118, 2005, p Whitlow, L.W., Hagler, W.M., Hopkins, B.A Mycotoxins occurrence in farmer submitted samples of North Carolina feedstuffs In Journal of Dairy Science, vol. 81, 1998, p Weaver, G.A., Kurtz, H.J. et al Effect of zearalenone on dairy cows. In American Journal of Veterinary Research, vol. 47, 1986, p Yiannikouris, A., Jouany, J.P Mycotoxins in feeds and their fate in animals. In Animal Research (A review), vol. 51, 2002, p Kontaktná adresa: Ing. Branislav Gálik, PhD., Katedra výživy zvierat, Fakulta agrobiológie a potravinových zdrojov, SPU v Nitre, [email protected] 67

69 MIKROBIOLOGICKÁ KONTROLA HYGIENY A SANITÁCIE PRI SPRACOVANÍ JATOČNEJ HYDINY MICROBIAL CONTROL OF HYGIENE AND SANITATION IN POULTRY PLANT. Golian, J., Čapla,., Sokol, J., Zajác, P., Katedra hygieny a bezpečnosti potravín, Fakulta biotechnológie a potravinárstva, Slovenská poľnohospodárska univerzita v Nitre, Abstrakt In this paper, we are evaluating level of hygiene and sanitation in the poultry plant. We were used 3M Petrifilm method. Total number of 100 samples were analysed for TBC and Enterobacteriaceae. We were not find overload of legislation limit for TBC in stainless steal surfaces. We were find higher counts of TBC in plastic surfaces. Enterobacteriaceae were found only sporadically and higher counts of Enterobacteriaceae were found in plastic and rubber surfaces. Úvod Možných rizík vzniku alimentárnych ochorení je niekoľko. Prvotným problémom je príjem kontaminovanej suroviny do spracovateľských závodov. I pri neškodnej surovine hrozí pri nedostatočnej hygiene riziko kontaminácie. Pri nízkej úrovni sanitácie nie sú zneškodnené všetky mikrobiálne činitele; je umožnený ich rast, rozmnožovanie i prenos. Obchod a doprava zvierat, surovín živočíšneho pôvodu, krmív, potravín, ľudí a ich migrácia zohrávajú v rozšírení alimentárnych patogénov tiež významnú úlohu. Zvýšenú pozornosť v mikrobiológii potravín si získal model kvantitatívneho odhadu rizika (QMRA) a prediktívne modelovanie. Ponúkajú riešenia na zvýšenie bezpečnosti potravín hodnotením nových výrobkov a prognózovaním účinkov rôznych opatrení vo výrobnom procese. Zatiaľ čo HACCP sa najviac uplatňuje v priemyselnej výrobe, QMRA často slúži na účely verejného zdravotníctva a prediktívne modelovanie využíva bakteriálny rast na kvantifikovanie zvýšenia či zníženia baktérií. Niektoré QMRA štúdie týkajúce sa Salmonella enteritidis vo vajciach alebo Salmonella spp. a Campylobacter spp. v hydine sú už kompletné alebo vo vývoji. Popisujú možné riziko v celom procese, od zdroja (napr. farma) až po moment konzumácie. Výsledky potom majú slúžiť nielen na odhad rizika, ale aj na predvídanie účinkov opatrení uplatnených na zmiernenie rizika (Nauta, 2001). Alimentárne ochorenia zapríčinené mikrobiálnymi činiteľmi sú rozsiahlym a narastajúcim verejným zdravotným problémom. Veľa krajín, ktoré majú vypracovaný monitoring týchto ochorení, zaznamenalo v posledných desaťročiach významný nárast prípadov spôsobených Salmonella spp., Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes alebo Escherichia coli O157:H7. Zdrojom informácií o alimentárnych ochoreniach v Európskom regióne je program WHO Surveillance Programme for Control of Foodborne Diseases in Europe. Salmonelóza je najčastejšie zaznamenávaná alimentárna nákaza. (Tirado, 2002). Monitorovací program pre zoonózy a zoonotické agensy, ako aj koordinované programy pre oficiálne úradné kontroly potravín môžu zlepšiť základne údajov pre štúdie odhadu rizika. Na zhromaždenie všetkých potrebných údajov (kvantitatívnych) o výskyte Campylobacter v brojlerových kurčatách bude potrebný rozsah všetkých existujúcich aj budúcich monitorovacích systémov. Výsledky sa dajú dosiahnuť len detailnými štúdiami. Pre odhad konečného rizika pre konzumenta sú relevantné aj regionálne údaje o výrobe a spracovaní brojlerových kurčiat, ako aj údaje z domácností o manipulácii s nimi (Bartelt, 2004). V Austrálii v roku 2003 sa celkovo vo všetkých štátoch vyskytlo prípadov alimentárnej nákazy spolu 8 patogénmi, pričom Salmonella tvorila 30 % prípadov. Spomedzi sérotypov bol najčastejší Salmonella typhimurium, spomedzi fagotypov to bol u Salmonella enteritidis fagotyp 26 (Ozfoodnetworking Group, 2004). 68

70 Salmonella brandenburg nepatrila medzi frekventované patogény, napriek tomu na Novom Zélande zaznamenali od roku 1996 jej narastajúci výskyt. V rokoch spomedzi všetkých prípadov salmonelóz spôsobila 48 %. Má sezónny výskyt, najviac prípadov sa vyskytuje od septembra do novembra (Clarke, Tomlinson, 2004). Prenos salmonel do hydinárskeho priemyslu je často spájaný s kontaminovanými krmivami. Keďže salmonely sú schopné prežiť aj niekoľko mesiacov pri chladiarenských podmienkach, predstavuje to závažný problém v hydinárskej produkcii. Pre zlepšenie tejto situácie je potrebný dôsledný dozor nad všetkými operáciami pri produkcii a takisto je dôležité odoberanie vzoriek (Maciorowski et al., 2004). Salmonelóza súvisiaca s vajcami je závažným problémom v európskych krajinách i v Spojených Štátoch Amerických. Výskyt tejto baktérie sa spája výrobkami obsahujúcimi surové alebo nedostatočne uvarené vajcia, so zmrzlinou, majonézou. Na zničenie baktérií pri kontaminovaných vajciach sa doporučuje teplota 60 C po dobu 3 minút (Hermawan et al., 2004). V porovnaní so surovým mäsom a vajcami sú mliečne výrobky menej významným vektorom pre salmonelové infekcie (Reu et al., 2004). Materiál a metodika V práci sme vykonali mikrobiologickú kontrolu hygieny a sanitácie vo vybranom hydinárskom podniku. Na mikrobiologickú kontrolu sme použili doštičky PETRIFILM platní. Analyzovali sme celkovo 100 vzoriek, z toho 50 vzoriek na celkový počet mikroorganizmov (CPM) a 50 vzoriek pre stanovenie Enterobacteriaceae. Metóda 3M je metóda podľa AOAC, validovaná podľa AFNOR. Vzorky sme odobrali 1 krát týždenne počas 5. týždňov pred začatím prevádzky, pričom predchádzajúci deň po skončení prevádzky bola vykonaná sanitácia. Vzorky boli odoberané z nasledovných miest a povrchov: 1. pásový dopravník na živú hydinu guma, 2. vykrvovací žľab nerezová oceľ, 3. vyberač vnútorností nerezová oceľ, 4. pracovný stôl na pečienky nerezová oceľ, 5. zhadzovacie miesta nerezová oceľ, 6. pracovné stoly nerezová oceľ, 7. pásový dopravník na kuracie stehná guma, 8. ručná filetovačka, nerezová oceľ, 9. kalibrovačka MAREL nerezová oceľ, 10. prepravka na chladenú hydinu plast Po pritlačení povrchu Petriflm Platní na daný povrch boli prenesené do laboratória na inkubáciu. Inkubáciu platní na stanovenie CPM sme vykonali pri teplote 30±1 0 C po dobu 48±2 hodiny a pre Enterobacteriaceae pri teplote 37±1 0 C po dobu 24±2 hodiny. Limitné hodnoty pre CPM a Enterobacteriaceae podľa Potravinového kódexu SR su: CPM 010 KTJ/cm 2 vyhovuje, viac ako 10 KTJ/cm 2 nevyhovuje, Enterobacteriaceae 01 KTJ/cm 2 vyhovuje, viac ako 1 KTJ/cm 2 nevyhovuje. Výsledky a diskusia Výsledky mikrobiologickej kontroly naznačujú, že procesy súvisiace s čistením a sanitáciou sa v prevádzke nevykonávajú podľa požadovaných zásad. Zvýšená mikrobiologická kontaminácia bola zistená vo viacerých prípadoch, nebolo to však kontinuálne pri všetkých odberoch. U pásových dopravníkov sme zistili pri 4tom odbere CPM viac ako 500. Toto je možné pripísať predovšetkým poškodeniam gumového povrchu, kde sa zachytávajú nečistoty a následne tam rastie mikrobiálna kontaminácia. Vysoké hodnoty CPM sme zistili z povrchu ručnej filetovačky, kde príčinami kontaminácii boli pravdepodobne nedostatočný oplach, kontaminácia rukami resp. kontaminácia rozstrekovanou vodou. Zvýšenie počtu CPM sme 69

71 zistili aj u kalibrovacieho zariadenia aj keď len v jednom prípade ale predpokladáme, že z rovnakých zdrojov ako u filetovačky. Najvyšší stupeň kontaminácie sme zistili u prepraviek na hydinu, kde bol zistený celkový počet CPM od KTJ/ cm 2. Plastové prepravky boli čistené nepravidelne, dezinfekcia bola len minimálna a boli zdrojom kontaminácie v celej prevádzke. V práci sme potvrdili, že výskyt baktérií na povrchoch, ktoré sú v kontakte s potravinami zvyšuje riziko krížovej kontaminácie mikroorganizmov a potravín čo potvrdili aj práce Nauta (2001) a Bartelta (2004). Z nami zistených výsledkov vyplýva, že hygiena jednotlivých odberových miest v sledovanom hydinárskom podniku bola vyhovujúca, v ojedinelých prípadoch však boli prekročené hodnoty prípustných limitov. V prípade spolupôsobenia ďalších faktorov to môže mať za následok aj plošné rozšírenie kontaminácie a ohrozenie zdravia spotrebiteľov. Záver V práci sme zistili rozdielny stupeň mikrobiálnej kontaminácie povrchov na jednotlivých odberových miestach. Boli zistené rozdiely v mikrobiálnej kontaminácii povrchov vo vzťahu k času a spôsobu čistenia a dezinfekcie, materiálu, povrchu a stupňa vlhkosti povrchu. Zistili sme tiež rozdiely v mikrobiálnej kontaminácii povrchov, ktoré prichádzajú do kontaktu s rukami v porovnaní s povrchmi, ktoré neprichádzajú do kontaktu s rukami pracovníkov. Bola zistená takmer rovnaká tendencia výskyty mikrobiálnej kontaminácie u povrchov nachádzajúcich sa v tesnej blízkosti respektíve v jednej miestnosti. Literatúra Bartelt, E. (2004). Monitoring and risk assessment of Campylobacter infections. In: Deutsch Tierarztl Wochenschr., 111 (8), 2004, s Clarke, R. Tomlinson, P. (2004). Salmonella brandenburg : changing patterns of disease in Southland Province, New Zealand. In: New Zealend Medicine Journal, 117 (1205), 2004, s Hermawan, M. Evrendilek, A. G. Dantzer, W. R. Zhang, Q. H. Richter, E. R. (2004). Pulsed Electric Field Treatment of Liquid Whole Egg Inoculated with Salmonella Enteritidis. In: Journal of Food Safety, roč. 24, 2004, č. 1, s Maciorowski, K. G. Jones, F. T. Pillai, S. D. Ricke, S. C. (2004). Incidence, sources and control of food borne Salmonella spp. in poultry feeds. In: World s Poultry Science Association, roč. 60, 2004, č. 4, s Nauta, J. M. (2001). Modelling bacterial growth in quantitative microbiological risk assessment : is it possible? In : International Journal of Food Microbiology, 73, 2003, s Ozfoodnetworking GROUP (2004). Foodborne disease investigation across Australia: annual report of the OzFoodNet network, In: Commun. Dis. Intell., 28 (3), 2004, s Reu, K. Grispeerdt, K. Herman, L. (2004). Microbiological safety of raw milk farm products. In: Journal of Food Safety, roč. 24, 2004, č. 1, s Tirado, C. (2002). Statistical Information on Food Borne Disease in Europe : microbiological and chemical hazards. In: Pan European Conference on Food Safety and Quality ( , Budapest, Hungary), Secretariat of the FAO/WHO, 2002, s Práca podporená Grantom VEGA G 287 Zvyšovanie bezpečnosti potravín prostredníctvom integrovaného prístupu analýzy rizika vo vzťahu k zdraviu človeka Kontaktná adresa: doc. Ing. Jozef Golian, Dr., Katedra hygieny a bezpečnosti potravín, Fakulta biotechnológie a potravinárstva SPU v Nitre, Tr. A. Hlinku 2, Nitra, tel. 037/ , [email protected] 70

72 VPLYV KADMIA NA CELKOVÝ OBSAH POLYFENOLICKÝCH LÁTOK V SLNEČNICI A HORČICI. THE INFLUENCE OF CADMIUM ON TOTAL POLYPHENOLIC SUBSTANCES CONTENT Harangozo, Ľ., Árvay, J., Katedra chémie, Fakulta biotechnológie a potravinárstva, Slovenská poľnohospodárska univerzita v Nitre, Abstrakt In the paper the results from vegetation pot experiment with using the soil from locality Výčapy Opatovce are presented. The experiment goal was the monitoring of risky metals enter into edible part of mustard seed and sunflower seed and to survey mutual relation between the heavy metals content and the content of total polyphenols. The contents of selected heavy metals by AAS method in seeds mustard and sunflower were determined. Afterwards the total polyphenolic substances content was determined, calculated on the tannin content.. The total polyphenolic substances conent in mustard in control variant (A variant) by calculation on tannin was mg.kg 1. In other variants the decline of polyphenols content beside B variant (with addition of 4,6 mg Cd) was observed, where the content of polyphenols was enhanced at 5 %. The total polyphenolic substances content in sunflower in control variant (A variant) when 1 calculated on tannin was mg.kg. Althoug the results suggest that by enhanced cadmium contents, also the total polyphenols content in plants was enhanced,it is not possible to define their mutual definite relation. Úvod Problematikou kontaminácie pôd a rastlín ťažkými kovmi sa zaoberajú viacerí autori. Ich výsledky sú niekedy protichodné. Príčinou je hlavne skutočnosť, že účinky kontaminantov sa môžu meniť vplyvom vonkajších podmienok ako je vlhkosť pôdy, podnebie, spôsob hnojenia, druh pôdy a rastliny. Z tohto dôvodu je dôležité poznať chovanie sa ťažkých kovov v konkrétnych problémových oblastiach. Pri zvyšovaní obsahu toxických kovov v pôde sa zvyšuje ich obsah aj v požívatinách rastlinného pôvodu a následne aj v živočíšnych produktoch, čo môže mať nepriaznivé následky na človeka, ktorý tieto požívatiny a produkty konzumuje. Ťažké kovy v životnom prostředí Ťažké kovy v pôde kontaminujú všetky zložky životného prostredia, ale najmä pôdu. Je to zapríčinené silnou adsorpciou ťažkých kovov na pôdne koloidy. Súčasné poznatky zo sledovania sorpcie ťažkých kovov pôdami uvádzajú významnosť zloženia pôd a ich fyzikálno che mických vlastností pre charakter väzby ťažkými kovmi. Zaraďujú k nim obsah ílu, oxidov Fe a Mn, obsah a kvalita humusu, katiónová sorpčná kapacita, ph a ďalšie. Kontaminácia životného prostredia kadmiom sa stáva vážnym ekologickým problémom. Kadmium Kadmium sa zaraďuje k na jzávažnejším kontaminantom životného prostredia. Na rastliny môže pôsobiť ako stresový faktor vyvolá vajúci fyziologické zmeny, ktoré môžu vyústiť do inhibície rastu až vyhynutia rastliny. V ľudskom organizme sa kumuluje, pričom zapríčiňuje poruchy kardiovaskulárneho systému a CNS, poškodenie obličiek a pečene, spôsobuje anémiu a onkologické ochorenia (Vollmannová et al., 2006). Podľa Beneša (1994) väčšina rastlín dobre toleruje zvýšené obsahy kadmia v pôde (paradajky, zemiaky). Citlivé plodiny reagujú negatívne 1 na koncentráciu Cd v pôde 4 13 mg.kg (špenát, sója, tabak), ktorá je však z hygienického živote veľmi vysoká. Vyššie koncentrácie kadmia v pôde inhibujú príjem Ca 2+ a Mg 2+ 71

73 rastlinami. Rastliny sa môžu vysporiadať s prebytkom kadmia zadržiavaním prebytočných iónov v koreňoch alebo na hraniciach metabolicky dôležitých orgánov, znížením aktivity prebytočných iónov. Polyfenolické látky Odhad príjmu fenolov potravou je pomerne komplikovaný vzhľadom na štruktúrnu odlišnosť fenolov, nedostatok štandardizovaný ch a spoľahlivých metód kvantifikácie rôznych tried fenolov, rozličnosť obsahu fenolov v rámci každej potravy, nevyváženosťou rozdelenia fenolov v rastlinnej potrave a technológii pri výrobe potravín (Juven et al., 1972). Materiál a metodika Experiment bol vykonaný formou vegetačného nádobového pokusu vo vegetačnej klietke v areáli SPU Nitra. Pred založením vegetačného nádobového pokusu (ďalej len VNP)sa uskutočnili všetky potrebné analýzy v pôde. Stanovila sa pôdna reakcia, obsah dusíka podľa Kjeldahla, obsah fosforu, draslíka a horčíka podľa Mehlicha II. Následne sa stanovil aj obsah ťažkých kovov vo výluhu zmesi kyselín HCl a HNO 3 (rozklad lúčavkou kráľovskou). Zo získaných hodnôt boli následne vypočítané potrebné množstvá základného hnojenia s NPK a to dusíka vo forme močoviny, fosforu vo forme superfosfátu a draslíka vo forme draselnej soli KCl. Do jednej pokusnej nádoby sme navážili 5 kg záujmovej pôdy premiešanej s 1 kg kremičitého piesku, pričom na dno nádoby sa dávala malá drenážna vrstva štrku. Každá plodina mala 4 varianty, základ ný variant bol len s príd avkom NPK a ďalšie tri varianty mali okrem základného hnojenia aj stupňujúci prídavok kadmia vo forme Cd(NO3) 2. Hnojenie NPK : N močovina 4,2 g P superfosfá t 22 g K KCl 4,9 g Množstvá pridaného Cd(NO 3 ) 2 sú uvedené v nasledovnej tabuľke: Varianty A B C D Hnojenie NPK NPK + 4,6 mg Cd/nádoba NPK + 9,1 mg Cd/nádoba NPK + 13,5 mg Cd/nádoba Plodiny sme zberali v čase plnej zrelosti a po vysušení a úprave vzoriek sme stanovovali obsah ťažkých kovov v zrne a v slame a obsah celkových polyfenolov v zrne metódou AAS. Jednotlivé charakteristiky použitej pôdy udáva nasledujúce tabuľky 1 až 3. Tab. 1: Charakteristiky pôdy z lokality Výča py Opa tovce obsah humusu, uhlíka a pôdna reakcia Pôda Výčapy Opatovce Humus % Cox % ph (H2O) ph (K Cl) 2,633 1,527 5,98 4,36 Pôda z lokality Výčapy Opatovce mala extrémne kyslú pôdnu reakciu a bola stredne humózna. Tab. 2: Obsah prístupných živín v pôde z lokality Výčapy Opatovce Mehlich II Pôda Výčapy Opatovce N mg.kg 1 P mg.kg 1 K mg.kg 1 Ca mg.kg 1 Mg mg.kg ,86 212, Pôda z lokality Výčapy Opatovce mala veľmi malý obsah fosforu, dobrý obsah draslíka a vysoký obsah horčíka. 72

74 Tab. 3: Obsah ťažkých kovov v pôde stanovených vo výluhu zmesi kyselín HCl a HNO 3 (rozklad lúčavkou kráľovskou) (mg.kg 1 ). Fe Mn Zn Cu Co Ni Cr Pb Cd pôda ,2 52,4 45,8 15,0 31,6 31,8 22,2 0,9 220/ ,7 Všetky obsahy ťažkých kovov boli pod maximálnymi prípustnými množstvami podľa zákona 220/2004 okrem kadmia, ktoré prekračovalo povolené množstvo o 22,3 % a obsah kobaltu bol na úrovni maximá lneho limitu. Výs ledky a diskusia V nasledujúcich tabuľkách uvádzame výsledky získané chemickými analýzami slnečnice ročnej a horčice bielej. Jednotlivé obsahy ťažkých kovov v semenách plodín sme porovnávali s maximálnymi prípustnými množstvami podľa Potravinového kódexu Slovenskej republiky. Tab. 4: Obsahy ťažkých kovov v zrne slnečnici ročnej vypestovaného na pôde z lokality Výčapy Opatovce (mg.kg 1 ). variant Fe Mn Zn Cu Co Ni Cr Pb Cd A 51,48 48,39 37,4 13,34 0,78 7,185 3,02 0,94 1,1 B 48,42 39,96 34,79 11,67 0,5 7,1 2,78 0,86 2,8 C 48,41 36,65 33,56 10,86 0,49 6,56 3,49 0,8 9,49 D 45,22 42,32 36,11 10,88 0,7 7,23 2,99 0,7 11,76 PK SR ,5 Vo všetkých variantoch boli prekročené maximálne prípustné množstvá určené Potravinovým kód exom SR pre kadmium a nikel. Zámerné pridávanie kadmia do pôdy so stúpajúcim množstvom v jednotlivých variantoch sa prejavilo aj v jeho obsahu v semenách slnečnice ročnej, pričom najväčší obsah kadmia bol vo variante D (s prídavkom 13,5 mg Cd) a to 11,76 mg.kg 1, čo je 10 násobné zvýšenie v porovnaní s kontrolným variantom, variantom A. Tab. 5: Celkový obsah polyfenolických látok v semenách slnečnici ročnej vypestovaného na 1 pôde z lokality Výčapy Opatovce (mg.kg ). slnečnica A B C D tanín Obsah celkových polyfenolických látok bol v základnom variante (variant A) pri prepočítaní na tanín mg.kg 1. V ostatných variantoch boli výsledky takmer identické, nepatrné zníženie bolo vo variante B, kde obsah polyfenolov klesol oproti základnému variantu o 2,6 % (s prídavkom 4,6 mg Cd). Tab. 6: Obsahy ťažkých kovov v zrne horčici bielej vypestovaného na pôde z lokality Výčapyopatovce (mg.kg 1 ). variant Fe Mn Zn Cu Co Ni Cr Pb Cd A ,34 60,17 7,79 1,47 8,2 0,77 1,22 0,40 B 142,66 45,24 61,59 8,09 1,55 8,37 0,82 1,29 1,08 C 116,25 36,74 57,34 7,18 0,79 6,57 0,78 0,95 2,94 D 94,66 40,74 57,60 7,33 1 6,06 0,66 0,89 3,56 PK SR ,5 73

75 Vo všetkých variantoch boli prekročené maximálne prípustné množstvá určené Potravinovým kódexom SR pre kadmium, nikel a pre olovo vo variantoch A a B. V prípade zinku sme zaznamenali mierne zvýšenie vo variantoch A a B. Zámerné pridávanie kadmia do pôdy so stúpajúcim množstvom v jednotlivých variantoch sa prejavilo aj v jeho obsahu v semenách horčice bielej, pričom najväčší obsah kadmia bol vo variante D (s prídavkom 13,5 mg Cd), a to 3,56 mg.kg 1, čo je takmer 9 násobné zvýšenie v porovnaní s kontrolným variantom. Tab. 7: Celkový obsah polyfenolických látok v semenách horčice bielej vypestovaného na pôde z lokality Výčapyopatovce (mg.kg 1 ). horčica A B C D tanín Obsah celkových polyfenolických látok bol v základnom variante pri prepočítaní na tanín mg.kg 1. V ďalších variantoch boli obsahu mierne zvýšené, najväčší nárast obsahu celkových polyfenolov bol vo variante B a to o 5 % oproti kontrolnému variantu. Záver Z výsledkov vyplýva, že zámerne pridávané množstvo kadmia v presne stanovených množstvách nemá výrazný účinok na celkový obsah polyfenolických látok v daných plodinách. Aj keď výsledky naznačujú, že pri zvýšených množstvách kadmia bol nepatrne zvýšený aj celkový obsah polyfenolov v rastlinách, nie je možné z toho zatiaľ definovať ich vzájomný jednoznačný vzťah. Literatúra 1. Beneš, S Obsahy a bilance prvků ve sférach životního prostředí. I. II. Část. Praha, ministerstvo zemědelství ČR, Vollmannová, A., Tóth, T., Lahučký, L. Stanovič, R Využitie láskavca na znižovanie pôdnych obsahov kadmia. In: Environmentálne inžinierstvo (zb. príspevkov z 3. vedeckej konferencie s medzinárodnou účasťou. Košice: TU 2006, s.136, ISBN Juven, B. Jacoby, B Studies on the mechanism of the antimicrobial action of oleuropein. J. Appl. Bacteriol, 1972, 35: Príspevok bol vypracovaný v rámci projektu: VEGA MÄSO KAČICE DIVEJ (ANAS PLATYRHYNCHOS) AKO DOPLNOK VO VÝŽIVE ĽUDÍ MEAT OF WILD DUCK (ANAS PLATYRHYNCHOS) AS SUPPLEMENT IN THE PEOPLE NUTRITION Haščík, P, Gašparík, J., Čuboň, J., Vladárová, D., Kulíšek, V., Kačániová, M., Bobko, M. Slovenská poľnohospodárska univerzita, Nitra Abstract In this experiment, the meat efficiency of wild ducks from hunting ground Bohelov in relation to sex was evaluated. Ten ducks and ten drakes were selected for control of meat efficiency. Slaughter weigh of drakes ( g) was statistically higher (P 0.01) in compare with ducks ( g). Carcass weight had similar tendency (drakes g and ducks g) and statistical differences between drakes and ducks were confirmed (P 0.01). 74

76 Statistical differences between weight of offal from drakes ( g) and from ducks ( g) were not found (P 0.05). Also statistical differences between carcass yield of drakes (69.92 %) and ducks (69.95 %) were not found (P 0.05) From aspect of adequate utility and possible feeding of wild ducks, we recommend enhancement their numbers and their hunt in Slovakia, eventually spreading their production about possible farm rearing. Úvod Divina historicky tvorila pred rozvojom poľnohospodárstva základný podiel ľuďmi konzumovaného mäsa, ktoré ale v poslednom období stráca na význame, ale isté oživenie je možné pozorovať s rozvojom intenzívnych farmových chovov (Steinhauser a kol., 2000). Divina je konzumovaná v Slovenskej republike, len ako doplnkový druh mäsa, kde jej spotreba na obyvateľa sa pohybuje v priemere 1,0 kg ročne, pričom odporúčaná spotreba by mala dosiahnuť hodnotu 2,7 kg (Haščík a kol., 2006). Mäso diviny je často považované za mäso dietetické (Mojto, 2000; Mojto a Zaujec, 2001; Haščík a kol., 2004a,b, 2005a i.), má svoje typické chuťové vlastnosti a rôzne možnosti kulinárskej úpravy. Je vyhľadávané predovšetkým labužníkmi a jeho prevažná konzumácia je v samotných rodinách poľovníkov (Mojto a Zaujec, 2001). Z hľadiska informovanosti pre samotného konzumenta nie sú často známe všetky náležitosti spojené s dosahovanou mäsovou úžitkovosťou rôznych druhov diviny, resp. c hemickými, nutričnými, fyzikálnotechnologickými, resp. senzorickými vlastnosťami ich mäsa a preto v nadväznosti na vyššie uvedené poznatky sme sa v našej práci zamerali na základné vyhodnotenie mäsovej úžitkovosti kačice divej podľa pohlavia v po ľovnom revíri Bohelov. Materiál a metodika V preverovanom experimente sme použili ako materiál kačicu divú (Anas platyrhynchos) oboch pohlaví. V jeseni bol uroben ý odchyt živých jedincov kačice divej pomocou sietí a vybraných bolo náho dne po 10 ks kačíc a1 0 ks káčerov. Porážanie kačíc oboch pohlaví sa uskutočnilo na Katedre hodno tenia a spracovania živočíšnych produktov pri FBP SPU v Nitre. V pokusnom zámere sm e sledovali porážko vú hmotnosť pred zabitím, hmotnosť jatočného opracovaného tela (JOT), hmotnosť drobo v a z uvedených ukaz ovateľov sme vypočítali jatočnú výťažnosť. Sledované ukazovatele sme zisťovali vážením na digitálny ch váhach typu Sartorius s presnosťou na 0,01 g a jatočnú výťažnosť sme vypočítali ako podiel hmotnosti zvieraťa po jatočnom opracovaní (hmotnosť JOT + hmotnosť drobov a abdominálneho tuku). Do drobov boli zaradené vnútorné orgány a to srdce, pečeň, svalnatý žalúdok a krk. Získané výsledky sme štatisticky spracovali v programe SAS, kde sme sledovali základné variačnoštatistické charakteristiky (aritmetický priemer, minimum, maximum, smerodajnú odchýlku). Pokus bol riešený v rámci projektu VEGA 1/2413/05. Výsledky a diskusia Základné hodnoty dosahovanej mäsovej úžitkovosti kačice divej (Anas platyrhynchos) podľa pohlavia sú uvedené v tabuľke 1. 75

77 Tabuľka 1 Mäsová úžitkovosť divých kačíc (Anas platyrhynchos) podľa pohlavia Sledovaný ukazovateľ Pohlavie x sx minimum maximum Preukaznosť rozdielov medzi pohlavím porážková 1121,43 116,16 956, , ,55 91, , ,00 P 0,01 JOT 678,14 36,38 640,00 746,00 Hmotnosť 778,36 60,05 703,00 864,00 P 0,01 drobov 112,80 15,88 98,00 144,80 (g) 101,57 11,78 79,20 114,30 P 0,05 JOT spolu 779,71 44,01 727,20 860,30 drobami 891,16 71,05 806, ,70 P 0,01 Jatočná vyťažnosť % 69,95 5,38 62,09 76,07 69,92 4,81 59,15 78,04 P 0,05 x priemerná hodnota, s x smerodajná odchýlka, minimum minimálna hodnota, maximum maximálna hodnota, Z dosiahnutých výsledkov nášho experimentu je zrejmé, že v sledovaných znakoch mäsovej úžitkovosti divých kačíc podľa pohlavia sa zistili preukazné rozdiely na úrovni (P<0,01) v porážkovej hmotnosti, hmotnosti JOT, resp. hmotnosti JOT spolu s drobami v prospech káčerov oproti kačiciam a nepreukazné rozdiely (P>0,05) sa medzi pohlavím dosiahli v hmotnosti drobov, resp. jatočnej výťažnosti. Z pohľadu konkrétnych výsledkov mäsovej úžitkovosti sa vyššia porážková hmotnosť pred zabitím dosiahla u káčerov 1276,55 g, čo bolo o 155,12 g viac ako sa zistila u kačíc, kde hodnota porážkovej hmotnosti pre zabitím bola 1121,43 g. Hodnoty porážkovej hmotnosti divých kačíc oboch pohlaví z poľovného revíru Bohelov sú približne na rovnakej úrovni ako zistili vo svojich prácach pri sledovaní mäsovej úžitkovosti divých kačíc v Slovenskej republike Hell a kol. (2000), resp. Haščík a kol. (2005), ale vyššie pri porovnaní s hodnotami dosahovanými v podmienkach Maďarskej republiky v oblasti Dunaszeg. Pri vyhodnotení hmotnosti JOT divých kačíc z poľovného revíru Bohelov sa dosiahla podobná tendencia ako vo výsledkoch porážkovej hmotnosti, kde opäť vyššia hmotnosť JOT sa dosiahla u káčerov (778,36 g) oproti kačiciam (678,14 g), čo bolo viac o 100,22 g. Výsledky hmotnosti JOT v poľovnom revíri Bohelov sú mierne nižšie pri porovnaní s výsledkami Hella a kol. (2000), resp. Haščíka a kol. (2005). Najdôležitejším ukazovateľom pre hodnotenie dosahovanej mäsovej úžitkovosti je jatočná výťažnosť, ktorej hodnota môže byť ovplyvnená tak dosiahnutou hmotnosťou JOT, hmotnosťou drobov ako aj vlastnou porážkovou hmotnosťou zvieraťa. Hodnoty jatočnej výťažnosti divých kačíc z oblasti Bohelov boli primerané príslušnému biotopu, ako aj slabšiemu prikrmovaniu divých kačíc v prírodných podmienkach, kde u samičieho pohlavia bola dosiahnutá úroveň 69,95 %, t.j boli mierne vyššia o 0,03 % oproti káčerom, kde hodnota bola na úrovni 69,92 %. Hodnoty jatočnej výťažnosti divých kačíc z poľovného revíru Bohelov neprekračujú hodnotu normy u domácich kačíc, kde sa požaduje minimálna jatočná výťažnosť na úrovni 70 %. Výsledky jatočnej výťažnosti nášho experimentu u divých kačíc podľa pohlavia ako aj bez rozdielu pohlavia sú nižšie ako zistili Slamečka a kol. (2003) u bažantov, kde sa hodnoty pohybovali na úrovni 71,90 % a taktiež sú nižšie v porovnaní s hodnotami jednoročných kohútov bažantov z voľnej prírody, ktoré zistil Ginter (1979) a ich hodnoty boli od 68,22 po 70,81 %. Porovnávaním dosiahnutých hodnôt jatočnej výťažnosti u oboch pohlaví divých kačíc z poľovného revíru Bohelov boli zistené nižšie hodnoty, nakoľko v práci Haščíka a kol. (2005) sa v tomto ukazovateli v poľovnom revíri Palárikovo (Slovenská republika) dosiahli hodnoty 76

78 od 76,19 % u káčerov, resp. 76,97 % u kačíc a taktiež vyššie hodnoty sa dosiahli aj v poľovnom revíri M aďarskej republiky (Dunaszeg), kde hodnoty boli od 71,47 % u káčerov po 73,04 % u kačíc. Dôvodom lepšej mäsovej úžitkovosti v podmienkach Slovenskej republiky v oblasti poľovného revíru Palárikovo bolo prikrmovanie divých kačíc a v oblasti Maďarskej republiky (Dunaszeg ) lepšie podmienky biotopu, t.j. viac prirodzenej potravy. Aj na základe týchto skutočností je nutné v poľovnom revíri Bohelov vykonať prikrmovanie tohto druhu malej pernatej zveri, aby sa dosiahla podobná, resp. vyššia mäsová úžitkovosť ako v ostatných poľovných revíroch Slovenskej republiky. Okrem prikrmovania je nutné aj naďalej vylepšovať podmienky vlastného biotopu v príslušných poľovných revíroch a oblastiach Slovenskej republiky, čím sa zvýši aj možnosť konzumácie prirodzenej potravy a tým zabezpečíme aj správnu výživu tohto druhu malej pernate j zveri s následnou požadovanou dosahovanou mäsovou úžitkovosťou. Záver Na základe dosiahnutých výsledkov nášho experimentu, v ktorom sme chceli poukázať na dosahovanú mäsovú úžitkovosť kačice divej podľa pohlavia chovanej v poľovnom revíri Bohelo v a tým dať čitateľom do pozornosti údaje o mäsovej úžitkovosti tohto druhu malej pernatej zveri môžeme skonštatovať, že tento druh malej pernatej zveri v mierne vylepšenom biotope a následným umelým prikrmovaním môže dosahovať optimálne parametre mäsovej úžitkovosti. Z hľadiska tradícii, odporúčame kačicu divú (Anas platyrhynchos) opätovne zaradiť na jedálny stôl človeka, nakoľko aj v dnešných podmienkach môže byť zaujímavým a významným spestrením samotného jedálneho lístka. Zároveň pre zvýšenie populácie navrhujeme rozšíriť jej chov aj umelým, t.j. farmovým spôsobom. Literatúra 1. GINTER, F Štúdium mäsovej produkcie ajatočnej výťažnosti rôznych rás bažantov. In: Folia Venatoria, Zvolen, 1979, č. 19, s HAŠČIK, P. GAŠPARÍK, J. ČUBOŇ, J. KULÍŠEK, V. KRIVÁNEK, L. 2004a. Nutričné zloženie svaloviny najcennejších častí jatočného tela bažanta poľovného z farmového chovu. In: Folia Venatoria, Zvolen, 2004, č. 34, s HAŠČÍK, P. GAŠPARÍK, J. MOJTO, J. ČUBOŇ, J. KULÍŠEK, V. MAKOVICKÝ, P. 2004b. Využitie netradičných zdrojov mäsa pre výživu ľudí. In: Zborník príspevkov z medzinárodnej vedeckej konferencie: Aktuální otázky produkce jatečných zvířat, Brno, 2004, s , ISBN HAŠČÍK, P. GAŠPARÍK, J. ČUBOŇ, J. KULÍŠEK, V: KAČÁNIOVÁ, M. MASSANYI, P Porovnanie mäsovej úžitkovosti kačice divej z rôznych poľovných revírov. In: Folia Venatoria, zvolen,, roč. 35, 2005, s , ISBN HAŠČÍK, P. GAŠPARÍK, J. VLADÁROVÁ, D. KULÍŠEK, V. KAČANIOVÁ, M. PAVLIČOVÁ, S Mäso lysky čiernej ako spestrenie jedálneho lístka človeka. In: Aktuální otázky produkce jatečných zv ˇrat, II. mezinárodní vědecká konference, MZLU, Brno, 2006, s , ISBN HELL, P., a kol., Špeciálny chov zveri. In: TU Zvolen, 2000, s , ISBN MOJTO, J Nutričná hodnota masa hospodárskych a divých zvierat chovaných v súčasnosti na Slovensku. In. Zborník z vedeckej konferencie Výživa a potraviny pre 3. tisícročie Nitra, 2000, s MOJTO, J. ZAUJEC, K Aktuálne údaje o chemickom zložení a nutričnej hodnote mäsa hospodárskych a divých zvierat, In: Maso, 2001, č. 4, s

79 9. SLAMEČKA, J. MERTIN, D. HELL,P. MOJTO, J. JURČÍK, R. 2003: Jatočná výťažnosť a kvalita mäsa bažantov z voľnej prírody a z farmového chovu. In: Folia venatoria, roč. 33, 2003, STEINHAUSER, L. SUCHÝ, P. STRAKOVÁ, E a kol Produkce masa. In: Brno, Last, 464 s., ISBN Kontaktná adresa: Ing. Peter Haščík, PhD., Katedra hodnotenia a spracovania živočíšnych produktov, SPU, FBP Nitra, tr. A. Hlinku 2, Nitra, [email protected] COLONIC HEALTH AND SHORT CHAIN FATTY ACIDS Hijová, E., Chmelárová, A. Institute of Experimental Medicine, Faculty of Medicine, Safarik University, Kosice, Abstract In recent years, colonic health has been increasingly linked to maintaining overall health and reducing the risk of various diseases by changes in diet and lifestyle. At the forefront has been the emergence of functional foods, such as "prebiotics" and "probiotics", dietary fibers, and other dietary components that target the colon and affect its environment enhancing short fatty acid (SCFA) production. The focus of this review will be on the key end products of colonic fermentation, the SCFA butyric, acetic, and propionic acids. Specific SCFA may reduce the risk of developing gastrointestinal disorders, cancer, and cardiovascular disesase. Key words: colon cancer, life style, nutrition, short chain fatty acids. Introduction Cancer is an important global public health problem. Colorectal cancer (CRC) is the fourth most common cause of cancerrelated mortality in the world. Within Europe, North America, Australia and New Zealand, it is the second most common cancer after lung or breast and in generally the incidence and mortality of the disease are increasing (Boyle and Langman, 2000). Evidence suggests that diet plays a significant role in the aetiology of CRC (Gill and Rowland, 2002). To establish causal relationships between diet and CRC risk and to identify more precisely the dietary components involved, human intervention trials are required. These studies will be key to the success of dietary recommendations to maximize colonic disease prevention. Biomarkers for colorectal cancer The problem with human intervention studies is that cancer is an impractical endpoint in terms of numbers, cost, study duration and ethical considerations. The long lag phase (up to 20 years) between exposure to a carcinogenic event and appearance of tumours is a particular problem. An alternative strategy is the use of intermediate endpoint biomarkers of cancer, which may be biochemical, molecular, cellular or rooted in pathologic change (e.g. recurrence of polyps, faecal water, epithelial markers). Biomarkers have been developed from an understanding of the sequence of events leading to colonic cancer, the biology of normal mucosa and the factors associated with changes symptomatic of progression toward cancer and the manifestation of cancer itself. The particular advantages of biomarkers are that they represent short/intermediateterm endpoint, which allow intervention on a reasonable time scale. Ethical approval is readily obtainable for biomarker studies as they are minimally invasive, with measurements occuring on accessible material (faeces and small biopsies, familial adenomatous polyposis). Ideally biomarkers should be sensitive, reproducible and rigorously validated, although this is not the case with all biomarkers in the cancer field. Biomarkers should be causally linked, or correlated with cancer and hence of biological significance. Thus validation of a biomarker is critical to its application as a research tool, as an appropriate response from the marker is required when assayed in cancer patients or in healthy individuals on lowrisk and highrisk diets for CRC. The biomarkers available for the study of 78

80 CRC are composed of two main types: tissue, and biochemical. Both categories possess distinct advantages. Tissue biomarkers are analysed from a tissue biopsy and as such necessitate invasive procedures of varying complexities to retrieve samples of rectal/colonic mucosa. Use of biopsies increases the technical complexity of studies, but reduces the degree of inference required to interpret the results when compared to biochemical markers. Tissue biomarkers, therefore, provide the scope to examine a range of cellular aspects intimately linked to CRC. Biochemical markers in contrast to the invasive techniques needed to obtain colonic tissue, but the majority of biochemical markers available can be readily measured in blood, urine or faeces, and thus are minimally or non invasive. Biochemical markers are composed of two main groups, mammalian enzymes and gut microflora associated biomarkers. The former are measures of specific endogenous enzyme activity in blood, urine or biopsy specimens, e.g. hepatic enzyme CYP1A2, glutathione Stransferase, whilst the latter include bacterial enzyme activities, bile acids, faecal metabolites, and short chain fatty acids. Short chain fatty acids (SCFAs) The concept of colonic health has become a major target for the development of functional foods such as probiotics, prebiotics, and synbiotics and other dietary components that target the colon and affect its environment, composition of the microflora, as well as on the physiology of the colon, and display distinct health benefits (Bomba et al, 2002). Dietary carbohydrates escaping digestion/absorption in the small bowel and prebiotics undergo fermentation in the colon and enhancing short chain fatty acids (SCFAs) production. These have been associated with reduced risk of some diseases, including the irritable bowel syndrome, inflammatory bowel disease, cardiovascular disease, and cancer (Roediger, 1980; Jenkins et al, 1999; Floch and HongCurtiss, 2002).Various population survey data show that SCFA production is in order of acetate > propionate > butyrate in a molar ratio of approximately 60:20:20 or 3:1:1, respectively in the proximal and distal colon (Cummings, 1981; Cummings et al, 1987; Topping and Clifton, 2001). Carbohydrates are fermented by saccharolytic bacteria primarily in the proximal colon producing linear SCFAs, CO 2 and H 2 (Macfarlane and Macfarlane, 2003), and both the presence of carbohydrates in the colon and their fermentation can alter the colonic physiology. Fermentation of proteins and amino acids by proteolytic bacteria yield branched SCFAs, CO 2, CH4, H 2, phenols, and amines (Roberfroid, 2005). The primarily effects of SCFAs are on colonic function as a result of their uptake and metabolism by colocytes, although SCFAs are also metabolic substrates for other tissues of the host. The production of SCFAs are determined by a number of factors, including the numbers and types of microflory present in the colon (Roberfroid, 2005), substrate source (Cook and Sellin, 1998), and gut transit time. A large microflora population is present in the human colon at to cfu/g wet wt (Hill, 1995), and more than 50 genera and over 400 species of bacteria have been identified in human feces. Bacterial numbers, fermentation, and proliferation are highest in the proximal colon where substrate carbohydrate availability is greatest. The principal site of colonic fermentation, therefore, is the cecum and proximal colon, whereas the distal colon is carbohydrate and water depleted. Specific species such as Bifidobacterium and Lactobacillus have been associated with improved health, resulting in the emergence of the sciences of probiotics, or delivery of specific bacteria to the colon and prebiotics, or the administration of dietary component that promote the growth of specific bacteria with defined metabolic functions. SCFA in general and butyrate in particular enhance the growth of lactobacilli and bifidobacteria and play a central role on the physiology and metabolism of the colon (Roy et al, 2006). Total SCFA and regional differences in SCFA concentration are implicated in diseases of the colon, especially in cancer and gastrointestinal disorders, where disease often occurs distally. Therefore, increased SCFA production and a greater delivery of SCFA distally, especially butyrate, may have a role in preventing these diseases. 79

81 Function and absorption of SCFAs SCFAs are rapidly absorbed in the cecum and the colon with only 5% to 10% being excreted in the feces. This process is associated with enhanced sodium absorption and bicarbonate excretion. Two proposed mechanisms of absorption are: 1,diffusion of protonated SCFAs (at least 60%) and 2, anion exchange (Cook and Sellin, 1998). SCFAs uptake is associated with transport of water that seems to be greater in the distal than in proximal colon. The major SCFAs: acetate, propionate, and butyrate are absorbed at comparable rates in different regions of the colon. Once absorbed, SCFAs are metabolized at 3 major sites in the body: 1, cells of the cecocolonic epithelium that use butyrate as a major substrate for maintenance energy producing pathways; 2, liver cells that metabolize residual butyrate with propionate used for gluconeogenesis and 50% to 70% of acetate also taken up by the liver; 3, muscle cells that generate energy from the oxidation of residual acetate. The role of SCFAs has expanded to include their role as nutrients for the colonic epithelium, as modulators of colonic and intracellular ph, cell volume, and other functions associated with ion transport, and as regulators of proliferation, differentiation, and gene expression (Cook and Sellin, 1998). Increases in SCFAs result in decreases ph, which indirectly influences the composition of the colonic microflora, decreases solubility of bile acids, increases absorption of minerals (indirectly), and reduces the ammonia absorption by the protonic + dissociation of ammonia and other amines (ie, the formation of the less diffusible NH 4 compared with the diffusible NH 3 ) (Vince et al, 1978; Jackson 1983; Jenkins et al, 1987). Acetate, propionate, butyrate Acetate, the principal SCFA in the colon, is readily absorbed and transported to the liver, and therefore is less metabolized in the colon. In human studies, acetate is often used to monitor colonic events because it is the main SCFA in the blood. Acetate is the primary substrate for cholesterol synthesis. In the host, it may be absorbed and utilized by peripheral tissues (Pomare et al, 1985), further, bacteria isolated from the human intestine are capable of utilizing acetate for the production of butyrate in the colon (Duncan et al, 2002). Lactate and acetoacetate may form substrate for other members of the flora and may be degraded into other SCFA. Propionate is produced via 2 main pathways: 1, fixation of CO 2 to form succinate, which is subsequently decarboxylated (the "dicarboxylic acid pathway"); 2, from lactate and acrylate (the "acrylate pathway"), (Cumming, 1981). Much of the knowledge about the nutritional fate of propionate comes from studies of ruminants. Intestinal glucose uptake is minimal in ruminants because of the presence of microbiota in their rumen for the digestion and fementation of carbohydrates. Production of SCFA constitutes the major source of ruminant energy ( Hooper et al, 2002) where propionate is primary precursor for gluconeogenesis. Propionate metabolism in humans is less well understood. A number of mechanisms have been suggested to be responsible for the observed lipid lowering effect, with increased propionate production being one of the possible mechanisms of action. Increased production of propionate, through fermentation, may inhibit hepatic cholesterol synthesis. It still seems possible that one of the determinants of the actions of propionate on serum lipids is the ratio of propionate to acetate (Cheng and Lai, 2000; Wolever et al, 1996). Butyrate is the preferred energy source of colonocytes and has been implicated in the control of the machinery regulating apoptosis and cellular proliferation and differentiation. 70% to 90% of butyrate is metabolized by the colonocyte (Zoran et al, 1997; Basson et al, 2000; Della Ragione et al, 2001). Sodium butyrate exerts an antiproliferative activity on many cells types, that have demonstrated preventive effects of butyrate on colon cancer and adenoma development (Bornet et al, 2002). At a molecular level, butyrate affects gene expression via the phosphorylation and acylation of histone proteins (Archer and Hodin, 1999). Butyrate is not produced by the lactic acid bacteria, however, certain probiotics may modify the ratio of SCFA 80

82 in the colon, this remains one of their more likely mechanisms of anticarcinogenic action within the colon. Butyrate also stimulates immunogenicity of cancer cells. There is mounting evidence that SCFAs play a key role in colonic health and may play a key role in the prevention and management of certain diseases. Given the potential benefits of prebiotics and probiotics, this has added another dimension to the study of SCFAs. There is now a need for further studies examining the synergistic effects of the combination of functional foods from different carbohydrate surces and their effects on SCFA and health. The combination of in vitro, an experimental and clinical trials will help guide future dietary recommendations to the general public. This work was supported by grant AV 4/0028/07 References Archer S, Hodin R. Histone acetylation and cancer. Curr Opin Genet Dev 1999; 9: Basson M, Liu YW, Hanly AM, Emenecker NJ, Shenoy SG, Gould Rothberg BE. Identification and comparative analysis of human short chain fatty acid response genes. J Gast Sur 2000; 4: Bomba A, Nemcova R, Gancarcikova S, Herich R, Guba P, Mudronova D. Improvement of the probiotic effect of microorganisms by their combination with maltodextrins, fructoologosaccharides, and polyunsaturated fatty acids. Br J Nutr 2002; Suppl 1: S95S99. Bornet FR, Brouns F, Tashiro Y, Duvillier V. Nutritional aspects of shortchain fructooligosaccharides: natural occurence, chemistry, physiology and health implications. Dig Liver Dis 2002; 34 (Suppl 2) : S111S120. Boyle P, Langman JS. ABC of colorectal cancerepidemiology. BMJ 2000; 321: Cook SI, Sellin JH. Review article: short chain fatty acids in health and disease. Aliment Pharmacol Ther 1998; 12: Cummings JH. Short chain fatty acids in the human colon. Gut 1981; 22: Cummings JH, Pomare EW, Branch WJ, Naylor CPE, Macfarlane GT. Short chain fatty acids in human large intestine, portal, hepatic and venous blood. Gut 1987; 28: Cheng HH, Lai MH. Fermentation of resistant rice starch produces propionate reducing serum and hepatic cholesterol in rats. J Nutr 2000; 130: Della Ragione F, Criniti V, Della Pietra V, Borriello A, Oliva A, Indaco S, Yamamoto T, Zappia V. Genes modulated by histone acylation as new effectors of butyrate activity. FEBS Lett 2001; 499: Duncan SH, Barcenilla A, Stewart CS, Pryde SE, Flint HJ. Acetate utilization and butyryl coenzyme A (CoA), acetate CoA transferase in butyrate producing bacteria from the human large intestine. Appl Environ Microbiol 2002; 68: Floch MH, HongCurtiss J. Probiotics and functional foods in gastrointestinal disorders. Curr Treat Options Gastroenterol 2002; 5: Gill CIR, Rowland IR. Diet and cancer: assessing the risk. Br J Nutr 2002; 88: S73S87. Hill MJ. Bacterial fermentation of complex carbohydrate in the human colon. Eur J Cancer Prev 1995; 4: Hooper LV, Midtvedt T, Gordon JI. How hostmicrobial interactions shape the nutrient environment of the mammalian intestine. Annu Rev Nutr 2002; 22: Jackson AA. Aminoacids: essential and nonessential? Lancet 1983; 1: Jenkins DJ, Wolever TM, Collier GR, Ocana A, Rao AV, Buckley G, Lam, Y, Mayer A, Thompson LU. Metabolic effects of a lowglycemicindex diet. Am J Clin Nutr 1987; 46: Jenkins DJ, Kendall CW, Vuksan V. Inulin, oligofructose and intestinal function. J Nutr 1999; 129 (Suppl 7): 1431S1433S. Macfarlane S, Macfarlane GT. Regulation of shortchain fatty acid production. Proc Nutr Soc 2003; 62:

83 Pomare EW, Branch WJ, Cummings JH. Carbohydrate fermentation in the human colon and its relation to acetate concentration in venous blood. J Clin Invest; 1985; 75: Roberfroid MB. Introducing inulintype fructans. Br J Nutr 2005; 93: S13S25. Roediger WE. Role of anaerobic bacteria in the metabolic welfare of the colonic mucosa in man. Gut 1980; 21: Roy CC, Kien CL, Bouthillier L, Levy E. Shortchain fatty acids: Ready for prime time? Nutr Clin Pract 2006, 21: Topping DL, Clifton PM. Shortchain fatty acids and human colonic function: roles os resistant starch and nonstarch polysaccharides. Physiol Rev 2001; 81: Vince A, Killingley M, Wrong OM. Effect of lactulose on ammonia production in the fecal incubation system. Gastroenterology 1978; 74: Wolever TM, Fernandes J, Rao AV. Serum acetate:propionate ratio is related to serum cholesterol in men but not women. J. Nutr 1996; 126: Zoran D, Barhoumi R, Burghardt R, Chapkin R, Lupton J. Diet and carcinogen alter luminal butyrate concentrations and intracellular ph in isolated rat colonocytes. Nutr Cancer 1997; 27: THE INFLUENCE OF LOW LEVELS OF PROTEIN AND SEX ON SOME CARCASS PARAMETERS AND NUTRIENT COMPOSITIONS IN BROILERS MEAT Horniaková, E., Abas Kamaran A. Department of Animal Nutrition, Slovak Agricultural University, Nitra, Slovakia Abstract The aim of this experiment was to study how a reduced content of protein and sex during raising influences breast and leg fattiness and, in consequence, the chemical composition in 6 weekold broilers. The birds number comprised 1214 onedayold of ROSS 308 broilers divided into three experimental groups. The birds of group 1 (control) received feeds with a nutritional value recommended by feeding standards for growing broilers, while the group 2 (T1) and 3 (T2) received rations with reduced levels of protein in all feeds for the period of raising supplement by APC addition. The breast and leg percentage was determined. Chemical analyses (dry matter, protein, fat and ash content) were carried out. The results of the study allowed us to conclude that sex affected significantly (P 0.05) the percentage of the legs, and a lower level of protein content in the diet reduced the breast percentage insignificantly. Most remaining tested meat quality characters were similar to those obtained in the control group. And differences between groups were insignificant (P 0.01). Key words: protein level, sex, meat, broiler Introduction There has been a notable increase in growth rate and feed efficiency in commercial broiler chickens in the last 20 years. Protein has a major effect on the growth performance of the bird and it is the most expensive nutrient in broiler diets (Kamran et al., 2004). It accounts for 15% of feed cost (Singh, 1990). Application of reduced protein levelfeeds for poultry may represent a way to reduce feeding costs (Gardzielewska et al., 2005). One of the most important decisions for broiler nutritionist is the level of protein in diet. Because of the expense of providing sufficient protein to growing broilers, numerous studies have been carried out to investigate the possibility of reducing dietary crude protein (CP) levels. Manipulation of the dietary protein can have various effects on broiler performance (Fraps, 1943). Findings on the effect of different levels of (CP) in isoenergetic diets on broiler metabolism and body composition are diverse and more researches are necessary to understand broilers response to different levels of protein. 82

84 Besides nutritional management (amount), ration composition (quality) is an other important factor affecting carcass composition. Among the different nutritional components, proteins (amino acids) are fundamentals, as they are related to the synthesis of structural tissues (Furlan et al., 2004). Tabeidian et al. (2005) compared CP levels, a NRC (1994) recommendation (21.16%) and even 10 percent more than the NRC recommendation (NRC 1.10) concluded, that an increase of diet protein up to 10% as the NRC recommendation would not effect carcass weight. Buyse et al. (1992) found that broilers reared on a 15% protein diet increased their feed intake in an attempt to meet their protein and amino acid requirement. Nawaz et al. (2006) investigated three levels of (CP) 20, 21and 22% were offered to birds from hatching to 28 d of age, and finisher diets with levels of CP 16, 17 and 18%, and 18, 19 and 20% respectively were offered during 2942 d of age. It was found that there were no significant differences of dietary treatments on any of the carcass characteristics. Excesses of some EAA increased the requirements for others (D'Mello and Lewis, 1970a, b, c). Guirguis (1978), however, found that the best proportion of EAA to noneaa for growth depends on the sex of the birds. Rezaei et al. (2006) found that thighs, drumsticks and breast meat percentage were not affected when dilute diets were consumed during an age of 814 days. Lee and Leeson (2001) reported that male broilers fed with diets diluted up to 50 % with oat hulls from 7 to 14 days, avoided a depression of Breast meat yield. Oyedeji et al (2005) when feeding low protein levels (18%) from 08 weeks observed better breast meat yield results compared to groups which were offered diets with higher levels of protein. Khajali and Hasan (2006) found that breast meat yield was improved (P 0.05) by an increasing methionine level. Furlan et al. (2004) concluded that carcass protein was affected by the level of protein in the diet. Hassanabadi and Nassiri (2006) observed that the broiler chickens after early feed restrictions compensated retarded growth and showed less abdominal and carcass fat content. Male broiler chickens productive traits were better than those of females. Fraps (1943) pointed out that differences occurred in the carcass composition of birds fed with different levels of the dietary protein. The results of a study by Gardzielewska et al (2005) concluded that lower levels of protein content in the feed reduced meat quality characteristics were similar to those obtained in the control group. Reduced protein level in the feeding ration does not influence the chemical composition of meat chickens due as observed by Jamroz et al., 1981: Jamroz et al., 1984: Daszkiewicz et al., Stringhini et al. (2006) observed that with increasing dietary CP levels in the prestarter period, protein retention showed a linear and positive effect. In a study of Jianlin et al. (2004) which was conducted to explore the extent to which CP can be reduced in cornsoybean meal broiler starter diets by amino acid supplementation while maintaining adequate performance, it was shown that the CP content of freezedried carcasses dedined as diet CP decreased. Rezaei et al. (2004) however observed that decreasing dietary protein had no significant effect on breast meat yield. Faria Filho (2004,unpublished data) verified an increase in the ether extract and a reduction in the protein content of breast, drumstick + thigh from broiler fed lowprotein diets. An increase in dry matter of drumstick + thigh was observed when the broilers were fed with diets containing low protein diet. The aim of our study was to determine the influence of different levels of CP on broilers performance, and to investigate the response of bird s sex to the effect of CP level. Materials and methods The experiment was conducted on 1214 chickens of commercial broilers, type (ROSS 308). They were randomly assigned to three groups. The trial was carried out in the experimental base UKSUP at the biologicaltesting station in Víglash. Each group is composed of 4 replications with a total of 100 chickens. The experiment contains one control group and 2 trial groups. Chickens were stocked on the litter. Microclimatic conditions and light modes were regulated automatically for optimal conditions for these hybrids. 83

85 The chickens were fed with the feed mixture HYD01/1, HYD01/2, HYD02 and HYD03. The scheme of the trial and documentation of the differences of crude protein and additives are detailed in table 1. At the age of 42 days, 8 male and female birds of the body weight similar to the sex s average from each group were slaughtered. In the trial the following parameters were observed: breast percentage, leg percentage and a chemical analysis of some nutrients was conducted. Percentages were calculated of dry matter, crude protein, fat and ash of the breast and leg meats. For calculation of the percentage of breast and leg, the following formula was used: Breast or thigh and leg percentage = breast or leg weight X 100 Live Body weight Crude protein was chemically analyzed by the Kjeldahl method. For fat, the soxhlet method was used. For calculating the dry matter (DM), protein, fat and ash we used the following formula: DM, P, F or As h percentage = DM, P, F or Ash weight of the sample X 100 Sample weight The data were analyzed using CRD design for breast and leg percentages. Significances between treatment means were separated using the Duncan s multiple range test. For nutrient percentages a ttest was used. Results and discussion The effect of treatments and sex on breast percentages (table2) were insignificant (P 0.05). These results agree with Rezaei et al. (2004) and Garcia et al. (2002) for the treatment and sex effect respectively. This is could be attributed to the fact that broilers reared on a low protein diet increased their feed intake in an attempt to meet their protein and amino acid requirements (Buyse et al., 1992). The interaction between sex and treatments was significant. The differences between treatments on legs percentages (table3) were significant (P 0.05). A higher value was observed in T2, the difference with to the control was insignificant. This means that decreasing the protein level influenced the utilization of protein in the diet. This feeding regimen increases enzyme secretions such as sucrase, amylase and lipase (Pinheiro et al., 2004) and also alters the functional development of the enzymes of protein digestion such as amino peptidase and dipeptidase and may therefore influence the growth rate of broilers. The protein efficiency ratio was improved (P 0.001) in chicks fed with a 190 g CP/kg diet versus chicks fed with the 225 g CP/kg diet (Kidd et al.,2001). A significant (P 0.05) difference of leg percentage was observed between both sexes. The leg percentage of male birds was higher than the female birds. Differences between treatments were insignificant (P 0.01) for dry matter, crude protein, fat and ash content of the meat of the breast and the leg. References BUYSE, J., E. DECUYPERE, L. BERGHMAN, E.R. KÜHN AND F. VANDESANDE. (1992): The effect of dietary protein content on episodic growth hormone secretion and on heat production of male broilers. Br. Poult. Sci., 33: (cited by Tabeidian et al., 2005). DASZKIEWICZ T., PUDYSZAK K., MELLER Z., MIKULSKI D., The effect of feed mixtures of different nutritive values on the chemical composition and physicochemical and sensory properties of the quail meat. Zesz. Nauk. PTZ 36, D'MELLO, J. P. F., LEWIS, D. (1970a): Amino acid interactions in chick nutrition. 1. The interrelationship between lysine and arginine. British Poultry Science 11: 299. (cited by Guirguis) D'MELLO, J. P. F., LEWIS, D. (197Ob)Amino acid interactions in chick nutrition. 2. Interrelationships between leucine, isoleucine and valine. British Poultry Science 11: 313. (cited by Guirguis) D'MELLO, J. P. F., LEWIS, D. (1970c): Amino acid interactions in chick nutrition. 3. Interdependence in amino acid requirements. British Poultry Science 11: 367. (cited by Guirguis) 84

86 DUNCAN, D.B., (1955). Multiple range and Multiple Ftest Biometrics. 11: 142. FARIA FILHO DE. Efeito de dietas com baixo teor protéico, formuladas usando o conceito de proteína ideal, para frangos de corte criados em temperaturas fria, termoneutra e quente. [Dissertação]. Jaboticabal (SP): Universidade Estadual Paulista; (cited by Furlan et al,. 2004). FRAPS, G.S. (1943): Relation of protein, fat, and energy of the ration to the composition of chickens. Poult. Sci. 22: FURLAN RL FARIA FILHO DE DE ROSA PS MACARI M. (2004): Does LowProtein Diet Improve Broiler Performance under Heat Stress Conditions?. Brazilian journal of poultry science. Vol: 6. No:2. p: 7179 GARCIA, RG MENDES, AA GARCIA, EA NÄÄS A MOREIRA J ALMEIDA ICL TAKITA TS. (2002): Effect of Stocking Density and Sex on Feathering, Body Injury and Breast Meat Quality of Broiler Chickens. Brazilian journal of poultry science. V: 4. No: 1. GARDZIELEWSKA J., TARASEWICZ Z., DAŃCZAK A., KWIECIEŃ J., GOLUCH KONIUSZY Z., GARDZIELEWSKA, JÓZEFA MAŁGORZATA JAKUBOWSKA ZOFIA TARASEWICZ DANUTA SZCZERBIŃSKA MAREK LIGOCKI. (2005): Meat quality of broiler quail fed on feeds with different protein content. Electronic journal of polish agricultural university. Vo.8 (1). GUIRGUIS N. ( 1978): Effects of dietary fat, age and sex of broilers on their requirements for essential and nonessential amino acids. Australian Journal of Experimental Agriculture and Animal Husbandry. V: 18. (cited by Guirguis) GUIRGUIS, N. (1978): The effect of dietary protein composition on the optimum time of change from starter to finisher diets for broilers. Australian Journal of Exjerimental Agriculture and Animal Husbandry 18: 404. (cited by Guirguis) HASSANABADI A. H. NASSIRI MOGHADDAM. (2006). Effect of Early Feed Restriction on Performance Characteristics and Serum Thyroxin of Broiler Chickens. International Journal of Poultry Science 5 (12): JAROZ D., SCHLEICHER A., FRITZ Z., (1981): Reduction by 30% protein level and synthetic amino acid supplementation of complete feed mixtures for broiler chickens. Rocz. Nauk. Zootech. 8, JAMROZ D., SCHLEICHER A., FRITZ Z., JAROSZ L. (1984): Reduction of the crude protein level in the mixtures for the 8974 interlinear hybrids of chickens. Zesz. Nauk. AR Wroc., Zootechnika 26, JIANG Q. P.W. WALDROUP C.A. FRITTS. (2005): Improving the Utilization of Diets Low in Crude Protein for Broiler Chicken 1. Evaluation of Special Amino Acid Supplementation to Diets Low in Crude Protein. International Journal of Poultry Science 4 (3): KAMRAN Z, MIRZA MA, HAQ AU AND MAHMOOD S. (2004): Effect of decreasing dietary protein levels with optimum amino acids profile on the performa nce of broilers. Pakistan Veterinary Journal. 24: (Cite d by Nawaz et al., 2006). KHAJALI,FARIBORZ AND HASAN NASIRI MOGHADD AM. (2006): Methionine Supplementation of LowProtein Broiler Diets: Influenc e upon Growth Performance and Efficiency of Protein Utilization. International Journal of Poultry Sc ience 5 (6): KIDD MT, GERARD PD, HEGER J, KERR BJ, ROWE D, SISTANI K, BURNHAM DJ. (2001): Threonine and crude protein responses in broiler chicks. Animal feed science and technology. 94 (12): (Abstract) Lee, K.H. S. leeson. (2001). Perform ance of broilers fed limited quantities of feed or nutrient during seven to fourteen days of age. Poult. Sci. 80: NAWAZ, H. TARIQ MUSHTAQ MUHAMMAD YAQOOB. (2006): Effect of varying levels of energy and protein on live performance and carcass characteristics of broiler chicks. The Journal of Poultry Science. (43)

87 OYEDEJI, J. O. O.O. OLASUPO P.A. EKU NWE O.T. OK UGBO. (2005): Response of Broilers to Alternative Dietary Crude Protein Regimen. International Journal of Poultry Science 4 (6): PULOWERKACA M. (1998): Właściwości sensoryczne bulionu i mięsa brojlerów przepiórczych żywionych dietami z udziałem oligosacharydów łubinu lub flavomycyny [Sensory attractiveness of bouillon and meat of quail broilers fed with diets containing oligosaccharides of lupine or flavomyc ine]. Zesz. Nauk. PTZ 36, (cited by Gardzielewska et al., 2005). REZAEI1 M. H. NASSIRI MOGHADDAM1 J. POUR REZA2 H. KERMANSHAHI. (2004): The Effects of Dietary Protein and Lysine Levels on Broiler Performance, Carcass Characteristics and NExcretion. International Journal of Poultry Science 3 ( 2): SING H, R. A. (1990): Poultry Production. 3 rd ed. Kalyani publishers, 1/1. Rajinder Nagar, Ludhiana (4) 008, New Delhi, India. STRINGHINI J.H., ANDRADE M.L., ANDRADE L., GOMES XAVIER S.A., CAFE M.B., MOGYCA LEANDRO N.S. (2006): Performance, nutrient balance and retention and biometrical measures of digestive organs of broilers fed different dietary protein levels in the prestarter period. Brazilian Journal of Animal Science. 35 (6): (abstract). TABEIDIAN A. GH. SADEGHI J. POURREZA. (2005): Effect of Dietary Protein Levels and Soybean Oil Supplementation on Broiler Perform ance. International Jo urnal of Poultry Science 4 (10): Table 1: Sch eme of the experiment groups control T1 T2 HYD01/ Crude protein HYD01/ g.kg1 HYD HYD APC g.kg1 2 2 Table 2: The effect of protein levels and the sex on the breast percentage (%) in broilers Treatments Sexes Control T1 T2 Means Female 24.27± ± ± ± 0.29 Male 25.07± ± ± ± 0.30 Means 24.67± ± ± 0.34 Table 3: The effect of protein levels and the sex on legs percentage (%) in broilers Treatments Sexes Control T1 T2 Means Female 19.46± O ± ± ± 0.14 a Male 19.76± ± ± ± 0.10 b Means 19.61± 0.20 b 19.26± 0.12 a 19.76± 0.13 b 86

88 Table 4: The effect of protein levels on nutrient composition (Dry Matter, Crude Protein, Fat and Ash) of the breast meat in broilers Dry matter Crude Protein Crude Fat Ash Control ± ± ± ±0.003 T ± ± ± ±0.020 T ± ± ± ±0.009 Table 4: The effect of protein levels on nutrient composition (Dry Matter, Crude Protein, Fat and Ash) of the leg meat in broilers Dry matter Crude Protein Crude Fat Ash Control 25.96± ± ± ±0.01 T ± ± ± ±0.03 T ± ± ± ±0.01 APLIKÁCIA HOMEOPATÍK AKO PREVENCIA DIARHOICKÉHO SYNDRÓMU U ODSTAVČIAT APPLICATION OF HOMEOPATHICS AS PREVENTION AGAINST DIARRHOIC SYNDROME IN WEANED PIGLETS Húska M., Dudríková E., Buleca J. II. interná klinika, UVL v Košiciach, Komenského 73, Košice, SR Abstract The benefit of homeopatics is that no residues persist in organism in comparison to classic therapeutics. This fact positively acts at health creation not only in animals but also in humans. We applied homeopatics in post weaning piglets as prevention to diarrheic syndrome occurrence. Preparation PVB Diarrhées is veterinary homeopathic specialty from Boiron company that is used for diarrhea treatment and prevents complications like weight loosing, chronic enterocolitis and hepatitis. Experiment was realized in ŠPP in Zem. Teplica on 28 piglets. Each swine was applied 2 ml of solution per orally in period since 3 days before weaning to 70 days after weaning. Kľúčové slová: homeopatiká, ošípané, metabolizmus, diarhoický syndróm Úvod Homeopatia je umenie medicíny založené na základe podobnosti. Jej zakladateľom bol nemecký lekár a chemik Samuel Hahnemann. Uplatňoval zákon podobnosti, ktorý spočíva na poznatku, že každá látka, ktorá je schopná v merateľných koncentráciách vyvolať u zdravého jedinca určité príznaky choroby, je potom aj schopná v nekonečne malých dávkach tieto príznaky potlačiť (Ramakrishnan a Coulterová 2005). Výhodou homeopatie je, že na rozdiel od klasických terapeutík homeopatiká nezanechávajú v organizme reziduá, čo sa pozitívne odráža na tvorbe zdravia nielen zvierat, ale aj ľudí (Lockie, 2002,). Odskúšali sme homeopatiká pri odstave prasiat ako prevenciu vzniku diarhoického syndrómu. Liek PVB Diarrhées je veterinárna homeopatická špecialita firmy Boiron, ktorý sa používa na liečenie hnačkových stavov a zabraňuje komplikáciám typu chudnutie, chronické enterokolitídy a žltačka. Materiál a metodika Pokus bol realizovaný na ŠPP v Zemplínskej Teplici. Do pokusu bolo náhodným výberom vybratých 28 prasiat krížencov plemena Slovenská biela ušľachtilá 75% a Landras 25%, približne rovnakej hmotnosti a rovnakého veku. Každé zviera bolo opatrené identifikačným číslom, a boli rozdelené do skupín A1, A2, B1, a B2. 87

89 Experiment spočíval v dennom podávaní homeopatických roztokov ošípaným 3 dni pred odstavom až 70 dní po odstave. Skupine A1 bol podaný prípravok Boiron šarža SL , B1 prípravok Boiron šarža SL , 2 ml na kus jeden krát denne, prvé 3 dni individuálne pomocou dávkovacej pumpy, potom potencovaný v 100 ml vody, aplikovaný v potrave. Kontrolným skupinám A2, B2 bolo podávané placebo v množstve 2 ml, prvé tri dni individuálne pomocou dávkovacej pumpy, potom aplikovaný v potrave. Váženie odstavčiat sa vykonávalo 3 krát, vo veku 5, 7 a 9 týždňov. Krv sa odoberala v deň odstavu, 14 a 28 dní po odstave, zo sinus ophtalmicus. Táto bola následne spracovaná v laboratóriu II. Internej kliniky UVL v Košiciach. Výsledky a diskusia Homeopatické prípravky neovplyvnili hodnoty zložiek hematologického profilu (tab.č.1). Leukocyty (Lc) tvoria bielu krvnú zložku hematologického profilu, sú základným komponentom lymfoidného a imunologického systému (Issautier, M.N., Calvet, H., 1993). Pri experimente sa hodnoty zinku (tab.č.2) pohybovali hlboko pod spodnou referenčnou hodnotou pri všetkých odberoch vo všetkých skupinách. Metabolizmus zinku (Zn) súvisí s metabolizmom vitamínov A, D, B 1 a B 6 (Vrzgula a kol., 1990). Poruchy energetického metabolizmu (tab.č.3) patria medzi najzávažnejšie produkčné choroby. Príčiny týchto porúch sú v úzkom vzťahu s kŕmnym režimom a inými etiopatogenetickými faktormi, ako sú choroby gastrointestinálneho traktu, parazity, poruchy funkčnej činnosti pečene, obličiek a centrálnej nervovej sústavy (Ammerman C. B. a kol., 1998). Analýzou výsledkov enzymatického a hepatálneho profilu v sére odstavčiat (tab.č.4) sme zistili, že aktivita AST mala vo väčšine prípadov klesajúcu tendenciu. AST sa nachádza predovšetkým v bunkách pečene, srdcového svalu a je lokalizovaný tak v cytoplazme, ako aj v mitochondriách. ALT je cytoplazmatický enzým, lokalizovaný najmä v hepatocytoch. Aktivita tohto enzýmu v sére odstavčiat mala v skupinách, kde boli podávané homeopatické prípravky, teda v skupinách A1 a B1, klesajúcu, respektíve ustálenú hladinu. Namerané hodnoty však boli v hornej hranici RH, alebo ju mierne prekračovali. Hodnoty GGT, enzýmu viazaného na bunkové membrány, sa zvyšujú pri enteritídach (Košťálová a Siveková, 1993). ALP sa vyskytu je takmer vo všetkých orgánoch a tkanivách, i v erytrocytoch a leukocytoch. Hladiny ALP sa počas celého experimentu pohybovala vo fyziologickom rozpätí, výnimku tvorí skupina A1 v druhom odbere, kde nameraná hodnota bola nižšia ako je udávaná RH 1,9 µkat/l. Hladina ALP sa zvyšuje pri zápalových črevných ochoreniach a malabsorpčnom syndróme. LDH sa nachádza hlavne vo svalovine, pečeňových bunkách a obličkách. Vo všetkých odberoch a vo všetkých skupinách aktivita tohto enzýmu výrazne prekračovala hornú hranicu RH, čo naznačuje zvýšenú stresovú záťaž u odstavčiat. Celkový bilirubín (Bi) vo väčšine odberov prekračovala hornú hranicu 5,13 µmol/l. Analýza výsledkov dusíkatého a bielkovinového profilu v sére odstavčiat (tab.č.5) ukázala, že koncetrácia CB nedosahovala referenčné hodnoty g/l. Počas celého experimentu pretrvávala mierna hypoproteinémia. Nedostatok bielkovín v kŕmnej dávke, resp. pri ich syntéze má za následok zníženie úžitkovosti, zhoršenie obranných reakcií organizmu, poruchy v procese trávenia (tab.č.6), endokrinného a nervového systému, stresu. Ich deficit je spôsobený nedostatočným prísunom stráviteľných dusíkatých látok, celkového množstva a kvality v kŕmnej dávke (Fehse a kol., 2000). Na zdravotný stav zvierat majú vplyv faktory prostredia pri chronických zápaloch v jednotlivých chovoch. sú to faktory vonkajšieho prostredia, technológia ustajnenia a kŕmenia, hygiena pôrodu, technológia dojenia, regionalizácia podľa chovateľských podmienok, stresové faktory. Nie menej významné faktory vnútorného prostredia, metabolické poruchy a orgánové poruchy(straw a kol. 2003) 88

90 Záver Záverom experimentu bolo overenie teórie biochemicko homeopatickej regulácie metabolizmu, ktorého výsledkom je súhrn analýz látkového metabolizmu a homeostázy u odstavčiat po perorálnej aplikácii homeopatických prípravkov BOIRON SainteFoy LésLyon šarža SL a a porovnanie so skupinami kontrolných odstavčiat. Zistili sme že prípravky: neovplyvnili hematologický profil, zvýšené hladiny Lc vo všetkých odberoch a skupinách poukazujú na zvýšenú aktivitu imunitného systému neovplyvnili mikro a makrominerálny profil, počas celého experimentu pretrvávala výrazná hypozinkémia vo všetkých skupinách a odberoch, čo bolo zapríčinené deficitom prísunu zinku v kŕmnej dávke neovplyvnili energetický profil, koncentráciu glukózy a TCH enzymatický a hepatálny profil bol v skupinách A1 a B1 vyrovnanejší a ustálenejší, čo pozitívne ovplyvnilo celkový zdravotný stav neovplyvnili dusíkatý a bielkovinový profil priaznivo ovplyvnili zdravotný stav v skupinách A1 a B1, kde nedošlo k úhynom a zabránili výskytu diarrhoického syndrómu; v skupinách A2 a B2 došlo k výskytu hnačiek a úhynu v skupine B2 priaznivo ovplyvnili hmotnostné prírastky v skupinách A1 a B1 Homeopatický liek je nositeľom informácie, ktorej prenesenie do organizmu navodí stimuláciu vlastných obranných mechanizmov. Pre predstavu je možné homeopatický liek prirovnať ku katalyzátoru, alebo ku špecifickému imunomodulátoru (Busserová a kol., 2006). Tým by mohol byť vysvetlený účinok homeopatického prípravku na odstavčatá bez výrazného vplyvu na metabolický profil. Dosiahnuté výsledky poukazujú na priaznivý vplyv podávania testovaných homeopatických prípravkov na zdravotný stav odstavčiat a odporúčame ich pre praktické využitie vo farmových chovoch ako alternatívnu náhradu suplementácie medikovaných kŕmnych zmesí antibiotikami, chemoterapeutikami a sulfonamidmi. Literatúra AMMERMAN, C. B., HENRY, P. R., LEWIS, A. J.: Supplemental organically bound mineral compounds in livestock nutrition. In: Recent Advances in Animal Nutrition, 1998, BUSSEROVÁ, M., CHEFDEVILLE, F., COUSIN, J.M., DESOBEAU, P., LAMBERT, J., MARCKEL, J., MOUGUEZOVÁ.: Homeopatické memento Od symptómu k Materii medike, CEDH INTERNATONAL, ISBN ,2006, DEMARQUE, D.: Homeopatie, Experimentální medicína.nakladatelsví Boiron,2005, ISBN , FEHSE, R., CLOSE, W. H.: The effect of the addition of organic trace elements on the performance of a hyperprolific sow herd. In: Biotechnology in the Feed Industry. Edited by T. P. Lyons and K. A. Jaques. Nottingham University Press, Nottingham, 2000, ISSAUTIER, M.N., CALVET, H.: Veterinární homeopatická terapie, Editions BOIRON, nakladatelství VODNÁŘ, 1993, ISBN , KOŠŤÁLOVÁ, D., SIVEKOVÁ, D.: Homeopatia a prírodné liečivá, Homeopatiká rastlinného a živočíšneho pôvodu. Príroda, Bratislava, 1993, ISBN , RAMAKRISHNAN, A.,U., COULTEROVÁ, C., R.: Homeopatický přístup k léčbě rakoviny. Alternativa, 2005, ISBN , 2235 STRAW, B., E., D ALLAIRE, S., MENGELING, W., L., TAYLOR, D., J.: Choroby ošípaných, Nemoci prasat, Hajko & Hajková, Bratislava,2003, ISBN LOCKIE, A.: Encyklopédia homeopatie, Perfekt, 2002, VRZGULA, L.a kol.: Poruchy látkového metabolizmu hospodárskych zvierat a ich prevencia,1990,

91 Experiment bol realizovaný za pomoci grantových agentúr: VEGA pod číslom 1/3487/06 a APVV tab. č.1 tab. č 2 Štatistické výsledky hematologického profilu Štatistické výsledky makro a mikrominerálneho profilu A1 A2 a < 0,05 Hb Ec Hk Lc MCV A1 A2 a < 0,05 Ca Mg P Na K Fe Zn 1. odber 2. odber odber 2. odber 3. odber + 3. odber + B1 B2 a < 0,05 Hb Ec Hk Lc MCV B1 B2 a < 0,05 Ca Mg P Na K Fe Zn 1. odber 1. odber 2. odber + 2. odber + 3. odber 3. odber + tab.č.3 Štatistické výsledky energetického profilu tab.č.4 Štatistické výsledky enzymatického profilu A1 A2 a < 0,05 Gluk TCH A1 A2 a < 0,05 1. odber AST ALT GGT ALP LDH Bi + 1. odber 2. odber odber 3. odber odber B1 B2 a < 0,05 Gluk TCH B1 B2 a < 0,05 1. odber AST ALT GGT + ALP LDH Bi 1. odber 2. odber odber tab.č.5 3. odber 3. odber + tab.č Štatistické výsledky bielkovinového profilu Výskyt hnaciek a úhyn odstavciat A1 A2 a < 0,05 CIg CB Alb Creat Urea 1. odber 2. odber A1 A2 B1 B2 3. odber hnacka ks B1 B2 a < 0,05 1. odber CIg + CB Alb Creat Urea hnacka % úhyn ks 28,5 0 57,0 0 42,8 0 71, odber 3. odber úhyn % , 3 90

92 VPLYV EMISIÍ NA ZDRAVIE OVIEC V SPIŠSKOM REGIÓNE EMISSION INFLUENCE TO HEALTH OF SHEEP IN SPIŠ REGION Húska M., Bíreš J., Dudríková E., Buleca J. Univerzita veterinárneho lekárstva v Košiciach, Komenského 73, Košice,SR Abstrakt Ľudské aktivity v posledných desaťročiach sa stali určujúcim faktorom zmenených pomerov biogénnych prvkov v prírodnom prostredí, vzniku a hromadenia látok, ktoré sa v prírode predtým nevyskytovali. Najvýznamnejším predmetom štúdia je ovzdušie, v ktorom sa nachádzajú minerálne častice, organické súčasti, ťažké kovy a ich vplyv na zdravie zvierat a ľudí. Práca bola zameraná na kvalitu životného prostredia, vplyv na homeostázu oviec a výskyt ťažkých kovov v ich krvnom sére. Monitorovali sme oblasti s rozvinutým priemyslom, kde bol už v 80. rokoch minulého storočia dokázaný zvýšený výskyt ťažkých kovov v prostredí. Vybrali sme obce v okolí Krompách, kde je najvýznamnejším zdrojom znečistenia a.s. Kovohuty Krompachy a Vikartovce nachádzajúce sa v oblasti Nízkych Tatier, považované za najmenej znečistenú obec vzhľadom na vzdialenosť od akýchkoľvek priemyselných podnikov. Abstract Human activities in last tens of years became leading factor of changed biogene elements ratio which were not present in nature before. Atmosphere appears to be the most important object of study because mineral and organic particles and heavy metals are present there. This project is focused on environment quality, its influence to homeostasis in sheep and heavy metals occurrence in sheep blood serum. We monitored area with developed industry where high concentration of heavy metals was confirmed in environment in 80 th years already. We selected villages around Krompachy where Kovohuty Krompachy Ltd. appears to be the most relevant source of pollution. We compared measured concentration between them and Vikartovce village, which is considered as significantly less polluted based on location from industrial estates. Kľúčové slová : ovce, metabolizmus, ťažké kovy, životné prostredie Úvod Antopogénne emisie znečisťujúcich látok do ovzdušia sú príčinou mnohých súčasných potencionálnych problémov. S rastúcim stupňom znečistenia sa záujem o dôsledky pôsobenia toxických látok na živé systémy zvyšuje. Živočíchy nie sú schopné svojimi zmyslami spoznať v potrave všetky cudzorodé látky (OCHONDRICKÝ, 2003). Musia žiť v prostredí, ktoré im určil človek a prijímať potravu, ktorú im človek predkladá, preto je potrebné monitorovať prítomnosť cudzorodých látok v cudzom prostredí v potravinovom reťazci, ale aj v organizme zvierat, ktoré v takom prostredí žijú, lebo sú tiež súčasťou potravinového reťazca človeka (KOVÁČIK, 2006). Tieto látky sa kumulujú v orgánoch a takto vyvolávajú intoxikácie (YAZAR, 2006). Materiál a metodika Pokus bol zrealizovaný na farmách s chovom oviec v Krompachoch, Slovinkách, Hrišovciach a Vikartovciach. Do pokusu bolo náhodným výberom vybratých po 25 ks bahníc a 10 jahniat plemena Zošľachtená valaška, približne rovnakej hmotnosti a rovnakého veku v každej odberovej skupine. Každé zviera bolo opatrené identifikačným ušným číslom. Krv od vybraných zvierat bola odoberaná na laboratórne účely z vena juguláris. Táto bola následne spracovaná v laboratóriu Kliniky prežúvavcov a ošípaných UVL v Košiciach. Hodnotený bol hematologický, makro a mikrominerálny, energetický, bielkovinový, enzymatický, hepatálny profil a ťažké kovy. 91

93 Výsledky a diskusia Na farmách Slovinky a Hrišovce sme pozorovali miernu leukocytózu a miernu hypovolémiu vo všetkých sledovaných farmách, koncentrácia hemoglobínu a počet erytrocytov boli vo fyziologickom optime. Hladina vápnika bola u všetkých vo fyziologickom optime, pričom pred dvadsiatimi rokmi bola v Krompachoch a v Slovinkách zaznamenaná hypokalcémia, hladiny horčíka boli taktiež vo fyziologickom optime, pred dvads iatimi rokmi bola na farmách Slovinky, Krompachy, Hrišovce zaznamená hypomagneziémia. Hladiny fosforu v sledovaných farmách boli vo fyziologickej norme, v osemdesiaty ch rokoch na farmách Krompachy a Slovinky bola zaznamenaná hypofosfatémia. Keďže v tejto oblasti bola v rokoch po písaná kumulačná otrava meďou, sledovali sme koncentráciu tohto prvku v súčasnom období. V súčasnej dobe najvyššie namerané hodnoty v krvnom sére u oviec sa pohybovali od 10,44 do 11,64 umol/l, čo je o % zníženie koncentrácie Cu oproti rokom Kumulačná otrava sa v súčasnosti nepotvrdila z dôvodu zmeny technológie výrobného procesu pri spracovaní medi. Hodnoty koncentrácie železa v krvnom sére oviec sa pohybovali vo fyziologickej norme. V Krompachoch klesla hodnota zinku v krvnom sére oviec o 114%.V Slovinkách a v Hrišovciach hypozinkémia pretrváva, oproti osemdesiatim rokom je výraznejš ia. Najväčší výskyt ťažkých kov ov bol zistený v 80tych rokoch. Najvyššia koncentrácia bola nameraná pri As v Krompachoch (2, 37 umol/l), Cd v Hrišovciach (0, 511 umol/l) a najnižšia koncentrácia bola zistená pri Pb ( 0,47umol/l). V súčasnom období sa hodnoty Cd v sledovaných farmách pohybovali v rozpätí 0,107 1,129 umol/ l, došlo k 2 4,5 násobnému zníženiu výskytu tohto prvku v sére ovie c. U ďalšieho sledovaného prvku, ktorým bolo Pb došlo k 1,5 10 násobnému zníženiu kon centrácie v krvnom sére oviec. Pred 20timi rok mi sa namerané hodnoty pohybovali medzi 0,052 0,47 umol/l, v súčasnosti je to 0,038 0,044 umol/ l. U As došlo k najvýraznej šiemu pokles u v sledovaných farmách a to o 13,5 18,5 násobok, oproti hod notám, ktoré boli namera né pred 20timi rokm i. Kým pred 20timi rokmi sa namerané hodnoty pohybov ali medzi 1, 879 2, 37 umol/l, v súčasnosti je to 0,098 0,165 umol/l. Na všetkých sl edovaných farmách bol nameraný najnižší výsk yt As u oviec (0,098 umol/l) a takisto aj Cd v rozmedzí (0,094 umol/l). Hodnota Pb bola vyššia (0,062 umol/l) ako na farmách Krompachy, Slovinky a Hrišovce. Z toho dôvodu, že sa objavujú relatívne vysoké koncentrácie aj z takých miest, kde nie sú evidované žiadne zdroje znečisťovania ovzdušia pre olovo. Ide o historicky zaťažené lokality kontaminantov prirodzeného pôvodu (geochemické anomálie), ktoré sa d o pôd d ostali v procese genézy substrátov pôd ( Štiavnické pohorie, Slovenské Rudohorie, Vihorlat, Nízke Tatry, Malá Fatr a a ich bezprostredné okolie Cd a Pb). Z roka na rok majú klesajúc u tendenciu a v súčasnosti nepreds tavujú vážnejší problém. (BOBRO,2006) V oboch odberoch u oviec a jahniat bola zistená hypozinkémia. Hodnoty medi sa pohybovali v rozmedzí referenčných hodnôt. Tab. 1 Hodnota medi (Cu) v krvnom sére oviec Cu rok 1983/1984 rok 2005/2006 9,0012,0 umo l/l min.m ax x ± sd min.m ax x ± sd Krompachy 7,0824,4 17,79 5,89 9,4411,80 10,62 0,848 Slov inky 7,0827,5 15,52 6,37 7,8714,16 10,44 1,66 Hrišovce 10,218,9 15,17 2,52 7,0814,16 10,479 2,041 Vikartovce 9,4415,74 11,64 1,790 92

94 Tab. 2 Hodnota železa (Fe) v krvnom sére oviec (fyziol. hodnota = umol/l) Fe rok 1983/1984 rok 2005/ umol/l min.max x ± sd min.max x ± sd Krompachy 17,034,0 26,59 6,27 18,827,76 24,801 2,672 Slovinky 8,0626,9 17,09 5,46 12,5325,96 20,234 3,321 Hrišovce 12,520,6 15,56 2,72 14,3225,96 20,489 3,033 Vikartovce 2,5931,34 20,467 6,969 Tab. 3 Hodnota zinku (Zn) v krvnom sére oviec (fyziol. hodnota = 12,5 24,0 umol/l) Zn rok 1983/1984 Rok 2005/ ,524 umol/l min.max x ± sd min.max x ± sd Krompachy 4,1712,2 19,12 2,59 7,6410,70 8,94 1,023 Slovinky 8,4125,2 12,22 5,43 6,8811,46 8,618 1,218 Hrišovce 8,6328,2 12,38 6,64 6,8813,76 9,723 1,665 Vikartovce 9,1715,29 11,718 1,406 Tab. 4 Hodnota arzénu (As) v krvnom sére oviec As rok 1983/1984 Rok 2005/2006 umol/l min.max x ± sd min.max x ± sd Krompachy 1,164,31 2,27 1,08 0,0760,179 0,123 0,030 Slovinky 1,384,31 2,37 0,966 0,0890,32 0,165 0,054 Hrišovce 1,093,05 1,879 0,584 0,0280,293 0,137 0,071 Vikartovce 0,0820,172 0,098 0,013 Tab. 5 Hodnota kadmia (Cd) v krvnom sére oviec Cd rok 1983/1984 Rok 2005/2006 umol/l m in.max x ± sd min.max x ± sd Krompachy 0,170,72 0,38 0,211 0,0670,150 0,107 0,031 Slovinky 0,190,44 0,266 0,086 0,0690,19 0,129 0,034 Hrišovce 0,370,69 0,511 0,177 0,0520,172 0,114 0,031 Vikartovce 0,0550,148 0,094 0,024 Pb Tab. 6 Hodnota olova (Pb) v krvnom sére oviec rok 1983/1984 rok 2005/2006 umol/l min.max x ± sd min.max x ± sd Krompachy 0,0340,09 0,052 0,0016 0,0150,072 0,038 0,017 Slovinky 0,0340,06 0,47 0,008 0,0250,077 0,044 0,014 Hrišovce 0,0520,155 0,089 0,031 0,0240,053 0,038 0,008 Vikartovce 0,0270,088 0,062 0,017 Záver Životné prostredie chápeme ako súbor faktorov, ktoré vplývajú na všetky živé organizmy, najmä však na ich zdravie (BOBRO,2000). Tento pojem zahŕňa nielen vonkajšie prostredie biologického systému, ale aj jeho vnútorné prostredie, v ktorom prebiehajú metabolické procesy. Neoddeliteľnou súčasťou životného prostredia je jeho kvalita a v tej spojitosti jej vplyv na zdravie. Efektívnosť chovu oviec je limitovaná faktormi, ktoré ovplyvňujú využitie produkčných a reprodukčných schopností, resp. fyziologické zvláštnosti metabolizmu prežúvavcov. Vyrovnaná a kvalitná výživa je nevyhnutným predpokladom vyšších produkčných parametrov. O intenzívnej produkcii rozhoduje okrem zdravia aj vysoká pôrodná hmotnosť a vysoké prírastky po narodení. S rastúcim stupňom znečistenia životného prostredia sa záujem o dôsledky pôsobenia toxických látok na živé systémy zvyšuje, preto je potrebné systematické štúdium v tejto oblasti ďalej rozvíjať. Táto práca bola podporovaná Agentúrou na podporu výskumu a vývoja na základe zmluvy č. APVV

95 Experiment bol realizovaný za pomoci grantovej agenúry VEGA pod číslom 1/3487/06. Literatúra Bobro, M.: Monitorovanie tuhých imisií v území medzi Krompachmi a Košicami v r Expertíza pre MÚ Košice,2000, ÚGt SaV, 4042 Bobro M., Hančuľák, J.: Jemnodispergované minerály vo voľnom ovzduší, Prešov, 2006, ISBN , Kováčik, J.: Rizikové faktory potravového reťazca človeka, SPU v Nitre,2000, ISBN , 543 Ochondrický, D., Poltársky, J.: Ovce, kozy a ošípané, Bratislava, Príroda, 2003, ISBN , 2932 YAZAR, E., ALTUNOK, V., EROGLU, T.: Concentrations of some elements in bloodserum of Angora goats. POLISH SOC VETERINARY SCIENCES EDITORIAL OFFICE POLAND,2006, , POROVNANIE VPLYVU MAGNETICKÉHO POĽA S RÔZNOU DĹŽKOU PÔSOBENIA S VPLYVOM MAGNETICKÉHO POĽA S RÔZNOU INDUKCIOU POČAS INKUBÁCIE NÁSADOVÝCH VAJEC NA LIAHNUTIE KURČIAT HYBRIDA ISA 715 VEDETTE. THE COMPARISON OF INFLUENCE OF THE MAGNETIC FIELD WITH DIFFERENT LENGTH EFFECT WITH INFLUENCE OF THE MEGNETIC FIELD WITH DIFFERENT INDUCTION DURING INCUBATION OF HATCHED EGGS FOR HATCHING OF HYBRID ISA 715 VEDETTE Jedlička, J. Slovenská poľnohospodárska univerzita v Nitre, Abstract We realized our experiments in hatchery the type BIOS MONO 06, which was adapted to work more correctly. We replaced thermostat with mechanical (bimetal) thermo sensor by electronic (bead type) thermo sensor, so we reached higher sensibility on set temperature. We also used digital thermometer STD 9, which is able to get results from hatchery with precision on 0,1C. The relative humidity of the air was kept and measured by digital hydrostat PHI. Biological control of hatching was taken by candling of eggs on 7 th and 18 th day. We should also remove futile eggs and also with dead embryo. Kľúčové slová: magnetické pole, magnetická indukcia, inkubácia, liahnutie kurčiat, Úvod Hydinové mäsá pre svoj nižší obsah tuku a naopak vyšší obsah bielkovín a esenciálnych ami nokyselín (v porovnaní s hovädzím a bravčovým mäsom) tvoria dôležitý článok vo výžive ľudí v krajinách s vysokým životným štandardom. Výskum faktorov regulácie biologických procesov hydiny je významný aj z evolučného a ekologického aspektu, pretože umožňuje poznávať cesty fylogenetického vývoja jednotlivých regulačných systémov a ich reakciu na zmeny prostredia. Vývoj vedných disciplín, zaoberajúcich sa živými organizmami sa neustále rozširuje. V súčasnosti sa veľká pozornosť venuje štúdiu a skúmaniu fyzikálnych prejavov živých organizmov, hlavne prostredníctvom vedného odboru biofyzika. Oblasť biofyziky, skúmajúca vplyv fyzikálnych faktorov prostredia na živý organizmus nazývame ekobiofyzika. Živé organizmy sú pri svojich životných prejavoch obklopené životným prostredím, ktoré je tvorené komplexom biologických, fyzikálnych, chemických a sociálnych faktorov. Účinok fyzikálnych podnetov, aplikovaných na živý organizmus z vonkajšieho prostredia vyvoláva určitú biologickú reakciu, prejavujúcu sa podráždením nervovej sústavy, vylučovaním hormónov a špecificky účinných látok, čo sa v konečnom dôsledku môže prejaviť zmenami 94

96 v činnosti, správania, funkcii a morfologickej stavbe jednotlivých buniek, tkanív, orgánov, ako i celých orgánových sústav, ovplyvňujúcich ďalší život jedinca, prípadne i jeho smrť. Magnetické pole môže podstatne ovplyvňovať najmä embryonálny vývin živočíchov. Vo svojich prácach sa viacero autorov venovalo vplyvu magnetického poľa na embryonálny vývin bezstavovcov (Levin a Ernst, 1997; Xing et al., 1991) ako i na embryonálny vývin vtákov (napríklad Pan, 1996; Behr et al., 1991; Blackman et al., 1988). Thalau et al. (2003) vystavili 550 oplodnených vajec kurčiat Leghornka biela rádiofrekvenčnému EMP 1,25 GHz v šiestich odlišných silových hustotách toku vĺn v rozsahu 90,75 mw/cm². Doba pôsobenia bola 21 dní, počas celej inkubácie dlhá expozícia, a 12 hodiny denne v takzvanej krátkodobej expozícii. Teploty embryonálnej tekutiny boli merané vloženými špeciálnymi teplomermy. Cieľom bolo zistiť vzťah medzi expozíciami a teplotnými zmenami v tkanivách. Počas 21 dní embryonálneho vývinu priemerná teplota sa zvýšila vo vajciach o 0,25 ºC pri silovej hustote toku 1,25 mw/cm² a o 2,3 ºC pri 9 mw/cm². Berman et al. (1990) skúmali vplyv unipolárneho pulzujúceho MP indukcie 1 µt počas prvých 48 hodín inkubácie. Po 48 hodinách trvania expozície boli vajcia podrobené analýze na vývin, morfológiu a štádium zrelosti. Výskyt abnormalít u embryí vystavených MP bol 25 %, oproti kontrolným 19 %. Rozdiel bol vysoko preukazný. Fyzikálne faktory, či už prírodné alebo umelo aplikované môžu buď pozitívne alebo negatívne vplývať na biologický materiál, na biologické systémy. V snahe zistiť, aký vplyv má na násadové vajcia elektromagnetické žiarenie počas inkubácie, sme si za cieľ našej práce stanovili: vplyv elektromagnetického poľa s rôznou dĺžkou pôsobenia (expozícia), pôsobenie elektromagnetického poľa s rôznou indukciou. Výsledky Pokus 1. Vplyv elektromagnetického poľa 0,04T, s rôznou dĺžkou pôsobenia počas inkubácie násadových vaje c, na liahnutie kurčiat hybrida ISA 715 Vedette V pokuse sme pozorovali, že kurčatá mäsového hybrida ISA 715 Vedette sa začali najskôr kľuvať v 1. pokusnej skupine, v ktorej pôsobilo premenlivé magnetické pole s indukciou 0,04T na embryá kurčiat počas liahnutia 15 minút denne (po 497,42 ± 3,12 hodinách inkubácie). Najneskôr sme spozorovali začiatok kľuvania u kurčiat mäsového hybrida ISA 715 Vedette v 3. p okusnej skupine, v ktorej na embryá kurčiat pôsobilo premenlivé magnetické pole v priebehu vlastného procesu liahnutia najdlhšiu dobu 30 minút denne, kurčatá sa začali kľuvať až po 500,53 ± 2,94 hodinách inkubácie. Pri porovnávaní ďalšieho sledovaného ukazovateľa liahnutia a dĺžky kľuvania celej skupiny kurčiat, sme nezaznamenali väčšie rozdiely v časoch medzi kontrolnou skupinou a pokusnými skupinami, ako ani medzi pokusnými skupinami navzájom. Za najkratší čas sa kurčatá vykľuvali v 1. pokusnej skupine (za 12,18 ± 1,77 h odín). Najdlhší čas potrebovali na vykľuvanie sa kurčatá v 2. pokusne j skupine (13,06 ± 2,11 hodín). Dĺžka liahnutia kurč iat bola taktiež vcelku vyrovnaná, pričom sa najskôr vyliahli kurčatá v 1. pokusnej skupine po 509,60 ± 3,18 hodinách i nkubácie. Najvyššiu liahnivosť z násad ových vajec vložených do liahne sme opäť pozorovali v kontrolnej skupine (89,78 ± 2,87 %), v ktorej počas inkubácie násadových vaje c mäsového hybrida ISA 715 Vedette, nepôsobilo elektromagnetické pole. Rozdiel medzi zistenými hodnotami liahnivosti v kon trolnej skupine a 1. pokusnej skupine b ol štatisticky preukazný (P < 0,05). V 2. pokusnej skupine, v ktorej pôsobilo EMP 30 minút denne na embryá k určiat počas celého liahnutia bola liahnivosť nižšia (74,48 ± 2,83 %). Najnižšiu liahnivosť z celého pokusu sme zaznamenali v 3. pokusnej skupine 72,79 ± 2,44%), v ktorej EMP ovplyvňovalo embryonálny vývin kurčiat 45 minút denne v priebehu liahnutia. Pri porovnaní dosiahnutých výsledkov liahnivosť medzi kontrolnou skupinou a pokusnými skupinami, môžeme konštatovať, že dosiahnuté rozdiely sú preukazné (P < 0,01). 95

97 Premenlivé magnetické pole taktiež negatívne ovplyvnilo priemernú hmotnosť vyliahnutých kurčiat. Najvyššiu hmotnosť u vyliahnutých kurčiat sme zistili v kontrolnej skupine, 42,17 ± 3,12 g. V pokusných skupinách boli zaznamenané nižšie priemerné hmotnosti u vyliahnutých kurčiat. Pri porovnaní číselných údajov, týkajúcich sa priemernej hmotnosti vyliahnutých kurčiat medzi kontrolnou skupinou a 1. pokusnou skupinou sme nezistili rozdiely štatisticky preukazné. Pri porovnaní zistených výsledkov medzi kontrolnou skupinou a 2. a 3. pokusnou skupinou sme už zaznamenali ich štatistickú preukaznosť (P < 0,05). Tabuľka 1. Vplyv elektromagnetického poľa 0,04T, s rôznou dĺžkou pôsobenia počas inkubácie násadových vajec, na liahnutie kurčiat hybrida ISA 715 Vedette Ukazovatele celkové množstvo inkubovaných vajec na pokus začiatok kľuvania čas vykľuvania celej skupiny Jednotky Kontrolná skupina 1. pokusná skupina (15 min) 2. pokusná skupina (30 min) 3. pokusná skupina (45 min) ks x ± s x ± s x ± s x ± s h 499,23±2,65 497,42±3,12 499,87±3,86 500,53±2,94 h 12,85±1,42 12,18±1,77 13,06±2,11 12,63±1,92 čas liahnutia h 512,08±3,54 509,60±3,18 512,93±3,49 513,16±4,14 liahnivosť % 89,78±2,87 hmotnosť vyliahnutých kurčiat + P < 0,05, ++ P < 0,01 Pokus 2. + K : P1 79,45±3,05 g 42,17±3,12 38,87±2,58 ++ K : P2 74,48±2,83 + K : P2 36,43±3,25 ++ K : P3 72,79±2,44 + K : P3 35,12±2,63 Pôsobenie elektromagnetického poľa s rôznou indukciou počas inkubácie násadových vajec na liahnutie kurčiat hybrida ISA 715 Vedette V tomto pokuse sme použili v pokusných skupinách premenlivé magnetické pole s rôznou indukcio u. EMP pôsobilo 20 minút denne, počas celej inkubácie násadových vajec mäsového hybrida ISA 715 Vedette. V 1. pokusnej skupine pôsobilo ele ktromagnetické pole z cievky elektronického induktora s intenz itou 0,02 T, v 2. pokusnej skupine s intenzitou 0,04 T a v 3. p okusnej skupine s intenzitou 0,07 T. V kontroln ej skupine na em bryá kurčiat po čas liahnutia nepôsobilo premenlivé magnetické pole. Kurčatá sa začali najskôr kľuvať v 2. pokusnej skupine a t o už po 500,42 ± 4,71 hodinách inkubácie. Najkratší čas potrebovali na vykľuvan ie sa kurčatá v 3. pokusnej skupine ( 13,13 ± 1, 87 hodín), potom kurčatá v kontrolnej skupine ( 13,55 ± 1,58 hodín), najdlhšie sa celá skupina kurčiat kľuvala v 1.pokusnej skup ine 14,72 ± 2,08 hodín. Pri porovnaní jednotlivých časových údajov za celú dĺžku liahnutia sme zaznamenali najkratší čas potrebný na vyliahnutie kurčiat mäsového hybrida ISA 715 Vedette v 2. pokusnej skup i ne (514,45 ± 3,64 hodín). Pri porovnaní uvedených ukazovateľov liahnutia (začiatok kľuvania, dĺžka kľuvania a liahnutia) sme nezaznamenali väčšie rozdiely v časových údajoch 96

98 a preto konštatujeme, že ani premenlivé magnetické pole s rôznou indukciou neovplyvnilo tieto ukazovatele. Najvyššiu liahnivosť sme zaznamenali v kontrolnej skupine (bez vplyvu elektromagnetického poľa na embryá kurčiat počas inkubácie) 93,41 ± 2,47 %. So zvyšujúcou sa indukciou elektromagnetického poľa v pokusných skupinách sa priamo úmerne znižovala liahnivosť kurčiat z násadových vajec vložených do liahne. Z pokusných skupín sme zistili najvyššiu liahnivosť v 1. pokusnej skupine (89,87 ± 3,02 %). Rozdiely medzi kontrolnou skupinou a 1. pokusnou skupinou neboli preukazné, medzi kontrolnou skupinou a 2. pokusnou skupinou boli rozdiely preukazné (P < 0,05), taktiež boli rozdiely štatisticky preukazné (P < 0,001) medzi kontrolnou skupinou a 3. pokusnou skupinou. Približne rovnaká bola priemerná hmotnosť vyliahnutých kurčiat v kontrolnej skupine (41,86 ± 2,07 g) a v 1. pokusnej skupine (41,03 ± 1,92 g). V 2. pokusnej skupine sme zaznamenali hmotnosť vyliahnutých kurčiat 37,11 ± 1,83 g a v 3. pokusnej skupine bola priemerná hmotnosť vyliahnutých kurčiat iba 35,85 ±1,71 g. Zistené rozdiely boli štatisticky preukazné (P < 0,05) len medzi kontrolnou skupinou a 3. pokusnou skupinou. Tabuľka 2. Pôsobenie elektromagnetického poľa s rôznou indukciou počas inkubácie násadových vajec, na liahnutie kurčiat hybrida ISA 715 Vedette Ukazovatele Jednotky 1. pokusná 2. pokusná 3. pokusná Kontrolná skupina skupina skupina skupina (0,02 T) (0,04 T) (0,07 T) celkové množstvo inkubovaných ks vajec na pokus x ± s x ± s x ± s x ± s začiatok kľuvania h 502,13±4,01 500,84±3,93 500,42±4,71 502,29±4,17 čas vykľuvania celej skupiny h 13,55±1,58 14,72±2,08 14,03±2,47 13,13±1,87 čas liahnutia h 515,68±4,58 515,26±3,92 514,45±3,64 515,42±3,42 liahnivosť % 93,41±2,47 89,87±3,02 + K : P2 +++ K : P3 81,12±2,19 72,23±3,17 hmotnosť + K : P3 vyliahnutých g 41,86±2,07 41,03±1,92 37,11±1,83 35,85±1,71 kurčiat + P < 0,05, +++ P < 0,001 Diskusia Vplyv elektromagnetického poľa, pôsobiaceho na embryá kurčiat počas ich inkubácie sa prejavil negatívne na zníženej liahnivosti násadových vajec ako i na zníženej priemernej hmotnosti u vyliahnutých kurčiat. Pri rôznej dĺžke pôsobenia premenlivého magnetického poľa na embryá kurčiat počas liahnutia bola najvyššia liahnivosť v kontrolných skupinách, v ktorých nepôsobilo elektromagnetické pole (89,78±2,87 %), v pokusných skupinách bola liahnivosť nižšia (72,79±2,44 %), pričom táto sa znižovala v priamej závislosti od dĺžky jeho pôsobenia. Priemerná hmotnosť vyliahnutých kurčiat ako i liahnivosť z násadových vajec vložených do liahne sa znižovala úmerne so zvyšovaním indukcie elektromagnetického poľa, pôsobiaceho na embryá kurčiat počas ich inkubácie. Najvyššiu liahnivosť a hmotnosť vyliahnutých kurčiat sme zaznamenali v kontrolných skupinách bez vplyvu premenlivého magnetického poľa (93,41 ± 2,47% resp. 41,86 ± 2,07 g). 97

99 Vo všetkých pokusných skupinách, v ktorých pôsobilo magnetické pole na embryá kurčiat počas inkubácie bola zistená nižšia priemerná hmotnosť u vyliahnutých kurčiat v porovnaní s kontrolnými skupinami, v ktorých magnetické pole počas inkubácie nepôsobilo (Veterány et al., 2001). Podľa Garciu Pereza et al. (1999), magnetické pole umožňuje presuny elektrického náboja v organizme, čím sa môže ovplyvniť i látková výmena. K podobným záverom dospeli aj Moses a Martin (1992, 1993). Naše zistenia v práci korešpondujú s výsledkami pokusov Vargu a Oblyvača (1997), ktorí konštatujú, že pokles hmotnosti tela je zapríčinený účinkom magnetického poľa na živý organizmus. Záver V oblasti výskumu pre dosiahnutie čím najoptimálnejších výsledkov si bude uvedená problematika vyžadovať ešte hlbšie etologické pozorovania procesu liahnutia kurčiat s využitím elektromagnetického poľa s vhodnou indukciou a časom pôsobenia a to tak v období uskladnenia násadových vajec, ako aj v čase ich liahnutia. Vďalších výskumoch bude potrebné v náväznosti na terajšie výsledky pokračovať v sledovaní vplyvu MP na zmeny genetických informácií (Velizarov et al., 1999; Cameron et al., 1993b a Denegre et al., 1998), a to aj z pohľadu následných potomstiev, v spolupráci s odborníkmi v danej oblasti. Literatúra ARIF, M. JOSHI, K. L. SHAN, P. et al Hatchability of layer aggs stored and incubated in different position at 5500amplitude. In: J. Agric. Sci.,č.1, 1992, s ASUSQUO, B. OKON, B. et al Effects of age in lay and egg size on fertility and hatchability of chicks eggs.in: Nigerian Journal of Animal Production, č.1/2, 1993, s HLUCHÝ, S. JEDLIČKA, J. ARPÁŠOVÁ, H. TOMAN, R. BROUČEK, J Vplyv magnetického poľa počas uskladnenia vajec na liahnivosť. In: Drủbež 2002: Technologické systémy v chove drủbeže, Brno: MZLU, 2002, s ISBN LAHIJANI, M. SAJADI, K Development of preincubated chicken eggs folloving exposure to 50 Hz electromagnetic fields with mt flux densities. In: Indian Journal of experimental biology, č. 42, 2004, s MARTIN, AH Development of chicken embryos following exposure to 60 Hz magnetic fields with differing waveforms. In: Bioelectromagnetic, s Kontakt: Ing. PaedDr. Jaroslav Jedlička, PhD, Slovenská poľnohospodárska univerzita, Katedra telesnej výchovy a športu, Tel.: , [email protected] OBSAH MINERÁLNYCH LÁTOK V MÄSE KRÁLIKOV PO EXPERIMENTÁLNOM PODANÍ NIKLU A ZINKU. THE LEVEL OF MINERAL SUBSTANCES IN THE MEAT OF RABBIT AFTER AN EXPERIMENTAL NICKEL AND ZINC ADMINISTRATION Kalafová, A. 1, Kolesárová A. 1, Zaujec, K. 2, Mojto J. 2, Massányi, P. 1, Lukáč, N. 1, Kováčik, J. 1, Schneidgenová, M. 1, Čupka, P. 1 1 Katedra fyziológie živočíchov, Fakulta biotechnológie a potravinárstva, Slovenská poľnohospodárska univerzita v Nitre, [email protected] 2 Výskumný ústav živočíšnej výroby, Slovenské centrum poľnohospodárskeho výskumu, Nitra Abstrakt The aim of this study was to recognize the effect of trace elements nickel and zinc on meat mineral profile of rabbit. Adult females (Californian and New Zeland white breed, n=25) were fed ad libitum with different concentration of nickel and/or combination with zinc. In first group (P1; n=5) animals were fed with granular feed mixture with addition of 17.5 g NiCl 2 per 100 kg of mixture and second group (P2; n=5) with 35 g NiCl 2 per 100 kg of mixture. In group 98

100 P3 (n=5) animals were fed with mixture containing 17.5 g NiCl 2 and 30 g ZnCl 2, and in group P4 (n=5) 35 g NiCl 2 and 30 g ZnCl 2 per 100 kg of mixture. All results were compared with control group (n=5). After experimental period (90 days) concentration of mineral elements (sodium, potassium, calcium, phosphorus, magnesium, iron, copper, manganese, zinc) was detected. We demonstrate that during 90 days of the experiment did not significant differences between control group and experimental groups in the level of those mineral substances. Generally we can conclude that detected heavy metal concentrations do not have negative effects on the level of mineral elements in meat of rabbits. Úvod Ťažké kovy patria medzi základné skupiny znečisťujúcich látok, ktoré sa sledujú v rôznych zložkách životného prostredia. Kumulujú sa v tele človeka cez potravový reťazec, vodu a ovzdušie. Ide o pomerne rozsiahlu skupinu kontaminantov, ktoré sa vyznačujú rozdielnymi vlastnosťami, účinkami i zdrojmi svojho pôvodu. Nikel (Ni) je prirodzene sa vyskytujúci prvok, ktorý môže existovať v rôznych minerálnych formách (Atsdr, 1988, Usaf, 1990). Ni a jeho zlúčeniny používané v priemysle patria medzi škodlivé látky. Príjem Ni sa môže uskutočniť vodou a jedlom, menej významná je gastrointestinálna cesta. Z hľadiska ochrany zdravia je potrebné jeho biologické monitorovanie (Cempel, 2006). Zinok (Zn) je nenahraditeľným prvkom nachádzajúci sa v každej bunke. Nachádza sa v rôznych formách. Stimuluje a aktivizuje približne 100 enzýmov (Sandstead, 1994; Solomons, 1998). Jedným z hlavných zdrojov dotácie živočíšnych bielkovín je mäso a mäsové produkty. V humánnych diétach králičie mäso by mohlo byť vhodnou potravinou, vzhľadom na zloženie tuku (Alasnier a Gandemer, 1998). Cieľom našej práce bolo zistiť ako rôzne koncentrácie niklu (NiCl 2 ) a niklu v kombinácii so zinkom (ZnCl 2 ) a dĺžka ich podávania ovplyvňujú obsah minerálnych prvkov v mäse králikov. Materiál a metodika V experimente bolo použitých 25 samíc králika brojlerovej línie Kalifornský a Novozélandský biely (SCPV, Nitra) o hmotnosti 3,5 4,0 kg vo veku 4 mesiace, ktoré boli rozdelené do piatich skupín (P1, P2, P3, P4, K). V prvej skupine (P1) zvieratá (n=5) dostávali nikel (NiCl 2, Reachem) v dávke 17,5 g NiCl kg 1 (KZ) po dobu 90 dní. V druhej skupine (P2) zvieratá (n=5) dostávali dvojnásobnú dávku niklu v rovnakom časovom období. V ďalšej skupine (P3) sme podávali piatim samiciam nikel v dávke 17,5 g NiCl kg 1 KZ v ko mbinácii so zinkom v koncentrácii 30 g ZnCl 2 (ZnCl 2, Reachem) po dobu 90 dní. V poslednej pokusnej skupine (P4) zvieratá (n=5) prijímali krmivo s prímesou niklu (35 g NiCl kg 1 KZ) a zinku (30 g ZnCl kg 1 KZ) po dobu 90 dní. Na porovnanie výsledkov sme zostavili skupinu piati ch samíc (K kontrolná skupina), ktorá prijímala rovnakú kŕmnu zmes (KK V1) ale bez pridania niklu a zi nku. Všetk y zvieratá boli umiestnené v klimatizovaných halách, v jednopodlažných individuálnych kovových klietkach typizovan ých roz merov. Voda a krmivo bola k dispozícii ad libidu m. Obsah mikroprvkov (meď, z inok, železo, draslík, sodík, h orčík, vápnik) vo vzorke chrbtového sv alu (m. longissimus dorsi ) bol analyzovaný po suchej mineralizácii svaloviny v atómovom absorbčnom spektrofotometri Unicam 939 (Cambrid ge, UK ). V prípade stanovenia fosforu an alýze fotometriou predchá dzala reakcia s roztokom molybdénu a vanádu (Mikrochem, Pezinok SR). Dosiahnuté výsledky sme vyhodnotili štatisticky použití m PC programu SAS. Výsledky diskusia V experimente sme zisťovali ako rôzne koncentrácie niklu (NiCl 2 ) a niklu so zinkom (ZnCl 2 ) a interval ich podávania ovplyvňujú obsah minerálnych látok (meď Cu, zinok Zn, železo Fe, draslík K, sodí k Na, horčík Mg, fosfo r P, vápni k Ca ) v mäse králikov. V našom pokus e sme sledovali a hodnotil i obsa h minerálnyc h prvkov (meď, zinok, že lezo, draslík, sodík, horčík, fosfor, mangán, vápnik) v mäse králikov samíc. Najvyššiu priemernú 99

101 hodnotu sme namerali pri hladine vápnika v skupine P1(17,5 g NiCl 2 ) 0,21 g/kg. Najnižšia hodnota bola nameraná v skupine P4 (35 g NiCl2 a 30 g ZnCl 2 ) 0,15 g/kg. Pri porovnávaní priemerných hladín fosforu, v kontrolnej skupine bola hodnota najnižšia 1,49 g/kg, v pokusných skupinách sa hodnoty pohybovali v rozmedzí od 1,50 do 1,77 g/kg. Priemerné hladiny horčíka boli v jednotlivých skupinách pomerne vyrovnané v rozmedzí od 0,25 do 0,27 g/kg. Obsah sodíka v mäse bol najnižší v skupine kontrolnej 0,27 g/kg. V pokusných skupinách boli hodnoty pomerne vyrovnané (0,300,32 g/kg). Pri porovnávaní kontrolnej skupiny s pokusnými skupinami bola najnižšia priemerná hodnota draslíka v skupine kontrolnej 3,49 g/kg. V skupine P3 (10,00 mg/kg.) a v skupine kontrolnej (9,03 mg/kg ) sme stanovili najvyššie priemerné hladiny železa. V ostatných skupinách (P1 a P4) boli hodnoty železa podstatne nižšie. Najvyššie hladiny mangánu sme namerali v skupine P2 (35 g NiCl 2 ) 0,56 mg/kg a v skupine P4 (35 g NiCl 2 a 30 g ZnCl 2 ) 0,53 mg/kg. Obsah zinku bol najvyšší v kontrolnej skupine 17,93 mg/kg. V pokusných skupinách sa pohyboval v rozmedzí od 11,12 do 12,45 mg/kg. Najnižšia priemerná hodnota medi bola v skupine P1 (17,5 g NiCl 2 ) 1,09 mg/kg. V ostatných skupinách bol obsah medi pomerne vyrovnaný od 1,68 do 2,20 mg/kg. Tab. Základné štatistické ukazovatele minerálnych prvkov v mäse králikov (x. ±SD CV) Ca g/100g P g/100g Mg g/100g Na g/100g K g/100g Fe mg/1kg Mn mg/1kg Zn mg/1kg Cu mg/1kg K P1 P2 P3 P4 17.5g ( NiCl 2 ) 35g ( NiCl 2 ) 17.5g ( NiCl 2 a 30g 35g ( NiCl 2 a 30g ZnCl 2 ) ZnCl 2 ) x SD CV x SD CV x SD CV x SD CV x SD CV P o troch mesiacoch (90 dňoch) pokusu sme nezistili v obsahu minerálnych prvkov mäsa štatisticky preukazné rozdiely medzi kontrolnou skupinou a pokusnými skupinami. Korelačná analýza nám ukázala vysokú pozitívnu koreláciu medzi draslíkom a horčíkom (r = 0,74). Výsledky nášho pokusu poukazujú na nesignifikantné rozdiely pri hodnotení vápnika, fosforu, horčíka, sodíka, draslíka, železa, zinku, medi, mangánu medzi kontrolnou skupinou a pokusnými skupinami. Priemerná koncentrácia minerálnych látok a stopových prvkov v tkanivách zvierat je závislá od stavby čriev, veku zvieraťa a rôznych iných faktorov, ktoré doposiaľ nie sú popísané (Hermida et al., 2006). Pri hodnotení obsahu vápnika vo vzorke mäsa sú naše výsledky podobné ako uvádzajú pri králičom mäse Niinivaara a Antila, ( 1973), Moreiras et al. (2004) a Combes (2004). Výsledky, ktoré sme zistili v obsahu fosforu boli nižšie ako udávajú Combes (2004) a Niinivaara a Antila ( 1973). Stanovený obsah horčíka je v rozpätí mg/100g), ako uvádzajú Niinivaara a Antila ( 1973), Moreiras et al., (2004) a Combes (2004). Králičie mäso sa vyznačuje vyšším obsahom horčíka ako mäso iných druhov zvierat. Hodnoty v obsahu sodíka ako uvádza Moreiras et al., (2004) sú zhodné s našimi meraniami. Je dokázané, že 100

102 koncentrácia sodíka klesá s vekom zvierat Hermida et al. ( 2006). Niinivaara a Antila ( 1973), Moreiras et al., (2004) a Combes (2004) zistili v koncentrácii draslíka v králičom mäse výsledky zhodné s našimi meraniami. V obsahu mangánu sme dosiahli vyššie hodnoty ako uvádzajú (Falandysz, 1993 a Falandysz et al., 1994). Priemerné koncentrácie železa a zinku sa pohybujú v rozpätiach ako uvádza Hermida et al., (2006). Množstvo medi v mäse je veľmi rozdielne a závisí od prítomnosti svalového tuku Lopez Alonso et al., (2000). Je veľmi náročné porovnávať hodnoty, pretože autori neudávajú z ktorých častí bola vzorka odobratá Combes (2004). Záver Okr em prostredia k závažným exogénnym faktorom ovplyvňujúcim zdravie človeka patrí zloženi e prijímanej potravy a životný štýl. Z hľadiska zabezpečovania zdravia ľudskej populácie sa za dôležitú považuje ochrana potravového reťazca pred kontamináciu ťažkými kovmi. V priebehu pokusu sme sledovali vplyv samotného niklu a niklu v kombinácii so zinkom na hladinu minerálnych prvkov v mäse králikov. Pri porovnávaní koncentrácie minerálnych prvkov vápnika, fosforu, horčíka, sodíka, draslíka, železa, zinku, medi a mangánu sme nezistili medzi skupinami štatisticky preukazné rozdiely. Dosiahnuté výsledky ukázali, že uvedené hladiny ťažkých kovov a časový interval podávania nemali negatívny vplyv na obsah minerálnych prvkov v mäse králikov. Práca bola podporená projektami APVV a VEGA 1/2417/05. Literatúra 1. ALASINER, C., GANDEMER, G Fatty acid and aldehyde compositionof individual phospolipid classes of rabbit skeletal muscules is related to the metabolic type of the fibre. In Meat Sci., vol.48, 1998, č. 34, p ATSDR (Agency for toxic Substances and Disease Registry) Toxicological Profile for Nickel, ATSDR/TP88/19, CEMPEL, M., NICKEL, G A Rewiev of Its Sources and Enviromental Toxicology. In polish Journal of enviromental Studies, 2006, vol. 15, Issure 3, p COMBES, S.: Nutritional value of rabbit meat: a review, In: Productions Animales 17 (2004) (5), pp FALANDYSZ, J.: Some toxic and essential trace metals in swine from the Northern Poland. In: The Science of the Total Environment 136 (1993), pp FALANDYSZ, J. KOTECKA, W. KANNAN, K.: Mercury, lead, cadmium, manganese, copper, iron and zinc concentrations in poultry, rabbit and sheep from the northern part of Poland In: The Science of the Total Environment 141 (1994), pp HERMIDA, M. GONZALES, M. MIRANDA, M. RODRÍGUEZOTERO, J.L.:Mineral analysis in rabbit meat from Galicia (NW Spain). In: Meat Science.vol. 73, Issue 4 (2006), pp LÓPEZALONSO, M. BENEDITO, J.L. MIRANDA, M. CASTILLO, C. J. HERNÁNDEZ, J. SHORE, R.F.: Toxic and trace elements in liver, kidney and meat from cattle slaughtered in Galicia (NW Spain) In: Food Additives and Contaminants 17 (2000) (6), pp MOREIRAS, O. CARBAJAL, A. CABRERA, L. CUADRADO, C. In: Tablas de composición de alimentos, Ediciones Pirámide, Madrid (2004). 10. NIINIVAARA, F.P. ANTILA, P.: Valor nutritivo de la carne. In: Editorial Acribia, Zaragoza (1973). 11. SANDSTEAD, H. H Understanding zinc: recent observations and interpretations. In J. Lab. Clin. Med., vol. 124, 1994, p

103 12. SOLOMONS, N. W., Mild human zinc deficiency produces an imbalance between cellmediated and humoral immunity. In Nutr. Rev., vol. 56, 1998, p USAF Nickel. In Installation Restoration Program Toxicology Guide, vol.5, A NOVEL FUNCTIONAL FOOD CANDIDATE, THE LYCOPENE CONTAINING EGG* Kerti A., Szabó Cs., Bárdos L. Department of Animal Physiology and Health, Faculty of Agricultural and Environmental Sci., Szent István University, Gödöllő Hungary Abstract Different sources of lycopene: condensed tomato paste (Golden pheasant canned tomato Hatvan, Hungary) and manufactured gelatine coated microcapsules (Redivivo TM Lycopene 5% TG/P, DSM, Switzerland) were used as laying food additives in our experiment in Japanese quails and laying hens. The color of egg yolks were measured with suitable modification technique by a portable spectrophotometer (Micromatch ; Sheen Ltd). The carotenoid content of yolks was determined by HPLC. The color of egg yolks in the lycopene supplemented groups increased markedly in both species and sources of lycopene too. This phenomenon proves that the lycopene can be utilized for the coloration of yolk. The utilization of lycopene is not proportional with the amount of added material. Probably there exists a saturation phenomenon in the pathway of utilization. The HPLC analyses support this finding. Based on present investigations it was concluded that the tomato produces (e.g. paste) and/or commercial lycopene preparations (e.g. Redivivo) could be used in the poultry nutrition to produce a novel functional food, the lycopene containing egg. * Supported by NKTHGAK00140 Introduction Functional foods are foods or dietary components that may provide a health benefit beyond basic nutrition. These can include fruits and vegetables, grains, fortified and/or enhanced foods and beverages, and different dietary supplements. The active components in functional foods may exert health benefits and/or advantageous physiological effects. Many of traditional foods have functional properties and new food products are being developed with beneficial components (INTERNATIONAL FOOD INFORMATION COUNCIL). Lycopene is a member of the carotenoid family as an acyclic isomer of betacarotene but has no vitamin A activity. This dye is responsible for the red color of tomato and its products. Beside the coloration effects lycopene has one of the highest antioxidant activities of all the carotenoids (Rao & Agarwal 1998). Nonantioxidant mechanisms have also been proposed. These are: upregulation of connexin 43 (gap junction protein) expressions (Forbes 2003), suppression of carcinogeninduced phosphorylation, inhibition of cholesterol synthesis in the HMGCoA depending step (Agarwal & Rao 1998) and stop cell division at the G0G1 cell phase. Because lycopene may have anticarcinogenic and antiatherogenic activities a lot of studies focused on its effects. Most of the studies are deal with aspects of human health (i.e. prostate and lung cancer)(gann & al.1999, Michaud & al. 2000) and less in animal science. For example a fresh tomato was added into the chicks diet in order to evaluate its chemoprotective effect against cytotoxicity of T2 toxin (Leal 2000). These data demonstrate the very important functions of lycopene. The sources of natural lycopene have different concentrations and seasonality in our geographic area. The color of egg yolk depends on its carotenoid content. Our aim was to develop a lycopene enriched egg. 102

104 Material and methods Different sources of lycopene: condensed tomato paste (Golden pheasant canned tomato Hatvan, Hungary), manufactured gelatine coated microcapsules (RedivivoTM Lycopene 5% TG/P, DSM, Switzerland) were used as laying food additives. The pilot studies were carried out in Japanese quails, the small case experiments were carried out in a commercial egg producing farm on HyLine Brown hybrids. Before the experiments the birds were fed with low carotene diet for exhausting their reserves. After the depletion period the test food were applied with different lycopene content ( mg/kg) for four weeks. Egg samples were collected in every week. The color of egg yolks were measured with suitable modification technique (Szabó & al. 2007) by a portable spectrophotometer (Micromatch ; Sheen Ltd). The carotenoid content of yolks was determined by HPLC (Kerti & Bárdos 2006). Results and discussion The Sheen values (a*) in the depletion period was fallen rapidly. The color of egg yolks in the lycopene supplem ented groups increased markedly in laying hens receiving Redivivo additives (Figure 1.) and in q uails (Picture 1) receiving tomato paste as source of lycopene respectively. This phenomenon proves that the lycopene can be utilized for the coloration of yolk. Lycopene content of yolk were calculated either by molar absorption coefficient at OD 505 nm of hexane extract (MERCK INDEX 1989), or by HPLC determination. Both methods are resulted the same values. In the case of L 1 group of hens (receiving 250 ppm lycopene = 250 mg/kg fodder) the average concentration of lycopene in yolk was 4.35 µg/g (±0.91), in L 2 group (500 ppm lycopene supplementation) 5.57 µg/g (±1.38). These figures indicate that the utilization of lycopene is not proportional with the amount of added material. Probably there exists a saturation phenomenon in the pathway of utilization. This represented in the Fig 1. where the lines of L 1 and L2 no differ to each other markedly L2 15 L1 a* 10 5 L Figure. 1 Picture 1 Egg yolk color of hen s eggs Yolk color of quail s eggs L 0 : no lycopene in fodder. L 1 : 250 ppm in fodder A: commercial fodder, B: 250 ppm lycopene L 2 : 500 ppm in fodder (tomato paste), C: 500 ppm lycopene (Redivivo), D: carotene free diet The carotene profile of yolks is presented in two figures. The chromatograms of Fig. 2. were detected at 450 nm. This is very close to the absorption maxima of the majority of carotenoids. The wavelength 505 nm is characteristic for lycoppene (Fig. 3.). The peaks of lycopene are nearly in same height in both chromatograms. These prove the nearly same concentrations too. W 103

105 Figure 2. HPLC profile of different carotenoids of egg yolks at 450 nm Lines: yellow: commercial fodder, green: low carotene diet, blue: 250 mg/kg lycopene in diet, (group L 1) red: 500 mg/kg lycopene in diet (group L 2). 1. Lutein+Zeaxanthin, 2. Crypoxanthin, 3. Lycopene Figure 3. HPLC profile of different carotenoids of egg yolks at 505 nm; Lines: yellow: commercial fodder, green: low carotene diet, blue: 250 mg/kg lycopene in diet, (group L 1 ) red: 500 mg/kg lycopene in diet (group L 2 ). 1. Lutein+Zeaxanthin, 2. Crypoxanthin, 3. Lycopene Based on our preliminary and present investigations we can conclude that the tomato produces ( e.g. paste), and/or commercial lycopene preparations (e.g. Redivivo) could be used in the poultry nutrition for producing a novel functional food, the lycopene containing egg. This type of functional food has beneficial effects against those risk factors which act as oxidative agents. 104

106 References Agarwal S., Rao A.V.: Tomato lycopene and low density lipoprotein oxidation: a human dietary intervention study. Lipids : Gann P.H., Ma J., Giovannucci E., & al.: Lower prostate cancer risk in men with elevated plasma lycopene levels: results of a prospective analysis. Cancer Res : International food information council Kerti Annamária, Bárdos L.: Simultaneous analysis of retinoids (retinol, retinylpalmitate), carotenoids (lutein, zeaxanthin, ßcriptoxanthin, lycopene, ßcarotene) and vitamin E by rphplc. (in Hungarian) Clinical and Experimental Laboratory Medicine (Suppl) : 106. Leal M., González E.M., Tsutsumib V, Shimadac A., Ruizc,F.: Chemopreventive effect of lycopene on cytotoxicity of T2 toxin in vivo. Cancer Detection and Prevention Online abstract No.262 ( Merck Index, Merck & Co, Rahway, N.J. USA Michaud D.S., Feskanich D, Rimm E.B., & al.: Intake of specific carotenoids and risk of lung cancer in 2 prospective U.S. cohorts. Am J Clin. Nutr : Rao A.V., Agarwal S.: Bioavailability and in vivo antioxidant properties of lycopene from tomato products and their possible role in the prevention of cancer. Nutr Cancer : Szabó Cs., Kerti Annamária, Bárdos L. Objective evaluation of yolk color s by CIELab methods (in Hungarian). Baromfiágazat (2) Contact address: László Bárdos, DVM, PhD., 2103 Gödöllő, SzIEMKKÁÉET, [email protected] EFFECT OF APPLE CIDER VINEGAR ON IMMUNE STATUS OF CHICKEN Kiss, Zs., Szabó, Cs., Lakner, H., Gregosits, B., Bárdos, L. Department of Animal Physiology and Health, Faculty of Agricultural and Environmental Sci., Szent István University, Gödöllő Hungary Abstract The botanical therapeutics that comprise functional foods, dietary supplements and botanical drugs hold several advantages over conventional drugs that way earn them a more prominent place in the medicine of the future. One of these natural substances known for hundred years and nowadays living its renaissance is the apple cider vinegar. In our experiment we have divided Ross chickens into two groups (5050), group A and B. We have pointed into group A s drinking water 1% concentrated apple cider and fed them ad libitum food. Group B (as the control) was given normal tap water. When the chickens were five days old, and than they got 20, 32, and 42 days old we have taken blood samples. A vaccine against Newcastle Disease (NDV) had been given to the chickens during hatching already and on the third week also. In the both groups we have determined the level of specified antibody against NDV with the help of HI and direct ELISA methods. On the third week we used the Rosetta Cell Forming test for measuring cellular immunity. 105

107 The antibody level in chickens against NDV vaccine has risen earlier and higher in group A measured by HI test. The IgY concentration in group was higher. Lymphocytes of chickens of group A had more rosettes (24%) compared the B groups (8%). Introduction The modern pharmaceutical industry based on synthetic chemistry severed the historical connection between plants, food and medicines. Nowadays food and feed additives of natural origin, used in natural and folk medicine with a partial predilection are coming more and more into the front. Multicomponent botanical therapeutics that comprise functional foods, dietary supplements and botanical drugs hold several advantages over conventional drugs that may earn them a more prominent place in the medicine of the future (RASKIN and RIPOLL, 2004). One of these natural substances known for hundred years and nowadays living its renaissance is the apple cider vinegar (ACV) which has been helping people to healthier lives. This is claimed by advertisements in different media (journals, TV, InterNet). They argue that ACV can help maintain blood sugar levels. It also can help in weight management, along with a low calorie diet, by helping to lower the amount of body fat and also helps break down the cholesterol formations that build up on walls of blood vessel. It improves renal function and stops multiplication and colonilalization of harmful bacteria (VIJAYAKUMAR and WOLFHALL, 2002). Beneficial effects of ACV have been proved by several practical observations, but there are only a few scientific evidences to prove these facts right. The search for publications in scientific data base surprisingly has only a few scores about the biological experiments with ACV. Practical evidences confirmed that this substance is an outstanding fodder additive for farm animals, based on its vitamin, free amino acid and rich mineral element content. Based on our previous experiments with Japanese quails, which are regularly used test animals for fowls (WILSON, 1961), and on turkeys getting 1:100 dilutions of the ACV in drinking water we could state that total cholesterol (tch) and triacylglicerols (TG) had decreased in blood (BÁRDOS and KISS, 2000; CZIRLE and BÁRDOS, 2007; KISS et al., 2000). Since these are primary factors in applying ACV as an additive for foodstuffs or as a medicinal substance of natural origin. In the present study the immune status was tested is chicken during the whole rearing period from 0 day to 42 days. Material and methods We have divided Ross chickens into two groups (5050), group A and B. We have pointed into group A s drinking water a 1% concentrated apple cider and fed them ad libitum food. Group B was given normal tap water. When the chickens were five days old, and then they got 20, 32, and 42 days old, we have taken blood samples. A vaccine against Newcastle Disease (NDV) had been given to the chickens in the enhanced already, and on the third week also. In both groups we have determined the level of specified antibody against NDV with the help of HI test from their blood samples (ROBERTS and OLESUK, 1967). The antigen in HI tests is simply a solution o f the antigenic particles which is capable of inducing the reaction of haemagglutination when mixed with a suspension of red blood cells. The presence and concentration of antibody is measured by its ability to inhibit the agglutination at various dilutions. On the third week we used the Rosetta Cell Forming (RCF) test for measuring cellular immunity. The test to identify Tlymphocytes by mixing purified blood lymphocytes with serum and sheep erythrocytes, rosettes of erythrocytes form around Tlymphocytes on incubation (ANGELINI et al., 2004). Two ml of heparinized chicken blood sample were centrifugated and the plasma was removed. The mononuclear cells were enriched by centrifugation over the FicollPaque (Pharmacia) gradient.the mononuclear cells were recovered from the interface whished and 106

108 adjusted to a final concentration (10 6 /ml). We tested the chicken blood lymphocytes by tannic acid treated sheep erythrocytes by incubation for 24 hours at 37 o C. Briefly, 100 µl of the lymphocyte suspension was mixed with an equal volume of a 0.5 % suspension of sheep erythrocytes. After that we counted the rosette forming cells by microscopic method. For determining the final IgY we have measured by ELISA method (LOSONCZY et al., 1999). Results and discussion Newcastle disease is endemic in many countries of the world. Some European countries have been free of the disease for years. For this reason very important to reach higher antibody level against NDV vaccine in poultry. In our experiment the chickens were vaccinated By LaSota virus strain at 14 da ys and the third week of life. The level of specific antibody has risen earlier and higher in group A measured by HI test (Figure 1.). The method is very reliable to measure of NDV antibody (DESCOTEAUX, 1980). The values of antibody level are no significant because the individual values of spreading. Probably, it is attributable to acidified ph. Acid ph has induced changes in the immunoreactivity of specific antigen and the circulating immune complexes have increased (KUMAR, 1992).According to RIGG and SCHALLER (1992), no evidence for a role for mildly acidic ph in the initiation of Duck hepatitis B virus infection was found. The authors suggest neutral ph. Lymphocytes of chickens of group A had more rosettes compared the B groups samples (Figure 2.). The totaligy titer was determined by direct ELISA developed in our laboratory (LOSONCZY et al., 1999). This technique used for serum involved a simple dilution 1:1000 method with PBS. The totaligy titers of blood serum were expressed as OD 492 nm. The total of error. IgY titers of blood serum were increased in both groups succeeding the immunizations. The humoral immune response to NDV in chicken serum was measurable with direct ELISA. The differences of groups were detectable but the values were in margin (Figure 3.) Antibody level HI test A group B group A group B group A group B group A group B group Figure 1. NDV antibody levels in chickens 107

109 RCF rosette 40 RCF test A group B group 0 Figure 2. Rosettecellforming test OD ELISA test day 20 day 32 day 42 day A group B group Figure 3. IgY content in chicken serum References ANGELINI, G. A., VERA, R. D., OVIDIO, C. L., MENEGHINI (2004): The active Erosette test in allergic contact dermatitis. Archives of Dermatological Research, BÁRDOS L, KISS ZSUZSANNA (2000): A modell is bizonyított. (The model has proven too.) Kistermelők Lapja, 44, BÁRDOS L, KISS ZSUZSANNA (2000): Az élet sava. (The acid of life.) Magyar Mezőgazdaság, 55, 28. CZIRLE N, BÁRDOS L. (2007): Use of apple cider vinegar containing drinking water in turkey fattening. (Almaecetes itatóvíz használata a hibridpulyka hizlalásban.) Baromfiágazat, 7, DESCOTEAUX, J.P., PAYMENT, P., TRUDEL, M. (1980): Comparison of the haemagglutination inhibition procedure and enzymelinked immunosorbent assay for detection of specific antibodies to pneumonia virus mice in experimentally infected laboratory rats. J. Clin. Microbiol. 11, (2) KISS ZSUZSANNA, CZIRLE N, RÉTHY KATALIN, BÁRDOS L. (2001): Experiences in poultry watered with drinking water containing apple cider vinegar. (A baromfitartásban alkalmazott almaecetes itatóvíz alkalmazásával nyert tapasztalatok.) Innováció, a tudomány és a gyakorlat egysége az ezredforduló agráriumában, Gödöllő, 2001 máj Proceeding Book, KUMAR, U., SAXENA, R. K., (1992 ): Acid phinduced changes in the immunoreactivity in circulating immune complexes from tuberculosis sera. Journal of Clinical Laboratory Analysis 6,

110 LOSONCZY S., SZABÓ CS., KISS ZSUZSANNA, BÁRDOS L. (1999): Application of an antihqigy antibody for the measurement of IgY concentratuon of henn's and quail's serum and yolk Acta Physiol. Hung., 86 (34) RASKIN, I., RIPOLL, C. (2004): Can an apple a day keep the doctor away? Current Pharmaceutical Design. 10, RIGG, H., SCHALLER (1992): Duck Hepatitis B virus infection of hepatocytes is not dependent on low ph. J. Virol. 66. (5), ROBERTS, D. H., OLESUK, O. H. (1967): Serological studies with Mycoplasma synoviae. Avian Dis., 11, VIJAYAKUMAR C., WOLFHALL, C. E. (2002): Evaluation of household sanitizers for reducing levels of Escherichia coli on Iceberg Lettuce. J.Food Protect., 65, WILSON, W.O., ABBOTT, U.K., ABPLANAP, H. (1961): Evaluation of coturnix (Japanese quail) as pilot animal for poultry. Poultry Sci. 40, Contact address: Zsuzsanna Kiss, H2103 Gödöllő, SzIEMKKÁÉET, [email protected] ANALÝZA VPLYVU PRÍDAVKU ŠKORICOVEJ SILICE NA KVALITU MÄSA KURČIAT ANALYSIS OF INFLUENCE CINNAMON ESSENTIAL OIL ON QUALITY CHICKEN MEAT Lagin, L. Bobko, M. Ducková, V. Katedra hodnotenia a spracovania živočíšnych produktov, FBP, Slovenská poľnohospodárska univerzita v Nitre Abstract The aim of this report is to evaluate impact and substitution of feeding antibiotics for fed the feeding mixture with cinnamon essential oil as possible feeding supplements in nourishment of poultry and it s influence on sensorial quality and shear power for this meat.we have been observing different indicators this sensorial quality of poultry such as: smell, flavour, mellowness, tenderness and shear power. Results of this study indicate that substitution of avilamycin (antibiotic preparation) by cinnamon essential oil negative influenced senzory quality and shear power of evaluated chicken meat. We have not recorded statistic conclusive differences in the sensorial quality and shear power of poultry meat between our observing groups. Úvod Úplný zákaz požívania kŕmnych antibiotík a rastových stimulátorov v štátoch EÚ od 1. januára 2006 je sprevádzaný intenzívnym hľadaním účinných prírodných aditív, ktoré by významne zlepšili úžitkovosť aj pri vysokej koncentrácií zvierat vo veľkochovoch, pri zabezpečení požadovaného zdravotného stavu zvierat. Legislatívne obmedzenia použitia klasických antibiotických stimulátorov rastu a antimikrobiálných látok v krmovinárstve vedie k aplikácií nových možných produktov v biotechnológii. Z tohto dôvodu sa hľadajú nové možnosti a spôsoby, ktorými by bolo možné tieto látky nahradiť. Pri sústavnej intenzifikácii živočíšnej produkcie v minulosti zohrávali antibiotické preparáty rozhodujúcu úlohu najmä pri zabezpečovaní zdravotného stavu, reprodukčného procesu ale aj kvalite výsledného jatočného produktu. Kŕmne antibiotiká mali význam z hľadiska zlepšovania rastu zvierat ako aj ich zdravotného stavu. Súčasným trendom vo výžive hospodárskych zvierat je hľadať nové alternatívne preparáty vhodné pre výživu zvierat ako náhradu za používané antibiotiká. 109

111 Aj tisícročné tradície a skúsenosti našich predkov s využívaním účinných obsahových látok rastlín v humánnom liečiteľstve, poukazujú na skutočnosť najprirodzenejšieho riešenia problematiky udržania zdravia a potravinovej bezpečnosti pre ľudí. Osobitná pozornosť je určená obsahovým látkam, ako sú alkaloidy, triesloviny a silice (Drdák et al., 1996). Použitie rastlinných silíc ako jednej z možných alternatív za kŕmne antibiotiká, ktoré kladne ovplyvnili úžitkovosť zvierat vo svojich experimentoch sledovali Demeterová (2004), Mudroňová et al. (2005), Angelovičová et al. (2005), Angelovičová et al.(2006) a iní. Angelovičova (2005) uvádza, že aromatické kŕmne doplnky pozitívne ovplyvňujú príjem krmiva, prírastky telesnej hmotnosti, utilizáciu živín a zlepšiť mikrobiálnu fermentáciu v čreve. Podľa Opletela (1998) môžu mať rastovostimulačné účinky aj prírodné esenciálne oleje z korenín a aromatických bylín, ako aj rastlinné extrakty obsahujúce aktívne zložky. Docic a Biklei (2003uvádzajú, že rastlinne extrakty podobne ako antibiotika pozitívne ovplyvňovujú príjem krmiva, prírastky živej hmotnosti, utilizáciu živín a zlepšujú mikrobiálnu fermentáciu v čreve. Bikler (2006) poukazuje na to, že použitie fytogénnych aditív stimuluje rast tráviacej sústavy a zlepšuje je odolnosť proti kolonizácií patogénnou mikroflórou Použitie bylín a esenciálnych olejov závisí od ich antimikrobiálnej aktivity. Väčšina rastlín má priaznivé multifunkčné vlastnosti, ktoré sú dané špecifickým obsahom bioaktívnych zložiek. Kamel a McKay (2003) charakterizujú fytogénne substancie ako prírodné latky rastlinného pôvodu, ktoré nezanechávajú rezídua v živočíšnych produktoch a nie je nutné dodržiavať ochrannú dobu pred jatočnou porážkou zvierat. V posledných rokoch sa prejavil zvýšený záujem o využitie rastlinných silíc. Biologicky aktívne komponenty rastlín sú prevažne sekundárnymi produktmi ich metabolizmu, ako sú napr. terpenoidy, glykozidy a alkaloidy. Existuje veľká variabilita v ich zložení vzhľadom na biologické faktory, podmienky prípravy a skladovanie. Je nevyhnutné identifikovať a kvantifikovať ich biologický účinok najmä vzhľadom na zlepšenie utilizácie živín a zdravotného stavu zvierat. Literárne poznatky svedčia o širokom spektre antimikrobiálnych a antioxidačných účinkov rastlinných extraktov, na kvalitu výsledného produktu Marcin et al.(2004), Horosová et al.( 2004). Neoddeliteľnou súčasťou skúmania využiteľnosti kŕmnych fytoaditív má byť aj v problematike ich vplyvu na technologicko spotrebiteľskú kvalitu živočíšnych produktov, vrátane ich zdravotnej bezpečnosti. Cieľom práce je overenie možného vplyvu škoricovej silice na senzorickú kvalitu a strižnú silu výkrmových kurčiat. Materiál a metodika Na základe poznatkov o zmenách v oblasti výživy týkajúcich sa vylúčenia mäsokostných múčok a taktiež zakázania používania kŕmnych antibiotík od roku 2006 sa uskutočnil kŕmny pokus s výkrmovými kurčatami COBB 500 do 36 dňa výkrmu. Do pokusu bolo zaradených po 100 kusov výkrmových kurčiat v každej skupine. Zvieratá sa rozdelili do dvoch skupín (kontrolná a pokusná skupina), pričom sme samostatne sledovali senzorickú kvalitu mäsa kurčiat u sliepočiek aj kohútikov. V kontrolnej skupine (KS) sa do kŕmnej zmesi pridával antibiotikum avilamycín. V pokusnej skupine (PS) sa do kŕmnej zmesi pridávala škoricová silica v zastúpení 0,05 %. Kurčatá všetkých troch skupín boli kŕmené kŕmnymi zmesami HYD01(štartérova) od 1 do 18 dňa výkrmu, HYD02 (rastová) od 19 do 31 dňa výkrmu a HYD03 (finálna) od 32 do 36 dňa výkrmu. Po jatočnom opracovaní kurčiat sa odobrali z každého sledovaného kusa vzorky hydinového mäsa (stehná a prsia) získané z 12 ks kurčiat z každej skupiny (6 sliepočiek, 6 kohútikov) a vzorky sa tepelne upravili pri 200 C a vlastnom pečení počas doby 60 minút, s dopečením 10 až 15 minút. Následne sa anonymne vyhodnotili senzorické vlastnosti hydinového mäsa 5 člennou komisiou, kde pri vlastnom hodnotení sa použila metóda hodnotenia 5bodovou stupnicou. Z hľadiska senzorického sa sledovali nasledovné ukazovatele: vôňa, chuť, šťavnatosť a jemnosť a krehkosť mäsa. 110

112 Strižnú silu sa bude merať konzistometrom WarnerBratzler značky Chatillon metódou Goodson et al., (2002) a je definovaná ako sila potrebná na prestrihnutie vzorky mäsa o priereze 1 cm 2 naprieč vláknami mäsa Získane údaje sme štatisticky vyhodnotili pri sledovaní základných štatistických ukazovateľov (aritmetický priemer, smerodajnú odchýlku, maximálny a minimálny počet bodov a koeficient variability) a na určenie preukaznosti rozdielov medzi sledovanými skupinami sme použili ttest. Výsledky a diskusi Celkové senzorické posúdenie predstavuje súhrne hodnotenie nasledovných znakov: vôňa, chuť, šťavnatosť a jemnosť a krehkosť mäsa: Každá z týchto vlastností bola hodnotená 5 bodovou stupnicou. Maximálny počet bodov pridelených za celkové senzorické hodnotenie bol 20 bodov. Pri hodnotení celkovej senzorickej kvality prsnej svaloviny (tabuľka 1) sme pri kohútikoch zaznamenali vyššiu priemernú celkovú senzorickú kvalitu u kontrolnej skupiny kŕmenej prídavkom kŕmneho antibiotika 14,60 bodu v porovnaní s 14,05 bodu, ktoré sme zaznamenali pri pokusnej skupine. Rozdiel medzi kontrolnou a pokusnou skupinou predstavoval 0,55 bodu, avšak tento rozdiel nebol štatisticky preukazný. Pri sliepočkách sme taktiež zistili vyššiu priemernú senzorickú kvalitu u kontrolnej skupiny 15,00 bodu v porovnaní s pokusnou skupinou u ktorej sme zaznamenali priemernú celkovú senzorickú kvalitu 14,63 bodu. Ani pri sliepočkách sme nezaznamenali medzi jednotlivými skupinami štatisticky preukazné rozdiely. Pri hodnotení celkovej senzorickej kvality stehennej svaloviny (tabuľka 2) sme pri kohútikoch zaznamenali vyššiu priemernú celkovú senzorickú kvalitu u kontrolnej skupiny 14,80 bodu v porovnaní s 14,28 bodu, ktoré sme zaznamenali pri pokusnej skupine. Rozdiel medzi kontrolnou a pokusnou skupinou nebol štatisticky preukazný. Pri sliepočkách sme taktiež zistili vyššiu priemernú senzorickú kvalitu u kontrolnej skupiny 15,70 bodu v porovnaní s pokusnou skupinou u ktorej sme zaznamenali priemernú celkovú senzorickú kvalitu 14,88 bodu. Ani pri sliepočkách sme nezaznamenali medzi jednotlivými skupinami štatisticky preukazné rozdiely. Tabuľka 1 Celkové senzorické posúdenie prsnej svaloviny Sledované KS PS ukazovatele X 14,60 15,00 14,05 14,63 S 0,67 0,95 0,77 1,22 Min. 13,60 13,40 12,80 13,30 Max. 15,40 16,10 14,90 16,00 v (%) 4,59 6,33 5,48 8,34 P KS:PS (P > 0,05) KS:PS (P > 0,05) Tabuľka 2 Celkové senzorické posúdenie stehennej svaloviny Sledované KS PS ukazovatele X 14,80 15,70 14,28 14,88 S 0,51 0,70 0,68 0,75 Min. 14,00 14,60 13,30 13,70 Max. 15,40 16,50 15,00 15,70 v (%) 3,45 4,46 4,76 5,04 P KS:PS (P > 0,05) KS:PS (P > 0,05) 111

113 Pri hodnotení priemerných hodnôt strižnej sily prsnej svaloviny (tabuľka 3) pri kohútikoch sme zaznamenali vyššiu strižnú silu u kohútikov kontrolnej skupiny kŕmenej prídavkom kŕmneho antibiotika avilamycin a to 2,74 kg.cm 2 v porovnaní s 2,16 kg.cm 2, ktoré sme zaznamenali pri pokusnej skupine. Rozdiel medzi kontrolnou a pokusnou skupinou nebol štatisticky preukazný. Pri sliepočkách sme zaznamenali naopak vyššiu priemernú strižnú silu prsnej svaloviny u pokusnej skupiny 2,48 kg.cm 2 v porovnaní s kontrolnou skupinou u ktorej sme zaznamenali priemernú strižnú silu 2,39 kg.cm 2. Ani pri sliepočkách sme nezaznamenali medzi jednotlivými skupinami štatisticky preukazné rozdiely. Tabuľka 3 Strižná sila (WB) prsnej svaloviny (kg.cm 2 ) Sledované KS PS ukazovatele X 2,74 2,39 2,16 2,48 S 0,83 0,30 0,65 1,05 Min. 1,77 1,83 1,53 1,10 Max. 3,97 2,62 3,33 4,20 v (%) 30,29 12,55 30,09 42,34 P KS:PS (P > 0,05) KS:PS (P > 0,05) Pri hodnotení priemerných hodnôt strižnej sily stehennej svaloviny (tabuľka 4) pri kohútikoch sme zaznamenali vyššiu priemernú strižnú silu u pokusnej skupiny a to 1,87 kg.cm 2 v porovnaní s 1,52 kg.cm 2, ktoré sme zaznamenali pri kontrolnej skupine. Rozdiel medzi kontrolnou a pokusnou skupinou nebol štatisticky preukazný. Pri sliepočkách sme taktiež zaznamenali vyššiu priemernú strižnú silu u pokusnej skupiny 1,89 kg.cm 2 v porovnaní s kontrolnou skupinou u ktorej sme zaznamenali priemernú strižnú silu 1,76 kg.cm 2. Ani pri sliepočkách sme nezaznamenali medzi jednotlivými skupinami štatisticky preukazné rozdiely. Nami dosiahnuté priemerné hodnoty strižnej sily potvrdzujú názory Haščíka et al. (2005), ktorý zaznamenal pri skrmovaní kŕmnych zmesí sna báze rastlinných krmív priemerné hodnoty strižnej sily pod 4 kg. cm 2. Tabuľka 4 Strižná sila (WB) stehennej svaloviny (kg.cm 2 ) Sledované KS PS ukazovatele X 1,52 1,76 1,87 1,89 S 0,71 0,51 0,55 0,98 Min. 0,93 1,10 1,13 0,82 Max. 2,67 2,50 2,70 3,50 v (%) 46,71 28,98 29,41 51,85 P KS:PS (P > 0,05) KS:PS (P > 0,05) Záver Pri sledovaní celkovej senzorickej hodnoty prsnej a stehennej svaloviny sme zaznamenali vyššiu senzorickú hodnotu hydinového mäsa výkrmových kurčiat u kontrolnej skupiny pri oboch pohlaviach. Na základe dosiahnutých výsledkov môžeme konštatovať, že nahradenie antibiotického preparátu avilamycínu rastlinnou škoricovou silicou negatívne ovplyvnilo senzorickú kvalitu hydinového mäsa výkrmových kurčiat. Pričom tieto rozdiely však neboli štatisticky preukazné. Pri hodnotení strižnej sily môžeme taktiež konštatovať negatívne pôsobenie prídavku škoricovej silice, kedy sme zaznamenali nižšiu strižnú silu len u kohútikov v prsnej svalovine. 112

114 Literatúra u autorov Kontaktná adresa: Ing. Marek Bobko, PhD., Katedra hodnotenia a spracovania živočíšnych produktov, FBP SELECTED METABOLIC INDICES IN SOW S BLOOD AFTER PROBIOTIC ADMINISTRATION Link, R., Kováč, G., Univerzita veterinárskeho lekárstva, Košice, Komenského 73, , SR Abstract The aim of our trial was to observed effect of probiotic administration on blood parameters in sows. There were 2 x 16 hybrid sows included into the trial. The trial lasted from 2 weeks before farrowing until weaning at 4 weeks after farrowing. Control group was fed with standard feed for lactating sows, experimental group was fed with diet, in which 400 g BioPlus 2B/t was mixed, i.e. 1.28x10 6 CFU/g feed. Blood samples for determination of parameters of protein and lipid profile was taken on day 1 and 15 after parturition. Level of cholesterol in blood of experimental group increased. As a result, significant higher cholesterol level was found in experimental group compared to control group on day 15 (P=0.038). Similar to cholesterol, total lipids in blood of experimental group was significantly higher in comparison to control group on day 15 (P=0.007). Results of our experiment indicate that the probiotics based on representatives of the genus Bacillus are able to affect the blood parameters. Introduction Both the feed industry and the food production sector suffer from huge losses due to the contamination of feed with pathogenic bacteria and their related impact in the animals, such as lower weight gains or even increased mortality. The ban on the use of antibiotic promoters in the EU furthermore puts pressure on both agricultural sectors. Nowadays, other alternative feed additives are being adopted in order to fill the gap from antibiotics. Luckstadt and Steiner (2006) increased postweaning piglet performance after the use of the acidifier, buffered mixture of formic and propionic acid, in a 35day trial. Especially the final body weight of the piglets fed the acidifier was significantly increased. Moreover, average daily gains tended to be higher in the acidifier group, while the feed conversion ratio remained the same level. Several growth trials were carried out in order to evaluate the effects of feeding benzoic acid at the dietary level 0.5% on practical production parameters in weaned pigs, such as growth rate, feed intake and feed conversion. Strong beneficial effects on the growth rate of piglets were noted in all trials and the daily weight gain was increased by %, when compared with the corresponding negative controls. In the majority of the trial, beneficial effect on the growth rate was also connected with an improved feed conversion ratio (Broz and Paulus, 2006). Probiotics are one of the most progressive way, how to resolve problem with growth promoters and keep the health in sow industry. Only few reports are about influence the probiotic on the blood parameters of sows. In our experiment, we monitored selected blood parameters in sows after administration probiotic preparation with bacteria genus Bacillus. Material and methods There were 2 x 16 hybrid sows all with the same genetic background (Landrace, and crossbred, Landrace x Slovak White) included into the trial. Control and BioPlus 2B groups was balanced according to the sows parity number. Both groups consisted of 8 uniparae and 8 multiparae. 113

115 From about 14 days before the anticipated farrowing date the sows were housed in conventional farrowing crates. The trial lasted from 2 weeks before farrowing until weaning at 4 weeks after farrowing. The weaning will take place from about 28 days. Control group was fed with standard feed for lactating sows, experimental one was fed with the same type of feed with 400 g BioPlus 2B/t feed, which equals 1.28x10 6 CFU/g feed. Probiotic preparation BioPlus 2B contains equal amounts of Bacillus licheniformis and Bacillus subtilis, at the total concentration 3.2 CFU/g of preparation. In both groups the piglets received the same creep feed without additives until weaning. Blood samples for determination of selected parameters of protein and lipid profile was taken on day 1 and day 15 after parturition. The blood was sampled from the eye sinus. Results Serum levels of total proteins were in physiological range and had increasing tendency in both groups. Though no significant differences were revealed between groups, the increase was higher in experimental group. The albumin level was relatively uniform during the experiment and did not deflect from the reference range, but on the contrary to experimental group there was slight decrease of albumin in control group on day 15. Serum urea level increased in experimental and also in control group on day 15 in comparison with day 1. Level of urea in blood ranged from 3.66 to 4.64 mmol.l 1. No significant differences were observed between groups in individual sampling. Level of cholesterol in blood of experimental group increased. On the contrast, cholesterol level in control group was constant in both sampling. As a result, significant higher cholesterol level was found in experimental group compared to control group on day 15 (P=0.038). Similar to cholesterol, total lipids in blood of experimental group was significantly higher in comparison to control group on day 15 (P=0.007). Total lipids in experimental group were steady in both samplings, but serum lipids in control group decreased in second sampling, that caused significant difference (Table 1). Table 1 Level of total proteins, albumin, urea, total lipids and cholesterol in blood of swine 1th day 15th day TP exp. group, g.l ± ±5.73 TP contr. group, g.l ± ±8.21 Alb exp. group, g.l ± ±2.93 Alb contr.. group, g.l ± ±2.38 Urea exp. group, mmol.l1 3.80± ±0.95 Urea contr. group, mmol.l1 3.66± ±0.60 TL exp. group, g.l1 2.03± ±0.60* TL control group, g.l1 2.30± ±0.43* TCh exp. group, mmol.l1 2.03± ±0.58* TCh contr. group, mmol.l1 1.84± ±0.47* * P < 0.05, TP total proteins, Alb albumin, TL total lipids, TCh total cholesterol Discussion Kritas et all. (2006) reported the results of the trial with probiotics in sows. It was evident that the probiotic supplementation of the feed improved gilt/sow performance by the decrease of sow weight loss during the lactation period (15.3±3.6 in the probiotic group, vs. 18.8±3.1 in the controls). Certain blood and milk parameters e.g. total lipids and protein were significantly improved. As a consequence, a positive effect was also noticed on litter health and performance characteristics. Furthermore returns to oestrus were reduced in the probiotic group possibly as a result of improved metabolic status The immune stimulating effect of probiotic is explained as the normalization of the intestinal permeability and altered gut microecology. Many probiotics have an effect through 114

116 immune regulation, especially through balance control of pro inflammatory and antiinflammatory cytokines. Many studies have shown that probiotics can be used to alleviate gut mucosal dysfunction, and down regulate hypersensitivity reactions (Isolauri, 2001). Probiotics have the effect on sows and via them to piglets. In trial with probiotics 500 sows were selected for the test. The control group was fed normal lactating feed, experimental group was fed normal feed with probiotics. The commercial probiotic consisted of Lactobacillus, Streptococcus and various Bacillus spp in a sporulated form. The concentration of the bacteria was 1 x10 9 CFU/gram. In the treatment group, only 1 out of 10 litters showed sign of scours during the 4 weeks. This scour disappeared spontaneously within one day without antibiotic treatment. The control group had 4 litters out of 10 with severe scours. These litters had to be treated with injectable antibiotics. The weaning weights also differed and were higher in the treatment group (6.9 % increased weaning weight). The increased weaning weights are not only due to less scours in the trial group, but these probiotics, especially the Bacillus spp produce the following enzymes, which help with digestion: Proteases, lipases, amylases and hemicelluloses. These enzymes ensure better digestion and absorption of nutrients and therefore better weaning weights (Volker et all., 2006). Conclusion Results of our experiment indicate that the probiotics based on representatives of the genus Bacillus are able to increase some metabolic indices in blood. References 1. Broz, J and Paulus, C: Benzoic acid as a new additive for weaned pigs. Proceedings 9. Tagung Schweine und Geflugelernahrung, Haale, November 2006, Isolauri E. February (2001). Am. J. Clin. Nutri Kritas SK, Alexopoulos C, Tzivara AH, Georgoulakis IE, Siochu A, Kyriakis, SC: Field evaluation of the effect of an EUregistered probiotic on the health status and performance of sows and their litters. IPVS Congress, Copenhagen, July 2006, O Luckstadt C and Steiner T: Effect of an organic acid blend on a slow release medium on postweanind piglet performance. Proceedings 9. Tagung Schweine und Geflugelernahrung, Haale, November 2006, Volker TW, Goosen D, Weber, G: The use of probiotics to reduce the incidence of scours in nursing pigs. IPVS Congress, Copenhagen, July 2006, O PERFORMANCE OF WEANED PIGS AFTER ADMINISTRATION OF BIOPLUS 2B Link, R., Kováč, G. Univerzita veterinárskeho lekárstva, Košice, Komenského 73, , SR, [email protected] Astract The aim of the study was to observe the efficacy of probiotics, based on genus Bacillus, in weaned pigs. Control group was fed with standard diets for weaned pigs without additives and without antibiotics (including omission of zinc and copper at a growth promotion level) Experimental group was fed with control feed with 1000 g BioPlus 2B/t feed which equals 3.2 x 10(6) CFU/g feed. Pigs were individually weighted at weaning, at the age of 42 days, at the age of 56 days, at the end of the trial. The differences in weight of the experimental group and control group were significant at the age of 42 days (p = 0.038). Average daily gains were significantly (p<0.001) higher in experimental group compared with control group in the first two weeks of the trial. 115

117 Introduction The balance of microorganisms in the gut maintains a gentle interaction between its components, is called eubiosis. On the contrary, dysbiosis means detrimental quantitative and qualitative changes in the gut microflora, its local distribution and metabolic activity (GEDEK, 1993). Metabolic activity can be more important than numbers of selected bacterial species. Probiotics are able to maintain balance of microorganisms and improve metabolic activity of gastrointestinal microflora. SALMINEN et al. (1999) defined probiotics as microbial cell preparations or components of microbial cell, which have positive effect on health and performance of the macroorganism. CHESSON (1993) asserts that a probiotic strain should come from the intestinal tract (or tolerate conditions of the intestinal tract), adhere, maintain high vitality after freezedrying, storing, produce inhibitors against pathogens and stimulate immunity of the macroorganism. In the past decade the genus Bacillus, along with Lactobacillus, nonenterotoxic E. coli, Bifidobacterium, Streptococcus, have been used as probiotics. According to taxonomy studies, the genus Bacillus can be divided into 5 or 6 groups (CLAUS & BERKELEY, 1986). In the Bacillus subtilis group usually five physiologically similar species are described Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus atrophalus, Bacillus licheniformis, Bacillus pumilus, Bacillus subtilis. Small subunit of rrna sequence indicates that it is group related species (ASH et al., 1981). BARBOSA et al. (2005) described the isolation of 237 presumptive gutassociated Bacillus spp. isolates that were obtained by heat and ethanol treatment of faecal material from organically reared broilers. The Bacillus species identified included B. subtilis, B. pumilus, B. licheniformis, B. clausii, B. megaterium, B. firmus, and species of the B. cereus group. Isolates sporulated efficiently in the laboratory, and the resulting spores were tolerant to simulated gastrointestinal tract conditions. They exhibited also antimicrobial activity against a broad spectrum of bacteria, including food spoilage and pathogenic organisms. Results suggest that some of the sporeformers have the potential to persist in or transiently associate with the complex gut ecosystem. Material and Methods A total of 100 piglets divided into 2 trial groups of 50 pigs each, comprising an equal number of male and female pigs were used in the trial. The trial was carried out from weaning, at the age 28 days, and the following 10 weeks. All pens were assigned with pigs with the same distribution of genetic background. Average start weight was approximately 7.5 kg. All pigs were allocated to the trial within the same day. Control group was fed with standard diets for pigs in the range from weaning until 45 kg of body weight without additives and without antibiotics (including omission of zinc and copper at a growth promotion level) Experimental group was fed with control feed with 1000 g BioPlus 2B/t feed which equals 3.2 x 10(6) CFU/g feed. BioPlus 2B (Chr. Hansen A/S, Hoersholm, Denmark) contains Bacillus licheniformis and Bacillus subtilis in concentration 3.2 x 10(9) per gram of preparation. Pigs were individually weighted at weaning, at the age of 42 days, at the age of 56 days, at the end of the trial. Feed conversion ratio was calculated in the weighing intervals. Results The weaned pigs in experimental group reached better weight already on day 42 of their life and this state persisted up to the end of the experiment. The differences in weight of the experimental group and control group were significant at the age of 42 days (P = 0.038). Average daily gains were significantly (P<0.001) higher in experimental group compared with control group in the first two weeks of the trial. Though nonsignificantly, feed conversion was better in experimental group at the beginning of the trial (Table 1). 116

118 Table 1 Weight of pigs, average daily gains (ADG) and feed conversion (FC) 28 day of life 42 day of life 56 day of life 98 day of life Weight exp. group, kg 7.45± ±1.54* 18.81± ±5.28 Weight control group, kg 7.41± ±1.49* 18.15± ±4.23 ADG exp. group, kg 0.323±0.07* 0.489± ±0.08 ADG control group, kg 0.272±0.06* 0.487± ±0.07 FC exp. group FC control group * P < 0.05 In general, weaned pigs did not suffer very intensive diarrhoea, but the pig diarrhoea score of control group was higher than that of experimental group (Table 2). The diarrhoea score for groups was calculated: Diarrhoea score = all partial scores were added per pen for all days of the trial days of monitoring Scale for diarrhoea was 0 3 (0 = no diarrhoea, 1 = slight, 2 = some signs, 3 = acute). Individual monitoring of pigs was done daily during the first two weeks of the trial. Table 2 Diarrhoea score and mortality of pigs Diarrhoea score % of mortality Experimental group 0.136± Control group 0.198± Discussion Composition of the microflora in an adult animal is almost constant (TANNOCK, 1990). Probiotic bacteria, even if they are given in large amounts, are rarely colonising permanently the intestinal tract and they are only seldom detected in faeces a few weeks after application. On the other hand, scientific results show that selected probiotics at the concentration of decrease incidence of diarrhoea (SANDERS, 1999). According to STRAW et al. (2003) we achieved ideal average daily gains in our trial. After evaluating growth rate among groups we can say that application of preparation BioPlus 2B had a positive effect on average daily gains. The results suggest positive effect of longterm BioPlus 2B application. References ASH, C., FARROW, J. A. E., WALLBANKS, S., COLLINS, M. D Phylogenetic heterogeneity of the genus Bacillus as reveal by comparative analysis of small subunitribosomal RNA sequences. Lett. Appl. Microbiol. 13: BARBOSA, T. M., SERRA, C. R., LA RAGIONE, R. M., WOODWARD, M. J., HENRIQUES, A. O Screening for bacillus isolates in the broiler gastrointestinal tract. Appl. Environ. Microbiol. 71: CLAUS, D. & BERKELEY, C.W Genus Bacillus, In: Sneath P. H. A. (ed) Bergey s manual of systematic bacteriology, Vol. 2, Waverly Press, INC., Baltimore M.D. USA. GEDEK, B Darmflora Physiologie und Ökologie. Chemother. J. Suppl. 1: 2 6. CHESSON, A Probiotics and other intestinal mediators. pp In: Cole, D. J. A., Wisiman, J., Varley, M. S. (eds) Principles of Pig Science. Loughbourough, UK, Nottingham University Press. 117

119 SALMINEN, S., OUWEHAND, A., BENNO, Y., LEE, Y Probiotics: how should they be defined? Trends Food Sci. Technol. 10: SANDERS, M Probiotics. Foodtechnology 53: STRAW, B. E., MEUTEN, D. J., THACKER, B. J Clinical examination and diagnostics. pp In: Straw, B. E., D Allaire, S., Mengeling, W., Taylor, D (eds) Diseases of pigs. Vol 1, Hajko & Hajková, Bratislava, 870 pp. TANNOCK, G. W The microecology of lactobacilli inhabiting the gastrointestinal tract. Adv. Microb. Ecol. 11: NECROTICKÁ ENTERITÍDA A UKAZOVATELE OXIDAČNÉHO STRESU U KURČIAT NECROTIC ENTERITIS AND OXIDATIVE STRESS PARAMETERS IN CHICKENS Lovásová, E., Škardová 1, I., Sesztáková 1, E.,Ništiar, F. Ústav patologickej fyziológie, Lekárska fakulta Univerzity P.J.Šafárika, Košice 1 I. Interná klinika, Univerzita veterinárskeho lekárstva, Košice Abstract Necrotic enteritis (NE) is an acute enterotoxaemia with severe mortality and the presence of the intestinal mucosa necrosis, caused by multiplication of C. perfringens and many other environmental factors involved. The work deals with the NE and possible association with oxidative stress parameters (intracellular and extracellular antioxidants and lipid peroxidation). Antioxidant parameters were investigated in twenty broiler chickens with necrotic enteritis. The activity of superoxide dismutase (SOD) significantly elevated (p < 0.01) in the NE group as well as plasma total antioxidant status (TAS, p < 0.005) and plasma thiobarbituric acid reactive substances (TBARS), the parameter of lipid peroxidation (p < 0.05), compared to the control group (C). The activity of erythrocyte glutathione peroxidase showed nonsignificant decrease in chickens with NE. Úvod Nekrotická enteritída bola prvýkrát opísaná v Anglicku roku Ide o akútnu enterotoxémiu vyskytujúcu sa najmä u brojlerových kurčiat a moriek vo veku 2 12 týždňov, ktorá je charakteristická rýchlym nástupom a následnou smrťou v priebehu niekoľkých hodín. K najtypickejším klinickým príznakom patrí apatia, znížený apetít, sťažená pohyblivosť a profúzne hnačky. Stena tenkého čreva je výrazne stenčená, ako dôsledok nekrotických zmien sliznice. Príčinou vzniku nekrotickej enteritídy môže byť trauma (zaklínenie cudzieho telesa, leptavé chemikálie) ale predovšetkým infekcia najmä Clostridium perfringens typ A and C. Rýchla diagnostika a rýchla a správna terapia (tetracyklín, penicilín and bacitracín) môže znížiť straty. V našej práci sme sa zamerali na zistenie súvislostí medzi nekrotickou enteritídou a zmenami ukazovetaľov oxidačného stresu (intracelulárne a extracelulárne antioxidanty a lipidová peroxidácia) u kurčiat. Materiál a metodika Z kŕdľa broilerových kurčiat na hydinovej farme, v ktorom sa prirodzene vyskytla nekrotická enteritída sme vybrali 20 jedincov vo veku 28 dní (skupina NE), ktoré boli následne klinicky vyšetrené a bola im odobratá krv na biochemické vyšetrenie, t.j. na stanovenie parametrov oxidačného stresu. Kontrolnú skupinu (K) tvorilo 10 zdravých kurčiat z toho istého chovu. Krv na biochemické analýzy sme odoberali z vena cutanea ulnaris. Aktivitu seperoxiddismutázy (SOD) v červených krvinkách sme stanovili spektrofotometrickou metódou (Fitzgerald a spol., 1992) s použitím komerčného setu RANSOD Superoxide dismutase 118

120 (Randox Laboratories, Veľká Británia) s použitím modifikácie podľa Šipulovej a Rácza (1997). Aktivitu glutatiónperoxidázy (GPX) v krvi sme stanovili spektrofotometrickou metód (Paglia and Valentine, 1967) setom RANSEL (Randox Laboratories) modifikáciou podľa Fitzgeralda a spol. (1992). Celkovú antioxidačnú kapacitu plazmy (Total antioxidant status TAS) sme stanovili spektrofotometrickou metódou (Miller et al, 1993) s použitím setu Total antioxidant status (Randox Laboratories). Koncentráciu látok reagujúcich s kyselinou tiobarbiturovou (Thiobarbituric acid reactive substances TBARS) ako produktov lipidovej peroxidácie, sme stanovili v plazme spektrofluorometrickou metódpu (Yagi, 1982). SOD, GPX a TAS sme merali na automatickom spektrofotometrickom analyzátore Cobas Mira S (Roche, Switzerland) a koncentráciu TBARS na spektroflurometrickom prístroji Perkin Elmer. Pre štatistické vyhodnotenie výsledkov sme použili nepárový Studentov ttest. Ako signifikantné uvádzame rozdiely, kde p < Výsledky V anamnéze sme zistili náhle zvýšenie morbidity v chove kurčiat na farme. Mortalita dosiahla 18,6 % v chove s celkovým počtom broilerových kurčiat. Klinickým vyšetrením sme zistili výrazné zmeny, náhle vznikajúcu profúznu diarheu, vyúsťujúcu do závažnej dehydratácie. Hematologické vyšetrenia preukázali erytropéniu, leukopéniu, zníženú koncentráciu hemoglobínu a znížený PCV. Leukogram preukázal lymfopéniu, eozinofíliu a monocytózu. Zistili sme zvýšený výskyt C. perfringens, prítomnosť kokcidiózy a Aspergillus fumigatus. Patologickoanatomický nález ukázal zmeny hlavne na sliznici tenkého čreva, kde bola prítomná hyperémia, multifokálne ulcerácie a nekrózy, sliznica bola pokrytá difúzne pevne adherovanými nálepmi fibrínu, v niektorých prípadoch až s odlúpavaním sliznice. Črevo bolo vyplnené zapáchajúcou hnedo sfarbenou tekutinou s veľkým obsahom plynu. Prítomná bola aj hepatomegália. Biochemickým vyšetrením sme zistili u kurčiat s nekrotickou enteritídou signifikantné zvýšenie aktivity SOD v porovnaní s kontrolnou skupinou (K: 845 ± 109 U.g Hb 1 ; NE: 1129 ± 173 U.g Hb 1 ; p < 0.01). Aktivita GPX sa naopak znížila u kurčiat s nekrotickou enteritídou (K: 96.7 ± 9.7 U.g Hb 1 ; NE: 90.7 ± 15.7 U.g Hb 1 ), ale toto zníženie nebolo signifikantné. Zvýšenie hodnoty TAS v skupine kurčiat s nekrotickou enteritídou bolo vysoko signifikantné (K: 1.05 ± 0.28 mmol.l 1 ; NE: 2.43 ± 0.76 mmol.l 1 ; p < 0.005). Koncentrácia TBARS bola tiež signifikantne zvýšená v skupine NE v porovnaní s kontrolnou skupinou (K: 1.32 ± 0.15 µmol.l 1 ; NE: 1.64 ± 0.30 µmol.l 1 ; p < 0.05) (obr.14, K kontrolná skupina, NE skupina s nekrotickou enteritídou). SOD [U.g Hb 1 ] p < K NE Obr. 1. Aktivita superoxiddismutázy v kontrolnej skupine (K) a v skupine s nekrotickou enteritídou (NE) GPX [U.g Hb 1 ] K NE Obr. 2. Aktivita glutatiónperoxidázy v kontrolnej skupine (K) a v skupine s nekrotickou enteritídou (NE) 119

121 TAS [mmol.l 1 ] 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 p < K NE Obr. 3. Hodnota TAS v kontrolnej skupine (K) a v skupine s nekrotickou enteritídou (NE) TBARS [µmol.l 1 ] 2,5 2 1,5 1 0,5 p < K NE Obr. 4. Koncentrácia TBARS v kontrolnej skupine (K) a v skupine s nekrotickou enteritídou (NE) Diskusia V posledných rokoch bola venovaná veľká pozornosť úlohe oxidačného stresu v procese starnutia, ale aj pri rozvoji mnohých ochorení a patologických stavov. Oxidačný stres a s ním súvisiaci proces lipidovej peroxidácie sú dnes považované za súčasť patogenézy mnohých ochorení v humánnej aj veterinárnej medicíne. Úloha oxidačného stresu v patogenéze nekrotickej enteritídy doteraz nebola veľmi skúmaná. Môžeme však predpokladať, že poškodenie sliznice tenkého čreva reaktívnymi formami kyslíka môže byť jedným z predispozičných faktorov rozvoja nekrotickej enteritídy. Nami predkladaná práca ukazuje, že nekrotická enteritída je spojená so zmenami v antioxidačnom statuse organizmu. Zistili sme zmeny v aktivite tak intracelulárnych (najmä SOD, menej GPX) ako aj extracelulárnych (TAS) antioxidantov, ako aj nárast koncentrácie produktov lipidovej peroxidácie (TBARS), ako dôsledku poškodenia lipidov reaktívnymi formami kyslíka. Aktivita enzýmu SOD v červených krvinkách bola signifikantne zvýšená u zvierat s nekrotickou enteritídou, v porovnaní s kontrolnou skupinou. Naopak, aktivita druhého antioxidačného enzýmu (GPX) sa znížila, tento pokles bol ale mierny a nesignifikantný. V literatúre sa uvádza zvýšenie aktivity antioxidačných enzýmov pri nekrotických zmenách v nervovom systéme, zvýšenie aktivity SOD (Fukuhara a spol., 1994; Mattson a spol., 1997) GPX a katalázy (Goss a spol., 1997). Príčina tohto zvýšenia nie je dostatočne objasnená. Jedným z možných mechanizmov je zvýšenie syntézy nového enzýmu stimuláciou transkripcie. Druhým možným mechanizmom je inhibícia degradácie alebo zvýšenie aktivity už existujúceho enzýmu (Sapolsky, 2001). Extracelulárne antioxidanty (vitamín C, vitamín E, albumín, glutatión, kyselina močová, bilirubín, flavonoidy) sú veľmi dôležitou súčasťou siete antioxidantov. V klinickej humánnej aj veterinárnej medicíne sa osvedčili tzv. integrované ukazovatele, ktoré sledujú súhrnný účinok týchto jednotlivých extracelulárnych antioxidantov. Jedným z nich je aj TAS. V našej skupine kurčiat s nekrotickou enteritídou sme zistil vysoko signifikantné zvýšenie TAS. Domnievame sa, že v tomto prípade ale nešlo o stimuláciu aktivity extracelulárnych antioxidantov, ale tento nárast bol spôsobený únikom intracelulárnych antioxidantov z poškodených (nekrotických) buniek do plazmy. Zvýšenie koncentrácie TBARS svedčí o výraznom priebehu lipidovej peroxidácie u kurčiat s nekrotickou enteritídou, ako dôsledku poškodenia membrán reaktívnymi formami kyslíka. Klinickým vyšetrením sme u kurčiat s nekrotickou enteritídou zistili najmä poruchy v príjme a spracovaní potravy, prítomnosť tmavej, vodnatej a krvavej stolice, vysoký nárast morbidity a mortality, ktorý viedol k vysokým ekonomickým stratám v chove. Po nevyhnutnej terapii antibiotikami je vhodné pre obnovu črevnej mikroflóry použiť probiotiká. 120

122 Záver Naša práca ukázala, že sledovanie ukazovateľov oxidačného stresu môže byť prospešné pre skorú a rýchlu detekciu zmien, ktoré hrajú významnú úlohu v rozvoji a progresii nekrotickej enteritídy. Literatúra 1. Fitzgerald S.P., Campbell J.J., Lamont, J.V.: The establishment of reference ranges for selenium. The selenoenzyme glutathione peroxidase and the metaloenzyme superoxide dismutase in blood fractions. 5 th International Symposium on Selenium in Biology and Medicine, Nashville, Tennessee, July 2023, Fukuhara T., Nishio S., Ono Y., Kawauchi M., Yasari S., Omoto T.: Induction of Cu,Znsuperoxide dismutase after cortical contusion injury during hypothermia. Brain Res., 654:333336, Goss J., Taffe K., Kochanek P., De Kosky S.: The antioxidant enzymes glutathione peroxidase and catalase increase following traumatic brain injury in the rat. Exp. Neurol., 146:291294, Mattson M., Goodman Y., Luo H., Fu W., Furukawa K.: Activation of NFkappaB protects hippocampal neurons against oxidative stressinduced apoptosis: evidence for induction of manganese superoxide dismutase and suppression of peroxynitrite production and protein tyrosine nitration. J. Neurosci. Res., 49:681697, Miller N.J., RiceEvans C., Davies M.J., Gopinathan V., Milner A.: A novel method for measuring capacity and its application to monitoring the antioxidant status in premature neonates. Clin. Sci., 76:407412, Paglia D.E., Valentine W.N.: Studies on the quantitative and qualitative characterisation of erythrocyte glutathione peroxidase. J. Lab. Clin. Med., 7:158169, Sapolsky R.M.: Cellular defenses against excitotoxic insults. J. Neurochem., 76: , Šipulová A., Rácz O.: Hodnotenie a modifikácia metódy na stanovenie aktivity superoxiddismutázy súpravou RANSOD. Laboratórna diagnostika, 2:144148, Yagi K.: Assay for serum lipid peroxide level and its clinical significance. In: Yagi K (Ed.): Lipid peroxides in biology and medicine, New York Academic Press, , STRUCTURAR CHANGES OF HAMSTER TESTES AFTER EXPERIMENTAL COBALT ADMINISTRATION Lukac 1*, N., Massanyi 1, P., Zakrewski 2, M., Toman 1, R., Cigankova 3., Stawarz 2, R., Formicki 2, G., Somosy 4, Z., Forgacs 4, Zs. 1 Department of Animal Physiology, Slovak Agricultural, Nitra, Slovak Republic 2 Institute of Biology, Cracow Pedagogical University, Cracow, Poland 3 Depatment of Anatomy, Histology and Physiology, University of Veterinary Medicine, Kosice, Slovak Republic 4 National Institute of Chemical Safety, Budapest, Hungary Abstract The purpose of this study was to assess the effects of cobalt on the testicular structure of adult golden hamsters. Hamsters in group A received cobalt (CoCl 2 ) in single intraperitoneal dose 20 mg/kg, in group B 10 mg/kg and in group C 5 mg CoCl 2 /kg body weight and were killed 48 h after cobalt administration. After a preparation of histological samples the results were compared with control. After a cobalt administration dilatation of blood capillaries in interstitium, undulation of basal membrane and occurrence of empty spaces in seminiferous epithelium was detected. Morphometric analysis showed that in all cobalt threated groups the relative volume of seminiferous epithelium was significantly decreased. In the relative volume 121

123 of interstitium a significant increase was found between control group and experimental groups. After cobalt administration we have found linear non significant decrease. Evaluation of diameter seminiferous tubules found increase of this parameter in the all experimental group in comparison with control. Heigth of seminiferious epitelium was relatively constant and in all groups but the difference between control and group A was significant (p<0.05). Analysis of the lumen diameter of seminiferous tubules detected significantly increase mainly group B. Evaluation of the number of cell nuclei per a constant area detected an increase of this parameter in experimental group. Results of this study report a negative effect of cobalt on structure and function of testes. Key words: Cobalt, Testis, Hamster, Toxic Effects Introduction Cobalt is a natural earth element present in trace amounts in soil, plants and in our diets. It usually occurs in association with other metals such as copper, nickel, manganese and arsenic. Cobalt is an element that occurs naturally in many different chemical forms throughout environment. Small amounts of cobalt are essential for health. [1] Primary histopathologic effects of inhalated cobalt sulphate are limited to the respiratory tract. Lesions in rats and mice include degeneration of the olfactory epithelium, squamous metaplasia of respiratory epithelium, and inflammation in the nose: inflammation, necrosis, squamous metaplasia, ulcers and inflammatory polyps of the larynx in rats; metaplasia of the trachea in mice and fibrosis, histiocytic infiltrates, bronchiolar epithelial regeneration, and [2, 3, 4] epithelial hyperplasia in the alveoli of the lung. Embryotoxicity and teratogenic effect of cobalt were studied. [5, 6]. It was found that cobalt pass the placenta and appears in the fetal blood and amniotic fluid. Cobalt produced dose dependent maternal toxicity and was found to be embryotoxic with increased frequency of fetuses with lower body weight or skeletal retardation and embryolethality. Cobalt also increases the frequency of major anomalies significantly in mice and rats, with anomalies of the eyes, kidneys, skull, spine, and sternum in mice, and anomalies of the urogenital system in rats. In chronic studies, cobalt affects fertility in a time and dose dependent manner. There is a decrease in testicular weight, epididymal sperm concentration, and fertility. Sperm motility is also depressed. [7] The aim of this study was to describe and quantify structural and functional changes in the testis of golden hamsters after an administration of cobalt. Material and methods The experiments were conducted on 21 adult (6 month old) male golden hamsters in an accredited experimental laboratory at Slovak Agricultural University in Nitra. Animals were divided into four groups (A, B, C and K). Hamsters in group A (n=5) received cobalt (CoCl 2, Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) in single intraperitoneal (i.p.) dose (20 mg/kg body weight) diluted in physiological solution, and killed 48 hour after experimental cobalt administration. In group B (n=5) animals received a single i.p. dose 10 mg CoCl 2 /kg body weight; and group C (n=5) received i.p. 5 mg CoCl 2 /kg and were killed 48 h after cobalt administration. The last group was the control (K, n=6) treated only with physiological solution. Samples of testis were fixed in 10% formalin. After fixation the samples were dehydrated in a graded series of ethanol (70, 80, 90 and 100%), saturated in benzene, benzene paraffin and embedded into paraffin. Blocks of samples were sectioned on a microtome into 10 µm thick sections and stained with heamatoxylin and eosin. [8] Qualitative and quantitave parameters were analyzed on microphotographs (Olympus PROVIS AX, Japan) and for quantitative analysis morphometrical image analyser software (Micro Image ver. 4.0) was used according to micromorphological criteria. [9, 10] In testis the relative volume of germinal epithelium, interstitium and lumen as well as the diameter and height of seminiferous tubules, diameter of lumen and the number of nuclei per constant are was determined. 122

124 From final data, basic characteristics were calculated (mean, SD, coefficient of variance, median) and an analysis of variance by Sheffe s test was completed for each variable. Result and discussion Qualitative oservations of testes in control group showed normal structure of germinal epithelium containing all developmental stages of spermatogenesis. The shape of the tubules was oval, without alterations. Interstitium contained collagen fibers and fibrocytes as well as Leydig cells. In groups with experimental cobalt administration dilatation of blood capillaries in interstitium, undulation of basal membrane and occurrece of empty spaces in seminiferous epithelium was detected. Morphometric analysis showed that in all cobalt threated groups the relative volume of seminiferous epithelium was significantly decreased (Table 1). In the relative volume of interstitium a significant increase was found between control group and experimental groups (Figure 1). After cobalt administration we have found linear, but insignificant decrease of the diameter of seminiferous tubules. This parameter was increased mainly in group B ( µm). Table 1. Relative volume (%) of basic structure of testis Group K A B C Germinal epithelium x * SD CV Median Interstitum x * SD CV Median Lumen x SD CV Median x mean SD standard deviation; CV coefficient of variance *p < 0.05 Figure 1. Relative volume of seminiferous tubules Evaluation of diameter seminiferous tubules found increase of this parameter in the all experimental group in comparison with control. Heigth of seminiferious epitelium was relatively constant and in all groups ( µm) but the difference between control and group A was significant (p<0.05). Analysis of the lumen diameter of seminiferous tubules detected significantly increase mainly group B. In all experimental groups tendency of higher 123

125 luminisation of seminiferous tubes is reported (Table 2). Evaluation of the number of cell nuclei per a constant area detected an increase of this parameter in experimental group (Figure 2). Table 2. Micromorphometric parameters of hamster testis K A B C Diameter of seminiferous tubule (µm) x SD CV Median Height of seminiferous epithelium (µm) X * SD CV Median Diameter of lumen (µm) X * SD CV median Number of nuclei per µm 2 X * SD CV median x mean SD standard deviation; CV coefficient of variance *p < 0.05 Figure 2. Morphological characteristics of seminiferous tubules Results of this study report a negative effect of cobalt on structure and function of testes. Qualitative observations found that blood capilares in intersticium were dilated. Undulation of basal membrane and empty spaces in some parts of seminiferous epithelium after cobalt administration were present. Our findings also suggest higher oedemization of intersticium, which is due to dilatation of blood capilares and transmision of blood elements into intersticium. In this study we report structural and functional alterations of testes after an acute cobalt intraperitoneal administration in hamster Syrian. Main findings refer decrease of the relative volume of germinal (seminiferous) epithelium as a dynamic part of testes in which mitotic as well as meiotic cell division occur. In nterstitium dilated blood capilares were observed indicating oedematization. 124

126 Cobalt provokes to cytotoxicity and transfer to the germinal cells in the testis. [11] Chronic exposure of male mice to cobalt chloride dramatically affected their reproductive potential, while acute administration had minimal effects. Acute exposure, followed by evaluation weekly over a 7 week period, revealed no significant changes in epididymal sperm concentration or testicular weight. [7] Effects of chronically administration of cobalt via drinking water to the murine testes were studied. [12] Cobalt caused vacuolation of Sertoli cells and formation of abnormal spermatid nuclei. This was followed by the presence of multinucleated cells and sloughing of cells. Sertoli cells phagocytosed degenerating cells. Continued degeneration resulted in shrinkage of tubules with the accumulation of calcified necrotic debris. Sertoli cells were the last surviving cells. As degenerating tubules shranked, peritubular areas became highly disorganized. Myoid cell shapes became irregular, and basal laminae became highly folded. Endothelial cells of testicular vessels were thickened in areas and contained vesiclelike structures. Leydig cell morphology was normal but interstitial areas appeared hypercellular. The possible interactions of cobalt with iron and zinc, essential metals for spermatogenesis, are discussed. Also some other some bi valent elements (cadmium, lead, nickel ets.) cause very similar alteration as reported in this [13, 14] study. Cobalt also activates mitochondrial lactate synthesis and synthesis of dehydrogenasis in testicular mitochondria. These effects probably evokes fertility defect on mammalian. [15 18] Cobalt in animal reproduction has a major importance. It is oxidative catalyzator and necessary to the vitamin B 12 synthesis. Decrease of cobalt level in the male evokes decreased spermatozoa motility, viability of spermatozoa and drop of sexual activity what is also supported by this study detecting mainly alteration in the active site of testis germinal epithelium. This study was supported by research grants from the Ministry of Education of Slovak Republic VEGA 1/2417/05 and APVV References 1. Kacmar, P.; Pistl, J.; Mikula, I. Immunotoxicology and veterinary medicine. Acta Vet. Brno 1999, 68, Soylak, M.; Colak, H.; Turkoglu, O.; Dogan, M. Trace metal content of snacks and appetizers consumed in Turkey. Bull. Environ. Contam. Toxicol. 2006, 76, Taylor, A.; Branch, S.; Day, M.P.; Patriarca, M.; White, M. Atomic spectrometry update. Clinical and biological materials, foods and beverages. J. Anal. Atom. Spectrometry, 2006, 21, Bucher, J.R.; Elwell, M.R.; Thompson, M.B.; Chou, B.J.; Renne, R.; Ragan, H.A. Inhalation toxicity studies of cobalt sulfate in F344/N rats and B6C3F1 mice. Fund. Appl. Toxicol., 1990, 15, Grasselli, F.; Basini, G.; Bussolati, S.; Bianco, F. Cobalt chloride, a hypoxiamimicking agent, modulates redox status and functional parameters of cultured swine granulosa cells. Reprod. Fertil. Develop., 2005, 17, Szakmary, E.; Ungvary, G.; Hudak, A.; Tatrai, E.; Naray, M.; Morvai, V. Effects of cobalt sulfate on prenatal development of mice, rats, and rabbits, and on early postnatal development of rats. J. Toxicol. Environ. Health, 2001, A62, Pedigo, N.G.; George, W.J.; Anderson, M.B. Effects of acute and chronic exposure to cobalt on male reproduction in mice. Reprod. Toxicol., 1988, 2, Massanyi, P.; Uhrin, V. Histological changes in the uterus of rabbits after an administration of cadmium. J. Environ. Sci. Health, 1997, A32, Weibel, E.R.; Kistler, G.S.; Scherle, W.F. Practical stereological methods for morphometric cytology. J. Cell Biol., 1966, 30,

127 10. Toman, R.; Massanyi, P.; Uhrin, V. Changes in the testis and epididymis of rabbits after an intraperitoneal and peroral administration of cadmium. Trace Elem. Elect., 2002, 19, Edel, J.; Pozzi, G.; Sabbioni, E.; Pietra, R.; Devos, S. Metabolic and toxicological studies on cobalt. Sci. Total Environ., 1994, 150, Anderson, M.B.; Lepak, K.; Farinas, V.; George, W.J. Protection action of zinc against cobalt induced testicular damage in the mouse. Reprod. Toxicol., 1993, 7, Massanyi, P.; Trandzik, J.; Nad, P.; Koranekova, B.; Skalicka, M.; Toman, R.; Lukac, N.; Strapak, P.; Halo, M.; Turcan, J. Concentration of copper, iron, zinc, cadmium, lead and nickel in boar semen and relation to the spermatozoa quality. J. Environ. Sci. Health, 2003, A38, Massanyi, P.; Uhrin, V.; Toman, R.; Pivko, J.; Lukac, N.; Forgacs, Z.; Somosy, Z.; Fabis, M.; Danko, J. Ultrastructural changes of ovaries in rabbits following cadmium administration. Acta Vet. Brno, 2005, 74, Cordier, D.E.; Rowe, L.D.; Clark, D.E.; Hare, M.F. Tolerance and effect of chronic dietary cobalt on sheep. Vet. Hum. Toxicol., 1986, 28, Pedigo, N.G.; Vernon, M.W. Embryonic losses after 10week administration of cobalt to male mice. Reprod. Toxicol., 1993, 7, Monsees, T.K.; Winterstein, U.; Hayatpour, J.; Schill, W.B.; Miska, W. Effect of heavy metals on the secretory function of testicular cells in culture. J. Trace Microprobe Tech., 1998, 16, Kozarova, I.; Mate, D.; Cabadaj, R. Veterinary drug residues and the safety of foods of animal origin. Folia Veterinaria, 2001, 45, REPRODUKČNÉ PARAMETRE POČAS MULTIGENERAČNEJ INTOXIKÁCII ŤAŽKÝMI KOVMI U POTKANOV REPRODUCTION PARAMETERS DURING MULTIGENERATION INTOXICATION WITH HEAVY METALS IN RATS Lukačínová 1, A., Beňačka 2, R., Lovásová 2, E., Hijová 3, E., Ništiar 2, F. 1 Ústav fyziológie, 2 Ústav patologickej fyziológie, 4 Ústav experimentálnej medicíny, Lekárska fakulta, UPJŠ Košice Abstract The aim of the present investigation was to evaluate the effects of multigeneration (P, F1 and F2) intoxication with low doses of lead, mercury and cadmium dissolved in drinking water (200times above maximal permissible dosage) on reproductive potency of 80 Wistar rats (40 males; 40 females in all generations) and the physical health of their progeny. The animals were divided into 4 groups control (C) and 3 groups intoxicated by metals (Pb, 100 µmol/l; Hg, 1 µmol/l, Cd, 20 µmol/l, respectively). Females gave births from 13 th to 78 th week of experiment. Parameters of reprotoxicity such as number of litters, total number of newborns (assigned in the birth day), number of newborns per litter and number of weanlings (raised youngs that reached 28th day of life) were measured in 13week intervals. Our data show decrease in all reproduction parameters in intoxicated animals of F1 and F2 generations. Úvod Kontaminácia životného prostredia, vrátane zdrojov pitnej vody je stále aktuálnejší problém. Vplyv ťažkých kovov na rôzne fyziologické a biochemické parametre bol v odbornej literatúre v celku podrobne analyzovaný pre akútne intoxikácie. Pomerne málo údajov je už k dispozícii pre chronické, najmä celoživotné podmienky (Sutou a spol., 1980; Paksy a spol., 1996). Čo sa týka chronickej expozície veľmi nízkymi dávkami ťažkých kovov a multigeneračných štúdií 126

128 intoxikácie rôznymi kovmi nie sú v literatúre zmienky (Lukačínová a spol., 2007). Problémom je kontaminácia veľmi nízkymi dávkami. Práve chronická expozícia takýmito nízkymi dávkami môže mať ťažko predvídateľné následky nielen pre tie generácie, ktoré sú priamo exponované, ale najmä pre budúce. To nás motivovalo k multigeneračnej štúdií chronickej intoxikácie subtoxickými dávkami ťažkých kovov. Hlavným cieľom štúdia bolo sledovanie vybraných fyziologických, reprodukčných a biochemických parametrov vo vzťahu ku chronickej (celoživotnej) expozícii potkanov kmeňa Wistar veľmi nízkymi dávkami vybraných ťažkých kovov (olovo, kadmium a ortuť), a to v troch nasledovných generáciách. V tejto práci diskutujeme vplyv na dĺžku života a na vybrané reprodukčné parametre dĺžku života a prežívanie. Materiál a metodika Zvieratá: Do pokusu sme zaradili 240 potkanov kmeňa Wistar (40 samičiek a 40 samcov, vo veku 4 týždňov, priemernej hmotnosti 120±19 g; v parentálnej, F1 /1.filiálna/ a F2 /2.fliálna/ generácii) a narodené mláďatá do veku 28. dní (po 28. dni boli preradené do iného pokusu, napr. ako reprezentanti F1, resp. F2 generácie). Potkany boli držané v klietkach 1 samec a 1 samička s voľným prístupom k vode a potrave. Svetelný režim bol 12 hodín svetlo 12 hodín tma. Pokus bol ukončený na 156. týždeň trvania v každej sledovanej generácii. Experimenty boli vykonané na pracovisku Centrálny zvieratník LF UPJŠ, ktoré má akreditáciu na chov laboratórnych zvierat a na vykonávanie pokusov na zvieratách v súlade s príslušnými legislatívnymi ustanoveniami. Pokusy boli schválené Etickou komisiou LF UPJŠ ako aj ŠVPS SR. Usporiadanie pokusu: Zvieratá boli náhodne zaradené do 4 skupín (10 samíc a 10 samcov, 1 párik v každej klietke). Prvá skupina (kontrola; n=10) prijímala čistú vodu. Druhá skupina (Pb; n=10) vodu s obsahom octanu olovnatého zásaditého v koncentrácii 100 µmol/l (t.j. 20,0 mg olova/l pitnej vody, čo zodpovedalo 200 násobku MPK (maximálne prípustnej koncentrácii) vo vode. Tretia skupina (Cd; n=10) vodu s obsahom chloridu kademnatého dvojvodého v koncentrácii 20 µmol/l (t.j. 2,0 mg kadmia/l pitnej vody, zodpovedajúcemu 200 násobku MPK vo vode. Štvrtá skupina (Hg; n=10) vodu s obsahom chloridu ortutnatého v koncentrácii 1 µmol/l (t.j. 0,2 mg ortuti/l pitnej vody, zodpovedajúcej 200 násobku MPK vo vode. Toto usporiadanie platilo aj pre F1 a F2 generáciu. U všetkých skupín sme sledovali a vyhodnocovali každý týždeň nasledovné reprodukčné parametre: počet vrhov, počet vrhnutých mláďat (stanovené v deň narodenia), počet odchovaných mláďat (počet mláďat 28. deň po narodení) a ich dynamiky. Štatistické metódy: Vyhodnotenie výsledkov, výpočty a štatistické spracovanie boli vykonané s použitím Microsoft Excel a štatistické výpočty (priemerné hodnoty, smerodajné odchýlky, párový a nepárový ttest doplnený Utestom WilcoxMannWhitney) boli počítané v programe Statgraphic. Na vyhodnotenie štatistickej významnosti zistených hodnôt bola použitá jednocestná ANOVA s NewmanKeulsovým posthoc testom. Výsledky a diskusia Porovnanie priemernej dĺžky života v 156. týždni pokusu u sledovaných generácii prezentujeme v Tab. 1. Tab. 1 Priemerná dĺžka života v 156. týždni pokusu Skupina P F1 F2 C 1119± ± ±74 Pb 950± ± ±361 Cd 1073± ± ±84 Hg 823± ± ±270 Na základe zistených výsledkov v kontrolnej skupine sa zdá, že v dĺžke života medzi generáciami nie je rozdiel. Z intoxikovaných skupín nebol rozdiel oproti kontrolnej skupine 127

129 v žiadnej generácii pri kadmiu. Mierny v parentálnej a významný v F1 a F2 generáciách bol aj pri intoxikácii olovom aj ortuťou. Najvýraznejšie sa pokles dĺžky života prejavoval v F2 generácii v skupine intoxikovanej olovom a ortuťou. Prežívanie zvierat uvádzame v grafe 1. K významnému poklesu prežívania v závislosti na generácii došlo len v skupine intoxikovanej kadmiom P F1 F2 0 C Pb Cd Hg obr. 1 Prežívanie zvierat v % Z grafu vyplýva klesajúci trend prežívania v generáciách intoxikovaných olovom, a akási adaptácia sa kadmium, kde prežívanie v generáciách stúpa. Obdobie vrhu mláďat trvalo od 13. do 78. týždňa pokusu u všetkých skupín sledovaných generácii. Ale po 50. týždni v skupinách intoxikovaných olovom a ortuťou už boli len ojedinelé vrhy v F2 generácii. Počet vrhov, vrhnutých mláďat a počtu odstavených mláďat prezentujeme v Tab. 2. Tab. 2 Počet vrhov/počet narodených mláďat/počet odstavčiat Skup. P F1 F2 C 98/754/686 99/766/698 96/ Pb 106/853/599 82/725/530 40/357/272 Cd 90/706/606 95/752/677 97/755/695 Hg 128/1015/ /772/471 54/321/205 Mierne nižší počet vrhov bol zaznamenaný v skupine exponovanej kadmiom u parentálnej generácii. V F1 a F2 generácii sa počet vrhov v tejto skupine dostal na úroveň vrhov v kontrolnej skupine. V F1 a F2 generácii bol zaznamenaný pokles počtu vrhov, čo je logický dôsledok parametrov prežívania zvierat. Počet mláďat na vrh sa generáciami nemenil u skupiny kontrolnej a intoxikovanej kadmiom. V skupine intoxikovanej olovom významne stúpol v F1 a F2 generácii (p <0,05). V skupine intoxikovanej ortuťou došlo k významnému poklesu počtu mláďat na vrh v F2 generácii (p <0,001). Zaujímavý je trend vzostupu počtu odstavených mláďat v F1 a F2 generáciách u všetkých intoxikovaných skupín. Tieto údaje jasne nasvedčujú tomu, že zvieratá intoxikované subtoxickými dávkami toxických kovov sa snažia naštartovať adaptačné mechanizmy, ktoré potvrdzuje trend zvyšovania počtu odstavených mláďat (zvýšená starostlivosť o mláďa v ohrozenej populácii?). Podobne, takým mechanizmom môže byť aj zvýšený počet mláďat na vrh (v prípade olova). Podobne zvýšený počet vrhnutých mláďat ale za vysokého úhynu počas prvých dvoch týždňov zistili aj iní autori pri štúdiu s chronickou expozíciou, ale pri podstatne vyšších dávkach ťažkého kovu (Sutou a spol., 1980; Paksy a spol., 1996). To sa ale nepotvrdilo pri ortuti. Gonády sú považované za dôležitý terč toxických látok z prostredia (Sokol, 1997). Aj keď väčšina prác prezentuje negatívny účinok je potrebné si uvedomiť, že intoxikácia bola realizovaná s podstatne vyššími dávkami, ako v našich podmienkach. Predpokladáme, že nami použité nízke koncentrácie ťažkých kovov aktivujú biologické mechanizmy smerujúce k zachovaniu druhu (vrátane aktivácie reprodukčných funkcií), a negatívne pôsobenie nastupuje až po prekročení určitého príjmu toxickej noxy. 128

130 Záver Na základe získaných poznatkov tak fyziologických, ale najmä ukazovateľov reprotoxicity je možné konštatovať, že získané výsledky sú prekvapivé. Významne lepšie reprodukčné parametre zistené v F1 a najmä v F2 skupinách exponovaných ťažkými kovmi sú v protiklade s takými ukazovateľmi, ako sú priemerná dĺžka života a percento prežívajúcich zvierat. To poukazuje na to, že v prvej etape (najmä obdobie reprodukčného zenitu) prevládajú adaptačné mechanizmy (záchova druhu) a v neskoršom období života, zhruba po 54. týždni začínajú prevládať toxické prejavy, vedúce k zníženej životaschopnosti jedinca. Aby bolo možné nami získané výsledky ďalej kriticky prehodnotiť a interpretovať bude potrebné v ďalšom štúdiu pokračovať a doplniť sortiment sledovaných parametrov o biochemické, imunologické a genetické ukazovatele, najmä na potvrdenie a presného mechanizmu a úlohy reaktívnych foriem kyslíka a metalotioneínu pri chronickej intoxikácii ťažkými kovmi (Sato a Kondoh, 2002), vplyv na vrodenú ako aj adaptívnu zložku imunitných mechanizmov (imunokompetenciu), aké ochranné mechanizmy sú aktivované v záujme vysporiadania sa so zvýšeným pozadím subtoxických koncentrácii ťažkých kovov v prostredí (Singh a spol., 2003; Biser a spol., 2004). Mimoriadne zaujímavou otázkou s perspektívou je aj štúdium mechanizmov karcinogenézy pri dlhotrvajúcom príjme nízkych (netoxických) dávok ťažkých kovov (Waalkes, 2003; Waisberg a spol., 2003). Časť práce bola riešená v rámci úlohy Vedeckej grantovej agentúry MŠ SR VEGA 1/8235/01 a časť VEGA 1/3494/06. Literatúra: 1. Biser, J.A. Vogel, L.A. Berger, J. Hjelle, B. Loew, S.S.: Effects of heavy metals on immunocompetence of whitefooted mice (Peromyscus leucopus). J. Wildlife Dis., 40, 2004: Lukačínová, A. Beňačka, R. Lovásová, E. Hijová, E. Ništiar, F.: Reproduction parameters in chronic intoxication with heavy metals in rats. In: Industrial Toxicology 07, Bratislava, 2007: Paksy, K. Varga, B. Lazar, P.: Effect of cadmium on female fertility, pregnancy and postnatal development in the rat. Acta Physiol.Hung., 84, 1996: Sato, M. Kondoh, M.: Recent studies on metallothionein: protection against toxicity of heavy metals and oxygen free radicals. Tohoku J. Exp. Med., 196, 2002: Singh, V.K. Mishra, K.P. Rani, R. Yadav, V.S. Awasthi, S.K. Garg, S.K.: Immunomodulation by lead. Immunol.Res., 28, 2003: Sokol, R.Z.: The hypothalamicpituitarygonadal axis as a target for toxicants. In: Sipes, I.C. McQueen, C.A. Gandolfi, A.J. (Eds.): Comprehensive Toxicology. Vol. 10. Elsevier Science, Oxford, 1997: Sotou, S. Yamamoto, K. Sendota, H. Sugiyama, M.: Toxicity, fertility, teratogenicity, and dominant lethal tests in rats administered cadmium subchronically. II. Fertility, teratogenicity, and dominant lethal tests. Ecotoxicol.Environ.Saf., 4, 1980: Waalkes, M.P.: Cadmium carcinogenesis. Mutat.Res., 533, 2003: Waisberg, M. Joseph, P. Hale, B. Beyersmann, D.: Molecular and cellular mechanisms of cadmium carcinogenesis. Toxicology, 192, 2003: Kontaktná adresa: Prof. MVDr. František Ništiar, CSc., Phone: Department of Pathological Physiology Fax: Faculty of Medicine, Šafárik University [email protected] Trieda SNP 1, Košice, Slovak republic 129

131 VISCOELASTIC PROPERTIES OF PROCESSED CHEESE AS A FUNCTION OF PECTIN CONCENTRATION Macků, I., Buňka, F., Pavlínek, V., Kráčmar, S., Hrabě, J. Tomas Bata University in Zlín, Zlín Abstract In this paper the effect of pectin concentration (0.2, 0.4, 0.6 and 0.8% w/w) on viscoelastic properties of model processed cheeses with 40% w/w dry matter and 50% w/w fat in dry matter after 42 days of storage at temperature 6±2 C has been studied. The samples were analysed by dynamic oscillation rheometry with plateplate geometry. Complex modulus (G*) and loss tangent (tan δ) were calculated for reference frequency 1 Hz. The present work found that with the increasing concentration of pectin the complex modulus (G*) rose and loss tangent (tan δ) decreased. In general, all samples with pectin were firmer than processed cheeses without it and, furthermore, created gels were more elastic. Introduction Pectin is a polysaccharide extracted from plant cell walls and has been widely used in food industry as stabilizing or thickening/gelling agent whose role is to enhance viscosity, form gels and bind water (Lootens et al. 2003, Syrbe et al. 1998). The backbone of pectin is created by α Dgalacturonic acid residues and is interrupted by 1,2linked rhamnose residues (Fu and Rao 1999). According to the percentage of the carboxyl group on αdgalacturonic acid esterified with methanol, socalled degree of esterification (DE), pectin can be divided into highmethoxyl (HMP; DE > 50 %) and lowmethoxyl pectin (LMP; DE < 50 %). This parameter strongly influenced the mechanism of gel formation and its rheological properties. LMPs create gels in the presence of calcium and in the wide range of ph (practically ) through calcium bridges between two different pectin chains. On the other hand, stable HMP gels are formed at ph 3.5 and in the presence of high sugar content (>55%) via hydrophobic interactions and hydrogen bonds between methyl groups of different pectin chains (Löfgren and Hermansson 2007, Tsoga et al. 2004, Norziah et al. 2001, May 2000). Processed cheese is a dairy product obtained by mixing shredded natural cheeses with emulsifying agents and other ingredients (e.g. water, butter, rework, flavours, colours, salt, preservatives, hydrocolloids) under a partial vacuum, heat and constant agitation (Guinee et al. 2004). The consistency of processed cheese can be influenced by a number of factors, e.g. dry matter content, fat content, maturity of raw material, ph, presence and concentration of ions (Ca 2+, Na +, K + ) etc. Also, hydrocolloids (including pectin) are often used in processed cheese manufacture and by their interactions with proteins significantly affect structure, texture and stability of final products (Guinee et al. 2004, Lee et al. 2004, Marchesseau et al. 1997). The major proteins occurring in bovine milk are α S1, α S2, β and κcasein (Dickinson 2006, Lucey 2002, Schorsch et al. 1999). These phosphoproteins exist in milk in the form of spherical casein micelles, but they are disrupted during cheese manufacture (Dickinson, 2006). Casein micelles and pectin interactions have been widely studied by a number of authors (Tuinier et al. 2002, Syrbe et al. 1998, Maroziene and de Kruif 2000). However, none of these studies is concentrated on interactions between pectin and particular casein fractions and their influence on consistency of processed cheese. The aim of the present study was to investigate the viscoelastic properties of model processed cheese depending on the addition of different amount of nonesterified pectin. Materials and methods Processed cheese was prepared using a 2L capacity Vorwerk Thermomix TM 31 blender cooker (Vorwerk & Co. Thermomix; GmbH, Wuppertal, Germany). The following ingredients 130

132 were mixed shredded natural cheese Eidam (eightweekold), deionised water, butter, emulsifying agents (Na + salts of phosphates and polyphosphates; JOHA, BenckiserKnapsack, Ladenburg, Germany) and nonesterified pectin (Sigma Aldrich, Inc., St. Louis, USA; >90% w/w dry matter and >74% w/w of galacturonic acid). The target pectin concentrations in model processed cheese were 0.2, 0.4, 0.6 and 0.8% w/w. This blend was subjected to heat treatment up to 93 C at constant agitation. Samples were stored for 42 days in refrigerator at 6±2 o C. Three groups of model processed cheese (I, II, III), manufactured using the same technology and formulation, were prepared separately on different days. There were 5 batches of processed cheese in each group: processed cheeses with pectin addition (0.2, 0.4, 0.6, 0.8% w/w) and control sample without pectin. Every sample was characterized by dry matter content (according to ISO 5534:2004) and ph (by phmeter with glass electrode). Rheological measurements were made by dynamic oscillation rheometry using a controlled stress Bohlin rheometer (Bohlin GEMINI, Malvern Instruments Ltd., UK) with plateplate geometry (40 mm diameter). The temperature of all measured samples was 20 C. Cheese samples were put between the fixed plate and the exposed edge were coated with low viscosity silicone oil to avoid evaporation. Measurements of the loss (G ) and storage (G ) moduli were performed in the linear viscoelastic region and in frequency sweep mode at the frequency range Hz. Further, loss tangent (tan δ = G /G ) and the complex modulus [G* = G + ig, where i = ( 1) 0,5 ] were calculated for reference frequency 1 Hz. All obtained results were statistically evaluated by means of nonparametric analysis of variance KruskalWallis test (Agresti 1984). The significance was shown when differences among comparisons achieved P < Results Results obtained by basic chemical analysis showed insignificant differences (P 0.05) in ph and the dry matter content among samples within the group. The dry matter content in Group I ranged from to 42.90% w/w, in Group II from to 43.72% w/w and in Group III from to 42.95% w/w. Measured values of ph in tested groups were as follows: (Group I), (Group II) and (Group III). The values of complex modulus (G*) for all three groups were calculated for reference frequency 1 Hz and are graphically presented in Figure 1. This figure shows that the rising pectin concentration caused significant growth in the complex modulus (G*) of model processed cheese compared to control samples; this increase was observed in all three groups of model processed cheese (P < 0.05). Figure 1: The complex modulus G* (Pa.s) at reference frequency 1 Hz as a function of growing pectin concentration for three groups (I, II, III) of model processed cheese 131

133 Furthermore, the values of loss tangent (tan δ) were computed for reference frequency 1 Hz. Table 1 reflects that the rising pectin concentration caused the decline in loss tangent of most tested samples. The only exception was the sample containing 0.6% w/w pectin in Group II whose value of complex modulus was lower than the specimen with 0.8% w/w pectin in the same group. Table 1: The values of loss tangent (tan δ) for reference frequency 1 Hz in model processed cheese depending on different pectin concentration Pectin concentration (% w/w) Values of tan δ Group I Group II Group III none Discussion The aim of this paper was to study the viscoelastic properties of model processed cheese with 40 % w/w dry matter and 50 % w/w fat in dry matter as a function of nonesterified pectin concentration. The consistency of processed cheese is substantially influenced by the dry matter content and ph of system (Guinee et al. 2004, Lee et al. 2004, Marchesseau et al. 1997). The practically similar values of these two chemical parameters allowed us to eliminate their influence on the product consistency. Hence, the analyzing of the influence of different pectin concentration on viscoelastic properties of model processed cheese in three different groups of model processed cheese is possible. Results obtained by rheological measurement indicated that the nature of gel is changed due to increasing amount of pectin; the higher pectin concentration, the higher rigidity of gel. Similar behaviour, i.e. growth of gel rigidity due to the increasing pectin amount, was also observed by ElNawawi and Heikal (1995). They found in their study that the gel strength increased with the rising pectin concentration. According to these results, it can be concluded that all used pectin concentrations caused significant increase in firmness of model processed cheese. Moreover, the decrease of loss tangent (tan δ) indicated that the rise in gel rigidity was caused by the increase of gel elasticity. These results show that the nature of gel is changed to more elastic material due to increasing amount of pectin. Conclusion The effect of pectin concentration on viscoelastic properties of model processed cheese with 40% w/w dry matter and 50% w/w fat in dry matter was investigated. All used pectin concentrations (0.2, 0.4, 0.6 and 0.8% w/w) caused significant increase in firmness of products compared to control samples in all tested groups. The effect of pectin on the viscoelastic properties of model processed cheese depended on used polysaccharide amount. It can be concluded that the rigidity of products increased with the growing pectin concentration. Hence, unsuitable texture of processed cheese can be improved by pectin addition under certain conditions. This work was kindly supported by a project of Czech Ministry of Education, Youth and Sports (Grant No. MSM ). 132

134 References AGRESTI, A.: Analysis of ordinal categorical data. USA: John Wiley & Sons, Inc., DICKINSON, E.: Structure formation in caseinbased gels, foams, and emulsions. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects, 288 (13), 2006, pp ELNAWAWI, S.A. HEIKAL, Y.A.: Factors affecting the production of lowester pectin gels. Carbohydrate Polymers, 26 (3), 1995, pp FU, J.T. RAO, M.A.: Rheology and structure development during gelation of lowmethoxyl pectin gels: the effect of sucrose. Food Hydrocolloids, 15 (1), 2001, pp GUINEE, T.P. CARIĆ, M. KALÁB, M.: Pasteurized processed cheese and substitute/imitation cheese products. In: Cheese: Chemistry, physics and microbiology. Volume 2: Major cheese groups, London and New York: Elsevier Applied Science. 2004, pp ISO Standard No. 5534:2004.: Cheese and processed cheese Determination of the total solids content (Reference method). Geneva: International Organization for Standardization. LEE, S.K. ANEMA, S. KLOSTERMEYER, H.: The influence of moisture content on the rheological properties of processed cheese spreads. International Journal of Food Science and Technology, 39 (7), 2004, pp LÖFGREN, C. HERMANSSON, A.M.: Synergistic rheological behaviour of mixed HM/LM pectin gels. Food Hydrocolloids, 21 (3), 2007, pp LOOTENS, D. CAPEL, F. DURAND, D. NICOLAI, T. BOULENGUER, P. LANGENDORFF, V.: Influence of ph, Ca concentration, temperature and amidation on the gelation of low methoxyl pectin. Food Hydrocolloids, 17 (3), 2003, pp LUCEY, J.A.: Formation and physical properties of milk protein gels. Journal of Dairy Science, 85 (2), 2002, pp MARCHESSEAU, S. GASTALDI, E. LAGAUDE, A. CUQ, J.L.: Influence of ph on protein interactions and microstructure of process cheese. Journal of Dairy Science, 80 (8), 1997, pp MAROZIENE, A. de KRUIF, C.G.: Interaction of pectin and casein micelles. Food Hydrocolloids, 14 (4), 2000, pp MAY, C.D. Pectins.: In Handbook of hydrocolloids. Eds. PHILLIPS, G.O., WILLIAMS, P.A. Cambridge and Boca Raton, 2000, pp NORZIAH, M.H. KONG, S.S. KARIM, A.A. SEOW, C.C.: PectinsucroseCa 2+ interactions: effects on rheological properties. Food Hydrocolloids, 15 (46), 2001, PEREYRA, R. SCHMIDT, K.A. WICKER, L.: Interaction and stabilization of acidified casein dispersions with low and high methoxyl pectins. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 45 (9), 1997, pp SCHORSCH, C. JONES, M.G. NORTON, I.T.: Thermodynamic incompatibility and microstructure of milk protein/locust bean gum/sucrose systems. Food Hydrocolloids, 13 (2), 1999, pp SYRBE, A. BAUER, W.J. KLOSTERMEYER, H.: Polymer science concepts in dairy systems an overview of milk protein and food hydrocolloid interaction. International Dairy Journal, 8 (3), 1998, pp TSOGA, A. RICHARDSON, R.K. MORRIS, E.R.: Role of cosolutes in gelation of highmethoxy pectin. Part 1. Comparison of sugars and polyols. Food Hydrocolloids, 18 (6), 2004, pp TUINIER, R. ROLIN, C. de KRUIF, C.G.: Electrosorption of pectin onto casein micelles. Biomacromolecules, 3 (3), 2002, pp Corresponding address: Macků Ivana, Ing. Ústav potravinářského inženýrství, Fakulta technologická, Univerzita Tomáše Bati ve Zlíně, nám. T.G.Masaryka 275, Zlín, [email protected] 133

135 ŠTÚDIA VÝSKYTU POTRAVINOVÝCH ALERGIÍ V REGIÓNE HORNEJ NITRY STUDY AND OCCURENCE OF FOOD ALLERGY IN REGION HORNA NITRA Marcinková, M. Katedra fyziológie živočíchov, Slovenská poľnohospodárska univerzita, Nitra Abstract Nemeth (2004), define food allergy like negative reactions of organism immunizied system to specific nutritive otor its element. When body immunizied system identificate allergen in food, it starts to produce antibody to divertion the invasion. From the questionnaires, filled by respondents from region Horna Nitra (435 year), we followed food allergy epidemiologie, clinic manifestations, food allergen, possibility of allergy combination and heredity of allergy. Following the we found evaluate im questionnaire out 282 potencionaly sensitive respondents, and 124 of them noticed specific food allergy. Just 30,65 % of them was theratea by allergy doctor. The highest occurence of food allergy was in class of age junior scholl class (12,8 %) and adolescent (21,6 %). The most fregment occurence of food allergens was: lemon, orange, milk and milk products, fruits and vegetables, flavouring and seafood. Notable diferences were determinated on lemon fruits, in men (3,2 %) and in women (34,4 %). Clinical manifestations ater food consumation were: urticale, atopic dermatitis (42 %), colic abdomen thores (27,4%), GIT manifestations like: vomiting, diarrhoea (18,5 %). Accesion of clinical manifestations after consuming of food allergen and subsequently manual labour indicated 17,7 % respondents. Key word: allergen, food allergy, immunized reactions, atopic, hypersenzitiv reactions, GIT, urticaria, Úvod Pretože nárast ochorení, na ktorých patogenéze sa zúčastňujú alergické mechanizmy, zasahuje nielen do kvality života postihnutých ale predstavuje zároveň významnú záťaž pre zdravotníctvo mnohí kladú alergické ochorenia do jednej roviny s civilizačnými ochoreniami. Tak ako pri iných civilizačných ochoreniach možno aj prudký vzostup alergických ochorení dať do súvisu s interakciou medzi genetickými vlastnosťami a rôznymi enviromentálnymi faktormi. Výskyt alergických ochorení je v posledných desaťročiach na vzostupe, závratným tempom sa zvyšuje výskyt átopických ochorení všeobecne a s ním súvisiace aj alimentárne alergie. Alergia na potraviny nie je zriedkavá, naopak, v obyvateľstve značne rozšírená. Význam ochorení, na ktorých patogenéze sa zúčastňujú alergické mechanizmy je daný aj socioekonomickou záťažou spoločnosti. Výrazne zasahujú do kvality života postihnutých a tiež významne zaťažujú zdravotníctvo. Poznatky v oblasti molekulovej biológie a genetiky sa rozvíjajú doslova explozívne a zasahujú aj do diagnostického a liečebného pohľadu na nové ochorenia z civilizácie. Patria medzi ne aj alergické ochorenia, ako stále častejšie sa vyskytujúce civilizačné ochorenia. Materiál a metodika Pre štúdium výskytu alimentárnej alergie, jej klinických príznakov, alimentárnych alergénov, ktoré spôsobujú nepriaznivé reakcie, väzbovosti na iné alergie v súvislosti s možnými kombinovanými alergiami a sledovanie výskytu dedičnosti alergií v okolí Hornej Nitry sme použili dotazník. Cieľovou skupinou boli respondenti vo veku od 4 do 35 rokov. Oslovených bolo celkovo 800 respondentov. Vzorka detí a mladých dospelých pozostávala zo žiakov materských, základných a stredných škôl. Vzorka dospelých z pacientov obvodného lekára, ktorým bol rozdaný dotazník. Z celkového počtu dotazníkov sa vrátilo 566, z dôvodu neúplného vyplnenia a uvedenia neobjektívnych odpovedí sme pri spracovaní celkového vráteného počtu použili 523 dotazníkov. 134

136 Dotazník so zameraním na potravinové alergie, resp. nepriaznivé reakcie na potraviny bol zostavený z 24 otázok, tak aby respondent laik mohol odpovedať na nami položené otázky, odpoveďou áno nie, označením jednej, nami uvedenej možnosti, alebo napísaním vlastnej alternatívy. Sledovali sme epidemiológiu alimentárnej alergie, jej klinické prejavy a najčastejšie potravinové alergény spôsobujúce alergie, väzbu na iné alergie v súvislosti s možnosťou kombinovaných alergií a dedičnosť alergií u najbližších pokrvných rodinných príslušníkov. Výsledky V skupine 33 detí predškolského veku sa alergia zistila u 6,4 % respondentov, z toho u 2,8 % sa vyskytuje potravinová alergia. Z celkového počtu 253 detí mladšieho školského veku predstavoval výskyt alergických ochorení 38,7 % a u 12,8 % sa vyskytla aj potravinová alergia. V skupine 196 respondentov staršieho školského veku bolo alergických 45,4 % a potravinovú alergiu uviedlo 21,6%. Z 22 respondentov vekovej kategórie mladších dospelých predstavovalo 5,3% alegických a 3,9% s potravinovou alergiou. Vo vekovej kategórii starších dospelých sme zistili 4,3% alegických a 2,8 % respondentov s potravinovou alegiou (viď. Graf 1 a 2). Sledovaním výskytu iných alergií u respondentov s potravinovými alergiami sme zistili, že výskyt iných alergií udávalo 54,8 %, najčstejšie uvádzané alergie boli alergie na peľ (26,6 %), alergiu na kombináciu viacerých alergénov uviedlo 12,9 % respondentov. V súvislosti s možnou skríženou reakciou alergénov a sledovaním vzostupu alergických problémov vo väzbe na ročné obdobie sme dospeli k nasledovným výsledkom: vzostup alergických problémov na jar uviedlo 20,17%, v lete 17,4 % respondentov. V tejto súvislosti môžeme na základe našich výsledkov výskytu peľových alergií a väzby vzostupu alergických problémov na ročné obdobie potvrdiť možnosť skríženej reakcie medzi alimentárnymi a peľovými alergénmi. Riziko skríženej reakcie medzi alergénmi sme zistili u 19 % respondentov (viď. Graf 3). Sledovanie výskytu najčastejších alimentárnych alergénov: najčastejšími alergénmi boli: citrusové ovocie, mlieko a jeho výrobky, ovocie a zelenina, koreniny, orechy. U mužov: mlieko 25.8%, orechy a morské ryby, zelenina, koreniny, vajcia u 6,5%. U žien: mlieko 21,5%, ovocie a zelenina u 20,4%, citrusové ovocie u 34,4% a orechy. Značné rozdiely boli zistené u mužov a žien pri citrusovom ovocí a ovocí (muži 3,2% a ženy až 34,4%), pri ostatných alimentárnych alergénoch sme také markantné rozdiely nezaznamenali. Alergia na potraviny nie je zriedkavá, naopak, podľa mnohých výskumov a výsledkov ktoré sme získali, v obyvateľstve značne rozšírená. Pritom do starostlivosti lekárov a do evidencie zdravotníkov sa dostáva iba časť pacientov. Z toho dôvodu nás zaujímalo, či je daný respondent liečený u alergológa. Zo 124 alergických respondentov uvádzajúcich alergiu na potraviny sa u alergológa lieči len 30,65 %. Najčastejšie klinické prejavy alimentárnej alergie: Kolikovité bolesti brucha. 27,4% Hyperkinetický syndróm (migrény, závrate) 8,9% Zvracanie, hnačka 18,5% Orálny alergický syndróm 15,3% Quinckeho angioedém 16,1% Prieduškové prejavy 12,1% Kožné prejavy 42% Zápcha 7,2% Diskusia KULLIG, et. al. (1999) uvádza, že alergické ochorenia postihujú predovšetkým deti a mladých ľudí. V jednej zo štúdií sa zistila senzibilácia aspoň jedným alergénom z deviatich testovaných alergénov v 1. roku života v 11% prípadov, ale v 6. roku už v 30%. V súčasnosti sa nepochybuje o vzostupe alergických ochorení, v posledných desaťročiach sa odhaduje, že prevalencia alergických ochorení stúpa celosvetovo približne o 5 6 % (HRUBIŠKO, et. al., 2003). Významné rozdiely medzi pohlaviami vo výskyte alergických 135

137 ochorení sme zistili vo veku od 15 do 20 rokov ( viac ako dvojnásobné). TOREN a HERMANSSON (1999) popisujú tiež významné rozdiely medzi pohlaviami. Predpokladá sa, že príčinou rozdielov medzi pohlaviami sú hormonálne zmeny, ktoré ovplyvňujú patogenetické mechanizmy alergickej astmy. Pri atoickej dematitíde prevažujú tiež dievčatá nad chlapcami (MANNING, et. al., 1997 a ROBERTSON, et. al., 1998).Zistili sme výskyt atopickej dermatitídy u 25,8% mužov a 47,3% žien. Možno teda konštatovať, že toto tvrdenie je totožné s našimi výsledkami. Pri potravinovej alergii situácia nie je tak presne zmapovaná ako v prípade astmy a ekzému. Metaanalýzou štúdií realizovaných v USA a v krajinách EÚ možno dospieť k záveru, že potravinovou alergiou trpí asi 8% detí mladších ako tri roky a 2% celkovej populácie (EXL, et. al., 2000). Viaceré štúdie potvrdili silnú asociáciu medzi potravinovou alergiou a neskorším vznikom astmy Až u 40% detí s potravinovou alergiou a s prejavmi atopickej dermatitídy sa do 5. roku vyvinie astma ( BERGMANN, et. al., 1988). Na rozdiel od alergie na inhalačné alergény nie je úplne presná prevalencia alergických potravinových ochorení známa. Súvisí to predovšetkým s problémami okolo definície. Až 30 40% ľudí udáva alergickú reakciu na niektorú z potravín, výskyt skutočnej potravinovej precitlivenosti je však podstatne nižší (HRUBIŠKO, et. al., 2003). BREITENEDER (1998) uvádza, že najčastejšie príčinné alergény u nás sú: vajcový bielokm kravské mlieko, lieskové orechy, morské ryby, pšenica a arašidy. Príčinou alergií môže byť kontaminácia plesňami, hmyzom, antibiotikami, zvyšky, orechov, mlieka a iné alergény v potrvinových produktoch môžu vyvolať závažné alergické reakcie ako tzv. skryté alergény (HEFLE, 2001). Tak ako aj pri iných civilizačných ochoreniach možno prudký vzostup alergických atopických ochorení dať do súvisu najmä s interakciou medzi genetickými vlastnosťami a rôznymi enviromentálnymi faktormi, pričom za rozhodujúce sa považujú enviromentálne vplyvy (HRUBIŠKO, et. al., 2003). Z našich výsledkov vyplýva zvýšený výskyt alergických ochorení u rodinných príslušníkov ženského pohlavia, možno teda predpokladať prenos genetického rizika vzniku alergie z matky na potomkov, a to hlavne na ženské pohlavie. Graf 1 Graf 2 Graf 3 136

138 Záver Získané výsledky štúdie výskytu potravinových alergií navrhujeme použiť ako: zlepšenie informovanosti zamestnancov spoločných stravovacích zariadení, aby sa zabránilo krížovej kontaminácii a tak k výskytu skrytých alergénov v potraivnách rozšíreniu označovania, aby sa alergickým spotrebiteľom uľahčilo nakupovanie, ako jedna z ciest vysporiadania sa s potenciálnymi alergénmi v potravinách vypracovanie návrhov a stratégií na zvýšenie účinnosti metód na odstránenie alergénov a tak celkové zlepšenie kvality potravín výskumy nevyhnutné na ďaľšie pochopenie mechanizmov a molekúl, ktoré sa zúčatňujú na potravinovej alergii a podporu stratégií, ktoré môžu zlepšiť kvalitu života jedincom trpiacim alergiou Literatúra 1. BERGMANN, R.L. EDENHARTER, G. BDERGMANN, K.E. et. al Atopic dermatitis in early infancy predicts allergic airway disease at 5 years. In: Clin. Exp. Allergy, 1998, 28, s BREITENEDER, H Plant food and seafood allergens an overview. In: Allergy, 1998, 53, Suppl. 46, s EXL, B.M. MULLERTEICHER, G. VANDENPLAS, Y Preventive Possibilities Within the Contest of Cow s Milk Allergy. In: ACI International 2000, 12, 2, s HEFLE, S.L Hidden food allergens. In: Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology, 2001, 1, 3, s HRUBIŠKO, M. et. al Alergológia, Martin, 2003, ISBN , s. 60, 76 84, KULLIG, M. BERGMANN, R. KLETTKE, U. et. al Natural course of senzitization to food and inhalant allergens during the first 6 years of life. In: J. Allergy Clin. Immunol., 103, 1999, s MANNING, P.J. CURRAN, K. KIRBY, B. et. al Asthma, hay fever and eczema in Irisch teenagers (ISAAC protocol). In: Irisch Medical Journal, 1997, 90, 3, s NÉMETH, K Čo je to potravinová alergia. In: Výživa a zdravie, ročník 48, č. 1, 2004, s ROBERTSON, C.F. DALTON, M.F. PEAT, J.K. et. al Asthma and other atopic disesaes in Australian children. Australian arm of the International Study of Asthma and Allergy in Childhood. In: Medical Journal of Australia, 1998, 168, 9, s TOREN, K. HERMANSSON, B.A Incidence rate of adultonset asthma in relation to age, sex, atopy and smoking: A Swedisch populationbased study of adults. In: Int. J. Tuberc. Lung Dis., 1999, 3, s Kontaktná adresa: Ing. Martina Marcinková, Katedra fyziológie živočíchov, Slovenská poľnohospodárska univerzita, Tr. A. Hlinku 2, Nitra, , [email protected] 137

139 HISTOLOGICKÁ ANALÝZA KOSTNÉHO TKANIVA KRÁLIKOV PO APLIKÁCII NI A ZN HISTOLOGICAL ANALYSIS OF RABBIT S BONE TISSUE AFTER ADMINISTRATION OF NI AND ZN Martiniaková, M. 1, Omelka, R. 2, Grosskopf, B. 3, Chovancová, H. 1, Chrenek, P. 1, 4 1 Katedra zoológie a antropológie, 2 Katedra botaniky a genetiky, Univerzita Konštantína Filozofa v Nitre; [email protected] 3 Inštitút zoológie a antropológie, Georg Augustova Univerzita v Goettingene, SRN 4 Slovenské centrum poľnohospodárskeho výskumu v Nitre Abstract In this study histological analysis of rabbit s bone tissue after administration of Ni and Zn was investigated. Experimental animals were divided into three groups. In the first group rabbits were fed by 35g NiCl 2 per kg of body mass (group P2, n=5). In the second group 35g NiCl 2 per kg of body mass in combination with 30g ZnCl 2 per kg of the mass (group P4, n=5) were included into feedstuff. The group without administration of Ni and Zn was the control (group K, n=4). We compared bone length, bone weight and histological structure of the bones between investigated groups of rabbits (P2, K, P4). Our results indicate there are no statistically significant differences in bone length and bone weight between experimental groups (P2, P4) and control group (K). Also, we did not identify changes in qualitative histological characteristics of the femora between rabbits from various groups except for lower number of secondary osteons found in rabbits from experimental groups. On the other hand, there were observed some changes in quantitative histological characteristics of compact bone tissue between experimental and control groups related to sizes of vascular canals of primary osteons and secondary osteons as well. Anyway, our results suggest that administration of Ni and Zn caused changes in rabbit s bone tissue. Úvod Životné prostredie podmieňuje existenciu každého z nás. So zvyšujúcou sa urbanizáciou a industrializáciou dlhodobo dochádza ku kontaminácii životného prostredia cudzorodými látkami. Môže ísť o každý prvok (zlúčeninu prvkov), ktorá svojou koncentráciou prevyšuje prirodzený obsah a zapríčiňuje poruchy zdravotného stavu zvierat a človeka. S rastúcou chemizáciou stále väčší význam nadobúda sledovanie ťažkých kovov a prvkov minerálnej výživy v rastlinnej a živočíšnej výrobe. Ide predovšetkým o železo, zinok, olovo, meď, kobalt, nikel, ako aj o prvky minerálnej výživy najmä vápnik, draslík, sodík, horčík atď. Rizikové prvky prostredia sú zastúpené v rôznych koncentráciách a rôznych formách v pôde. Zákernosť pôsobenia rizikových prvkov spočíva v tom, že okrem akútnych intoxikácií (ktoré sú vzácne), sa tieto látky v tele kumulujú a postupne spôsobujú zdanlivo nebadateľné poruchy, ktoré však môžu vyústiť do vážnych metabolických porúch. Patologické stavy boli identifikované aj na mikroštrukturálnej úrovni, pričom vo väčšine vedeckých publikácii sú detailne analyzované zmeny v mikroskopickej stavbe parenchymatóznych orgánov (Massányi et al., 2003; Toman et al., 2005; Kramárová et al., 2005; Massányi et al., 2007). Existuje iba niekoľko vedeckých prác stručne popisujúcich zmeny v tvrdých spojivových tkanivách (zvlášť v kostnom tkanive) v dôsledku kumulácie určitého rizikového prvku (Kenney a McCoy, 1997; Bentley a Grubb, 1991; Baltaci et al., 2004; Bersényi et al., 2004). V našej práci si kladieme za cieľ makroskopicky a mikroskopicky analyzovať stehnové kosti (femury) adultných králikov exponovaných vybranými rizikovými prvkami prostredia (Ni, Zn) a výsledky porovnať v rámci troch skúmaných skupín s rozdielnymi koncentráciami analyzovaných prvkov v ich kŕmnej zmesi. 138

140 Materiál a metodika V našom experimente bolo použitých 14 samíc brojlerových línií kalifornského králika s hmotnosťou 3,54,0 kg vo veku 4 mesiace, ktoré boli rozdelené do troch skupín (P2, P4, K). V prvej skupine (P2) bol zvieratám (n=5) podávaný nikel (NiCl 2, Reachem) v dávke 35g NiCl kg 1 kŕmnej zmesi (KZ) po dobu 100 dní. V ďalšej pokusnej skupine (P4) zvieratá (n=5) prijímali krmivo s prímesou niklu (35g NiCl kg 1 KZ) a zinku (30g ZnC kg 1 KZ) počas toho istého obdobia. Na porovnanie výsledkov sme zostavili skupinu štyroch samíc (K kontrolná skupina), ktorá prijímala rovnakú kŕmnu zmes, ale bez pridania niklu a zinku. Všetky zvieratá boli umiestnené v klimatizovaných halách, v jednopodlažných individuálnych kovových klietkach typizovaných rozmerov. Voda bola k dispozícii z automatických napájačiek. Na stanovenie hodnôt dĺžky a hmotnosti stehnových kostí králikov (zo skupín P2, P4 a K) sme použili posuvné meradlo a analytické váhy. Na analýzu mikroskopickej stavby kompaktného kostného tkaniva exponovaných a neexponovaných skupín králikov sme použili stehnové kosti. Základné rezy sme zhotovili naprieč diafýzou v mieste najmenšej šírky femuru. Získané segmenty (cca 0,5 cm) boli následne podrobené macerácii a odmasťovaniu (Martiniaková et al., 2003). Odmastené vzorky kostí boli zaliate do epoxidovej živice Bioduru (Günter von Hagens), inkubované počas 30 minút vo vákuu a následne vložené na 3 dni do sušiarne. Zaliate fragmenty kostí sme rezali mineralogickou pílkou s diamantovým rezným kotúčom (Steeg & Reuter) a následne na špeciálnom mikrotóme (Leitz 1600) na konečnú hrúbku 7080 µm. Získané výbrusy boli ponorené do demineralizovanej vody, vysušené a napokon zaliate Eukittom (Merck) v súlade s metodikou Martiniakovej et al. (2006). Histologické preparáty sme pozorovali svetelným mikroskopom Jenaval (Carl Zeiss Jena) s digitálnou CCD kamerou (Mintrow) pri 200x zväčšení. Fotodokumentácia bola realizovaná pomocou počítačového softvéru Ati Player (Ati Technol. Inc.) a počítačového programu Adobe Photoshop Kvalitatívne vlastnosti v mikroskopickej stavbe kompaktného kostného tkaniva králikov sme určili na základe klasifikácií kostného tkaniva podľa Enlowa a Browna (1956) a Ricqlésa et al. (1991). Kvantitatívne charakteristiky analyzovaného kostného materiálu sme zistili pomocou počítačového softvéru Scion Image (Scion Corporation, USA). Boli merané nasledovné premenné: plocha, obvod, maximálny a minimálny priemer cievnych kanálikov primárnych osteónov, Haversových kanálikov a sekundárnych osteónov. Rozdiely v kvantitatívnych charakteristikách medzi králikmi exponovanými ťažkými kovmi a kontrolnou skupinou sme určili pomocou analýzy variácii a Tukeyho testu (Statistica 4. 3, 1993). Výsledky a diskusia Makroskopickou analýzou sme nezistili prítomnosť žiadnych štatisticky preukazných rozdielov v hodnotách priemernej dĺžky a hmotnosti femurov medzi experimentálnymi skupinami králikov (P2, P4) a kontrolnou skupinou (K). Hodnoty dĺžky a hmotnosti stehnových kostí boli najvyššie pri králikoch zo skupiny P4 s prímesou Ni a Zn v potrave, avšak štatisticky významný rozdiel sme identifikovali iba pri hmotnosti femuru medzi králikmi zo skupín P2 a P4 (tabuľka 1). Pandey et al. (1999) zistili zmeny hmotnosti semenníka, prisemenníka a prostaty po perorálnom podávaní Ni. Avšak, v práci Bersényiho et al. (2004) nebola zaznamenaná preukazná zmena v celkovej hmotnosti králikov po podaní Ni. Tabuľka 1 Priemerná hodnota dĺžky a hmotnosti femurov v rámci analyzovaných skupín králikov skupina králikov n priemerná dĺžka femurov (cm) priemerná hmotnosť femurov (g) P2 (1) 10 10,52±0,27 15,78±1,42 K (2) 8 10,63±0,37 16,13±1,07 P4 (3) 10 10,78±0,29 17,76±2,05 P<0.05 (+) Tukeyho test 1:

141 Mikroskopická stavba dlhých kostí všetkých analyzovaných skupín králikov (P2, K, P4) bola vo všeobecnosti tvorená primárne cievnatým longitudinálnym kostným tkanivom, ktoré sa vyskytovalo najmä pri periostálnom povrchu. V stredových úsekoch kompakty sme zaznamenali výskyt hustého Haversoveho a primárne cievnatého radiálneho kostného tkaniva. Endostálna hranica bola tvorená hustým Haversovým kostným tkanivom. Uvedené výsledky korešpondujú s výsledkami prác viacerých autorov (Enlow a Brown, 1958; Currey, 2002; Martiniaková et al., 2003). Avšak pri experimentálnych skupinách králikov (P2 a P4) sme zistili znížený počet sekundárnych osteónov v stredovej časti kompakty v porovnaní s kontrolnou skupinou. Uvedená skutočnosť poukazuje na to, že proces remodelácie kostného tkaniva by mohol byť u týchto jedincov redukovaný pravdepodobne v dôsledku kumulácie rizikových prvkov (Ni a Zn). Pomocou histomorfometrických metód sme zistili, že hodnoty premenných cievnych kanálikov primárnych osteónov sú najvyššie pri králikoch zo skupiny P4, ktorým bolo aplikované krmivo s prímesou Ni a Zn (tabuľka 2). Štatisticky preukazné rozdiely boli zistené pri ich ploche, obvode, maximálnom priemere (medzi králikmi zo skupín P2 a K, P2 a P4) a minimálnom priemere (medzi skupinami P2 a K, P2 a P4, K a P4). Premenné Haversových kanálikov nadobúdali najvyššie hodnoty pri králikoch zo skupiny P2 s aplikáciou Ni v potrave (tabuľka 3). Avšak v tomto prípade sme nezaznamenali prítomnosť žiadnych štatisticky významných rozdielov medzi jednotlivými analyzovanými skupinami (P2, K, P4). Hodnoty premenných sekundárnych osteónov boli taktiež najvyššie pri králikoch zo skupiny P2 (tabuľka 4). Štatisticky preukazné rozdiely sme identifikovali pri ich ploche (medzi králikmi zo skupiny P2 a P4), obvode a maximálnom priemere (medzi skupinami P2 a P4, K a P4). Z uvedených výsledkov vyplýva, že aplikácia Ni a Zn v potrave nemá signifikantný vplyv na veľkosť Haversových kanálikov králikov. Vyššia koncentrácia Ni v potrave však vyvoláva preukazné zmeny týkajúce sa veľkosti cievnych kanálikov primárnych osteónov a súčasný príjem Ni a Zn má za následok signifikantné zmeny vo veľkosti sekundárnych osteónov. Hodnoty Haversových kanálikov a sekundárnych osteónov králikov z kontrolnej skupiny korešpondovali s už publikovanými údajmi pri adultných králikoch (Martiniaková et al., 2003; Martiniaková et al., 2006). Hodnoty cievnych kanálikov primárnych osteónov boli však pri týchto králikoch vyššie v porovnaní s publikovanými výsledkami. Domnievame sa, že uvedená skutočnosť je zapríčinená rozdielnym vekom králikov v jednotlivých štúdiach. Výsledky nášho experimentu potvrdzujú fakt, že hoci je Ni esenciálnym prvkom, po podaní jeho vyššej dávky môže dochádzať k určitým zmenám v kompaktnom kostnom tkanive králikov. Podobnú skutočnosť sme zaznamenali aj v prípade aplikácie kombinácie Ni a Zn. Uvedené zmeny sa prejavujú zníženou remodeláciou kostného tkaniva a následne nižším počtom sekundárnych osteónov. Pri aplikácii Ni dochádza k zmenám vo veľkosti cievnych kanálikov primárnych osteónov a pri súčasnej aplikácii Ni a Zn nastávajú zmeny vo veľkosti sekundárnych osteónov. V štúdii Baltaciho et al. (2004) sa uvádza, že podanie Zn zabraňuje poškodeniam kostného tkaniva pri potkanoch. Kenney a McCoy (1997) dokonca uvádzajú, že nízky príjem Ca je možné nahradiť príjmom Zn bez výrazných zmien v pevnosti a elasticity kosti. Pre potvdenie resp. vyvrátenie uvedených faktov by bolo nutné experiment realizovať u adultných králikov s aplikáciou Zn v ich kŕmnej zmesi. Tabuľka 2 Analýza variácii a Tukeyho test premenných cievnych kanálikov primárnych osteónov skupina králikov n plocha (µm 2 ) obvod (µm) max. priemer (µm) min. priemer (µm) P2 (1) 5 190,93±100,82 40,91±9,83 18,59±5,67 6,38±1,86 K (2) 4 235,24±83,81 45,74±8,09 20,98±4,95 7,09±1,67 P4 (3) 5 253,74±80,32 46,98±7,27 21,27±4,66 7,63±1,84 Tukeyho test P<0,05 (+), P<0,01 (++) 1:2, :2, :2, :2, :

142 Tabuľka 3 Analýza variácii a Tukeyho test premenných Haversových kanálikov skupina králikov n plocha (µm2) obvod (µm) max. priemer (µm) min. priemer (µm) P2 (1) 5 373,08±173,55 55,96±11,86 25,50±6,64 9,13±2,47 K (2) 4 344,70±154,51 54,02±11,20 24,54±6,39 8,78±2,19 P4 (3) 5 335,54±115,93 53,08±8,61 23,94±5,04 8,89±2,16 Tukeyho test P<0,05 (+), P<0,01 (++) Tabuľka 4 Analýza variácii a Tukeyho test premenných sekundárnych osteónov skupina králikov n plocha (µm2) obvod (µm) max. priemer (µm) min. priemer (µm) P2 (1) ,81±3486,18 284,10±53,22 134,01±28,82 46,75±9,75 K (2) ,88±3344,45 278,93±55,20 132,83±33,44 45,44±8,50 P4 (3) ,44±2671,20 258,69±42,36 118,15±25,83 46,33±8,57 Tukeyho test P<0,05 (+), P<0,01 (++) 1:3 + 1:3 + 1:3 ++ 2:3+ 2:3 ++ Uvedená štúdia vznikla s podporou grantov VEGA 1/2417/05 a CGA VI/10/2007. Literatúra Baltaci, A. K., Sunar, F., Mogulkoc, R. et al.: Toxicology, 2004, 203, Bentley, P. J., Grubb, B. R.: J. Anim. Sci., 1991, 69, Bersényi, A., Fekete, S. G., Szilágyi, M. et al.: Acta Vet. Hung., 2004, 52, Currey J.D.: Bones: structure and mechanics. Princeton University Press: New Jersey, 2002, Enlow D.H., Brown S.O.: The Texas Journal of Science, 1956, 8, Enlow D.H., Brown S.O.: The Texas Journal of Science, 1958, 10, Kenney, M. A., McCoy, H.: Biol. Trace Elem. Res., 1997, 58, Kramárová, M., Massányi, P., Jančová, A.: Bull. Vet. Inst. Pulawy, 2005, 49, Martiniaková, M., Vondráková, M., Fabiš, M.: Scripta Medica, 2003, 76, Martiniaková, M., Grosskopf, B., Omelka, R. et al.: J. For. Sci., 2006, 51, Massányi, P., Lukáč, N., Zemanová, J. et al.: Acta Vet. Brno, 2007, 76, Massányi, P., Tataruch, F., Slamečka, J. et al.: J. Envir. Sci. Health A, 2003, 38, Pandey, R., Kumar, R., Singh, S. P. et al.: Biometals, 1999, 12, Toman, R., Massányi, P., Hluchý, S. et al.: Risk factors of the food chain: proceeding book, SPU Nitra, 2005,

143 THE CONTENT OF MERCURY IN SELECTED SAMPLES OF FRESHWATER ALGAE AND SEAWEEDS Mišurcová, L. 1, Stratilová, I. 2, Škrovánková, S. 1, Kráčmar, S. 1 1 Tomas Bata University in Zlín, Czech Republic 2 Agrotest fyto s.r.o., Kroměříž Abstract In this study mercury levels were examined in freshwater algae and seaweeds products. The samples of these products were chosen as a representative of green Chlorophyta: Chlorella tabs (Chlorella pyrenoidosa); greenblue Cyanobacteria: Spirulina pacifica (Spirulina pacifica) freshwater algae; red seaweed Rhodophyta: Nori (Porphyra tenera) and brown seaweeds Fucophyceae (Phaeophyceae) with commercial names: Wakame instant and Wakame (Undaria pinnatifida), KombuKelp and Kombu (Laminaria japonica), Iziki (Hizikia fusiformes) and Arame (Eisenia bicyclis). The concentrations for mercury were 0.011, 0.018, 0.025, 0.037, 0.011, 0.031, 0.031, and mg.kg 1 dry wt, respectively. The Czech Republic and the European Union has not a limit for mercury in seaweeds with the exception France. None of the samples exceeded French limit: 0.1 mg.kg 1 dry wt in this study. Key words: freshwater algae, seaweeds, Hg, concentration, contamination Introduction Mercury represents a diffused and hazardous environmental contaminant. Its capacity of bioaccumulation and biomagnification in the food chain increases the risk of human exposure. The ability of aquatic plants to accumulate toxic metals from water is well documented (Phaneuf et al., 1999; Lares et al., 2002). Freshwater algae and seaweeds have a high capacity to bind trace metals; their cellular wall is rich in sulphated polysaccharides in which hydroxyl, sulphate and carboxyl groups are strong ionexchangers, and therefore are important complexation sites for hard transition metal cations (Vasconcelos et al., 2001). As a result of their metalbinding properties, seaweeds have been considered suitable for use as biomonitors of trace metals (Gupta and Chandra, 1998). Furthermore, freshwater algae and seaweeds have also been considered suitable to be used in the removal of trace metals from the environment (Robinson and Wilkinson, 1994; MuñosBarbosa et al., 2000; Sawidis et al., 2001; Basha et al., 2007). The level of mercury in foods is changeable and reflects the level of pollution of the local environment (Nasredine et al., 2002). Environmental pollution of mercury remains a major concern in many regions of the world. The significant anthrophogenic sources of mercury contamination are coal combustion (Zheng et al., 2007) and chloralkali plants using metallic Hg for electrolytical production of chlorine (Remy et al., 2006). Gaseous elemental mercury has a long atmospheric residence time, enabling global transport, which means that all people and environments will pay some type of cost as a mercury receptor, some more than others, due to enhanced deposition, as in the case in the Arctic (Hylander and Goodsite, 2006). Methods In this study total mercury levels were examined in freshwater algae and seaweeds products. The samples of these products were purchased in the local health store as a representative of green Chlorophyta: Chlorella tabs (Chlorella pyrenoidosa); greenblue Cyanobacteria: Spirulina pacifica (Spirulina pacifica) freshwater algae; red seaweed Rhodophyta: Nori (Porphyra tenera) and brown seaweeds Fucophyceae (Phaeophyceae) with commercial names: Wakame instant and Wakame (Undaria pinnatifida), KombuKelp and Kombu (Laminaria japonica), Iziki (Hizikia fusiformes) and Arame (Eisenia bicyclis). All samples were blended in the laboratory mill VM7. Total mercury was determined directly from untreated samples in the special device for mercury determination TMA

144 Results The total mercury values have been determined in the samples of green and greenblue freshwater algae, red and brown seaweeds. Results are shown in Fig.1. Concentrations of total mercury are expressed in mg.kg 1 on a dry weight. 0,045 0,040 Hg mg.kg 1 0,037 0,035 0,030 0,025 0,025 0,031 0,031 0,029 0,030 0,020 0,018 0,015 0,010 0,005 0,011 0,011 0,000 Chlorella Spirulina Nori Wakame instant Wakame Kombu Kelp Kombu Iziki Arame Fig. 1. Concentrations of total mercury in freshwater algae and seaweeds As may be seen in Fig. 1, the products from freshwater algae Chlorella tabs, Spirulina pacifica and brown seaweed Wakame showed the lowest concentration of mercury: 0.011, and mg.kg 1 dry wt, respectively. On the other hand, the highest concentration of mercury was determined in Wakame instant mg.kg 1 dry wt. Mercury concentrations in other samples of red and brown seaweeds ranged between and mg.kg 1 dry wt. Discussion The toxicity of mercury is associated with its chemical form: elemental, inorganic and organic. In the case of gaseous elemental mercury, Asian countries in general as China, Japan and Korea had higher concentrations when compared with the Arctic, Ireland and Canada (Zhang and Wong, 2007). Fig. 2 compares average gaseous elemental mercury (GEM) concentrations in different countries. The organic form, usually methylmercury, is more hazardous than other forms. Microbial processes play a key role in alterning the chemical form of Hg compounds (Morel et al., 1998). Marine organisms possess a remarkable capacity to turn inorganic mercury into organic compounds, thus changed mercury is more easily transferable throughout the aquatic food chain (Nasredine et al., 2002). Our results confirmed that mercury concentrations in samples of freshwater algae and seaweeds were very low, which correlated with authors Phaneuf et al. (1999) and Lares et al. (2002). There is no standard for mercury in seaweeds for human consumption in the Czech Republic and the European Union. However, France has a limit for mercury in seaweeds: 0.1 mg.kg 1 dry wt (Mabeau et al., 1993). None of the samples exceeded this limit in this study. 143

145 7 6 5 GEM ng.m Arctic Ireland Canada Korea Japan China Fig. 2. Atmospheric GEM concentration on average in different countries (Zhang and Wong, 2007) Conclusion The utilisation of micro and macroalgal biomass from contaminated areas for direct or indirect human use may result in health risks due to the high bioaccumulation capacity. In the world of increasing population, such a nutritive food resource as seaweeds should not be withdrawn from human consumption due to anthropogenic pollution. Efforts to reduce human and environmental exposure to mercury must be prioritized because of the adverse health and environmental effects. Thus constant monitoring of the environment and food is essential. Literature ANONYMOUS, 2005: Seznam zkušebních metod NRL pro krmiva. Věstník ÚKZUZ Brno, 2005, IV, 213 BASHA, S. MURTHY, Z.V.P. JHA, B. 2007: Biosorption of hexavalent chromium by chemically modified seaweed, Cystoseira indica. Chemical Engineering Journal, 2007, in press GUPTA, M. CHANDRA, P. 1998: Bioaccumulation and toxicity of mercury in rootedsubmerged macrophyte Vallisneria spiralis. Environmental Pollution, 1998, 103, HYLANDER, L.D. GOODSITE, M.E. 2006: Environmental costs of mercury pollution. Science of the Total Environment, 2006, 368, KAROUNARENIER, N.K. SNYDER, R.A. ALLISON, J.G. WAGNER, M.G. RAO, K.R. 2007: Accumulation of organic and inorganic contaminants in shellfish collected in esturiane waters near Pensacola, Florida: Contamination profiles and risks to human consumers. Environmental Pollution, 2007, 145, LARES, M.L. FLORESMUŇOZ, G. LARALARA, R. 2002: Temporal variability of bioavailable Cd, Hg, Zn, M and Al in an upwelling regime. Environmental Pollution, 2002, 120, MABEAU, S. FLEURENCE, J. 1993: Seaweed in food products: biochemical and nutritional aspects. Trends in Food Science & Technology, 1993, 4, MOREL, F.M.M. KRAPIEL, A.M.L., AMYLOT, M. 1998: The chemical cycle and bioaccumulation of mercury. Annual Rewiew of Ecology and Systematics, 1998, 29, MUŇOZBARBOSA, A. GUTIERREZGALINDO, E.A. FLORESMUŇOZ, G. 2000: Mytilus californianus as an indicator of heavy metals on the northwest coast of Baja California, Mexico. Marine Environmental Research, 2000, 49, NASREDINE, L. PARENTMASSIN, D. 2002: Food contamination by metals and pesticides in the European Union. Should we worry? Toxicology Letters, 2002, 127, 2941 PHANEUF, D. COTE, I. DUMAS, P. FERRON, L.A. LEBLANC, A. 1999: Evaluation of the Contamination of Marine Algae (Seaweed) from the St.Lawrence River and Likely to Be Consumed by Humans. Environmental Research Section A. 1999, 80,

146 REMY, S. PRUDENT, P. PROBST, J.L. 2006: Mercury speciation in soils of the industrialised Thur River catchment (Alsace, France). Applied Geochemistry, 2006, 21, ROBINSON, P.K. WILKINSON, S.C. 1994: Removal of aqueous mercury and phosphate by gelentrapped Chlorella in packedbed reactors. Enzyme Microb. Technol., 1994, 16, SAWIDIS, T. BROWN, M.T. ZACHARIADIS, G. SRATIS, I. 2001: Trace metal concentrations in marine microalgae from different biotopes in the Aegean Sea. Environ. International, 2001, 27, 4347 SUZUKI, Y. KAMETANI, T. MARUYAMA, T. 2005: Removal of heavy metals from aqueous solution by nonliving Ulva seaweed as biosorbent. Water Research, 2005, 39, VASCONCELOS, M.T.S.D. LEAL, M.F.C. 2001: Seasonal variability in the kinetice of Cu, Pb, Cd and Hg accumulation by macroalgae. Marine Chemistry, 2001, 74, 6585 ZHANG, L. WONG, M.H., 2007: Environmental mercury contamination in China: Sources and impacts. Environmental International, 2007, 33, ZHENG, L. LIU, G. CHOU, CH.L. 2007: The distribution, occurence and environmental effect of mercury in Chinese coals. Science of the Total Environment, 2007, 383, Kontaktní adresa: Ing. Ladislava Mišurcová, Ústav potravinářského inženýrství, nám. T.G. Masaryka 275, Zlín, VÝSKYT REZIDUÍ TETRACYKLINOVÝCH ANTIBIOTIK V SYROVÉM KRAVSKÉM MLÉCE OCCURRENCE OF TETRACYCLINE ANTIBIOTICS IN RAW COWۥS MILK Navrátilová P., Borkovcová I., Dračková M., Janštová B., Vorlová L. Ústav hygieny a technologie mléka, Fakulta veterinární hygieny a ekologie, Veterinární a farmaceutická univerzita, Brno, Česká republika Abstract In this study was determined content of residual tetracyclines (tetracycline (TC), oxytetracycline (OTC) and chlortetracycline (CTC) in raw cowۥs milk. All samples (n=171) were assayed both by means of RPHPLC method with UV detection and the group specific test (Milk Tetrasensor Kit). The HPLC system was the Breeze chromatographic system (Waters, U.S.). Milk samples were processed using the solid phase extraction cleanup procedure. The HPLC analyses were carried out using the mobile phase acetonitrile/methanol/0.05 M oxalic acid (13:13:74) on a C 8 column Nova Pack (3,9x150 mm i.d., 4 µm, Waters) at flow rate of 0.8 ml/min. The detection limits of TCs were 50 µg.l 1 (OTC, CTC) and 35 µg.l 1 for TC. Recoveries of TCs from spiked samples were ranged between 88.1% 93.3% and their relative standard deviations 9.26% (OTC), 12.18% (TC) and 11.7% (CTC). Any TCs residues were not detected in milk using Milk Tetrasensor Kit. Low levels TC, near the detection limits, were found in 157 milk samples by HPLC method. At 10 tanker and 2 bulk samples concentration levels of TC exceeded value 100 µg.l 1. Úvod Jedním z významných znaků jakosti syrového kravského mléka je kontrola přítomnosti reziduí antibiotik. Koncepce a strategie detekce antibiotik a sulfonamidů v mléce v sobě zahrnuje dva aspekty. Kontrolu jakosti mléka jako suroviny pro výrobu mléčných výrobků a za účelem stanovení jeho ceny (technologická bezpečnost). Dalším aspektem je stanovení znaků jakosti za účelem ochrany zdraví člověka (toxikologická bezpečnost). Přítomnost reziduí 145

147 veterinárních léčiv v potravinách přináší farmakologickotoxikologická, mikrobiologická a imunopatologická rizika (Heeschen, 1993). V souladu s legislativou ES (Nařízení komise ES č. 1662/2006) musí provozovatelé potravinářských podniků zavést postupy jimiž zajistí, že syrové mléko nebude uvedeno na trh, pokud obsahuje rezidua antibiotik v množství, které překračuje maximální hodnotu povolenou legislativou EU (Nařízení EHS č. 2377/90). Tetracykliny jsou antibiotika s širokým spektrem antimikrobiálního účinku četně využívaná v živočišné výrobě. Ve veterinární praxi se rutinně používají u hospodářských zvířat především oxytetracyklin, chlortetracyklin, tetracyklin a doxycilin (Botsoglou a Fletouris, 2001). Antimikrobiální látky podávané kravám v laktaci mohou v různé míře přecházet do mléka. Častým a převládajícím zdrojem kontaminace mléka je intramamární (intracisternální) aplikace. Další cesty kontaminace mléka představují perkutánní, intrauterinní, subkutánní, intramuskulární a intravenózní aplikace léčiv (Heeschen and Blűthgen, 1991). Tetracykliny se po aplikaci eliminují z organismu i mlékem. Jejich obsah v mléce dosahuje 5060 % koncentrace v krevní plazmě. Vyšší hladiny reziduí tetracyklinů v mléce jsou detekovány po intramamární aplikaci (Botsoglou a Fletouris, 2001). Cílem práce bylo stanovení reziduí tetracyklinů: tetracyklinu (TC), chlortetracyklinu (CTC) a oxytetracyklinu (OTC) v cisternových a bazénových vzorcích mléka. Byly využity dvě metody: pro separaci a kvantitativní stanovení metoda HPLC, pro kvalitativní stanovení rychlý specifický test (Milk Tetrasensor Kit, Unisensor S.A. Belgium). Materiál a metody Vzorky V průběhu měsíce července 2007 byly na svozných linkách mlékárenského závodu odebírány vzorky syrového kravského mléka. Celkem bylo odebráno 114 cisternových a 57 bazénových vzorků. Výrobní program mlékárny je zaměřen na výrobu přírodních polotvrdých a tvrdých sýrů. Vzorky mléka byly do vyšetření uchovávány při teplotě do 4 C. Screeningový test Milk Tetrasensor Kit (Unisensor, S.A., Belgie) je receptorový test pro rychlé stanovení tetracyklinů v mléce (tetracyklinu, oxytetracyklinu, doxycyklinu, chlortetracyklinu, methacyklinu, aj). Vyšetření vzorků bylo provedeno dle návodu výrobce. Limit citlivosti soupravy je 25 ppb. Stanovení metodou kapalinové chromatografie (HPLC): Chemikálie a materiál: Acetonitril a methanol: HPLC grade (Merck), kyselina šťavelová dihydrát Suprapur (Merck); Na 2 HPO 4 heptahydrát (Merck), EDTA disodná sůl, kyselina citronová monohydrát (Fischer Scientific) byly v čistotě p.a. SPE kolonky Oasis HLB, 3 cc, 60 mg (Waters). Vakuová jednotka pro SPE (Supelco), analytické váhy, chlazená odstředivka. Příprava pufru McIlvaine: 400 ml 0,2 mol.l 1 hydrogenfosforečnanu sodného, 600 ml 0,1 mol.l 1 kyseliny citronové a 0,37 g EDTA, ph = 4,1. Roztok lze uchovávat při teplotě 4 0 C několik týdnů. Příprava standardních roztoků tetracyklinových antibiotik : Pro přípravu standardů byly zakoupeny antibiotické preparáty Tetracycline hydrochloride T 3383, Oxytetrycycline hydrochloride O5875 a Chlortetrycycline hydrochloride C4881 (Sigma Aldrich). Ze zásobních roztoků o koncentraci cca 0,1 g/100 ml methanolu byly připraveny pracovní roztoky v koncentračním rozsahu 0,1 50 mg.l 1 jednotlivých antibiotik. Příprava vzorku: Před analýzou byly vzorky mléka zahřáty na 40 C, promíchány a zchlazeny na 20 C. 15 ml vzorku mléka bylo smícháno s 25 ml McIlvaine pufru s přídavkem EDTA. Zředěný vzorek byl odstředěn při otáčkách minimálně 4000.min 1 při 5 C po dobu 10 minut. Po odstředění byla odstraněna povrchová vrstva tuku. Alikvotní podíl 25 ml získaného supernatantu byl podroben extrakci na pevné fázi SPE na kolonách Oasis HLB podle postupu uvedeného v aplikačním listu fy Waters. 146

148 SPE kolonky byly nejprve aktivovány 3 ml methanolu, promyty 2 ml vody, pak bylo naneseno 25 ml supernatantu, promyto 1,5 ml 5 % methanolu ve vodě, eluováno 2 ml methanolu. Eluent byl odpařen, zbytek rekonstituován na 1 ml mobilní fází a filtrován přes 0,2 um nylonové filtry pro HPLC stanovení. Podmínky HPLC stanovení: Pro HPLC stanovení byl použit stavebnicový kapalinový chromatograf Breeze (Waters, USA) skládající se z binárního gradientového čerpadla 1525, duálového UV/VIS detektoru 2487, autosampleru 717 plus a kolonového termostatu. Systém je řízen a data vyhodnocována softwarem Breeze (Waters). Pro dělení byla použita chromatografická kolona Nova Pack C8, 3,9x150 mm o velikosti částic 4 µm (Waters). Detekce UV byla prováděna při vlnové délce 365 nm. Měření probíhalo v izokratickém módu. Mobilní fázi (průtok 0,8 ml.min 1 ) tvořila směs acetonitrilu, methanolu a 0,05 mol.l 1 kyseliny šťavelové v poměru 13:13:74. Velikost nástřiku byla 20 µl, teplota kolony 30 0 C. Kvantitativní i kvalitativní stanovení bylo prováděno metodou vnějšího standardu, každý vzorek byl měřen ve dvou paralelních stanoveních, v každé sérii byl měřen slepý vzorek. Meze detekce a stanovitelnosti byly stanoveny ze směrodatné odchylky slepého pokusu a směrnice kalibračních přímek, opakovatelnost z 15 paralelních stanovení a výtěžnost z 12 stanovení vzorku mléka s přídavkem roztoku standardů o známé koncentraci (0,5 µg.ml 1 ). Výsledky byly vyhodnoceny pomocí statistického a grafického softwaru STAT Plus. Výsledky a diskuse V ČR patří tetracykliny spolu s βlaktamovými antibiotiky ve veterinární praxi k nejpoužívanějším antimikrobiálním látkám. Při plošném monitorování antimikrobiálních látek v mléce se využívají především mikrobiologické inhibiční metody (screeningové testy) a rychlé specifické testy. Citlivost metod se liší. Mikrobiologické inhibiční metody využívající Bacillus stearothermophilus vykazují vyšší citlivost na βlaktamová antibiotika, méně jsou citlivá na tetracykliny, které většinou detekují v hladinách vyšších než jsou stanovené MRL. Rychlé specifické testy mají vyšší citlivost ( MRL). V mlékárně kde byly vzorky odebírány jsou cisternové vzorky mléka testovány rychlým specifickým testem na přítomnost βlaktamových antibiotik. Bazénové vzorky jsou několikrát měsíčně v akreditované laboratoři testovány mikrobiologickou inhibiční metodou. Cisternové i bazénové vzorky syrového kravského mléka byly vyšetřeny metodou Milk Tetrasensor Kit. V žádném z vyšetřených vzorků nebyla potvrzena přítomnost tetracyklinových antibiotik (celkem 171 vzorků). Limit citlivosti soupravy daná výrobcem byla 25 ppb. Ve vzorcích by neměly být přítomné tetracykliny v koncentracích > 0,025 µg.ml 1. HPLC je fyzikálněchemická metoda, která se využívá k separaci tetracyklinových antibiotik na reverzní fázi s různými metodami detekce: spektrofotometrie, fluorometrie, hmotnostní spektrometrie a elektrochemie. Metoda se využívá především při cíleném vyšetřování tetracyklinových antibiotik. Pro stanovení OTC, TC A CTC byla aplikována HPLC metoda s UV detekcí a izokratickou elucí. Optimalizace HPLC analýzy byla provedena pomocí standardních roztoků tetracyklinových antibiotik. Opakovatelnost a výtěžnost celého analytického postupu byly zjištěny ze 12 (resp. 15) stanovení vzorku mléka s přídavkem roztoku standardů o známé koncentraci (Tab.č.1). Meze detekce byly stanoveny ze směrodatné odchylky slepého pokusu a směrnice kalibračních přímek a činily 50, 35 a 50 µg.l 1 pro oxyteracyklin, tetracyklin a chlortetracyklin. Stanovením tetracyklinových antibiotik v mléce metodou HPLC se zabývala řada autorů. Autoři Sokol a kol. (1995) sledovali koncentraci tetracyklinových antibiotik v mléce po intramamární aplikaci metodou HPLC. Obdrželi výtěžnost 95,41 % pro CTC, 91,98 % pro OTC a 83,44 % pro TC a meze detekce stanovení 0,05 ppm (50 ng.g 1 ). Výtěžnost OTC a TC jsou u metody HPLC obvykle o 1020% vyšší než u CTC (Wells, 1997), jak je patrné i z našich měření. 147

149 Tabulka č.1: Výtěžnost a opakovatelnost stanovení oxyteracyklinu (OTC), tetracyklinu (TC) a chlortetracyklinu (CTC) pro přídavek cca 0,5 µg.ml 1 jednotlivých analytů. Parametr OTC TC CTC Výtěžnost (%) 93,3 91,5 88,1 RSD (%) 5,1 11,7 9,9 n Opakovatelnost RSD (%) 9,3 12,2 11,7 n RSD = relativní standardní odchylka, n = počet měření Metodou HPLC nebyla v bazénových ani v cisternových vzorcích prokázána přítomnost oxytetracyklinu a chlortetracyklinu. Tyto látky byly pravděpodobně přítomné v koncentracích nižších než meze detekce nebo nebyly ve vzorcích přítomny. Ve 157 vzorcích z celkového počtu 171 byla zjištěna rezidua tetracyklinu (Tabulka č.2). 10 cisternových a 4 bazénové vzorky byly negativní. Tabulka č.2: Koncentrace reziduí tetracyklinu v bazénových a cisternových vzorcích syrového kravského mléka metodou HPLC parametr n x medián min max SD Tetracyklin (µg.l 1 ) ,93 34,00 4 * ,13 Cisternové vzorky Tetracyklin (µg.l 1 ) ,53 38,50 8* ,14 Bazénové vzorky Tetracyklin (µg.l 1 ) 53 33,91 23,00 4* ,63 n počet pozitivních vzorků, x průměr, min a max minimální a maximální hodnota, SD směrodatná odchylka, *koncentrace < meze detekce Stanovený MRL (maximální reziduální limit) legislativou ES je pro TC, OTC i CTC v syrovém mléce 0,1 mg.kg 1, celkový obsah reziduí tetracyklinů v mléce nesmí překročit 0,1 mg.kg 1. U 10 cisternových vzorků byla zjištěna koncentrace reziduí tetracyklinu > 100 µg.l 1, u 1 vzorku koncentrace 222 µg.l 1. U bazénových vzorků pouze 2 stanovené hodnoty přesáhly koncentraci > 100 µg.l 1. Pro důkaz zvýšených hodnot zjištěných HPLC metodou a vyloučení falešně pozitivních výsledků, které mohou být způsobeny vlivem matrice bude třeba provést konfirmační stanovení HPLC s hmotnostní detekcí. Závěr Cílem studie bylo monitorování reziduí tetracyklinových antibiotik. Rychlým specifickým testem nebyla ve vzorcích syrového kravského mléka prokázána přítomnost reziduí tetracyklinových antibiotik. Metodou HPLC byla ve 157 vzorcích zjištěna rezidua tetracyklinu. U 10 cisternových a 2 bazénových vzorků hladiny tetracyklinu přesáhly koncentraci 100 µg.l 1. Tetracyklinová antibiotika patří v ČR k četně využívaným antimikrobiálním látkám. Plošné monitorování antimikrobiálních látek ve vzorcích syrového kravského mléka na příjmu v mlékárně by nemělo být zaměřeno pouze na nejčastěji využívané antimikrobiální látky (βlaktamová antibiotika), ale i na tuto skupinu látek. Literatura Literatura u autora. 148

150 Práce vznikla za finanční podpory Výzkumného záměru MSM Veterinární aspekty bezpečnosti a kvality potravin. Kontaktní adresa: MVDr. Pavlína Navrátilová, Ph.D., Ústav hygieny a technologie mléka, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno, Palackého 1/3, Brno, Česká republika, e mail: [email protected]. TETRAHYMENA PYRIFORMIS AKO BIOSENZOR NA STANOVENIE TOXICKÝCH ORGANOFOSFÁTOV Ništiar, F., 1 Beňačka, R., 1 Lovásová, E., 1 Lukačínová, A. 2 1 Department of Pathological Physiology, 2 Department of Physiology, Faculty of Medicine, Šafárik University, Košice, Slovak Republic Abstract The development of nonanimal methods to predict the potential of chemicals to cause of toxicity is of great importance. The cytotoxic effect (LD 50, and IC 50 for AChE) of four organophosphate (trichlorphon, dichlorvos, methation, and OethylS/2diisopropyl aminoethyl/methylthiophosphonate) has been tested on the ciliate Tetrahymena pyriformis. This ciliate has been shown to be very sensitive biosensor to organophosphate. Results are comparable with those obtained using other biosensors. Úvod V našej práci použitý jednobunkový in vitro model, Tetrahymena pyriformis, ktorý je vo vodnom prostredí ubikvitárne sa vyskytujúci prvok s obľubou využívaný pre toxicitné štúdiá (Bonnet et al., 2003). Fyziológia a biochémie tejto eukaryotickej bunky je dobre známa (Elliott, 1973). Je ľahko kultivovateľný v malých množstvách axenického média. Prvok má krátky generačný čas okolo troch hodín. Preto je možné účinok testovaných látok sledovať počas niekoľkých generácií. Mnohé štúdiá preukázali, že tento prvok je vhodným modelom na toxikologické štúdiá rôznych látok, ako sú karcinogény (Yoshioka a Ose, 1993), insekticídy (Ništiar a spol., 1981), fungicídy (Yoshioka a spol., 1985), mykotoxíny (Bijl a spol., 1988; Benitez a spol., 1994; Ništiar a spol., 1986), organické látky (Huber a spol., 1990; Schultz a spol., 1994; Bogaerts a spol., 2001), ťažké kovy (Nilsson, 1989) a farmaceutiká (Sauvant a spol., 1999). V literatúre bolo predložených viacero testovacích metód pre štúdiá toxicity (Roberts a Berk, 1990; Noever a spol., 1994; Sauvant a spol., 1995; Larsen a spol., 1997; Bogaerts a spol., 1998). Pre hodnotenie toxicity sa využívali rôzne kritériá, napr. smrť buniek, imobilita, reprodukcia, rast, fyziologické funkcie, genotoxicita a pod. V tejto štúdii sme využili ako markerov toxity test prežívania buniek a stanovenie inhibície aktivity acetylcholinesterázy v bunkách. Cieľom bolo určiť relatívnu toxicitu týchto látok na bunkovom modely in vitro (prvok T. pyriformis), a preukázať, že biotest s T. pyriformis môže byť považovaný za alternatívnu in vitro metódy pre stanovenie rizika potencionálne toxických organofosforečných zlúčenín. Materiál a metodika Testované organofosfáty: Trichlórfon (Bayer, Nemecko, 98 %) použitý vo finálnej koncentrácii 500 µg/l až 32 mg/l kultivačného média; dichlórvos (CHZJD Bratislava, 95,9%), použitý vo finálnej koncentrácii 600 ng/l až 40 mg/l kultivačného média; metatión (CHZJD Bratislava, 98%), použitý vo finálnej koncentrácii 100 µg/l až 400 mg/l kultivačného média; O etyls(2diizopropyl aminoetyl)metyltiofosfonát (96%), použitý vo finálnej koncentrácii 1 ng/l až 4 µg/l kultivačného média. 149

151 Bunkové kultúry: Tetrahymena priformis, kmeň W, rastúci axenicky pri 28 C v médiu PPYS (ph 6,87,0), obsahujúcom 0,75% proteóza peptón (Difco, Detroit, MI, USA), 0,75% kvasničný extrakt (Difco) a anorganické soli (Plesner a spol., 1964). Bunky boli udržiavané preočkovaním do tekutého média PPYS v exponencionálnej fáze rastu. Počas rastu počet buniek logaritmicky stúpa do približne buniek/ml, potom nastupuje prestacionárna a stacionárna fáza rastu (Nilsson, 1981). Testy na stanovenie LD 50 : Prežívanie buniek v médiu s obsahom príslušnej koncentrácie toxickej látky bolo stanovené kolorimetricky (Mosmann, 1983) v úprave pre Tetrahymena pyriformis (Zilberg a Sinai, 2006). 50 %ná inhibícia aktivity acetylcholinesterázy (IC 50 ): Aktivita acetylcholinesterázy (E.C., ) bola stanovená kolorimetrickou metódou (George a Abernethy, 1983). Štatistické analýzy: Na stanovenie LD50 a IC50 bola využitá up and down metóda podľa Dixona (Pandy a spol., 1993). Výsledky a diskusia V tabuľke 1 uvádzame toxicitu testovaných organofosforečných zlúčenín na alternatívny celulárny model prvoka Tetrahymena pyriformis. Organofosfát LD 50 IC 50 (AChE) Trichlórfon 4,2 mg.l 1 1,34 mg.l 1 Dichlórvos 2,9 mg.l µg.l 1 Metatión 42,8 µg.l 1 1,77 µg.l 1 OetylS(2diizopropyl aminoetyl)metyltiofosfonát 27,7 ng.l 1 5,13 ng.l 1 Výhody, ktoré T. pyriformis ako model poskytuje už sme uviedli v úvode, tu zdôraznime len možnosť rýchlej detekcie toxickej látky najmä na základe stanovenia 50% inhibície aktivity acetylcholinesterázy, ako špecifického biomarkera toxického pôsobenia organofosfátov. T. pyriformis je klasický eukaryotický organizmus a preto umožňuje štúdium metabolizmu organických látok, vrátane aj biotransformácie toxických látok. Citlivosť testu je porovnateľná, dokonca aj prevyšuje citlivosť podobných testov, ktoré využívajú baranie erytrocyty, L929 fibroblasty, lymfocyty, ryby, dafnie a pod. (Ništiarová a spol., 1987; Nilsson, 1989; Huber a spol., 1990; Sauvant et al., 1994, 1999). Pri testovaní zlúčenín bol zistený dobre hodnotiteľný nárast populácie, ako i dobre merateľné aktivity acetylcholinesterázy. Pri populačných testoch sa ukazujú aj ďalšie hodnotiteľné parametre, ako ovplyvnenie generačného času, indukcia lag fázy rastu a pod. (Bonnet et al., 2003). Všetky testy toxicity organofosfátov vykazovali dávkovú závislosť a získané výsledky boli porovnateľné s našimi predchádzajúcimi údajmi (Ništiar a spol., 2003), ale inováciou stanovenia inhibície acetylcholinesterázy sa výrazne zvýšila ich presnosť a interpretačná validita. Osobitne cenné je, že pri použití testu inhibície aktivity acetylcholinesterázy sa skracuje čas testovania len na necelé 2 hodiny. Počas pokusov sme zistili, že najvyššiu toxicitu vykazuje OetylS(2diizopropyl aminoetyl)metyltiofosfonát potom metatión, dichlórvos a najmenej toxický je trichórfon. Podobne to je aj v teste inhibície aktivity acetylcholinesterázy. Ďalšie výhody sú v tom, že je možnosť pracovať s minerálnymi médiami, kde je minimalizovaná interakcia toxickej látky s organickými zložkami média a tým jej možná inaktivácia. Krátka časová relácia testu silne podporuje jeho zaradenie do arzenálu služieb zabezpečujúcich detekciu toxických látok v prostredí pri chemických haváriách, alebo v prípade detekcie bojových chemických prostriedkov pri predpokladanom bioteroristickom nasadení. Táto práca vznikla v rámci riešenia projektu VEGA č. 1/3494/

152 Literatúra 1. Benitez, L. MartinGonzalez, A. Gilardi, P. Soto, T. de Lecea, J.R. Gutiérrez, J.C.: The ciliated protozoa Tetrahymena thermophila as a biosensor to detect mycotoxins. Lett.Appl.Microbiol., 19, 1994: Bijl, J.P. Rousseau, D.M. Dive, D.G. Van Pethegem, C.H.: Potentials of a synchronized culture of Tetrahymena pyriformis for toxicity studies of mycotoxins. J.Assn.Offic.Anal.Chem., 71, 1988: Bogaerts, P. Bohatier, J. Bonnemoy, F.: Use of the ciliated protozoan Tetrahymena pyriformis for the assessment of toxicity and quantitative structureactivity relationships of xenobiotics: comparison with the microtox test. Ecotoxicol.Environ.Saf., 49, 2001: Bogaerts, P. Senaud, J. Bohatier, J.: Bioassay technique using nonspecific esterase activities of Tetrahymena pyriformis for screening and assessing cytotoxicity of xenobiotics. Environ.Toxicol.Chem., 17, 1998: Bonnet, J.L. Dusser, M. Bohatier, J. Laffosse, J.: Cytotoxicity assessment of three therapeutic agents, cyclosporinea, cisplatin and doxorubicin, with the ciliated protozoan Tetrahymena pyriformis. Res. Microbiol., 154, 2003: Elliott, A.M. (Ed.): Biology of Tetrahymena. Dowden, Hutchinson and Ross Inc., Stoudsburgh/Pennsylvania, 1973: George, P.M. Abernethy, M.H.: Improved Ellman procedure for erythrocyte cholinesterase. Clin.Chem., 29, 1983: Huber, H.C. Huber, W. Ritter, H.: Simple bioassays for evaluating toxicity of environmental chemicals using microcultures of human peripheral blood lymphocytes and monoaxenic cultures of the ciliate Tetrahymena pyriformis. Zbl. Hyg., 189, 1990: Larsen, J. Schultz, T.W. Rasmussen, L. Hoofman, R. Pauli, W.: Progress in an ecotoxicological standard protocol with protozoa: results from a pilot ringtest with Tetrahymena pyriformis. Chemosphere, 35, 1997: Mosmann, T.: Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxity assays. J.Immunol.Meth., 65, 1983: Nilsson, J.R.: On cell organelles in Tetrahymena: with special reference to mitochondria and peroxisomes. Carlsberg Res.Com., 46, 1981: Nilsson, J.R.: Tetrahymena in cytotoxicology: with special reference to effects of heavy metals and selected drugs. Eur.J.Protistol., 25, 1989: Ništiar, F. Hrušovský, J. Beneš, J.: Employment of the protozoon Tetrahymena pyriformis for testing biological material contamination by organophosphates and carbamates. Veter.Med.(Praha), 26, 1981: Ništiar, F. Hrušovský, J. Mojžiš, J. Mižik, P. Ništiarová, A.: A biological method of the determination of mycotoxins Tetrahymena pyriformis. Veter.Med.(Praha), 31, 1986: Ništiar, F. Lukačínová, A. Ništiarová, A.: Rapid bioassay that uses protozoan Tetrahymena to asses the toxicity of various xenobiotics. Lab.Diag., 8, 2003: Ništiarová, A. Ništiar, F. Bajgar, J.: Využitie baraních erytrocytov a plazmy na stanovenie nervovoparalytických látok in vitro. Veter. Med. (Praha), 32, 1987: Noever, D.A. Matsos, H.C. Cronise, R.J. Looger, L.L. Relwani, R.A.: Computerized in vitro test for chemical toxicity based on Tetrahymena swimming patterns. Chemosphere, 29, 1994: Pandey, A.C. Suryanarayana, M.V.S. Vishwakarma, V.S.: A computer program in BASIC for estimation of LD 50 of a chemical by Dixon's up and down method. Comput. Appl. Biosci., 9, 1993: Plesner, P. Rasmussen, L. Zeuthen, E., in: Zeuthen, E. (Ed.): Synchrony in Cell Division and Growth. Interscience Press, New York, 1964: Roberts, R.O. Berk, S.G.: Development of a protozoan chemoattraction bioassay for evaluating toxicity of aquatic pollutants. Toxic.Assess., 5, 1990:

153 21. Sauvant, M.P. Pepin, D. Bohatier, J. Groliére, C.A. Veyre, A.: Comparative study f two in vitro models L929 fibroblasts and Tetrahymena pyriformis (GL) for the cytotoxicological evaluation of packaged water. Sci. Total Environ., 156, 1994: Sauvant, M.P. Pepin, D. Bohatier, J. Groliére, C.A.: Microplate technique for screening and assessing cytotoxicity of xenobiotics with Tetrahymena pyriformis. Ecotoxicol.Environ.Saf., 32, 1995: Sauvant, M.P. Pepin, D. Piccini, E.: Tetrahymena pyriformis: a tool for toxicological studies. Chemosphere, 38, 1999: Schultz, T.W. Bryant, S.E. Lin, D.T.: Structuretoxicity relationships for Tetrahymena: aliphatic aldehydes. Bull.Environ.Contam.Toxicol., 52, 1994: Yoshioka, Y. Ose, Y.: A quantitative structureactivity relationship study and ecotoxicological risk quotient for the protection from chemical pollution. Environ.Toxicol.Water Qual., 8, 1993: Yoshioka, Y. Ose, Y. Sato, T.: Testing for the toxicity of chemicals with Tetrahymena pyriformis. Sci.Total Environ., 43, 1985: Zilberg, D. Sinai, T.: Optimization and validation of a colorimetric assay for Tetrahymena sp. survival. Res.Microbiol., 157, 2006: Kontaktná adresa: Prof. MVDr. František Ništiar, CSc., Phone: Department of Pathological Physiology Fax: Faculty of Medicine, Šafárik University [email protected] Trieda SNP 1, Košice, Slovak republic RISK AND BENEFICIAL USES OF SEA ALGAE (ULVA LACTUCA LINNAEUS) IN ANIMAL FEEDSTUFFS Okab, A. B. Department of Environmental Studies, Institute of Graduate Studies and Research, Alexandria University, Alex. Egypt ( [email protected]) Current Address: Slovak Agriculture Research Center, Nitra, Slovak Republic Abstract Twelve adult male Rabbits were used to evaluate the effect of feeding a diet supplemented with 1% sea algae (Ulva lactuca Linnaeus) on semen characteristics and some selected biochemical properties of seminal plasma. The averages of maximum and minimum ambient temperature during the experiment (summer season) were 34.3 ºC and 27.3 ºC, while the average of relative humidity was 72.2 %. Results revealed that motile sperm/ejaculate was significantly (P<0.05) increased during treatment period. Sperm motility and motile sperm/ml were significantly (P<0.01) increase. Meanwhile, percent of dead and abnormal sperm, and altered acrosomes were significantly (P<0.01) decreased during the treatment period. Ejaculate volume and sperm concentration were insignificantly affected by treatment. Biochemical analyses of seminal plasma showed that, initial fructose, alkaline phosohatase (ALP), and blood plasma testosterone (P<0.01) and total lipids (P<0.05) were significantly increased during treatment period. Meanwhile, Total protein, albumin, cholesterol, aspartate aminotransferase (AST) and alanine aminotransferase (ALT) were insignificantly affected by treatment. Introduction Algae are autotrophic organisms, which have potential source of food and feed for man and animals. They are rich in protein (5060%), lipids (222%), vitamins and minerals (e.g., zinc, selenium, iodine etc.). Amino acid composition of algae is comparable to that of egg protein (Chowdhury, et al., 1994 and Grigorova, et al., 2005). Some of the loss in testicular growth was 152

154 found to be associated with reduced zinc intake (Martin and white, 1992), where a role for zinc in the control of testosterone synthesis or secretion has been proposed (Prasad, 1985). Trace elements are known to be essential for the function of various enzymes and other proteins. Zinc is required for normal protein synthesis, and is necessary for reproduction, growth and wound healing (LeonhardMarek, 2000). In addition, iodine plays an important role in male fertility, and its deficiency causes a decline in libido and deterioration in semen quality (Rajendran, et al., 2002). The idea of using algae as a new approach of food for animal production is unique in the sense that they can use nature s gifts of abundant solar energy and high ambient temperature for their growth. In addition their use appears to be sustainable economically, ecologically and sociologically (Phang, 1992 and ElBanna, et al., 2005). Therefore, the objective of this study was to evaluate the effects of feeding a diet supplemented with 1% of sea algae (Ulva lactuca Linnaeus) on semen characteristics and some selected biochemical properties of seminal plasma male rabbits. Material and Methods This experiment was carried out at the Institute of Graduate Studies and Research, Alexandria University. During the experimental period (two and half month extended from 1st. July to 15th. September) the rabbits were individually housed in universal galvanized wire batteries with feed and fresh tap water offered ad libitum. Twelve adult male red baladi rabbits were weighed and divided into two groups of 6, homogeneous in age, weight and paternity. The first group was given a commercial balanced pelleted ration for breeding rabbits containing 18% crude protein, 14% crude fiber, 2% fat and 2600 kcal DE/ kg and served as a control. The second group was fed the same diet as the control but supplemented with 1% of sea algae (Ulva lactuca Linnaeus). Sea algae were obtained from Mediterranean Sea, Alexandria Government, Egypt and were analyzed at Central Laboratory, Faculty of Science, Alexandria University. Chemical analyses of Sea algae (Ulva lactuca Linnaeus) presented in Table (1). Semen collection was performed weekly using an artificial vagina at about 9 AM. Volume of semen ejaculates was recorded and ejaculates were placed on water bath at 38 ºC. Determination of initial seminal fructose was carried out immediately after collection according to the method of Mann (1948). Percentages of spermatozoal progressive motility were subjectively estimated at 400 X magnification using light microscope equipped with warm stage. Sperm cell concentrations were measured using hemocytometer slide. The percentages of dead and abnormal spermatozoa were assessed according to Blom (1983). Acrosome integrity was evaluated according to the method of Bryan and Akruk (1977). Seminal plasma was separated from ejaculates by centrifugation at 5000 rpm for 10 min. The recovered seminal plasma fraction was further centrifuged at rpm for 15 min at 4 0 C. Fractions of twoweek seminal plasma were pooled and stored at 20 ºC until analysis. Seminal plasma total protein (TP), albumin, total lipids (TL), total cholesterol concentrations and transaminase activities were determined using commercial kits obtained from Bio ADWIC, Egypt. Blood samples were obtained from each animal fortnightly from the ear vein in heparinized tubes and were placed immediately on ice. Plasma was obtained by blood centrifugation at 3,000 rpm for 20 min. and stored at 20 ºC until used. Blood plasma testosterone was determined by Enzyme Linkage Immuno Sorbant Assay (ELISA) kits obtained from Biosource Europe S.A. Belgium. The data were analyzed using the general linear model (GLM) produced by Statistical Analysis Systems Institute (SAS, 1999). Significant differences among means were evaluated using Duncan's Multiple Range Test of SAS (1999). Results and Discussion The effects of feeding of sea algae (Ulva lactuca Linnaeus) on semen quality are presented in Table (2). There were insignificant increases in ejaculate volume and sperm concentration due to the supplement of rabbit diet with 1% of sea algae. This result agrees with the finding of 153

155 (Rajendran, et al., 2002). However, sperm motility (P<0.01), motile Sperm/ml. (P<0.01) and motile Sperm/Ej. (P<0.05) were significantly increased during treatment period Table (2). Motility is involved in defining the ability of the spermatozoa to ascent the reproductive tract to the site of fertilization, as well as the act of fertilization itself, particularly the penetration of the vestments surrounding the oocyte, including the cumulus oophorus and zona pellucida. In view of the significance of sperm motility, it is not surprising that this criterion of sperm function has a central role in the routine clinical diagnosis of male fertility (Hidiroglou, et al., 1978). On the other hand, percent of dead and abnormal sperms and altered acrosomes were significantly (P<0.01) decreased during treatment (Table 2). Selenium present in algae act as an antioxidant to improve the semen quality through maintaining sperm integrity, moreover, antioxidants improve the motility of ram sperm and integrity of their acrosomes (Maxwell and Stojanov, 1996 and Okab and Ayoub, 2005). Dead spermatozoa are substantial source of reactive oxygen species (ROS) due to the breakdown of their membrane and the continued availability of unsaturated membrane fatty acids to peroxidation (Kessopoulov et al., 1992), which leads to loss of sperm motility and reduced fertilizing ability of many species (Aitken, 1994 and Lenzi et al., 1996). The antioxidant system of the cells is not potent enough to prevent lipid peroxidation completely. Although, the main beneficial effects of antioxidant supplement may reside in the delay of the sperm membrane destabilization associated with sperm aging (Maxwell and Watson, 1996) and maintenance of spermatozoal motility (Aitken, 1995). Biochemical analyses of seminal plasma showed that, initial fructose, ALP and blood plasma testosterone (P<0.01) and total lipids (P<0.05) were significantly increased during treatment periods (Table 2). Fructose formation by the accessory glands is dependent upon the secretion of testosterone by the testes (Moon and Bunga, 1971).The present findings are further confirmation of an improvement in plasma testosterone level of rabbits due to feeding a diet supplemented with 1% sea algae which contain suitable level of iodine. This results agree with the finding of Rajendran et al., (2002). The elevation in seminal plasma initial fructose in treatment group may contribute to the shortening of sperm live ability, because fructose represents the main source of energy for spermatozoa (Atterwill and Steele, 1987). Therefore, level of fructose in seminal plasma reflects testosterone action and quality of semen (Taha et al., 2000). Lipids are basic component of semen contributing to the membrane structure of spermatozoa, the metabolism of the sperm cells and to their ability to capacitate and fertilize the female gametes (Mann and LutwakMann, 1981 and Subev et al., 2005). The presence of high concentrations of long chain polyunsaturated fatty acids within the lipid structure of sperm cells requires efficient antioxidant systems to diminish peroxidative damage and associated sperm dysfunction (Selley et al., 1991; Aitken, 1994). Thus, the maintenance of high fertility appears to require the presence of optimal concentrations of polyunsaturated fatty acids together with associated antioxidant capacity (Kelso et al., 1997). Alkaline phosphatase (ALP) showed elevated overall mean values in treatment group than the control. Chauban, et al., 1993 reported that one of the consequences of acrosomal damage is the leakage of enzymes from the sperm. The leakage of ALP revealed a positive correlation between enzyme release and sperm cell integrity and acrosomal damage. Physiological parameters reveled that, feed intake, water intake and body weight gain were significantly (P<0.05) decreased by treatment (Table 3). The decrease in body weight could explained by the less digestible nutrients eaten which may resulted in less rate of digestion and less rate of outflow of nutrient from the rumen to the small tract, resulting in the observed decrease in weight gain found in treated animals. The hazardous effect of zinc contained in the algae on feed intake may be due to its effect on CNS, particularly the hypothalamus which contains a center governing feed and water consumption (Shull and Cheeke, 1983). The present results indicated that in spite of the low fertility of rabbits during hot season, the use of sea algae improved the reproductive performance of treated rabbits than the control group. It can be concluded that the use of Ulva lactuca Linnaeus as a feed additive in rabbit diets, improved sperm motility, increased the percent of live and normal sperms and decreased 154

156 the percent of dead and abnormal sperms. Also it decreased the numbers of altered acrosomes. Thus, it improved the reproductive performance of rabbits. It is very important to make enough precautions when collecting sea algae for use in animal feeding as regard to be free from contaminations with heavy metals, poisons, or toxic chemicals..etc. Otherwise, it would constitute a high risk for animal and human feeds. References Aitken, R. J. (1994). A free radical theory of male infertility. Reprod. Fertil. Dev., 6: Aitken, R. J. (1995). Free radical, lipid peroxidation and sperm function. Reprod. Fertil. Dev., 7: Atterwill, C. K. and Steele, C. E. (1987). In vitro methods in toxicology. Cambridge University Press, pp Blom, E. (1983). Pathological conditions in the genital organs and in the semen as grounds rejection of breeding bulls for import or export to or from Denmark Nordisk Veterinaermedicin 35: Bryan, J. H. and Akruk, S. R. (1977). A naphthol yellow S and Erythrosine B for use in studies of the acrosome reaction of rabbit spermatozoa. Stain Technol. 52: Chauban, M. S.; Kapila, K.; Gandhi, K. K. and Anand, S. R. (1993). Acrosome damage and enzyme leakage of goat spermatozoa during dilution, cooling and freezing. Andrologia. 26: Chowdhury, S. A.; Huque, K. S.; Khatun, M. and Nahar, Q. (1994). Study on algae as substitute of oilcake for growing cattle. In: A Report on The Use of Algae as Potential Feed Supplements For Cattle. Bangladish Livestock Research Institute, Savar, Dahaka 1341, Bangladesh, pp 926. ElBanna, S. G., A.A. Hassan, A. B. Okab, A. A. Koriem and M. A. Ayoub (2005). Effect of feeding diets supplemented with seaweed on growth performance and some blood hematological and biochemical characteristics of male Baladi Rabbits. The 4 th inter. Conf.on Rabbit Prod. In Hot Clim., Sharm Elsheikh, Egypt, Grigorova, S., Surdgijska, S., Banskalieva, V., Dimitrov, G. (2005). Dry Biomass of fresh water Algae from chlorellakind in the feed mixture of Laying Henns. Russian J. Animal Science XLII: Hidiroglou, M., Williams, C. J., Ho, S. K. and Tryphonas, L. (1978). Zinc and manganese in accessory genital glands of male sheep: Distribution, uptake and effect of testosterone. Am. J. Vet. Res. 40: Kelso, K. A.; Redpath, A.; Noble, R. C. and Speake, B. K. (1997). Lipid and antioxidant changes in spermatozoa and seminal plasma throughout the reproductive period of bulls. J. Reprod. Fertil., 109: 16. Kessopoulov, E., Tomlinson, M. J., Barratt, C. L. R., Bolton, A. E. and Cooke, I. D. (1992). Origin of reactive oxygen species in human semen: spermatozoa or leucocytes? J. Reprod. Fertil., 94: Lenzi, A., Picardo, M., Gandini, L. and Dondero, F. (1996). Lipids of the sperm plasma membrane: from polyunsaturated fatty acids considered as markers of sperm function to possible scavenger therapy. Hum. Reprod., Update, 2: LeonhardMarek, S. (2000). Why do trace elements have an influence on fertility? Tierarztliche Praxis AusgabeG, Grosstiere Nutztiere. 28: Mann, T. (1948). Fructose content and fructolysis in semen. Practical application in evaluation of semen quality. J. Agric. Sci., 38: Mann, T. and Lutwakmann, C. (1981). Biochemistry of spermatozoa: chemical and functional correlations in ejaculated semen. In: Male Reproductive Function and Semen. Themes and Trends in Physiological and Biochemical and Investigative Andrology, ed. T. Mann and Lutwak Mann, Spring Verlag, Berlin, pp Martin, G. B. and White, C. L. (1992). Effects of dietary zinc on gonadotrophin secretion and testicular growth in young male sheep. J. reprod. fertil. 96:

157 Maxwell, W. M. C. and Stojanov, T. (1996). Liquid storage of ram semen in the absence or presence of some antioxidant. Reprod. Fertil. Dev., 8: Maxwell, W. M. C. and Watson, P. F. (1996). Recent progress in the preservation of ram semen. In: Sperm Preservation and Encapsulation. Reprod. Fertil. Dev., 5: Moon, K. H. and Bunge, R. G. (1971). Seminal fructose as an indicator of androgenic activity. Critical analysis. Investig. Urol., 8: Okab, A.B. and M.A. Ayoub (2005). Role of free radicals in male infertility. Third Scientific Conference on Physiological Response to Environmental Pollutions. Dept. of Physiology, Faculty of Veterinary Medicine, Cairo University, Society of Physiological Sciences and Their Applications. Ras Sedr, (2831 July, 2005) pp 525. Prasad, A. S. (1996). Zinc deficiency in women, infants and children. J. Am. Coll. Nutr. 15: Phang, S. M. (1992). Role of algae in livestockfish integrated farming system. (Editors, T. K. Mukherjee; P. S. Moi; J. M., Panandam and Y. S. Yang). Proceedings of the FAO/IPT Workshop on Integrated LivestockFish Production System; 1620 Dec., 1991, University of Malaya, Kuala Lampur, Malysia. Pp Rajendran, D., Pattanaik, A. K., Kahan, S. A. and Besi, S. P. S. (2002). Influence of iodine on reproductive performance of bucks subabul (Leucaena leucocephala) leafmeal. Indian J. anim. sci. 72: SAS. Statistical Analysis Systems Institute (1999). SAS/STAT user s guide: release V 8 SAS institute Inc., Cary, NC. USA. Selley, M. L., Lacey M. R., Bartlett, C. M., and Ardlie, N. G. (1991). Content of significant amount of cytotoxic endproduct of lipid peroxidation in human semen. J. reprod. Fertile., 92: Shull, L. R. and Cheeke, P. R. (1983). Effects of synthetic and natural toxicants on livestock. J. Anim. Sci., 75: Subev, M., Stefanov, R. and Zahariev, Z. (2005). Improvement of Motility and cell Metabolism of ram spermatozoa by addition to sperm antioxidant. Russian J. Animal Science XLII: Taha, T. A.; AbdelGawad, E. I. and Ayoub, M. A. (2000). Monthly variations in some reproductive parameters of Barki and Awassi rams throughout 1 year under subtropical condition. I. Semen characteristics and hormonal levels. Anim. Sci., 71:

158 Table 1: Chemical Composition of Sea Algae Extracts used as Feed Supplement for Male Rabbits during the Experimental Period. Parameters Ulva lactuca Linnaeus EC ds/m 89 Major Cations: * Sodium Potasium 97.8 Calcium 70.1 Magnesium 207 Major Anions: * Carbonate 0.00 Bicarbonate 0.00 Phosphorus Iodine 185 Minor Cations: * Lead Cadmium Iron Copper Manganese Selenium Zinc * ppm 157

159 Table 2: Overall means ± SEM of Semen Characteristics, Seminal Plasma Biochemical and Blood Plasma Testosterone Constituents of Male Rabbits during Treatment with Sea Algae (Ulva lactuca Linnaeus). Parameters Control Treatment MSN P Values Semen Characteristics: Ejaculate Volume (ml) N.S Sperm Motility (%) 23.0 b 30.2 a 2.64 ** Motile Sperm / ml (x10 6 ) 11.0 b 15.5 a 1.74 ** Motile Sperm / Ej (x10 6 ) 31.0 b 38.3 a 3.74 * Dead Sperm (%) 11.5 a 8.7 b 0.44 ** Abnormal Sperm (%) 10.2 a 7.8 b 0.37 ** Sperm Concentration (x 10 6 / ml) N.S Altered Acrosomes (%) 8.6 a 6.5 b 0.27 ** Seminal Plasma Biochemical: Total Protein (gm / dl) N.S Albumin (gm / dl ) N.S Total Lipids (gm / dl) 3.93 b 4.22 a 0.20 * Cholesterol (mg / dl) N.S Initial Fructose (mg / ml) 1.81 b 2.43 a 0.09 ** AST (IU/L) N.S ALT (IU/L) N.S ALP (IU/L) 3616 b 4653 a 227 ** Blood Plasma: Testosterone (ή g/dl) 4.29 b a 0.92 ** a,b,c Within rows, means with different superscript letters differ significantly (P<0.05) * P < 0.05, ** P < 0.01 for comparing main effects. Table 3: Overall means ± SEM of Feed Intake, Water Intake and Body Weight Gain of male rabbits during treatment with sea algae (Ulva lactuca Linnaeus). Parameters Control Treatment SEM P Value Feed Intake (gm/day) 74.8 a 70.2 b 1.65 * Water Intake (ml/day) 281 a 236 b 10.4 * Body Weight Gain (gm/head/day) 1.96 a 1.85 b 0.28 * a,b,c Within rows, means with different superscript letters differ significantly * P (P<0.05) < 0.05, ** P < 0.01 for comparing main effects. 158

160 OBSAH JÓDU V SUROVOM KRAVSKOM MLIEKU V NIEKTORÝCH REGIÓNOCH SLOVENSKA IODINE CONCENTRATION IN RAW COW MILK IN SOME SLOVAKIAN REGIONS Paulíková, I., Seidel, H., Nagy, O., Kováč, G., Reichel, P., Konvičná, J. Univerzita veterinárskeho lekárstva, Košice Abstrakt Obsah jódu v mlieku bol vyšetrený v 457 vzorkách surového kravského mlieka odobratých v rôznych regiónoch Slovenska za roky Priemerná hodnota z celkového počtu vyšetrených vzoriek predstavovala 136,89 ug.l l s rozpätím 8,061790,60 ug.l 1. Z celkového počtu nami vyšetrených 457 vzoriek mlieka 113 vzoriek (29,94 %) malo obsah nižší ako 50 µg.l 1, 294 vzoriek (64,33%) bolo v rozpätí µg.l 1, 19 vzoriek (4,16%) od 200 do 500 µg.l 1, 17 vzoriek (3,72 %) medzi µg.l 1 a 13 vzoriek (2,85 %) nad 1000 µg.l 1. Koncentrácia jódu v mlieku v rôznych regiónoch Slovenska ukázala najvyššie hodnoty v chovoch západného Slovenska, potom stredného, východného a najnižšie hodnoty na severe krajiny. Z výsledkov je však zrejmá značná variabilita v rámci regiónov, ale aj chovov. Abstract Iodine concentrations were analyzed in 457 raw cow milk samples collected in various Slovakian regions in From all the samples, average concentration ug.l l was recorded with range ug.l l. Among all the samples, iodine content bellow 50 µg.l 1 was recorded in 113 samples(29.94 %), 294 samples (64.33%) ranged between µg.l 1, 19 samples (4.16%) from 200 to 500 µg.l 1, 17 samples (3.72 %) between µg.l 1, and 13 samples (2.85 %) over 1000 µg.l 1. Concentrations in the Slovakian regions showed the highest values in western, than middle, eastern, and the lowest values in the northern Slovakia. However, the results showed large variability within both regions and farms. Úvod Jód je stopový prvok potrebný pre život. Je inkorporovaný do chemickej štruktúry hormónov štítnej žľazy a jeho nedostatok spôsobuje veľmi vážne poruchy zdravia všetkých vekových kategórií ľudí aj zvierat. Poruchy zdravia sa neprejavia ihneď a až do prvých príznakov prebieha jodopénia subklinicky, čo platí aj v živočíšnej výrobe s dopadom na jej ekonomiku. Nakoľko organizmus nie je schopný jód syntetizovať je každý živý organizmus závislý na jeho príjme. Medzi hlavné zdroje jódu v potrave ľudí patrí mlieko (Herzig a Suchý, 1996, Borkovcová a Rehurková, 2001), pričom mlieko a mliečne výrobky tvoria viac ako 50% z celkového príjmu jódu (Dellavalle a Barbano, 1984). Napríklad KrajčovičováKudláčková a kol. (2001) zistili, že výlučne rastlinná potrava vyvolá príznaky deficitu jódu (obsah jódu v moči pod 100 µg.l 1 ). Koncentrácia jódu v mlieku sa mení veľmi rýchlo ako odpoveď na jeho príjem krmivom. Je dobrým indikátorom momentálneho alebo nedávneho príjmu potravou, ak je kŕmna dávka dojníc relatívne stabilná v zložení a bez prítomnosti strumigénov (Swanson a kol., 1990). Príjem jódu potrebný na to, aby hladina plazmatického jódu neklesla pod kritickú hranicu 10 µg na 100 ml (pri ktorej je pravdepodobný vznik strumy), je 120 µg na deň. Ako dostatočný príjem jódu pre dospelých a adolescentov sa odporúča príjem jódu 150 µg denne (Wayne a kol., 1993). Podľa humánnej medicíny príjem jódu u dospelých by nemal dlhodobo presiahnuť 2000 µg a u detí 1000 µg denne (Wolff, 1969). Dlhodobý príjem jodidov v 10 a viacnásobnom množstve, ako je denná potreba pre biosyntézu tyreoidných hormónov, môže vyústiť u niektorých ľudí v strumu alebo tyreotoxikózu (Wolff, 1969; Braverman a kol., 1971). Primárny cieľ tejto práce bol zmapovať obsah jódu v surovom kravskom mlieku od dojníc, nezávisle na produkcii, plemene a reprodukčného cyklu. Zámerom práce bolo 159

161 zároveň porovnane tejto suroviny ako zdroja jódu v potravovom reťazci ľudí v niektorých regiónoch Slovenska ako aj porovnanie výsledkov s doterajšími poznatkami iných autorov. Materiál a metodika. Obsah jódu v mlieku bol stanovený v 457 vzorkách surového kravského mlieka. Vzorky boli ručne vydojené z každej štvrte vemena dojníc po umytí bez jódového dezinfekčného prostriedku. Dojnice pochádzali z 23 chovov z rôznych regiónov Slovenska, ktoré sme zoradili podľa abecedy a zatriedili do štyroch skupín podľa polohy v krajine západ, stred, východ a sever. Vzorky mlieka boli vyšetrené fotometrickou metódou stanovenia stôp jódu v potravinách na základe katalytickej reakcie NO2/SCN (Tušl, 1983). Výsledky boli sumarizované, vyhodnotené percentuálne a spracované štatisticky s udaním aritmetického priemeru (x), smerodajnej odchýlky (sd) a vyznačením minimálnych a maximálnych hodnôt v jednotlivých chovoch a spolu. Výsledky a diskusia Zistené hodnoty jódu v mlieku v rôznych regiónoch Slovenska sú uvedené v tabuľkách 1 5. Tabuľka 1. Obsah jódu v mlieku (µg.l 1 ) v rôznych regiónoch Slovenska (x±sd) Región Západ Stred Východ Sever Celkom x 160,98 153,63 75,87 51,10 136,89 sd 297,94 297,99 116,43 8,90 258,24 min. 9,20 43,72 8,06 44,32 8,06 max. 1790, , ,92 82, ,6 n Tabuľka 2. Obsah jódu v mlieku (µg.l 1 ) v rôznych chovoch západného Slovenska (x±sd) Chov A B C D E F G H x 44,12 56,29 119,85 54,62 60,29 109,38 221, ,42 sd 32,52 7,81 86,30 2,53 4,95 56,24 126,31 393,15 min. 9,20 40,63 51,58 51,96 51,90 56,72 70,24 650,00 max. 92,74 84,91 337,30 59,24 68,56 273,30 497, ,60 n Tabuľka 3. Obsah jódu v mlieku (µg.l 1 ) v rôznych chovoch stredného Slovenska (x±sd) Tabuľka 4. Obsah jódu v mlieku (µg.l 1 ) v rôznych chovoch severného Slovenska (x±sd) Chov I J Chov V X x 259,17 48,08 x 45,97 54,52 s 401,70 1,87 s 1,64 10,12 min. 47,88 43,72 min 44,32 44,69 max. 1182,13 50,40 max 50,55 82,91 n n Tabuľka 5. Obsah jódu v mlieku (µg.l 1 ) v rôznych chovoch východného Slovenska (x±sd) K L M N O P Q R S T U x 56,32 87,11 839,33 52,93 57,79 55,39 67,43 345,20 64,12 62,49 46,54 s 2,53 5,88 306,95 4,61 18,48 1,90 15,74 426,73 17,31 15,55 90,19 min. 53,30 76,10 206,87 42,87 44,60 52,79 43,97 61,87 37,04 41,74 8,06 max. 60,61 95, ,0 63,93 135,81 169,22 97, , 103,19 91,10 230,58 n

162 Podľa zahraničných údajov prirodzený obsah jódu v mlieku sa pohybuje v rozmedzí od 10 do 4840 µg.l 1, najčastejšie v rozpätí µg.l 1 ( Šucman a kol., 1984). Napríklad Park a kol. (1981) zistili u dospelej populácie v USA, že mliečne produkty sa podieľajú na príjme jódu 56 %. Analýza mlieka z približne 2500 chovov ukázala, že 62 % chovov malo obsah jódu v mlieku nižší ako 200 µg.l 1, 28 % medzi 200 a 500 µg.l 1 a 7 % medzi 200 a 1000 µg.l 1. Takmer 3 % chovov mali obsah jódu v mlieku vyšší ako 1000 µg.l 1. Podľa Ankeho a kol. (1998) sa za normálny obsah jódu v mlieku považuje 50 µg.l 1. Na Slovensku zistené hodnoty zo sedemdesiatych rokov sa pohybovali v rozmedzí od 21 do 103 ug.l 1 (Görner, 1979). Ďalej uvádza, že v neendemickej oblasti bol priemerný obsah jódu v mlieku 89,24 ug.l 1, v nížinnej endemickej oblasti 52,57 ug.l 1 a v horskej endemickej oblasti 31,02 ug.l 1. Z celkového počtu nami vyšetrených 457 vzoriek mlieka 113 vzoriek (29,94 %) malo obsah nižší ako 50 µg.l 1, 294 vzoriek (64,33%) bolo v rozpätí µg.l 1, 19 vzoriek (4,16%) od 200 do 500 µg.l 1, 17 vzoriek (3,72 %) medzi µg.l 1 a 13 vzoriek (2,85 %) nad 1000 µg.l 1. Koncentrácia jódu v mlieku v rôznych regiónoch Slovenska ukázala najvyššie hodnoty v chovoch západneho Slovenska, potom stredného, východného a najnižšie hodnoty na severe Slovenska, pričom nami zistené hodnoty sú väčšinou značne vyššie ako hodnoty, ktoré uvádza Görner (1979). Podobný nárast obsahu jódu v mlieku zaznamenali oproti minulosti aj v iných krajinách (Trávniček a kol., 2006). Z výsledkov je však zrejmá značná variabilita v rámci regiónov, ale aj chovov. Koncentrácia jódu v mlieku závisí od množstva faktorov, predovšetkým je to jeho príjem potravou (Swanson a kol., 1990; Kroupová a kol., 2001), ale aj ročné obdobie (Groppel a Anke, 1991; Dahl a kol., 2003; Trávniček a kol., 2006), úpravou (Herzig a Suchý, 1996; Bobek, 1998) a časom zberu krmiva (Trávniček a kol., 2004). Záver Z našich výsledkov vyplýva, že nami zistené koncentrácie jódu v surovom kravskom mlieku zodpovedajú hodnotám uvádzaným i v literatúre. Pri porovnávaní rôznych regiónov Slovenska sme zistili najvyššie hodnoty v chovoch západneho Slovenska, potom stredného, východného a najnižšie hodnoty na severe Slovenska. Z výsledkov je však zrejmá značná variabilita v rámci regiónov, ale aj chovov. Výsledky bude potrebné doplniť o väčší počet analýz, hlavne z oblasti stredného a severného Slovenska. Literatúra 1. Anke, M., Dorn, W., Gunstheimer, G., Arnhold, W., Glei, M., Anke, S., Lösch, E. (1998): Effect of trace and ultratrace elements on reproduction performance of ruminants. Vet. Med.Czech, 43: Bobek, S. (1998): Iodine prophylaxis in animals. Medycyna Weterynaryjna, 54: Borkovcová, I. a Rehurková, I. (2001): Study of iodine exposure in foodstuffs (in Czech). Report of National Institute of Public Health. 6: Braverman L. E., Vagenakis, A. G., Wang, C. A., Malof, F., Ingbar, S. H. (1971): Studies on the pathogenesis of iodine myxedema. Trans. Ass. Amer. Physicians., 84: Dahl, L., Opsahl, J. A., Meltzer, H. M., Julshamm, K. (2003): Iodine concentration in Norwegian milk and dairy products. Br. J. Nutr. 90: Dellavalle, M. E. a Barbano, D. M. (1984): Iodine Content of Milk and Other Foods. J. Food Protection. 9: Görner, F., Kollár, F., Havelka, B., Knop, J. (1979): Problematika obsahu jódu v mlieku. Veterinářství. 10: Groppel, B. a Anke, M.: Iodine content in foodstuffs and iodine intake of adult in central Europe. In: Momčilovič, B. (1991): Trace Elements in Man and Animals. 7. University of Zagreb, Croatia, Yugoslavia Herzig, I. a Suchý, P. (1996): Actual experience of importance iodine for animals. Veterinarni Medicina, 41:

163 10. KrajcovicovaKudlackova, M., Buckova, K., Klimes, I., Sebokova, E. (2001): Iodine deficiency at alternative and traditional nutrition. Bulletin of Food Research (slovak Republic), 40: Kroupová, V., Herzig, I., Kursa, J., Trávniček, J., Ther, R. (2001): Level of iodine intake by cows in Czech Republic. Veterinářství, 51: Park, Y. K., Harland, B. F., Vanderveen, J. E., Shank,F. R., Prosky, L. (1981): Estimation of dietaryiodineintake of Americans in recent years. J. Am. Diet. Assoc. 79: Swanson, E. W., Miller, J. K., Mueller, F. J., Patton, C. S., Bacon, J. A., Ramsey, N. (1990): Iodine in Milk and Meat of Dairy Cows Fed Different Amounts of Potassium iodine or Ethylenediamine Dihydroiodide. J. Dairy Sci. 73: Šucman, E., Cvak, Z., Kalous, F., Synek, O.: (1984): Some question concerning the iodine content in milk. Acta Vet. Brno, 53: Trávniček, J., Kroupová, V., Soch, M. (2004): Iodine content in bulk feed in western and southern Bohemia. Czech J. Anim. Sci., 49: Trávniček, J., Herzig, J., Kursa, J., Kroupová, V., Navrátilová, M. (2006): Iodine content in raw milk. Vet. Med. (Czech) 51: Tušl, J. (1983): Fotometrické stanovení stop jodu v potravinách na základě katalytické reakce NO2/SCN. Chemické listy, 7: Wayne, E. J.. Koutras, D. A.. Alexander, W. D. (1993): Clinical aspects of iodine metabolism. Blackwell publ., New York: Wolf, J. (1969): Iodine Goiter and the pharmacological effects of excess iodine. Amer. J. Med. 47: Kontaktná adresa::mvdr. Iveta Paulíková, Klinika prežúvavcov, Univerzita veterinárskeho lekárstva, Komenského 73, Košice, [email protected] VPLYV LEPTÍNOVÉHO GÉNU NA VYBRANÉ JATOČNÉ UKAZOVATELE HOVÄDZIEHO DOBYTKA THE INFLUENCE OF LEPTIN GENE TO SELECTED BUTCHER INDICATORS OF BEEFCATTLE Pavličová, S., Kačániová, M., Angelovičová, M. Slovenská poľnohospodárska univerzita, Nitra Abstract The aims of this study were to detection of leptin gene at beefcattle by polymerase chain reaction and Real time PCR method and to determination of leptin gene concentration by Real time PCR method and to determine correlation between leptin gene concentration and selected butcher indicators of beefcattle. We were used bullscalf (40 samples) like biological material in our experiments. We found the leptin gene in all samples. We were monitored also body weight, butcher wroughted body, average daily growth of body weight and butcher recovery. The minimal leptin gene concentration was 2,45 µg. µl 1, maximal leptin gene concentration was 36,89 µg. µl 1 and average leptin gene concentration was 12,78 µg.µl 1. The minimal body weight was 430 kg, maximal body weight was 607 kg and average body weight was 514,93 kg. The minimal weight of butcher wroughted body was 241 kg, maximal weight of butcher wroughted body was 341 kg and average weight of butcher wroughted body was 288,38 kg. The minimal butcher recovery was 53,67 %, maximal butcher recovery was 57,99 % and average butcher recovery was 55,50 %. The minimal average daily growth of body weight was 0,52 kg, maximal average daily growth of body weight was 0,87 kg and average value of average daily growth of body weight was 0,75 kg. Key words: beef.cattle, leptin gene, body weight, butcher recovery 162

164 Úvod Prudké zmeny v spôsobe výživy zapríčiňujú u prežúvavcov zmeny v koncentrácii leptínu. U dospelých jedincov koncentrácia leptínu stúpa 2násobne, a to až 5 dní po zvýšenom príjme krmiva. Hladovanie zase spôsobuje prudký pokles koncentrácie leptínu v krvnej plazme. Dlhodobo obmedzený príjem potravy spôsobuje zníženie koncentrácie leptínu u dospelých a gravidných oviec a u jahniat (Blache et al., 2000). Koncentrácia leptínu klesá pri zníženom príjme potravy a stúpa pri jeho zvýšení (Delavaud et al., 2000). Identifikácia leptínového génu je spojená s reguláciou príjmu krmiva, s metabolizmom, akumuláciou telesnej energie, reprodukciou a imunitou. V humánnej medicíne je táto problematika spojená so zvýšeným výskytom obezity v západných krajinách a jej negatívnym vplyvom na zdravie. Hlavným cieľom týchto pozorovaní je identifikovať príčiny porušenia rovnováhy energie ovplyvňujúce obéznych jedincov. V živočíšnych vedách príjem sušiny súvisí s produkciou, efektívnosťou, kvalitou produktov a rentabilitou. Rovnováha negatívnej energie a zníženej chuti do jedla sú často spojené so zníženou funkciou imunity. Napríklad, najviac zdravotných problémov a problémov s reprodukciou u vybraných dojníc sa vyskytuje počas skorej laktácie a tieto problémy súvisia s rovnováhou negatívnej energie (Ingvartsen et al., 2001). Je známe, že sekrécia leptínu je úzko spojená s množstvom telesného tuku u myší, ľudí a prežúvavcov. Je tiež dokázané, že existuje pozitívny vzťah medzi cirkulujúcim leptínom a obsahom tuku u hovädzieho dobytka (Brockman et al., 2000). Koncentrácia leptínu v krvnej plazme sa pohybuje od 5,3 do 9,5 ng.ml 1 v období pred oplodnením a v strede gravidity. Na konci gravidity a počas laktácie koncentrácia leptínu prudko klesá. Tieto zmeny k koncentrácii leptínu úzko súvisia so zmenami v expresii leptínového génu v tukových tkanivách. To znamená, že gravidita u oviec súvisí so zvyšovaním koncentrácie leptínu, podobne ako u ľudí a hlodavcov. Placenta u prežúvavcov obsahuje len veľmi nízku koncentráciu leptínovej mrna a preto nemá žiadny vplyv na produkciu leptínu (Ehrhardt et al., 2001). Ako sa predpokladalo, telesná hmotnosť má vplyv na kolísanie spojené s časom začiatku dospievania a súvisí s obsahom leptínu. Koncentrácia leptínu sa zvyšuje lineárne od 16 týždňa života až do 1 roka jalovíc, kedy je dosiahnutá pohlavná dospelosť. Tiež sa zvyšuje koncentrácia leptínovej mrna, a to až do konca dospievania (Garcia et al., 2002). IGF1, ktorý je viac premenlivý ako leptín ma stúpajúcu tendenciu, a to o 21 %, od 10 týždňa života, koncentrácia leptínu sa zvyšuje o 34 % u dospelých kráv a to najmä od skorej zimy až do jari. Keď sa testovali dospelé kravy a sexuálne dospelé jalovice, zistila sa klesajúca tendencia leptínu počas skorej folikulárnej fázy. Táto klesajúca tendencia súvisí so štatisticky významným poklesom leptínovej mrna (Garcia et al., 2002). Aktivita leptínového génu a koncentrácia leptínu u hovädzieho dobytka sa mení v závislosti od veku, výživy a tiež od prostredia. Avšak, niektoré štúdie indikujú, že génová aktivita aj sérová koncentrácia leptínu sa zvyšuje pred dospievaním u jalovíc, ale doposiaľ nie je celkom jasný vzťah medzi leptínom a sexuálnou dospelosťou u týchto druhov. Najdôležitejšie informácie sa týkajú schopnosti exogénneho leptínu stimulovať sekréciu LH u nenasýteného dobytka a tieto účinky sú priame hlavne na adenohypofýzovej úrovni (Pan a Kastin, 2001). Materiál a metodika Pri riešení vedeckého problému sme sa zamerali na: detekciu leptínového génu pomocou klasickej PCR metódy a real time PCR, stanovenie vzájomných vzťahov medzi koncentráciou leptínu a vybranými jatočnými ukazovateľmi hovädzieho dobytka pomocou Real time PCRmetódou. Ako biologický materiál sme použili krv hovädzieho dobytka, z ktorej sme izolovali DNA. Odobrali sme 40 vzoriek z plemena slovenský strakatý dobytok. Sledovali sme nasledovné ukazovatele: koncentráciu leptínu v µg. µl 1, živú hmotnosť v kg, hmotnosť 163

165 jatočného tela po zabití v kg, jatočnú výťažnosť v % a priemerný denný prírastok živej hmotnosti v kg. Reakčná zmes PCR metódy zahŕňala zložky v nasledovných výsledných koncentráciách: 5 pmol každého primera, 1,5 mm MgCl 2, 0,2 mm dntp, 1,0 U Taq DNA polymerázy (Invitrogen), PCR reakčný roztok (200 mm TrisHCL ph 8,4, 500 mm KCl) a približne 50 ng DNA. Použité primery: Forvard (FOR) 5 ' ATGCGCTGTGGACCCCTGTAT C 3', Revers (REV) 5' TGGTGTCATCCTGGACCTTCC 3 '. Počty cyklov pri PCR 1. Denaturačný krok 94 C, 2 min, 2. Denaturácia 94 C 20 s, 3. Annaeling 55 C 30 s, 4. Syntéza 72 C 30 s, Denaturácia annealing a syntéza sa opakujú 35 krát, Posledným krokom je pôsobenie teploty 72 C, počas 10 minút. Identifikácia a analýza izolovanej DNA bola uskutočnená elektroforeticky v agarózovom géle. Na prípravu agarózových gélov (Sambrock et al., 1989) sme použili agarózu (Invitrogen) a 1x TBE roztok (89 mmol.l 1 TrisHCl, 89 mmol.l 1 kyselina boritá, 2 mmol.l 1 EDTA) pričom výsledná koncentrácia gélu bola 3,5 %. Gél obsahoval aj interakčné činidlo etídium bromid (5 µl.ml 1 ). Elektroforéza prebiehala v 1xTBE roztoku pri maximálnom napätí 5 V na 1 cm a vzdialenosti elektród (80120 V) po dobu 3090 minút. Vzorky boli nanášané spolu s 6 x farbiacim nanášacím roztokom (0,25 % brómfenolová modrá, 40 % sacharózy, 0,10,2 M roztok EDTA) v pomere 5:1 (PCR produkt : nanášací roztok). Pri elektroforetickej identifikácii štiepených fragmentov sme nanášali celý objem štiepenej zmesi spolu s farbiacim roztokom. Po skončení elektroforézy sme nadelené fragmenty detekovali UV transiluminátorom. Pre presné určenie veľkosti fragmentov sme používali DNA hmotnostné markery (DNA Ladder bp, Promega). Výsledný PCR produkt mal veľkosť 94 bp. Výsledky stanovení sú vyhodnotené graficky a matematickoštatistické analýzy variability sú spracované v tabuľkách. Matematickoštatistické analýzy (aritmetický priemer, smerodajná odchýlka, štandardná chyba, variačný koeficient) boli spracované na počítači Pentium V. s použitím programového systému Statgraffic 5. Výsledky a diskusia Najnižšia koncentrácia leptínu u slovenského strakatého dobytka (mladé býky) bola 2,45 µg.µl 1. Najvyššia koncentrácia leptínu bola 36,89 µg.µl. Priemerná koncentrácia leptínového u slovenského strakatého dobytka génu bola 12,78 µg.µl 1 (tab. 1). Na základe polymorfizmu leptín kódujúceho génu aj genotyp daného jedinca vplýva na periférnu koncentráciu leptínu v krvi gravidných kráv. V prvých dňoch po pôrode kráv vysoká hladina leptínu z obdobia státia nasucho v krvnej plazme prudko klesne a v priebehu rôzne dlhej doby aj zotrváva na nízkej úrovni. Najnižšia koncentrácia leptínu v krvi sa vyskytuje v čase medzi 4. a 32. dňom laktácie a súvisí s najvýraznejšou energetickou negatívnou bilanciou. Tento úkaz nebol pozorovaný pri kravách neprodukujúcich mlieko, v koncentrácii leptínu zaznamenané zníženie jednoznačne vysvetľuje laktáciou zapríčinená negatívna energetická bilancia. Hladina leptínu v plazme niekoľko týždňov po pôrode vykázala pozitívny súvis s koncentráciou inzulínu a glukózy a negatívnou koreláciou s koncentráciou STH a neesterifikovaných mastných kyselín (NEFA). Podľa týchto údajov sa dá právom uzatvárať, že leptín hrá významnú úlohu v regulácii negatívnej energetickej bilancie v niekoľkých týždňoch po pôrode (Delavaud et al., 2000). Najnižšia živá hmotnosť u slovenského strakatého plemena bola 430,00 kg. Najvyššia živá hmotnosť bola 607,00 kg. Priemerná živá hmotnosť u slovenského strakatého plemena bola 514,93 kg (tab. 1). 164

166 Najnižšia hmotnosť jatočne opracovaného tela v teplom stave u slovenského strakatého dobytka bola 241,00 kg. Najvyššia hmotnosť jatočne opracovaného tela v teplom stave bola 341,00 kg. Priemerná hmotnosť jatočne opracovaného tela v teplom stave u slovenského strakatého dobytka bola 288,38 kg (tab. 1). Page et al. (2001) hodnotili vplyv pohlavia a plemena, kde sa zvieratá chovali, na kvalitu hovädzieho mäsa. Hmotnosť jatočne opracovaných tiel bola 340 ± 43 kg. Kvalitu jatočného tela špecializovaných mäsových plemien porovnávali Šubrt et al. (2004). Najvyššiu prepočítanú hmotnosť (nad 700 kg) zistenú z hmotnosti jatočne opracovaného tela a vyššiu hmotnosť jatočne opracovaného tela ako 400 kg bola zistená u plemena Galloway, plavý akvitánský dobytok a mäsový simentál. Najmenšiu hmotnosť jatočne opracovaného tela autori zistili u slovenského strakatého dobytka a býkov holštajnského plemena (pod 300 kg) rovnako ako v našich výsledkoch. Najnižšia jatočná výťažnosť u slovenského strakatého plemena bola 53,67 %. Najvyššia jatočná výťažnosť bola 57,99 %. Priemerná jatočná výťažnosť bola u slovenského strakatého plemena 55,50 % (tab. 1). Najnižší priemerný denný prírastok živej hmotnosti u slovenského strakatého plemena bol 0,52 kg. Najvyšší priemerný denný prírastok živej hmotnosti bol 0,87 kg. Priemerná hodnota priemerného denného prírastku živej hmotnosti u slovenského strakatého plemena bola 0,75 kg (tab. 1). Bartoň et al. (1998) porovnávali kvalitu mäsa krížencov po otcoch plemena Charolais a belgickej modrobielej s matkami červenej a čiernostrakatej populácie. Zvieratá boli v priebehu experimentu kŕmené rovnakou kŕmnou dávkou na priemerný denný prírastok 1,3 kg. Vplyvom porážkovej hmotnosti do 430 a nad 431 kg a intenzitou rastu (do 1,05 a nad 1,051 kg priemerného denného prírastku) na vybrané ukazovatele mäsovej úžitkovosti holštajnských volov sa zaoberal Chládek a Ingr (2003). Tabuľka 1 Základné štatistické charakteristiky u slovenského strakatého dobytka Ukazovateľ n x s s x v % ŽH v kg ,93 44,65 7,06 8,67 JOT v kg ,38 31,17 4,93 10,81 JV v % 40 55,50 1,11 0,17 1,99 PDP v kg 40 0,75 0,07 0,01 9,56 Leptín v µg.µl ,78 9,64 1,52 75,42 ŽH v kg živá hmotnosť v kg, JOT v kg jatočne opracované telo v kg, JV v %jatočná výťažnosť v %, PDP v kg priemerný denný prírastok v kg, n počet zvierat, x x priemerné, s štandardná odchýlka, s štandardná chyba, vvariačný koeficient x Záver V našich experimentoch sme použili ako biologický materiál 40 vzoriek krvi z býkov plemena slovenský strakatý dobytok. Na základe výsledkov molekulárno genetickej detekcie leptínového génu sme zistili jeho prítomnosť vo všetkých sledovaných vzorkách. Okrem koncentrácie leptínu sme sledovali a vyhodnotili aj živú hmotnosť v kg, hmotnosť jatočne opracovaného tela v kg, jatočnú výťažnosť v % a priemerný denný prírastok živej hmotnosti v kg. Koncentrácia leptínu sa pohybovala od 2,45 µg. µl 1 do 36,89 µg. µl 1 a priemerná koncentrácia leptínu bola 12,78 µg.µl 1. Živá hmotnosť sa pohybovala od 430 do 607 kg a priemerná živá hmotnosť bola 514,93 kg. Hmotnosť jatočne opracovaného tela sa pohybovala od 241 do 341 kg a priemerná hmotnosť jatočne opracovaného tela bola 288,38 kg. Jatočná výťažnosť sa pohybovala od 53,67 % do 57,99 % a priemerná hodnota jatočnej výťažnosti bola 55,50 %. 165

167 Priemerný denný prírastok živej hmotnosti sa pohyboval od 0,52 do 0,87 kg a priemerná hodnota priemerného denného prírastku živej hmotnosti bola 0,75 kg. Pri sledovaní koncentrácie leptínu u hovädzieho dobytka odporúčame použiť väčšiu skupinu zvierat rôznych plemien. Okrem nami sledovaného plemena odporúčame sledovať aj ďalšie plemená hovädzieho dobytka. Pri sledovaní koncentrácie leptínu odporúčame dať do vzťahov aj ďalšie ukazovatele výkrmu výkrmu hovädzieho dobytka. Literatúra BARTOŇ, L. TESLÍK, V. HERRMANN, H. ZÁHRADKOVÁ, R Porovnání masné úžitkovosti kříženců po otcích plemen charolais a belgické modrobílé a byků českého strakatého skotu. In Czech journal of animal science, roč.43, 1998, č. 5, s BLACHE, D. TELLAM, R.L. CHAGAS, L.M. et al Level of nutrition affects leptin concentrations in plasma and cerebrospinal fluid in sheep. In J. Endocrinol., 2000, s BROCKMANN, G.A. KRATZSCH, J. HALEY, C.S. et al Single QTL effects, epistasis and pleiotropy account for twothirds of the phenotypic F(2) variance of growth and obesity in DUGi DBA/2 mice. In Genome Res., 2000, č. 10, s BRONSON, F.H Puberty in female rats: relative effect of excercise and food restriction. In Am. J. Physiol., 1987, s DELAVAUD, C. BOCQUIER, F. CHILLIARD, Y. et al Plasma leptin determination in ruminants: effect of nutritional status and body fatness on plasma leptin concentration assessed by a specificria in sheep. In J. Endocrinol., 2000, s EHRARDT, R.A. SLEPETIS, R.M. BELL, A.W. et al Maternal leptin is elevated during pregnancy in sheep. In Domest. Anim. Endocrinol., 2001, s GARCIA, M.R. AMSTALDEN, M. WILLIAMS, S.W. et al Serum leptin and its adipose gene expression during pubertal develpoment, the estrous cycle and different seasons in cattle. In J. Anim. Sci., 2002, s CHLÁDEK, G. INGR, I Meat quality and beef production parameters of Holstein steer fattened up to months of age. In Czech J. Anim. Sci., roč. 48, 2003, č. 11, s INGVARSTEN, K.L. DEWHURST, R.J. FRIGGENS, N.C On the relationship between lactational performance and health: is it yield or metabolic imbalance that causes production diseases in dairy cattle. In Livest. Prod. Sci., 2001, s PAGE, J. K. WULF, D.M. SCHWOTZER, T.R A survey of beef muscle color and ph. In J. Anim. Sci., roč. 79, 2001, s PAN, W.H. KASTIN, A.J Diurnal variation of leptin entry from blood to brain involving partial saturation of the transport systém. In Life Sci., 2001, s ŠUBRT, J. KRÁČMAR, S. FILIPČÍK, R Vliv porážkové hmotnosti a užitkového typu býků na obsah proteinu a profil aminokyselin v musculus longissimus thoracis. In Mezinárodní vědecká konference PROTEINY 2004.,MZLU v Brně , 7679, ISBN: Kontaktná adresa: Ing. Simona Pavličová, Katedra hygieny a bezpečnosti potravín, FBP, SPU v Nitre, [email protected] 166

168 VZŤAH MEDZI LEPTÍNOVÝM GÉNOM A ŽIVOU HMOTNOSŤOU JEDNOTLIVÝCH PLEMIEN OŠÍPANÝCH RELATION BETWEEN LEPTIN GENE AND BODY WEIGHT IN SELECTED PIGS BREEDS Pavličová, S., Kačániová, M., Angelovičová, M. Slovenská poľnohospodárska univerzita, Nitra Abstrakt The aim of this study was detection of leptin gene in two pigs breeds by Real time PCR method, determination of leptin concentration in individual pigs breeds by Real time PCR methods and detection of correlation between leptin gene concentration and body weight of pigs. Pigs of breeds Landras (7 samples) and biela ušľachtilá (7 samples) were used. The minimal concentration of leptin gene was µg. ml 1 in breed biela ušľachtilá and maximal concentration of leptin gene was µg. ml 1 in Landras, the average concentration of leptin gene was µg.µl 1. The minimal body weight was kg in breed biela ušľachtilá, the maximal body weight was kg in Landras and average body weight was kg. Key words: leptin gene, body weight, pigs, Landras, Úvod Regulátorom génovej expresie leptínu u ľudí, hlodavcov a ošípaných je momentálny stav metabolizmu, konkrétne rovnováha prijatej a vydanej energie. Hladovanie spôsobuje zníženú reguláciu génovej expresie leptínu, a to hlavne u ľudí a hlodavcov. Avšak, obmedzená regulácia génovej expresie leptínu spôsobená hladovaním je oveľa miernejšia u ošípaných, v porovnaní s ostatnými druhmi (Lin et al., 2001). Jeden z možných faktorov, ovplyvňujúcich reguláciu expresie leptínu v tukových tkanivách je hexozamín. Avšak tento spôsob regulácie u ošípaných nebol doposiaľ preskúmaný. Je hypoteticky možné, že hormóny alebo metabolity, ktoré sú zmenené počas obmedzeného príjmu potravy, spôsobujú zmeny v regulácii génovej expresie leptínu. Inzulín a glukóza, ktoré sú značne redukované počas hladovania, sú potenciálnymi regulátormi expresie leptínu u potkanov a u ľudí. Je tiež dokázané, že inkubácia podkožného tukového tkaniva získaného zo 70 kg ošípaných s rôznou koncentráciou inzulínu, zvyšuje množstvo leptínovej mrna (Leininger et al., 2000). Leptín je u mnohých druhov dôležitým faktorom, ktorý je súčasťou imunitného systému. Leptín sa podieľa na tvorbe krvi, ovplyvňuje funkciu imunitného systému a dráždivosť. Deficit leptínu vedie ku genetickým abnormalitám (Fantuzzi, Faggioni, 2000). Regulácia imunitného systému je u ošípaných veľmi dôležitá z hľadiska ochorení a má aj významný dopad na vývin svaloviny (Spurlock, 1997). Zloženie mäsa a obsah tuku sú dôležitými charakteristikami, ktoré poukazujú na kvantitatívne odchýlky medzi populáciamu ošípaných. Kvantitatívna charakteristika je kontrolovaná mnohými génmi, ktoré môžu prispieť k fenotypovým rozdielom a tiež sú ovplyvnené enviromentálnymi faktormi. Na tomto základe boli pre ošípané vyvinuté komplexné genetické mapy, ktoré obsahujú rôzne gény ovplyvňujúce telesnú stavbu (Malek et al., 2001). Neuenschwander et al. (1996) ako prví čiastočne identifikovali sekvenciu cdna pre leptín ošípaných. Ramsay et al. (1998) identifikovali celú dĺžku regiónu kódujúceho leptínový gén. Navyše dokázali, že hladina leptínu u obéznych ošípaných je približne o 306 % vyššia ako u hybridných ošípaných. U ošípaných bolo popísaných sedem polymorfizmov leptínového génu. Materiál a metodika Pri experimentálnych pokusoch sme sa zamerali na detekciu leptínového génu u dvoch plemien ošípaných pomocou Real time PCR metódy, na určenie koncentrácie leptínu 167

169 u jednotlivých plemien ošípaných Real time PCR metódou a na zistenie vzájomných vzťahov medzi koncentráciou leptínu a živou hmotnosťou ošípaných. Vzájomné vzťahy medzi koncentráciou leptínu a živou hmotnosťou ošípaných sme stanovili pomocou Real time PCR metódou. Ako biologický materiál sme použili krv ošípaných. Vzorky ošípaných boli odobraté z nasledovných plemien: 7 vzoriek plemena biela ušľachtilá a 7 vzoriek plemena Landras. Na Real time PCR metódu sme použili nasledovné typy primerov: Forvard (FOR) 5 ' ATGCGCTGTGGACCCCTGTAT C 3' Revers (REV) 5' TGGTGTCATCCTGGACCTTCC 3 ' Vlastná PCR prebehla v termocykleri MJ Mini Opticon Real time PCR System (Biotech). DyNAmo TM HS SYBR Green qpcr kit slúži na kvantitatívnu analýzu vzoriek DNA z rôznych zdrojov v reálnom čase. Kvantitatívna qpcr je vhodná metóda na zistenie génovej expresie, detekciu patogénov, vírusov a mnoho ďalších aplikácií. Práca DyNAmo TM HS SYBR Green qpcr kitu je založená na horúcom štarte modifikovanej Thermus brockianus DNA polymerázy a SYBR Green I fluorescenčnom farbení. Nešpecifické viazanie DNA domén je zastavené Tbr DNA polymerázou. Doména prepožičiava fyzikálnu stabilitu komplexu polymeráza DNA. Počiatočná denaturácia v protokole PCR aktivuje Tbr polymerázu. SYBR Green I je špecifický pre dvojvláknovú DNA a fluoreskuje pri amplifikácii DNA. Chemická reakcia DyNAmo TM HS SYBR Green qpcr kitu je aplikovateľná u väčšiny PCR prístrojov pracujúcich v reálnom čase. Použitý protokol pri RTQ PCR 1. Úvodná denaturácia pri teplote 94 C, 4 min 2. Denaturácia pri teplote 94 C, 20 s 3. Annealing pri teplote 55 C, 30 s 4. Predlžovanie pri teplote 72 C, 30 s 5. Čítanie 6. Od 2 kroku opakovanie 40 krát 7. Inkubácia pri teplote 72 C, 10 min 8. Krivka topenia od 72 C do 92 C, čítanie každých 0,5 C, prerušenie 5 s 9. Inkubácia pri teplote 10 C 10. Koniec Výsledky stanovení sú vyhodnotené graficky a matematicko štatistické analýzy variability sú usporiadané v tabuľkách. Matematicko štatistické analýzy (aritmetický priemer, smerodajná odchýlka, štandardná chyba, variačný koeficient) boli vykonané na počítači Pentium V. s použitím programového systému Statgraffic 5. Výsledky a diskusia V súlade s vytýčenými cieľmi práce sme sa zamerali na vzťah koncentrácie leptínového génu v µg. µl 1 k živej hmotnosti v kg u plemien ošípaných Landras a biela ušľachtilá. Expresia a sekrécia leptínu je preukázne korelovaná s reguláciou príjmu potravy, energetickým metabolizmom a hmotnosťou tela, preto sa LEP gén považuje za kandidátny gén pre hrúbku chrbtovej slaniny, s potrebou krmiva a prírastok hmotnosti (Remesár et al., 1997). Koncentrácia leptínu klesá pri zníženom príjme potravy a stúpa pri jeho zvýšení (Maraček et al., 2004). Najnižšia koncentrácia leptínu u kancov plemena biela ušľachtilá bola 18,34 µg.µl 1. Najvyššia koncentrácia leptínu bola 21,54 µg.µl 1. Priemerná koncentrácia leptínu kancov plemena biela ušľachtilá bola 20,06 µg.µl 1 (tab. 1). Najnižšia koncentrácia leptínu u kancov plemena Landras bola 19,24 µg.µl 1. Najvyššia koncentrácia leptínu bola 24,34 µg.µl 1 Priemerná koncentrácia u kancov plemena Landras leptínu bola 20,76 µg.µl 1 (tab. 2). 168

170 Pomerné zastúpenie parciálnych častí jatočnej polovičky je značne variabilné, pričom toto konštatovanie je predovšetkým platné pre tukové tkanivo. Podiel jednotlivých častí JOT je ovplyvnený množstvom faktorov napr. plemeno, úžitkový typ, hmotnosť pri zabití, pohlavie, výživa a kŕmenie, ustajnenie a podobne (Brestenský et al. 2004). Najnižšia živá hmotnosť u kancov plemena biela ušľachtilá bola 86 kg. Najvyššia živá hmotnosť bola 103 kg. Priemerná živá hmotnosť u kancov plemena biela ušľachtilá bola 100,43 kg (tab. 1). Najnižšia živá hmotnosť u kancov plemena Landras bola 88 kg, vzorka č. 12. Najvyššia živá hmotnosť bola 130 kg. Priemerná živá hmotnosť u kancov plemena Landras bola 107,63 kg (tab. 2). Tabuľka 1 Základné štatistické charakteristiky u bielej ušľachtilej Ukazovateľ n x s s x v % ŽH v kg 7 100,43 6,37 2,41 6,35 Leptín v µg.µl ,08 1,02 0,38 5,08 ŽH v kg živá hmotnosť v kg, JOT v kg jatočne opracované telo v kg, PDP v kg priemerný denný prírastok v kg, n počet zvierat x x priemerné, s štandardná odchýlka, s štandardná chyba, vvariačný koeficient Tabuľka 2 Základné štatistické charakteristiky u Landrasa Ukazovateľ n x s s x v % ŽH v kg 8 107,63 14,43 5,10 13,41 Leptín v µg.µl1 8 20,76 1,57 0,55 7,55 ŽH v kg živá hmotnosť v kg, JOT v kg jatočne opracované telo v kg, PDP v kg priemerný denný prírastok v kg, n počet zvierat x x priemerné, s štandardná odchýlka, s štandardná chyba, vvariačný koeficient Záver V súlade s vytýčenými cieľmi sme optimalizovali a aplikovali Real time PCR metódu pre identifikáciu a určenie koncentrácie leptínového génu u ošípaných a určenie vzájomných vzťahov medzi koncentráciou leptínu a živou hmotnosťou ošípaných. V našich experimentoch sme použili ako biologický materiál kancov plemena biela ušľachtilá (7 ks) a Landras domáci (7 ks). Na základe výsledkov molekulárno genetickej detekcie leptínového génu sme zistili jeho prítomnosť vo všetkých sledovaných vzorkách. Okrem koncentrácie leptínu sme sledovali a vyhodnotili aj živú hmotnosť ošípaných. Koncentrácia leptínu u ošípaných sa pohybovala v rozmedzí od 18,34 u bielej ušľachtilej do 24,34 µg. ml 1 u Landrasa, priemerná koncentrácia leptínu u ošípaných bola 20,01 µg.µl 1. Živá hmotnosť ošípaných sa pohybovala v rozmedzí od 80,00 u bielej ušľachtilej do 130,00 kg u Landrasa, priemerná živá hmotnosť u ošípaných bola 103,29 kg. Cieľom našej práce bolo zistenie koncentrácie leptínu u rôznych plemien ošípaných. Preto odporúčame naďalej sledovať koncentrácie leptínu v µg.µl 1, pretože práce ostatných autorov konkrétne koncentrácie leptínu neuvádzajú. x x Literatúra BRESTENSKÝ, V. et al Sprievodca chovateľa hospodárskych zvierat. VÚŽV Nitra, s ISBN FANTUZZI, G. FAGIONI, R Leptin in the regulation of immunity, inflammation, and hematopoesis. In J. Leukocyte. Biol., 2000, s

171 LEININGER, M.T. PORTOCARRERO, C.P. BIDWELL, C.A. et al Leptin expression is reduced with acute endotoxemia in the pig: correlation with glucose, insulinlike growth factori (IGF1). In J. Interferon. Cytokine. Res., 2000, s LIN, J. BARB, C.R. KRAELING, R.P. et al Developmental changes in the long form leptin receptor and related neuropeptide gene expression in the pig brain. In Biol. Reprod., 2001, s MALEK, M. DEKKERS, J.C.M. LEE, K. et al A molecular genome scan analysis to identity chromosomal regions influencing economic traits in the pig I. N Growth and body composition. In Mammalian Genome, 2001, č. 12, s MARAČEK, I. STANÍKOVÁ, A. DANKO, J Fyziológia leptínu a jeho význam v prevenci porúch plodnosti prežúvavcov. In Slovenský chov, 2004, s. 48. NEUENSCHWANDER, S. RETTENBERGER, G. MEIJERINK, E. et al Partial characterization of porcine obesity gene (OBS) and its localization to chromosome 18 by somatic cells hybrids. In Animal Genetics, č. 27, 1996, s RAMSAY, T.G. YAN, X. MORRISON, S The obesity gene in swine: sequence and expression of porcine leptin. In Journal of animal Science, 1998, č. 76, s SPURLOCK, M.E Regulation of metabolism, and growth during immune challenge: an overview of cytokine function. In J. Anim. Sci., 1997, s REMESÁR, X. RAFECAS, I. FERNANDEZ LOPEZ, J. A. ALEMANY, M Leptin. In Medicinal Research Rewievs, č. 17, 1997, s Kontaktná adresa: Ing. Simona Pavličová, Katedra hygieny a bezpečnosti potravín, FBP, SPU v Nitre, [email protected] THE INFLUENCE THE ADDITIVE ON RHEOLOGY OF THE WHEAT FLOUR DOUGH Pečivová 1 P, Hrabě 1,J., Pavlínek 2 V. 1 Department of Food Engineering, Faculty of Technology, Tomas Bata University in Zlín, T.G.Masaryka 275, Zlín, [email protected], [email protected] 2 Polymer Centre, Faculty of Technology, Tomas Bata University in Zlín, T.G.Masaryka 275, Zlín, [email protected] Abstract In this study modification of rheological properties of wheat dough by addition of amino acid Lcysteine hydrochloride monohydrate was investigated.the dough was mixed with the use of spiral mixer and rheological properties of the dough were monitored by oscillation rheometry. Results showed softening of the dough with addition of Lcysteine hydrochloride monohydrate. Knowledge of rheological properties enables standardization of flour mixture preparation and development of wheat dough with reguired properties. Key words: rheology, dough, amino acid, mixer, addition Introduction The dough belongs among the first from food materials whose rheological properties were studied. Flour quality has crucial effect on rheological properties of dough, especially the proteins gliadin and glutenin content (Zheng 2000, Dobraszczyk 2003). Příhoda (1971) argued that properties of wheat products and dough are given by the texture and molecular size of gluten polymers and their rheological properties. It was showed that branching of peptide chains and their structure, for example weaving of individual fibres, is important for rheological properties. 170

172 Amino acids improve taste, smell, volume and rheological properties of the dough. It is known that cysteine accelerates weakening of the dough after optimal time of mixing due to reactions of disulfid bonds (Kilborn and Tipples 1973). Cysteine reduces disulfide bonds among proteins and weakens gluten network in the dough (Bloksma, 1990 a) therefore elasticity (hardness) of the dough decreases, and relaxation of the dough accelerates too (Abd Elmoneim and Abdullahi, 2002; Pomeranz, 1988; Srinivasan, Waniska, and Rooney, 2000). The aim of this paper is to evaluate the influence of Lcysteine hydrochloride monohydrate addition on rheological properties of the dough prepared in spiral mixer. Materials and methods For the dough preparation white wheat smooth flour T350 (Penam, Kroměříž, CR), amino acid Lcysteine hydrochloride monohydrate (Ireks GmbH, Eppelborn, Germany) were used. Doughs were prepared in the kitchen kneader Bosch Profi Mixx 47 MUM 4770/05 (Robert Bosch Hausgeraete GmbH, Germany). At first 9 g of salt was dissolved in redistilled water then 500 g of flour and different amount of Lcysteine hydrochloride monohydrate were individually added during a permanent mixing. The doughs were mixed for 5.5 minutes. Then, the dough was picked up and shaped into a loaf and left to relax in a plastic bowl for 50 minutes. Rheological properties of prepared doughs were characterized by the rotational viscometer Bohlin Gemini (Malvern Instruments, UK) at temperature ( 25 ± 1) C with parallel plates geometry. The gap was set to 1.5 mm and diameter of parallel plates was 25 mm. Measurements were made in the area of linear viscoelasticity with the constant stress of 50 Pa. The surface of plates was covered by a sandpaper to avoid any slippage problem. The dough edges were cut and coated with silicone oil to prevent moisture loss. Results Fig. 1. shows dependence of loss tangent (tan δ = G /G ) on amount of Lcysteine hydrochloride monohydrate in the dough. The loss tangent is often used to measure the ratio of viscous and elastic response of the dough being tested. The loss tangent tan δ expresses the influence of Lcysteine hydrochloride monohydrate on viscoelastic properties of the dough. Where the storage modulus (G ) gives an indication about the elastic nature of the dough under test and the loss modulus (G ) is related to its viscous behavior. 0,6 0,5 tan ( 0,4 0,3 0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 0,14 0,16 amount of Lcysteine hydrochloride monohydrate [g] Fig. 1. Dependence of tan δ on amount of Lcysteine hydrochloride monohydrate in the dough. 171

173 Discusion As can be seen, with increasing amount of Lcysteine hydrochloride monohydrate the phase angle raises. That means that dough weakens due to the effect of Lcysteine hydrochloride monohydrate which influences disulfide bonds and they can break. However, there exists some critical amount of Lcysteine hydrochloride monohydrate (app g) above which practically no further softening effect was observed. Conclusion The objective of this investigation was to assess the effect of Lcysteine hydrochloride monohydrate on the rheological properties of dough. Typical dough viscoelastic behavior was affected by Lcysteine hydrochloride monohydrate and its addition had positive effect on dough softening. It has been found that optimum concentration of Lcysteine hydrochloride monohydrate exists and further addition is not beneficial. References ABD ELMONEIM, O.E. ABDULLAHI, H.E.: Effect of cysteine on bakery products from wheatsorghum blends. Food Chemistry, 77, 2002, pp BLOKSMA, A.H.: Dough structure, dough rheology and baking quality. Cereal Food World, 35, 1990a, pp DOBRSZCZYK, B.J. MORGENSTERN, M.P.: Rheology and the breadmaking process, 38, 2003, pp KILBORN, R.H. TIPPLES, K.H.: Factors affecting mechanical dough development. IV. Cereal Chem., 50, 1973, pp PŘÍHODA, J. HAMPL, J. KARLOVÁ, S.: Rheological studies of dough with the Hoeppler consistometer. Cereal Chemistry, 48, 1971, pp SRINIVASAN, M. WANISKA, R.D. ROONEY, L.W.: Effects of ingredients and processing on dough rheology of wheat flour tortillas. Food Science Technology International, 6(4), 2000, pp Contact: Pavlína Pečivová, MSc., Department of Food Engineering, Faculty of Technology, Tomas Bata University in Zlín, T.G.Masaryka 275, Zlín, tel , This work was kindly supported by the project of Ministry of Education, Youth and Sports of the Czech Republic (MSM ). VPLYV ODRODY NA OBSAH VITAMÍNU C V ĽUĽKU ZEMIAKOVOM (SOLANUM TUBEROSUM L.) THE VARIETY INFLUENCE ON VITAMIN C CONTENT IN POTATOE (SOLANUM TUBEROSUM L.) Peltznerová, L., Musilová, J., Harangozo, Ľ Slovenská poľnohospodárska univerzita, Nitra Abstract Potatoes are the source of energy in saccharides form and they content fibre supporting digestion. Potatoes contain a number of important vitamins and minerals. They are easily digestible, thus it is recommended to consume them as dietary foods. Work goal was to survey variety influence on content of C vitamin in potatoe. We surveyed the dependence between vitamin C content and fourth variety of potatoes very early Junior, middle early Agria, early Livera, and middle late variety Asterix. 172

174 The experiment was realized by the form of pot vegetation survey, in which the soil from locality Výčapy Opatovce was used, with addition of basic fertilizer NPK in a rate 15: 10: 10. Vitamin C was determined spectorophotometric with method by Mukherjee and Choudhuri. The content vitamin C by very early Junior variety was 182,20 mg.kg 1. In other variants the vitamin C content had risen in order: very early Junior < middle early Agria < early Livera < middle late variety Asterix. These results are reffered as of one year, thus there is a need to verify them in next experiments. Key words: potatoes, vitamin C, variety Úvod Ľuľok zemiakový (Solanum tuberosum), v bežnej reči len zemiak, je viacročná hľuznatá plodina z čeľade ľuľkovitých. Zemiaky patria medzi najvýznamnejšie poľnohospodárske plodiny; väčší význam pre ľudskú výživu majú len pšenica, ryža a kukurica. Za svoju obľubu vďačia nenáročnosti na prírodné podmienky a predovšetkým mimoriadne vysokým hektárovým výnosom. Ich široké uplatnenie v európskom poľnohospodárstve na začiatku 19. storočia ochránilo Európu od cyklických hladomorov a epidémií skorbutu ( Spotreba zemiakov na jedného obyvateľa sa na Slovensku pohybuje v rozmedzí kg, čp zodpovedá kritériám výživy obyvateľstva aj celosvetovým trendom. Spotreba skorých zemiakov sa pohybuje v rozmedzí kg v závislosti od produkcie a spotrebiteľských cien a ostatných konzumných zemiakov v rozmedzí kg ( Základné chemické zloženie zemiakov vo veľkej miere ovplyvňuje odroda. Podľa dĺžky vegetačnej doby od výsadby do fyziologickej zrelosti sa odrody zeiakov delia na veľmi skoré, stredne skoré, skoré, stredne neskoré a neskoré (Vestník MP SR, 2006). Známych je vyše tisíc odrôd zemiakov. Zemiaky sú už oddávna dôležitou súčasťou nášho jedálneho lístka, pretože obsahujú veľa výživných látok, vitamínov a minerálov., pri Vitamín C, čiže kyselina askorbová acidum ascorbicum je dôležitá antioxidačná látka, rozpustná vo vode, ktorá sa v ľudskom organizme zúčastňuje dlhého radu rôznych procesov je súčasťou dejov látkovej výmeny, má význam pri syntéze kolagénu, pri premene niektorých aminokyselín, pri syntéze steroidov v nadobličkách, pri skladovaní železa. Vitamín C je vitamínom len pre človeka a niekoľko ďalších živočíchov. Ľudský organizmus sa od väčšiny živých organizmov odlišuje tým, že si nevie vitamín C sám vytvárať, preto ho musí prijímať potravou alebo vo forme výživových doplnkov. Vitamín C má pozitívny protirakovinový účinok, pozitívne vplýva na inhibíciu rastu leukemických bunkových štruktúr, Kladné účinky vitamínu C sa tiež uplatňujú v imunitnom systéme, kde zvyšuje koncentráciu interferónov, hladinu imunoglobulínov v krvi a podporuje uvoľňovanie hormónov týmusu (Zachar, 2004). Najväčším zdrojom vitamínu C je ovocie a zelenina. Najvyšší obsah vitamínu má čerstvé ovocie a čerstvá zelenina. Medzi jednotlivými druhmi však v obsahu vitamínu existujú veľké rozdiely. Tie sú výrazne závislé aj od vegetačných podmienok počas rastu, stupňa zrelosti, spôsobu pozberového spracovania a ďalších faktoroch (Velíšek, 2002). Materiál a metodika Cieľom experimentu bolo na základe rozborov rastlinného materiálu sledovať obsah vitamínu C v jednotlivých odrodách ľuľka zemiakového a posúdiť vzťah medzi obsahom vitamínu C a rôznymi odrodami ľuľka zemiakového. Experiment bol realizovaný formou vegetačného nádobového pokusu. V experimente sme použili 25 kg zmesi pôdy a kremičitého piesku v pomere 21:4. Pôda bola odobratá z lokality Výčapy Opatovce. Dno nádoby sme pokryli malou vrstvou štrku. Na základe analýz bola stanovená pôdna reakcia, obsah dusíka, fosforu, draslíka, horčíka a vápnika. Z nameraných hodnôt sme vypočítali dávky základného hnojenia. Ďalej boli stanovené aj obsahy ťažkých kovov vo výluhu lúčavky kráľovskej (zmes HCl a HNO 3 ). Pokus bol prevedený z prídavkom základného hnojenia NPK v pomere 15:10:10. NPK bolo pridané v množstve 97,5 g/nádoba. 173

175 Charakteristika pôdy a obsahy ťažkých kovov sú uvedené v tabuľkách 1 a 2. Zákon 220/2004. O ochrane a využívaní poľnohospodárskej pôdy a o zmene zákona č. 245/2003 Z. z. o integrovanej prevencii a kontrole znečisťovania životného prostredia a o zmene a doplnení niektorých zákonov, uvedený v tabuľke 2 nám uvádza najvyššie prípustné množstvá ťažkých kovov v pôde. Tab. 1 Charakteristika pôdy z lokality Výčapy Opatovce (obsahy N, K, Ca, Mg, P sú udávané v mg.kg 1 ) N K Ca Mg P ph/h 2 O ph/kcl Cox % Humus% ,5 1459, ,86 5,98 4,63 1,527 2,633 Pôda z lokality Výčapy Opatovce sa vyznačovala stredným obsahom humusu, veľmi kyslou pôdnou reakciou a veľmi nízkym obsahom fosforu. Podľa kritérií na hodnotenie obsahu prístupného fosforu pre stredne ťažké pôdy pri ph 5,98 sme doplnili fosfor na hladinu dobrý množstvom 130 mg.kg 1. Tab. 2 Obsahy ťažkých kovov v pôde získané z výluhov v lúčavke kráľovskej (mg.kg 1 ) Zn Cu Mn Fe Cr Cd Pb Co Ni lúčavka kráľovská 52,4 45,8 621, ,8 0,9 22,2 15,0 31,6 220/ , Obsahy ťažkých kovov v porovnaní so zákonom 220/2004 boli okrem kadmia pod limitom. Obsah kobaltu bol v maximálnom prípustnom množstve a obsah kadmia bol zhruba o 28 % vyšší ako je uvedené v zákone. Testovanou plodinou bol ľuľok zemiakový (Solanum tuberosum L.). V experimente boli použité 4 rôzne odrody veľmi skorá: odroda Junior, stredne skorá: odroda Agria, skorá: odroda Livera a stredne neskorá: odroda Asterix. Do nádob sme vysádzali po 2 hľuzy a pre každú odrodu sme robili 4 opakovania. Nádoby so zemiakmi boli počas celej vegetácie zalievané na 70% vodnú kapacitu. Vitamín C bol stanovený spektofotometricky metódou modifikovanou podľa Mukherjeeho a Choudhuriho. Meralo sa pri 530 nm. Výsledky a diskusia Výsledky z chemických analýz ktoré sme vykonávali na hľuzách ľuľka zemiakového sú uvedené v nasledujúcej tabuľke. Tab. 1 Obsah vitamínu C v čerstvej hmote (mg.kg 1 ) Odroda Junior Odroda Agria Odroda Livera Odroda Asterix 182,20 238,28 425,76 406,29 174

176 Graf 1 obsah vit.c v ľulku zemiakovom v mg.kg 1 množstvo vit C v mg.kg Junior Agria Livera Asterix odroda Rad1 Porovnanie obsahu vitamínu C medzi jednotlivými odrodami : Junior < Agria < Livera < Asterix Záver Uvedené výsledky nám naznačujú vzťah medzi obsahom vitamínu C a jednotlivými odrodami ľuľka zemiakového. Najnižší obsah vitamínu C sme zaznamenali u veľmi skorej odrody Junior, najvyšší obsah vitamínu C bol pri skorej a stredne neskorej odrode (Livera a Asterix) a to až nad 400 mg.kg 1. Keďže sa jedná o jednoročné výsledky, závery nie sú jednoznačné a je nutné ich v budúcnosti overiť. Tento článok vznikol v rámci projektu VEGA 1/4428/07. Literatúra Velíšek, J. 2002b. Chemie potravin 2. Tábor: Ossis, 2002, 320 s., ISBN: Vestník Ministerstva pôdohospodárstva SR, ročník XXXVIII, 31. máj 2006, čiastka 11 Zachar, D Humánna výživa II. Zvolen: Technická univerzita, s. ISBN Kontaktná adresa: Ing. Linda Peltznerová, Slovenská poľnohospodárska univerzita v Nitre, Trieda A. Hlinku 2, Nitra, [email protected] 175

177 SENZITIVITA DRUHOV SKUPINY ALTERNARIA INFECTORIA NA CYKLOHEXIMID SENSITIVITY OF ALTERNARIA INFECTORIA ON CYCLOHEXIMIDE Piovarčiová, Z., Labuda, R., Tančinová, D. Katedra mikrobiológie, Fakulta biotechnológií a potravinárstva, Slovenská poľnohospodárska univerzita v Nitre Abstrakt A total of 33 strains pertaining to four Alternaria speciesgroups, namely A. alternata, A. arborescens, A. infectoria, and A. tenuissima were tested for their growth response to 100 µg.ml 1 cycloheximide in potato carrot agar. All A. infectoria strains were completely inhibited, showing no growth at all even after prolonged incubation. In contrast, all other strains representing the remnant three species exhibited a high resistance to this antibiotic. Cycloheximide sensitivity may thus represent further important physiological character for distinguishing A. infectoria from similar species. Kľúčové slová: cykloheximidová tolerancia, mykotoxíny, toxinogénne huby Úvod Cykloheximid je selektívny fungicíd, ktorý inhibuje rast mnohých nepatogénnych kontaminantov, ale i niektorých patogénnych húb. Zároveň však pomáha pri izolácii niektorých patogénov a príbuzných organizmov (napr. dermatofyty a iné huby z radu Onygenales, niektoré kvasinky Candida), mnohých príležitostných patogénov, ktoré patria medzi anamorfy čeľade Herpotrichiellaceae (napr. druhy rodu Exophiala) a mnohých príležitostných patogénov (napr. niektoré druhy rodov Aspergillus a Pseudallescheria) (Summerbell, 2004). Látka známa i pod názvami aktidión, naramycín A a aktívna prísada v komerčne vyrábanom Mycosel agare predstavuje polyénové antibiotikum produkované aktinomycétami Streptomyces griseus, ktoré narúšajú syntézu proteínov u eukaryontov (Seifert et Giuseppin, 2000). Z taxonomického pohľadu Herrington (1981) úspešne aplikoval cykloheximid ako fyziologický znak odlišujúci rod Ceratocystis od rodu Ophiostoma. Seifert et Giuseppin (2000) uviedli relatívne stále odpovede väčšiny druhov rodu Penicillium na toto anibiotikum, preukazujúce potenciál pre využitie cykloheximidovej tolerancie (alebo senzitivity) na fyziologicky založenú identifikáciu v rámci rodu Penicillium, alebo iných druhov húb. Preto bola testovaná možnosť použitia cykloheximidovej tolerancie a/alebo senzitivity ako doplnkového poznávacieho znaku na rozlišovanie morfologicky príbuzných druhov aj v rámci iných rodov, ako sú Alternaria a Trichoderma. V predloženej štúdii sú vedené predbežné výsledky indikujúce cykloheximidovú tleranciu/senzitivitu v rámci poľnohospodársky dôležitých malospórových skupín rodu Alternaria. Materiál a metodika Kmene použité v tejto štúdii sú uvedené v Tabuľke 1. Každý kmeň bol kultivovaný na zemiakovomrkvovom agare (PCA potatocarrot agar; Simmons, 1992) a na zemiakovomrkvovom agare s prídavkom 100 ppm cykloheximidu. Zriedený cykloheximid v 2 ml acetónu (Kane et al., 1997) bol po autoklávovaní pridaný do PCA, aby bola získaná koncentrácia 100 µg.ml 1. Následne boli na stuhnutý agar v Petriho miskách (9 cm) naočkované do troch bodov kolónie pomocou sterilných mikrobiologických ihiel. Kruhový rast kolónií bol meraný po 7 dňoch inkubácie pri izbovej teplote (25 ± 2 ºC) pri rozptýlenom dennom svetle. Výsledky a diskusia Rastové reakcie testovaných skupín rodu Alternaria kultivovaných na PCA agare s prídavkom 100 ppm cykloheximidu sú uvedené v Tabuľke 1. Ukázalo sa, že všetky izoláty A. infectoria boli senzitívne a nepreukazovali rast ani po predĺženej inkubácii (30 dní). Ostatné 176

178 izoláty zastúpené skupinami A. alternata, A. arborescens a A. tenuissima boli tolerantné (60 95 % rast oproti kontrole) a v rámci jednotlivých skupín boli ich reakcie relatívne zhodné, s odchýlkou ± 21 %, 11 % a 25 % podľa poradia. Tabuľka 1.: Rastová reakcia izolátov vybraných skupín rodu Alternaria na 100 µg.ml 1 cykloheximidu v PCA agare po 7 dňoch kultivácie pri izbovej teplote (25 ± 2 C). Alternaria spp. Izolát % rastu oproti kontrole A. alternata E.G.S D D D D D A. arborescens E.G.S BA BA BA BA BA A. infectoria E.G.S D. 1 0 D. 2 0 D. 3 0 D. 5 0 D. 8 0 D D D D D D D A. tenuissima E.G.S D D D D D D EGS kmene poskytnuté E.G. Simmonsom (USA), BA kmene poskytnuté B. Andersenovou (Dánsko), D čerstvé izoláty získané autormi zo pšeničných zŕn slovenskej produkcie zberanej v roku Významnosť týchto zistení o senzitivite na cykloheximid v rámci uvedených skupín vláknitých húb pozoruhodne korešponduje s potenciálnou schopnosťou druhov rodu Alternaria produkovať toxické sekundárne metabolity, t. j. mykotoxíny. V tejto súvislosti je všeobecne známe, že druhy skupiny A. infectoria, sú okrem fenotypových znakov (Simmons, 1994; Simmons et Roberts, 1993; Andersen et al., 2002) a/alebo molekulárnych vlastností (Serdani et al., 202) chemicky veľmi odlišné od druhov skupín A. alternata, A. arborescens a A. tenuissima, 177

179 s výnimkou minimálneho počtu spoločných metabolitov (Andersen et al., 2002). Okrem toho sa ukázalo, že každý doposiaľ testovaný (a správne identifikovaný) izolát A. infectoria neprodukoval nijaké známe mykotoxíny, ako sú altenuén, alternáriol, alternáriol monometyl éter, altertoxín a kyselina tenuazónová (Andersen et al., 2002; Andersen et Thrane, 1996; Serdani et al., 2002). Záver Uvedené skupiny rodu Alternaria sa s vysokou frekvenciou vyskytujú na rôznych druhoch potravín a krmív, prednostne cereálneho pôvodu. Na základe uvedenej štúdie je možné cykloheximid, ako látku pridávanú do selektívnych médií, využiť na izoláciu niektorých potenciálne toxinogénnych skupín rodu Alternaria, ako sú A. alternata, A. tenuissima a/alebo A. arborescens, na ich priamu separáciu od netoxinogénnych druhov zo skupiny A. infectoria. Poďakovanie Štúdia vznikla za finančnej podpory projektom VEGA 1/3456/06. Poďakovanie patrí profesorovi Emmory G. Simmonsovi za poskytnutie reprezentatívnych kmeňov Alternaria spp. a doktorke Birgitte Andersenovej za poskytnutie reprezentatívnych kmeňov A. arborescens. Referencie Andersen, B. Kroger, E. Roberts, R. G Chemical and morphological segregation of Alternaria arborescens, A. infectoria and A. tenuissima speciesgroups. In Mycological Research, 106, 2002, s Andersen, B. Thrane, U Differentiation of Alternaria infectoria and A. alternata based on morphology, metabolite profiles, and cultural characteristics. In Canadian Journal of Microbiology, 42, 1996, s Harrington, T. C Cycloheximide sensitivity as a taxonomic character in Ceratocystis. In Mycologia, 73, 1981, s Kane, J. Summerbell, R. Sigler, L. Krajden, S. Land, G Laboratory handbook of dermatophytes. Belmont : Star Publishing, s. Seifert, K. A. Giuseppin, S Cycloheximide tolerance as a taxonomic character in Penicillium. In Samson, R. A. Pitt, J. I., eds. Integration of modern taxonomic methods for Penicillium and Aspergillus classification.amsterdam : Harword Publishers, s Serdani, M. Kang, J. C. Andersen, B. Crous, P. W Characterisation of Alternaria species groups associated with core rot of apples in South Africa. In Mycological Research, 106, 2002, s Simmons, E.G Alternaria taxonomy: current status, viewpoint, challenge. In Chelkowski, J. Visconti, A. eds. Alternaria biology, plant diseases and metabolites. Amsterdam : Elsevier, s Simmons, E. G Alternaria themes and variations (106111). In Mycotaxon, 50, 1994, s Simmons, E. G. Roberts, R. G Alternaria themes and variations (73). In Mycotaxon, 48, 1993, s Summerbell, R. C Fungi associated with vertebrates. In Mueller, G. M. Bills, G. F. Foster, M. S. eds. Biodiversity of fungi. Inventory and monitoring methods. Oxford : Elsevier Academic Press, s Kontaktná adresa Zuzana Piovarčiová, Katedra mikrobiológie, Fakulta biotechnológií a potravinárstva, Slovenská poľnohospodárska univerzita v Nitre, Tr. A. Hlinku 2, Nitra 178

180 GLAZÚROVANIE RÝB GLAZING OF FISH Popelka, P., Nagy, J., Žoldoš, P.*, Marcinčák, S. Univerzita veterinárskeho lekárstva, Katedra hygieny a technológie potravín, Košice *Mraziarne, s.r.o., Poprad Abstract The application of a layer of ice to the surface of a frozen product by spraying, brushing on water or by dipping, is widely used to protect the product from the effects of dehydration and oxidation during cold storage. The ice layer sublimes rather than the fish below and it also excludes air from the surface of the fish and thereby reduces the rate of oxidation. When it is known that storage will be for a short period only, glazing or wrapping may not be necessary or practical. Blocks of whole cod, frozen at sea, are usually transferred to the ship's cold store without a protective wrapper or glaze but this may be added later, prior to long term storage on shore. During relatively short terms of storage, fish without a protective wrapper or glaze can be severely dehydrated in a poorly designed or operated store. Úvod Zmrazené ryby alebo rybie výrobky by mali byť glazúrované a balené z dôvodu zachovania ich kvality počas skladovania a distribúcie. Kvalita zmrazených rýb a rybích výrobkov sa zhoršuje počas skladovania ak nie sú adekvátne chránené pre efektmi dehydratácie a oxidácie a taktiež proti fyzikálnemu poškodeniu a kontaminácii cudzími telesami. Povrch celých rýb alebo nepravidelný tvar filiet sú vo všeobecnosti chránené glazúrovaním a balením, ktoré prilieha ku povrchu rýb. Na trhu je množstvo obalových materiálov, ktoré poskytujú dobré ochranné vlastnosti, a ktoré sú vhodné pre balenie zmrazených rýb a rybích výrobkov. Vo všeobecnosti sa glazúra nepoužíva pre spracovanie rýchlo zmrazených blokov z bielych rýb. Glazúrovanie sa odporúča pre rýchlo zmrazené bloky zo sleďov, makrel a iných hnedých (tučných) rýb sú glazúrované, v prípade ak sú určené na ďalšie spracovanie (konzervovanie, údenie). Glazúrovanie sa tiež používa pri spracovaní rýb, ktoré sú určené pre ďalšie spracovanie alebo verejné stravovanie. Je odporúčané kontrolovať úroveň glazúrovania, predovšetkým hrúbku glazúry, ktorá by mala na povrchu rýb vytvárať uniformnú vrstvu, vyjadrenú v percentách z celkovej hmotnosti rýb. Ryby, ktoré nie sú balené by mali byť glazúrované tak rýchlo ako je to len možné po ukončení zmrazovania. Glazúrovanie predstavuje prevenciu dehydratácie a taktiež znižuje pravdepodobnosť rozkladných zmien. U tučných rýb reakcia kyslíka zo zložkami rybieho mäsa, predovšetkým tuku, ktorá vedie ku zmene chuti a vône rýb predstavuje rozkladný proces. Ryby ako slede, sardely, sardinky, makrely a lososovité ryby a tuniaky sú náchylné na oxidačné zmeny. Ak sú správne glazované, oxidácia je spomalená, pretože kyslík musí difundovať cez vrstvu ľadu predtým ako dôjde ku reakcii s tukmi v svalovine. V niektorých oblastiach sa používa modifikované glazúrovanie, kedy sa glazujú ryby v blokoch. Príležitostne je tiež možné glazúrovať ryby balené v pergamenovom papieri pred zmrazovaním a glazúrovanie prebieha okamžite po zmrazení. Ak sa používajú ako súčasť glazúry aditívne látky, je nevyhnutné rešpektovať predpisy jednotlivých členských štátov. V prípade, že ľad je drobivý a môže sa uvoľňovať počas manipulácie, aditíva ako cukor škrob, alginát sodný alebo karboxymetylcelulóza sa používajú na zlepšenie jeho vlastností, predovšetkým trvanlivosti. Ak sa aditíva pridávajú do glazúry, treba brať do úvahy možnosť, že môže dôjsť ku zhoršeniu celkového vzhľadu výrobkov. Nepriehľadná glazúra je odporúčaná pre ryby ako halibut a rybie filety, kde môžu zlepšiť prirodzenú belosť kože, alebo svaloviny. Na druhej strane, svetlo strieborná vzhľad lososa bude zvýraznený použitím priehľadnej glazúry. 179

181 Aplikácia vrstvy ľadu na povrch zmrazených produktov sprayovaním, nanášaním alebo ponáraním, je široko používanou metódou ochrany produktov pred dehydratáciou a oxidačnými zmenami počas skladovania. Vrstva ľadu na povrchu sa počas skladovania síce mení a uvoľňuje, ale zabraňuje zmenám svaloviny, ktorá sa nachádza pod ňou a tiež zabraňuje prístupu vzduchu k povrchu rýb a tým redukuje úroveň oxidácie tukovej zložky. Počas glazúrovania zvyčajne dochádza ku miernemu zvýšeniu teploty svaloviny a preto je žiaduce opätovné zmrazenie a zníženie teploty pred premiestnením rýb do mraziarenského skladu. Glazúrovanie ponáraním do vody nie je odporúčané. Počiatočná teplota vody môže byť relatívne nízka, ale počas procesu glazúrovania sa mení a tým môže byť ovplyvnená hrúbka glazúry na povrchu. Pri glazúrovaní IQF filiet sa táto hrúbka menila v rozpätí 2 až 20 %, dokonca aj v prípade ak čas ponárania zostal konštantný. V praxi, zvyčajne nie je možné dodržať konštantný čas glazúrovanie, čo ešte viac prehlbuje rozdiely v množstve glazúry u jednotlivých produktov. Riziko predstavuje tiež možnosť kontaminácie vody, čo je jedným z dôvodov prečo táto metóda nie je odporúčaná pre praktické použitie. Pokiaľ sa rozhodnete pre glazúrovanie ponáraním, je potrebné zabezpečiť, aby voda v kontajneri kde sú ryby ponárané bola kontinuálne menená a kontajner bol prietokový. Glazúrovanie sprayovaním vody na povrch je vhodnejšou metódou, ale taktiež je pomerne obtiažne dosiahnuť uniformnú vrstvu glazúry na povrchu a je potrebné obracanie ryby a sprayovanie z oboch strán tak aby sa vrstva glazúry vytvorila na celom povrchu. Aby bola vytvorená uniformná, jednotná vrstva glazúry na povrchu rýb, proces glazúrovania musí byť striktne kontrolovaný. Množstvo vytvorenej glazúry závisí na nasledujúcich faktoroch: Čas glazúrovania Teplota rýb Teplota vody Veľkosť produktu Tvar produktu Teplota roztoku použitého na glazúrovanie by nemala byť vyššia ako 5 C (41 F). Glazúrovanie by malo byť aplikované namáčaním alebo sprayovaním pitnou vodou alebo roztokom obsahujúcom povolené aditíva. Vzostup teploty počas glazúrovania by mal byť minimálny. Lososy, halibuty a čerstvé ryby sú často glazúrované pri chladiarenských teplotách. Je všeobecne známe, že len ryby, ktoré boli správne zmrazené sú glazúrované ľahko a uniformne, a to predovšetkým ak sú do glazúrovacieho média namáčaná niekoľkonásobne, za účelom vytvorenia dostatočne hrubej vrstvy glazúry. Zmrazené výrobky by mali byť premiestnené do mraziarenského skladu okamžite po ukončení glazúrovania. Akýkoľvek vplyv vyššej teploty môže spôsobiť čiastočné rozmrazenie glazúry a taktiež spôsobiť zvýšenie teploty v mraziarenskom sklade. Presun zmrazených výrobkov do mraziarenského skladu by mal byť preto vykonaný čo najrýchlejšie s minimálnym poškodením výrobkov. Vodná glazúra je drobivá a preto hrubé zaobchádzanie môže spôsobiť poškodenie glazúry a tým nuluje výsledný efekt, pre ktorý bolo glazúrovanie vykonané. Pri dlhodobom skladovaní by mali byť glazúrované výrobky periodicky kontrolované na opotrebovanie glazúry. Opotrebovanie glazúry je časom spôsobené odparovaním a kondenzáciou na povrchu v mraziarenskom sklade. Pokiaľ ryby zostávajú v sklade počas veľmi dlhého obdobia zopakovanie glazúrovanie je odporúčané na zabránenie dehydratácie a oxidačných zmien. Balenie a materiály použité pre balenie by mali byť vyberané spôsobom aby bol zabezpečený atraktívny vzhľad výrobkov, primeraný a ekonomický obal, ktorý bude primerane chrániť výrobky. Existuje mnoho faktorov, ktoré musia byť vzaté do úvahy pri výbere vhodného obalového materiálu. Je dôležité aby výrobky boli zabalené v atraktívnom obale pre konzumenta a súčasné boli odolné pri manipulácii. Značky musia byť jasne vytlačené a musia byť v súlade s požiadavkami na označovanie rybích výrobkov členskej krajiny. Nedostatok v štandardizácii spôsobov balenia, definovaní vlastností použitého materiálu spôsobuje problém pri výbere najvhodnejšieho obalového materiálu. Je často obtiažne rozhodnúť, ktoré materiály sú základné alebo rozoznať jednotlivé obalové materiály, pretože výrobcovia v jednotlivých 180

182 krajinách im dávajú špecifické názvy. Nedostatky v štandardizácii taktiež predstavujú problém pri testovaní jednotlivých obalových materiálov a obmedzujú možnosti ich vzájomného porovnávania. Mnoho typov flexibilných materiálov je dostupných, obyčajne vo viacerých stupňoch kvality a hrúbky. Tieto zahŕňajú viacero typov rastlinných pergamenov a ošetrených papierov, alumíniové fólie a filmy z regenerovanej celulózy, polyetylén, polivinylchlorid (PVC), vinilidén chlorid, vinyl chlorid kopolymér (PVACPVC), polyester, polyamid a polypropylén. Tieto materiály sa líšia svojou cenou, schopnosťou priepustnosti vody a plynov. Laminátované obaly sú často používané kvôli výhode kombinácie žiaducich vlastností dvoch alebo viacerých materiálov. Napríklad regenerovaná celulóza, ktorá má nízku priepustnosť pre plyny, s vysokou odolnosťou voči poškodeniu, je priehľadná a ľahko potlačiteľná sa často kombinuje s polyetylénom, ktorý ma nízku priepustnosť Glazovanie produktov, ktorých teplota na povrchu je 70 C alebo menej, napríklad po kryogénnom zmrazení, môže spôsobiť tvorbu glazúry, ktorá je nestála, láme sa z dôvodu termálneho stresu počas tvorby ľadu z vody na povrchu. Takto vytvorená glazúra je ľahko odstrániteľná počas manuálnej manipulácie. Podobný problém vzniká pri ponáraní rýb do vody na príliš dlhú dobu, kedy sa tvorí hrubá vrstva glazúry, ale pri vyrovnávaní teploty ryby a vody sa svalovina otepľuje na hodnoty blízke 0 C. Takto vytvorená glazúra je taktiež ľahko odstrániteľná počas manuálnej manipulácie. Metódy stanovenia podielu glazúry 1. Stanovenie čistej hmotnosti u zmrazených rybích filiet pokrytých glazúrou Tak rýchlo ako je to len možné po odstránení obalu po skladovaní pri nízkych teplotách, umiestnite obsah balenia pod jemný prúd studenej vody. Rozrušte opatrne povrch vzorky tak aby ste ju neporušili alebo nezlomili. Nechajte pod prúdom vody dovtedy pokiaľ je glazúra na povrchu viditeľná a pokiaľ sa z povrchu uvoľňuje. Odstráňte vodu z povrchu použitím papierovej osušky a odvážte vzorku na váhach. 2. Stanovenie čistej hmotnosti u zmrazených blokov rýb pokrytých glazúrou Pred vážené glazúrované vzorky sú vložené do vodného kúpeľa dovtedy kým nie je všetka glazúra rukami odstránená (pocit prstov). Ako náhle sa povrch stane drsným, stále zmrazené vzorky sa vyberú z vodného kúpeľa a osušia sa papierovou utierkou pred stanovením čistej hmotnosti opätovným zvážením. Použitím tejto metódy je možné sa vyhnúť stratám odkvapom pri rozmrazovaní a/alebo naviazaniu vonkajšej vlhkosti na povrch pri spätnom namrazení. Zariadenie Váhy presnosť do 1 g Vodný kúpeľ, prednostne s možnosťou regulácie teploty Kruhové sito s priemerom 20 cm a 13 mm očkami siete (ISO R 565) Papierové alebo plátenné utierky s hladkým povrchom Mraziarenský box by mal byť dostupný na mieste, kde prebieha stanovenie Príprava vzoriek a vodného kúpeľa Teplota produktu by mala byť prispôsobená na hodnotu 18/20 C pre dosiahnutie štandardných podmienok odglazúrovania (obzvlášť potrebné ak štandardná doba odglazúrovania bude definovaná pre produkty s pravidelným tvarom). Po vybratí vzoriek z miesta skladovania pri nízkej teplote, ak sú prítomné, odstráňte ľadové kryštáliky alebo sneh z obalu, v ktorom sú mrazené produkty balené. Vodný kúpeľ by mal obsahovať čerstvú pitnú vodu v množstve rovnocennom približne 10 násobku deklarovanej hmotnosti produktu, teplota by mala byť prispôsobená na hodnotu od 15 C do 35 C. Odstránenie glazúry Pred vážené vzorky sú premiestnené do vodného kúpeľa a opatrne v rukách do neho ponorené. Produkt je opatrne na povrchu rozrušovaný až pokiaľ medzi prstami necítite uvoľňujúce sa častice glazúry, povrch produkty sa zmení z hladkého a klzkého na drsný. Potrebný čas, závisí od veľkosti/tvaru glazúrovaných produktov, od 10 do 60 sekúnd ( a prípadne viac ak je hrúbka glazúry silnejšia alebo ak zmrazených spolu viac produktov). 181

183 Nasledujúci postup je použiteľný pre konzumentské balenia rýchlo zmrazených produktov (tiež pre jednotlivo glazúrované produkty, ktoré sú následne zmrazené spolu počas skladovania: Pred vážené bloky alebo ich časti sú prenesené na sito vhodnej veľkosti a ponorené do vodného kúpeľa. Jemným tlakom prstov oddeľujeme jednotlivé frakcie bloku tak aby sme ich úplne oddelili. Krátkodobé ponáranie je možné zopakovať ak sú stopy glazúry na povrchu stále prítomné. Vzorky zbavené glazúry po odstránení naviazanej vody použitím utierok (bez tlaku) sú okamžite zvážené. Jednotlivé čisté hmotnosti jednotlivých frakcií bloku sú spočítané. Záver Voda, ktorá sa uvoľňuje počas rozmrazovania je často konzumentmi považovaná za nežiaduci efekt glazúrovania. Napriek tomu niektoré druhy rýb alebo rybích výrobkov by mali byť glazúrované a balené z dôvodu zachovania ich kvality počas skladovania a distribúcie. Kvalita zmrazených rýb a rybích výrobkov sa zhoršuje počas skladovania ak nie sú adekvátne chránené pre efektmi dehydratácie a oxidácie a taktiež proti fyzikálnemu poškodeniu a kontaminácii cudzími telesami. Dodržanie pravidiel a podmienok glazúrovania môže byť prospešné zachovanie vlastností rýb aj v prípade ak podmienky skladovania alebo transportu nie sú úplne ideálne. Na druhej strane nedodržanie podmienok, čiastočné rozmrazenie rýb a opätovné zmrazenie, respektívne príliš pomalé zmrazovanie po glazovaní, môžu mať nežiaduci vplyv na vlastnosti produktov. Spracovanie príspevku bolo podporené projektom AV/0010/07 Kontaktná adresa: MVDr. Peter Popelka, PhD., Katedra hygieny a technológie potravín, Univerzita veterinárskeho lekárstva, Komenského 73, Košice, [email protected] PARAMETRY BOURÁNÍ JATEČNÝCH TĚL SKOTU V RÁMCI TŘÍD ZMASILOSTI SEUROP. CUTTING PARAMETERS OF CARCASSES IN THE SEUROP MEATINESS CLASSES. Říha J., Homola M., Bjelka M., Burócziová M. Abstract In this paper we describe distributions of 23 cutting parameters of 54 carcasses in SEUROP meatiness classes. It is important to know this distributions because of different prices of kinds of the beef and for precision the classification. We use GLM and ANOVA methods for exploration analysis of the distributions. After that we discuss analysed differences between classes in the relations with the SEUROP norm. Key words: carcass, cutting, SEUROP, meatiness. Uvod Hodnocení dle normy SEUROP ČSN je v ČR závazné pro JUT skotu od roku Norma ve své podstatě zohleňuje pouze vizuální vzhled JUT pro zařazení do některé ze tříd klasifikace zmasilosti. Práce, které publikovali Šubrt et al. (2003, 2004) nebo Bjelka et al.(2004a,b) se zabývaly hodnocením JUT v ČR dle SEUROP ve vztahu k pohlaví, úrovni výživy a hybridizace. Cílem naší práce je podrobný rozbor jednotlivých parametrů při bourání JUT v rámci zatřídění do tříd zmasilosti SEUROP. Tyto výsledky mohou být vhodným indikátorem pro zpeněžování v rámci jednotlivých tříd, vzhledem k různým spotřebitelským cenám hovězího masa. Stejně tak mohou být výsledky použitelné pro rozbor hodnocených parametrů při samotné klasifikaci. 182

184 Material a metody Datový soubor JUT skotu je tvořen 54 jedinci (18 jalovic, býků a volů) plemen ZCH, ZXX a ZSI, jak ukazuje tab. 1. Všechna zvířata byla poražena v přibližně stejném věku m = 621, s = 26, 125 dnů). 2 ( X X Tab. 1: Charakteristika datového souboru JUT. N = 54 PLEMENO SEUROPMASO R SEUROPMASO U SEUROPMASO O SOUČET jalovice ZXX ZSI ZCH býk ZXX ZSI ZCH vůl ZXX ZSI ZCH Celkem Parametry bourání vyhodnocované v práci jsou všechny přepočítány na procentní podíl z hmotnosti pravé poloviny JUT. Jedná se o procentní parametry hmotnosti u kostí masitých, kostí technických, ořezů, lojů z předních i zadních čtvrtí, hrudí s žebry, podplečí, plece, přední kližky, krku, boku bez kostí, boku s kostí, kýty, zadní kližky, nízkého roštěnce, svíčkové, dále o složené parametry procentní hmotnosti masa, kostí, loje a parametr poměru masa a kostí. Bourání JUT skotu probíhalo dle normy ČSN , podrobněji viz Bjelka et al.(2002). Všechny parametry bourání vykazují normální rozdělení a homogenitu rozptylů (Leveneův test). Dalšími parametry analýzy jsou věk při porážce, pohlaví a plemenná příslušnost jedinců. Jako třídu zmasilosti dle normy SEUROP uvažujeme hodnocení stanovené pověřeným klasifikátorem. Pro statistické vyhodnocení jednotlivých parametrů v rámci tříd zmasilosti dle SEUROP užíváme metody ANOVA v rámci procedury GLM (SPSS v. 14). Model použitý pro testování jednotlivých parametrů bourání má následující podobu. x = m+ a + e, ij j ij kde: x je hodnotou parametru případu i ve třídě j, e ij m je společný průměr, a j ij je efekt j té třídy klasifikace zmasilosti, je náhodnou chybou. Výsledky Prvním krokem analýzy pokusného souboru bylo provedení analýzy pevného efektu třídy zmasilosti SEUROP v závislosti na pohlaví, plemenné příslušnosti a porážkovém věku jedinců. Nebyly prokázány žádné rozdíly v rámci zatřídění do tříd zmasilosti SEUROP pro žádný z těchto parametrů. Proto tyto efekty v další analýze neuvažujeme a používáme výše popsaný model. Distribuci jednotlivých veličin, které v rámci datového souboru vykazují signifikantní (p<0.05) rozdíly při zatřídění do tříd zmasilosti ukazují grafy 110 (vynechán graf distribuce složené veličiny poměru masa a kostí). 183

185 5,6 5,4 5,4 5,2 PODPLECI%POL 5,2 5,0 4,8 4,6 4,4 4,2 HKTPP% 5,0 4,8 4,6 4,4 4,2 4,0 3,8 3,6 4,0 3,4 3,8 R U O 3,2 R U O 6,5 9,0 6,0 8,5 8,0 KOSTIMASIT%POL 5,5 5,0 4,5 4,0 KRK%POL 7,5 7,0 6,5 6,0 5,5 5,0 4,5 3,5 4,0 3,5 3,0 R U O 3,0 R U O 184

186 3,1 9,0 3,0 2,9 8,5 2,8 8,0 KLIZKA ZC %POL 2,7 2,6 2,5 2,4 2,3 HKTZC% 7,5 7,0 6,5 2,2 6,0 2,1 2,0 5,5 1,9 R U O 5,0 R U O 4,4 1,6 4,3 4,2 1,5 Roštěnec 4,1 4,0 3,9 3,8 Svíčková %POL 1,4 1,3 3,7 3,6 1,2 3,5 R U O 1,1 R U O Maso% POL 79,0 78,5 78,0 77,5 77,0 76,5 76,0 75,5 75,0 74,5 74,0 73,5 73,0 72,5 R U O Kost %POL R U O Graf : Distribuce průkazně rozdílných parametrů bourání v rámci tříd SEUROP. Vertikální čáry značí 95% intervaly spolehlivosti. Empirickou zkušeností a normou SEUROP samotnou je dána významná úloha kýty JUT skotu při klasifikaci do třídy zmasilosti. Proto uvádíme v grafu 11 distribuci tohoto parametru v jednotlivých třídách klasifikace. 185

187 18,5 18,0 17,5 KYTA %POL 17,0 16,5 16,0 15,5 15,0 R U O EUROPMASO Graf 11.: Procentní hmotnost kýty v rámci tříd SEUROP. Vertikální čáry značí 95% intervaly spolehlivosti. Diskusia Při diskuzi výsledků je třeba přihlédnout k nestejnému počtu JUT v jednotlivých třídách zmasilosti. Zejména u tříd R a O je malý počet jedinců příčinou nekompaktních intervalů spolehlivosti. Pokusme se však diskutovat výsledky z hlediska naznačených trendů. Z výsledků je patrné, že parametr procentní váhy roštěnce v podstatě jako jediný zohledňuje objektivně správně třídu klasifikace zmasilosti. Ostatní parametry v rámci tříd vykazují jiné, než očekávané výsledky, kdy zejména třída R vykazuje neočekávané hodnoty vzhledem ke třídě U, případně ke třídě O. Jedná se například o procentní parametr podílu masa, krku či kýty vzhledem k celkové váze půli JUT a zatřídění JUT do tříd zmasilosti dle SEUROP. Při rozboru vztahů mezi třídami O a U můžeme konstatovat, že kopírují logický trend daný normou SEUROP. Vzhledem k výsledkům distribuce parametru váhy kýty pak můžeme usuzovat na předem danou malou diferenci mezi třídami zmasilosti v samotné normě (především mezi třídami R a U), což potvrzují i některé ostatní výsledky (parametr procentní váhy podplečí a roštěnce). Vzhledem ke zmíněným skutečnostem bude jistě zajímavý podobný metodický rozbor zahrnující podstatně větší množství sledovaných JUT. Práce byla vytvořena za podpory projektu MŠMT 2B Literatura BJELKA, M. ŠUBRT, J. POLÁCH, P. KRESTÝNOVÁ, M. UTTENDORFSKÝ, K. Carcass quality in crossbred bulls in relation to SEUROP systém grading. Czech J. Anim. Sci., 47, 2002 (11): BJELKA, M. ŘÍHA, J. HOMOLA, M. ŠUBRT, J. VACÁTKO, E. PUDILOVÁ, K. (2004a):Differences of meat yield by progeny trough dams by Czech Spotted Cattle and sires by beef cattle. POSTER XXI Genetic Days International Scientific Conference WROCLAW POLAND, 1 3 SEPTEMBER

188 BJELKA, M. ŠUBRT, J. HOMOLA, M. FILIPČÍK, R. VACÁTKO, E. HAVLÍČKOVÁ, M. SLEZÁKOVÁ, M. Hodnocení vlivu pohlaví na vybrané parametry jatečné hodnoty při vyšší úrovni výživy. In Aktuální otázky produkce jatečných zvířat. 1. vyd. MZLU v Brně: MZLU v Brně, 2004b, s ISBN: ŠUBRT, J. KRESTÝNOVÁ, M. BJELKA, M. HOMOLA, M. (2003): Jakostní parametry jatečného těla kombinovaného a masného užitkového typu skotu. Agromagazín, 4, č. 9, s.5459, ISSN ŠUBRT, J. FILIPČÍK, R. BJELKA, M. HOMOLA, M. VACÁTKO, E. Hybridizace skotu jako zdroj zvyšování kvality jatečného těla. In Collection of Scientific Papers, Faculty of Agriculture in České Budějovice, Series for Animal Sciences, Volume 21.Special Issue. 1. vyd. České Budějovice: Jihočeská univerzita v Českých Budějovicích, Zemědělská fakulta, 2004, s ISSN: VLIV STUPŇOVANÝCH DÁVEK PŮDNÍHO MANGANU A ZINKU NA JEJICH OBSAH A DISTRIBUCI V ROSTLINÁCH RAJČAT EFFECT OF GRADATIONAL AMOUNTS OF SOIL MANGANESE AND ZINC ON THEIR CONTENT AND DISTRIBUTION IN TOMATO PLANTS Rop, O., Valášek, P., Kráčmar, S. Univerzita Tomáše Bati ve Zlíně, Česká republika Abstract Manganese and zinc belong to essential microelements which have indispensable importance on physiologic processes in plant organism. Its enhanced quantity in environment can cause their higher amount in plant organism. The target of our trials was to monitor the effect of gradational amounts of manganese and zinc in soil on their content in tomato plants. The indicating plants were tomatoes of Domino variety. The gradational amounts of microelements in soil led to a statistically significant increasing amount of their content in roots, tops and fruits of tomatoes. Key words: tomatoes, roots, leaves, fruits, manganese, zinc Úvod Mangan (Mn) a zinek (Zn) patří k základním mikroelementům ve výživě rostlin (Purves et al., 2004). Na rozdíl od makrobiogenních prvků, které působí převážně jako stavební látky rostlinného organismu, mají mikrobiogenní prvky ve spojení s enzymatickými systémy úlohu katalytickou. Mangan je v biochemických funkcích podobný hořčíku. Má významnou úlohu při oxidaci indolyl octové kyseliny. Vysoká koncentrace manganu má také vztah k deficienci rostlinných hormonů, například auxinu (Savitsky et al., 1999). Zinek má význam především v enzymových systémech. Aktivuje řadu enzymů, jako například enolázy a anhydrázy, které se účastní metabolických procesů v živých organismech. Zinek se podobně jako mangan podílí zejména na dusíkatém metabolismu rostlin (Obata a Umebayashi, 1997). Podporuje asimilaci NO 3 v první fázi nitrátové redukce, aktivně ovlivňuje metabolismus aminokyselin a syntézu proteinů (Zhu et al., 2001). Materiál a metodika Jako pokusné rostliny byla zvolena tyčková rajčata F1 hybrid DOMINO. Pokus byl prováděn v plastových vegetačních nádobách, které byly umístěny v kryté vegetační hale. Do každé nádoby bylo navažováno 10 kg stejné zeminy. Do pokusu byly zařazeny 3 varianty se stupňovanými dávkami Mn a Zn v půdě podle následujícího schématu: Tabulka 1. Schéma pokusu se stupňovanými dávkami Mn a Zn v půdě 187

189 Aplikace kovu do mg.kg Varianta 1 půdy KONTROLA Mangan Zinek Použitá množství manganu a zinku vycházela z limitních obsahů rizikových prvků v půdách (Anonymous, 1994). Mangan byl aplikován ve formě roztoku síranu manganatého a zinek ve formě síranu zinečnatého. Přídavek kovů byl proveden 20 dní před výsadbou předpěstovaných sazenic rajčat. Každá varianta byla 8x opakována za stejných podmínek (tj. v každé variantě bylo 8 nádob). Rostliny byly pěstovány vždy po jednom kusu v nádobě. Celé rostliny byly sklízeny po 130 dnech vegetace. Obsah kovů byl měřen v kořenech, v nadzemní části rostliny a v plodech, u kterých bylo množství sledovaných prvků stanovováno ve slupkách, dužnině a semenech, Kontrola přirozeného obsahu mikroelementů v půdě byla prováděna měřením na atomovém absorpčním spektrofotometru (PHILIPS PU 9200X) ve výluhu půdy v c(hno 3 ) = 2 mol.dm 3 a je uvedena v tabulce 2 (Javorský, 1984). Mineralizace rostlinné hmoty byla provedena na mokré cestě ve směsi koncentrované kyseliny sírové a 30 % peroxidu vodíku a proměření mineralizátů rostlinné hmoty bylo provedeno na atomovém absorpčním spektrofotometru PHILIPS PU 9200X (Novotný, 2000). Výsledky chemických analýz byly zpracovány statisticky metodou analýzy variance (ANOVA). Pro vyhodnocení průkaznosti rozdílů byl použit Tukayův test při 5 % hladině významnosti (Snedecor a Cochran, 1967). Výsledky obsahu mikroelementů v jednotlivých rostlinných částech byly vyjádřeny v mg.kg 1 sušiny. Pro účely porovnání výsledků obsahu stanovených kovů v plodech rajčat z našeho pokusu s limity maximálního přípustného množství v potravinách, byly výsledky jejich obsahu v dužnině plodů přepočteny také na čerstvou hmotu (Anonymous, 2001; Anonymous, 2004). Tabulka 2. Přirozený obsah mikroelementů v zemině u kontrolní varianty Prvek mg.kg 1 Mangan 511,5 Zinek 26,9 Výsledky Výsledky chemických analýz na obsah manganu a zinku v rostlinách rajčat jsou uvedeny v tabulkách 3 4. Se stupňovanými dávkami manganu i zinku v půdě docházelo ke zvyšování jejich obsahu v jednotlivých orgánech rostlin rajčat. Toto zvýšení bylo v případě manganu statisticky průkazné u kořenů a nadzemní části, a to při srovnání všech variant. V případě plodů, kde byly zvlášť analyzovány slupka, semena a dužnina došlo ke statisticky významnému zvýšení u variant se dvěma nejvyššími dávkami Mn ve srovnání s variantou kontrolní a variantou s nejnižším přídavkem Mn do půdy (Tab. 3) 188

190 Tabulka 3. Obsah manganu (mg.kg 1 sušiny) v kořenech, nadzemní části rostlin, ve slupkách, dužnině a semenech plodů rajčat (průměr± S.D.) varianta kořeny nadzemní část slupka plodů semena dužnina plodů česrtvá hmota dužniny 1 4,12 ± 0,45 2,11 ± 0,25 0,97 ± 0,11 1,63 ± 0,21 0,51 ± 0,04 0,06 2 8,15 ± 0,23 3,12 ± 0,36 1,14 ± 0,11 1,84 ± 0,11 0,58 ± 0,09 0, ,21 ± 1,15 3,59 ± 0,21 1,56 ± 0,10 2,21 ± 0,12 0,69 ± 0,06 0, ,33 ± 1,55 4,26 ± 0,39 1,96 ± 0,12 2,26 ± 0,15 1,52 ± 0,09 0,14 Tabulka 4. Obsah zinku (mg.kg 1 sušiny) v kořenech, nadzemní části rostlin, ve slupkách, dužnině a semenech plodů rajčat (průměr± S.D.) varianta kořeny nadzemní část slupka plodů semena dužnina plodů česrtvá hmota dužniny 1 13,29 ± 2,15 4,51 ± 0,52 2,22 ± 0,15 2,20 ± 0,24 1,52 ± 0,12 0, ,45 ± 1,25 4,66 ± 0,51 2,24 ± 0,14 2,13 ± 0,29 1,55 ± 0,19 0, ,35 ± 2,16 7,25 ± 0,39 2,58 ± 0,15 2,50 ± 0,25 1,78 ± 0,10 0, ,66 ± 2,60 8,95 ± 0,42 2,99 ± 0,19 2,51 ± 0,26 1,85 ± 0,11 0,17 Statisticky průkazně nejvyšší obsah manganu byl zaznamenán u kořenů, kdy např. u varianty s nejvyšším množství Mn v půdě bylo naměřeno 25,33 mg Mn.kg 1 sušiny. V nadzemní části (stonky a listy) se potom ve srovnání s kořeny kumulovalo o 75 % méně manganu. Nejnižší množství manganu potom bylo naměřeno v plodech rajčat. Přitom slupky plodů rajčat obsahovaly o 41 % více manganu než dužnina. Také v případě zinku vlivem jeho stupňovaných dávek v půdě docházelo k signifikantnímu zvyšování jeho množství v kořenech. U nadzemní části byl tento nárůst statisticky významný až u variant s přídavkem zinku 100 a 200 mg Zn.kg 1 zeminy. U těchto variant docházelo také ke statisticky průkaznému zvyšování obsahu zinku v plodech rajčat (Tab. 4). Přitom slupky plodů obsahovaly opět vyšší množství zinku ve srovnání s dužninou (o 33 %). Podobně jako v případě manganu i u zinku se ho kumulovalo nejvíce v kořenech. Nejméně zinku bylo opět obsaženo v plodech (Tab. 4). Diskuse Na zvyšování obsahu prvků v rostlinnném organismu při jejich zvýšeném množství v půdě poukazuje řada autorů (Markert, 1992; Patra a Sharma, 2000; Purves et al., 2004). Přitom nejvyšší množství mikroelementů i cizorodých prvků bývají v kořenech. Zde působí toxicky na vodivá pletiva a snižuje se tak možnost jejich translokace do nadzemní části rostliny (Mortvedt, 1994). Dalším aspektem mohou být také jejich chemické reakce z rostlinnými bílkovinami za vzniku nerozpustných komplexů (Patra a Sharma, 2000). Nejmenší množství mikroelementů i cizorodých prvků se potom hromadí v plodech, které jsou určeny pro konzum. V našem pokusu se potvrdila skutečnost, že v rámci plodů se většina prvků ukládá ve slupkách (Welch, 1995). Stupňované dávky mikroelementů sice zvyšovaly jejich množství v plodech rajčat, ale po přepočtení na čerstvou hmotu je patrné (Tab. 3 a 4), že ani nejvyšší množství manganu nebo zinku neznamenalo zvýšení jejich obsahu nad hodnoty stanovené platnými hygienickými normami (Anonymous, 2001; Anonymous, 2004). Závěr V nádobových pokusech byl sledován vliv manganu a zinku na jejich ukládání a distribuci v rostlinách rajčat. Se stupňovaným množstvím sledovaných prvků vzrůstal statisticky růkazně 189

191 jejich obsah v jednotlivých orgánech rostlin rajčat. Nejvíce manganu i zinku se kumulovalo v kořenech, nejméně potom v plodech, které jsou konzumním orgánem. Literatura ANONYMOUS: Vyhláška Ministerstva životního prostředí České republiky 13/1994 Sb. ANONYMOUS: Commission Regulation (EC) No 466/2001 Sb. ANONYMOUS: Vyhláška Ministerstva zdravotnictví České republiky 304/2004 Sb. JAVORSKÝ, P.: Chemické rozbory v zemědělských laboratořích. Praha, Ministerstvo zemědělství a výživy, 1987, 285 s. MARKERT, B.: Presence and significance of naturally occuring chemical elements of the periodic system in the plant organism and consequences for future investigations on inorganic environmental chemistry in ecosystems. Osnabruck, Kluwer Academic Publishers, 1992, 29 pp. MORTVEDT, J. J.: Needs for controlledavailability micronutrient fertilizers. Fertilizer Research, 38 (3), 1994, pp NOVOTNÝ, F.: Metodiky chemických rozborů pro hodnocení kvality odrůd. Brno, ÚKZÚZ, 2000, 555 pp. OBATA, H. UMEBAYASHI, M.: Effects of cadmium on mineral nutrient concentrations in plants differing in tolerance for cadmium. Journal of Plant Nutrition, 20 (l), 1997, pp PATRA, M. SHARMA, A.: Mercury toxicity in plants. Botanical Review, 66 (3), 2000, pp PURVES, W. SADAVA, D. ORIANS, G. H. HELLER, H. C.: Life: The Science of Biology. Sunderland, Sinauer Associates, 2004, 1121 pp. SAVITSKY, P. A. GAZARYAN, I. G. TISHKOV, V. I. LAGRIMINI, L. M. RUZGAS, T. GORTON, L.: Oxidation of indole3acetic acid by dioxygen catalysed by plant peroxidases. Biochemical Journal, 340, 1999, pp SNEDECOR, G. W. COCHRAN, W. G.: Statistical Methods. Iowa, Iowa State University Press, WELCH, R. M.: Micronutrient nutrition of plants. Critical Reviews in Plant Sciences, 14 (1), 1995, pp ZHU, Y. G. SMITH, S. E. SMITH, F. A.: Plant growth and cation composition of two cultivars of spring wheat differing in P uptake efficiency. Journal of Experimental Botany, 2001, 52 (359), pp Kontaktní adresa: Ing. Otakar Rop, Ph.D., Ústav potravinářského inženýrství, nám. T.G. Masaryka 275, Zlín, [email protected] HODNOTENIE MOTILITY A KONCENTRÁCIE SPERMIÍ KRÁLIKOV PO EXPERIMENTÁLNOM PODANÍ NIKLU A ZINKU MOTILITY AND CONCENTRATION RABBIT SPERMATOZOA EVALUATION AFTER EXPERIMENTAL NICKEL AND ZINK ADMINISTRATION Schneidgenová, M., Kalafová, A., Chrenek, P. 1, Massányi, P., Lukáč, N. Slovenská poľnohospodárska univerzita, Nitra 1 Slovenské centrum poľnohospodárskeho výskumu, Nitra Abstract The aim of this study was to compare concentration and motility of rabbit spermatozoa after experimental peroral administration of nickel and zinc. For analysis the semen samples from 5 groups were used (n= 20) and were collected 5 periodes (Day 0, 20, 40, 60, 90). We fed the control group with KKV1 feed without nickel and zinc. Experimental groups of rabbits received different concentrations of nickel and zinc for 90 day P1 (17.5 g NiCl kg 1 food), P2 (30g NiCl kg 1 food), P3 (17.5g NiCl kg 1 food + 30g ZnCl kg 1 food), P4 (35g 190

192 NiCl kg 1 food + 30g ZnCl kg 1 food) Spermatozoa motility parameters were evaluated by the CASA method. In general, analysis detected that the average spermatozoa concentration was ml and spermatozoa motility %. Significant differences were found in spermatozoa concentrations at Day 0 between K:P1 and at Day 40 between K:P1, P2 and P3. Motility analysis report significant differences between groups K:P1 at Time 0; K:P2 at Time 40; K:P4 at Time 60 and between K:P3. According to relative high variability i tis difficult to evaluate spermatozoa quality parameters and further analysis have to be done. In general, our research suggest possible negative effect of nickel administration on reproductive parameters in males. Key words: rabbit, spermatozoa, motility, concentration, nickel, zink Úvod Reprodukčný proces samcov závisí na komplexnom rade biologických vzťahov zahrňujúcich mnoho orgánov, typov buniek, typov molekúl ako aj presnú časovú a priestorovú koordináciu procesov. Nie je preto prekvapujúce, že tento zložitý biologický systém je zraniteľný rozličnými environmentálnymi faktormi, fyzikálnymi ako aj chemickými (Massányi et al., 1999). Charakteristickým prejavom života spermií a ich fertilizačných vlastností je látková premena a pohyb. Metabolické procesy prebiehajúce v spermiách sa využívajú hlavne na zabezpečenie pohybu spermií (Gamčík et al., 1992). Ejakulát sa posudzuje makroskopicky, mikroskopicky a biochemicky. Mikroskopické hodnotenie ejakulátu sa robí hneď po odbere, najneskôr do 10 minút. Vyšetrenie sa robí pri teplote o C pod mikroskopom. Posudzuje sa: koncentrácia spermií, aktivita pohybu spermií, intenzita pohybu vírivosť a morfologické vlastnosti spermií (Massányi et al., 2002). Činnosť ľudstva, predovšetkým niektoré oblasti ako je priemyselná činnosť, energetika, doprava, ale aj poľnohospodárska produkcia sú trvalým a dá sa povedať stále sa zvyšujúcim zdrojom cudzorodých látok, ktoré sa dostávajú do životného prostredia a do potravy. Tieto látky, aj keď sú súčasťou neživej prírody a v malých množstvách sa nachádzajú aj v živej hmote, pri relatívne nízkych koncentráciách nepriaznivo ovplyvňujú činnosť buniek, orgánov a tým aj funkcie celého organizmu (Massányi et al., 2002). Toxicita niklu vyvoláva veľký záujem kvôli rozšírenému výskytu niklu v prostredí. Možným vysvetlením ako nikel spôsobuje poškodenie a smrť buniek, je peroxidácia lipidov a tvorba reaktívnych foriem kyslíka (Chang Yo et al., 2003). Vysoké množstvo niklu je známe ako škodlivé pre zdravie zvierat i ľudí. Laboratórne experimenty na zvieratách potvrdzujú, negatívne účinky niklu na semenníky, semenné váčiky a prostatu (Forgacs et al., 2001, Pandey a Srivastava, 2000). Zinok je esenciálny stopový prvok nevyhnutný pre všetky druhy žijúcich organizmov. U pohlavne dospelých samcov deficit zinku spôsobuje poruchy v priebehu spermatogenézy. Pri sledovaní vybraných spermiologických ukazovateľov sa zistilo, že pri zníženej koncentrácii zinku v krvi je nižšia hustota a aktivita spermií, je znížená prežívateľnosť spermií ako aj vyšší výskyt patologických spermií (Cigánková et al., Cieľom práce bolo sledovanie motility a koncentrácie spermií králikov po experimentálnom perorálnom podaní niklu a zinku v rôznych dávkach. Materiál a metodika V pokuse sme použili 20 samcov brojlerovej línie Kalifornský a Novozélandský biely (SCPV VUŽV, Nitra) o hmotnosti 3,5 4,0 kg vo veku 4 mesiace, ktoré boli rozdelené do piatich skupín (P1, P2, P3, P4, K). V každej skupine boli 4 zvieratá chované v kovových klietkach pri svetelnom režime 14 h svetlo. Zvieratá boli kŕmené kŕmnou zmesou KKV1, do ktorej boli pridané ťažké kovy (nikel a zinok) po dobu 90 dní (ad libidum s neobmedzeným prístupom k vode). V prvej pokusnej skupine (P1) zvieratá (n=4) dostávali nikel (NiCl 2, Reachem) v dávke 17,5 g NiCl kg 1 KZ. Druhej pokusnej skupine zvierat (P2; n=4) bol do krmiva pridaný nikel v dávke 30g NiCl kg 1 KZ. Tretia skupina (P3) prijímala nikel 191

193 v dávke 17,5 g NiCl kg 1 KZ v kombinácii so zinkom v koncentrácii 30g ZnCl kg 1 KZ (ZnCl 2, Reachem). V poslednej pokusnej skupine (P4) sme zvieratám (n=4) pridali do krmiva prímes niklu (35g NiCl kg 1 KZ) a zinku (30g ZnCl kg 1 KZ). Na porovnanie výsledkov bola zostavená kontrolná skupina K, v ktorej zvieratá (n=4) prijímali rovnakú kŕmnu zmes (KKV1), ale bez pridania niklu a zinku. Ejakulát králikov sme odoberali pomocou umelej vagíny mesačne raz (v rovnakej časovej perióde). Motilita a koncentrácia spermií bola stanovená CASA analyzátorom (Sperm Vision TM ; Minitüb Nemecko). Dosiahnuté výsledky boli štatisticky spracované použitím PC programu SAS. Výsledky a diskusia V pokuse sme sledovali motilitu a koncentráciu spermií v ejakulátoch králikov po experimentálnom podaní niklu a zinku. Priemerná koncentrácia spermií v K skupine pri 0. odbere (Tab.1) bola 0, ml 1, v skupinách P1 P4 sa pohybovala v rozmedzí od 0, ml 1 do 0, ml 1. Priemerná hodnota motility spermií (Tab. 2) v K skupine v tomto odbere bola 74,25 % a v skupinách P1 P4 v rozmedzí 46,17 77,12%. V 1. odbere sme zistili priemernú hodnotu koncentrácie spermií v K skupine 0, ml 1 a v pokusných skupinách sa pohybovala v rozpätí od 0, ml 1 do 0, ml 1. V kontrolnej skupine bola hodnota motility spermií 78,44%, v P1 skupine bola najvyššia priemerná hodnota a to 84,72%, najnižšia v skupine P2 66,40%. V 2. odbere v kontrolnej skupine priemerná hodnota koncentrácie mala hodnotu 1, ml 1. V pokusných skupinách sa pohybovala v rozmedzí od 0, ml 1 do 1, ml 1. Motilita spermií v 2. odbere bola najvyššia v P4 skupine 91,02% a najnižšia v P2 skupine 65,55%, v kontrole mala hodnotu 86,01%. Tabuľka 1 Základné štatistické ukazovatele koncentrácie spermií v ejakuláte králikov odber Skupina K (kontrola; n=4) x 0,27 0,39 1,52 0,73 0,88 SD 0,22 0,23 0,14 0,75 0,51 CV 80,91 59,07 9,28 103,10 58,03 P1 Ni 2 + ( mg NiCl 2 /kg) x 0,05 0,49 0,99 0,72 1,52 SD 0,04 0,19 0,25 0,58 0,16 CV 96,17 38,95 25,33 80,59 10,42 P2 Ni 2 + ( mg NiCl 2 /kg) x 0,07 0,24 0,56 0,95 1,12 SD 0,02 0,17 0,25 0,46 0,36 CV 22,01 73,00 44,88 48,40 31,87 P3 Ni Zn ( mg NiCl 2 /kg + 30 mg ZnCl 2 /kg x 0,27 0,43 0,61 0,68 0,60 SD 0,22 0,09 0,22 0,34 0,32 CV 83,02 20,84 35,25 50,43 52,58 P4 Ni 2 + Zn (+ 35 mg NiCl 2 /kg + 30 mg ZnCl 2 /kg) x 0,11 0,46 1,46 0,90 1,30 SD 0,04 0,42 0,89 0,65 1,08 CV 34,31 91,48 60,87 72,54 82,74 x priemer; SD smerodajná odchýlka; CV variačný koeficient Priemerná koncentrácia a motilita spermií 3 odberu sa pohybovala: najvyššia hodnota koncentrácie v skupine P2 0,95.109ml1 a najnižšia v skupine P3 0,68.109ml1, v kontrole má koncentrácia hodnotu 0,73.109ml1. Priemerná hodnota motility v K skupine bola v tomto odbere 63,15% a v pokusných skupinách sa motilita pohybovala v rozpätí od 69,15% do 83,36%. 192

194 4. odber je popísaný v tabuľkách 1 a 2 a priemerná koncentrácia v K skupine bola 0,88.109ml1 a pokusné skupiny boli v rozmedzí od 0,60.109ml1 do 1,52.109ml1. Najvyššiu hodnotu 1,52.109ml1 sme zaznamenali v skupine P1. Priemerné hodnoty motility spermií sa pohybovali v rozmedzí od 55,37% do 84,87% v pokusných skupinách a K skupina mala hodnotu 83,12%. Sledovaním koncentrácie a pohyblivosti králičích spermií sa tiež zaoberal Slamečka (2007). V našom pokuse sme zistili približne rovnaké hodnoty koncentrácie spermií, pri hodnotení motility sme však dospeli k o niečo vyšším výsledkom. Tabuľka 2 Základné štatistické ukazovatele motility spermií v ejakuláte králikov odber Skupina K (kontrola; n=4) X 74,25 78,44 86,01 63,15 83,12 SD 4,47 18,71 2,83 23,16 9,56 CV 6,02 23,85 3,30 36,67 11,50 P1 Ni 2 + ( mg NiCl 2 /kg) X 46,17 84,72 87,85 72,11 83,39 SD 29,75 4,89 4,95 16,01 2,66 CV 64,44 5,78 5,64 22,20 3,19 P2 Ni 2 + ( mg NiCl 2 /kg) X 68,08 66,4 65,55 71,92 71,24 SD 11,74 25,46 18,35 11,79 10,98 CV 17,24 38,34 27,99 16,39 15,41 P3 Ni Zn ( mg NiCl 2 /kg + 30 mg ZnCl 2 /kg X 64,03 71,02 71,76 69,15 55,37 SD 19,24 7,26 10,59 9,10 24,39 CV 30,04 10,22 14,75 13,16 44,04 P4 Ni Zn (+ 35 mg NiCl 2 /kg + 30 mg ZnCl 2 /kg) X 77,12 71,99 91,02 83,36 84,87 SD 10,29 10,27 3,25 5,67 8,63 CV 13,35 14,26 3,57 6,80 10,17 x priemer; SD smerodajná odchýlka; CV variačný koeficient Záver V našej práci sme sledovali motilitu a koncentráciu králičích spermií po experimentálnom podaní niklu a zinku do kŕmnej dávky v rôznych koncentráciách. Zistili sme, že koncentrácia spermií sa pohybovala v rozpätí od 0,02 do 1, ml 1 a motilita spermií v rozsahu od 46,17 do 91,02%. Zistili sme: vysoko signifikantné rozdiely v 0. odbere v koncentrácii spermií medzi skupinami K:P1, P3:P1, pri hodnotení motility sme v hladine 0,01 mali rozdiely medzi skupinami K:P1 a P4:P3 v 1. odbere sme nezistili preukazné rozdiely medzi žiadnymi skupinami ani v koncentrácii, ani v motilite spermií signifikatné rozdiely v hladine 0,01 sme zistili v 2. odbere pri hodnotení koncentrácie spermií v skupinách K:P1,P2,P3, P4:P2,P3 v motilite spermií boli rozdiely medzi pokusnými skupinami P1:P2,P3, P4:P2,P3 a K:P2 v 3. odbere sme nezistili preukazné rozdiely medzi skupinami pri hodnotení koncentrácie, pri motilite bol zistený rozdiel medzi P4:K v hladine 0,01 vo 4. odbere boli vysoké signifikantné rozdiely pri hodnotení motility v hladine 0,001 a to medzi skupinami P4:P3, P1:P3, K:P3. V koncentrácii bol preukazný rozdiel 193

195 v hladine 0,01 iba medzi pokusnými skupinami P1:P3 a skupinami P4:P3 bol zistený signifikatný rozdiel v hladine 0,05 Pre značnú variabilitu medzi skupinami nie je možné zhodnotiť vplyv niklu a zinku na ejakulát králikov. Literatúra 1. CIGÁNKOVÁ, V., MESÁROŠ, P., BÍREŠ, J., LEDECKÝ, V., CIGÁNEK, J., TOMAJKOVÁ, E Morfologické zmeny semenníkov žrebcov pri deficite zinku. Slov. vet. čas., 23, 1998, s FORGACS, Z., NEMETHY, Z., REVESZ, C., LAZAR, P Specific amino acids mederate the effects of Ni 2+ on the testosterone production of mouse Leydig cells in vitro. In: J Toxicol Environ Health, 2001, s GAMČÍK, P., KOZUMPLÍK, J., MESÁROŠ, P., SCHVARC, F., VLČEK, Z., ZIBRÍN, M Andrológia a umelá inseminácia hospodárskych zvierat. In: Príroda, Bratislava, s CHANG, Y. CH., YIFEN, W., YUHWAN, L., SHUFANG, Y Nickelinduced oxidative stress and effect of antioxidants in human lymphocytes. In: Arch. Toxicol., roč. 77, č. 3, s MASSÁNYI, P., CIGÁNKOVÁ, V., FABIŠ, M., KOVÁČIK, J., MASSÁNYIOVÁ, K., TOMAN, R Reprodukčná toxikológia. SPU, Nitra, 147 s MASSÁNYI, P., TRANDŽÍK, J., LUKÁČ, N., TOMAN, R., HALO, M., STRAPÁK, P Hodnotenie pohyblivosti spermií komputerovou technikou. SPU, Nitra, 70 s. 7. MASSÁNYI, P., TRANDŽÍK, J., NAĎ, P., LUKÁČ, N., TOMAN, R., KORÉNEKOVÁ, B., SKALICKÁ, M Hodnotenie výskytu patologických spermií vo vzťahu ku koncentrácii niektorých rizikových prvkov v ejakulátoch zvierat. In: Rizikové faktory potravového reťazca. SPU, Nitra, s PANDEY, R., SRIVASTAVA, S Spermatotoxic effects of nickel in mice. In: Bull. Environ. Contam. Toxicol., 2000, s SLAMEČKA, J Vplyv HPAlektínu na pohyblivosť spermií králikov. In: Bakalárska práca, SPU Nitra, 2007, 47 s. SIGNÁLNÉ LÁTKY SPROSTREDKUJÚCE VPLYV VÝŽIVY NA FUNKCIE OVÁRIÍ A ICH PREDISPOZÍCIU K VÝVINU RAKOVINY SIGNALLING SUBSTANCES MEDIATING EFFECT OF NUTRITION ON OVARIAN FUNCTIONS AND THEIR PREDISPOSITION TO CANCER DEVELOPMENT Sirotkin, A., (1,2) Švarcová, O.,(2), Rafay, J.,(1) Chrastinová, Ľ, (1), Makerevič A., (1), Grossmann, R., (3), Benčo, A., (2), Pavlova, S., (2), Lauková, M., (4), Kotwica, J.,(5), Ovcharenko, D., (6), Mlynček, M., (7), Bulla, J. (4) (1) Slovenské centrum poľnohospodárského výskumu, Nitra, Slovensko, (2) Univerzita Konštantína Filozofa, Nitra, Slovensko, (3) Institute of Animal Science, FAL, Neustadt, Germany and (4) Slovenská poľnohospodárska univerzita, Nitra, Slovensko, (5) Institute of Reproduction and Food Research, OlsztynKortowo, Poland, (6) University of Texas, Austin, USA, (7) Fakultná nemocnica s poliklinikou v Nitre, Nitra, Slovensko. Abstract It is known, that nutrition can affect reproductive system and substances relating to malignant transformation of this system via metabolic hormones leptin, ghrelin and insulinlike growth factor IGFI. The aim of our invivo and invitro experiments was to examine the role of these metabolic hormones in mediating effect of food restriction on ovarian functions, in controlling these functions, especially on expression of proliferation, apoptosis and cancerrelated substances in different species. In invivo experiments, rabbits were subjected to food 194

196 restriction and IGFI treatments, whilst plasma L and IGFI levels were measured. In invitro experiments, rabbit, human, porcine and chicken ovarian cells were cultured in the presence of leptin, ghrelin, antiserum against IGFI, inhibitors of protein kinase A, MAP kinase and of CDC2 kinase or their combination. Part of rabbit, porcine and human ovarian granulose cells were transfected with gene constructs for apoptosisstimulated protein kinase 1 (ASK1) and transcription factors p53 (anticancer substance), STAT1 and CREB1 and subsequently cultured with or without leptin, ghrelin and IGFI. In some cases human granulose cells were transfected with sirna and mirna constructs influencing protein kinases and other signaling substances. Expression of intracellular peptides associated with proliferation, apoptosis, cancerogenesis, as well as hormone release were determined by using RIA/IRMA, TUNEL, immunocytochemistry and Western immunoblotting. Food restriction in rabbits results in a reduction in plasma L and IGFI levels, IGFI addition has an opposite effect. Addition of leptin, ghrelin and IGFI altered hormone release and the expression of intracellular substances mentioned above by cultured rabbit, human, porcine and chicken ovarian cells. Immunoneutralisation of IGFI reversed the effects of L on the secretory activity of human granulosa cells. Inhibitors of protein kinases PKA, MAPK and CDC2, as well as the transfection of ovarian cells with gene constructs encoding ASK1, p53, STAT1 and CREB1 were able to affect ovarian functions listed above, as well as to promote or prevent effects of leptin, ghrelin and IGFI. Furthermore, inhibition of some protein kinases by using transfection with some si RNA and mirna constructs was able to promote proliferation, apoptosis, accumulation of cancerpreventing substance p53 in human ovarian granulose cells. The present observations suggest (1) that metabolic hormones leptin, ghrelin and IGFI can be controlled by pattern of nutrition, (2) that they directly control ovarian cell proliferation, apoptosis, and secretory activity including signaling substances involved in development (estrogen, proliferationrelated peptides) and prevention (apoptosisrelated substances and p53) of ovarian cancer, and (3) these hormones may act through local IGFI, protein kinase, transcription factor and mirnadependent intracellular mechanisms. Kľúčové slova: leptín, ghrelín, IGFI, ováriá, rakovina, proliferácia, apoptóza Úvod Je známe, že charakter výživy môže ovplyvňovať (stimulovať alebo inhibovať) funkcie reprodukčného systému a jeho odolnosť voči nádorovým ochoreniam. Hormonálne a vnútrobunkové mechanizmy tohto vplyvu však nie sú úplne objasnené. Je známe, že niektoré takzvané metabolické hormóny sú pod kontrolou výživy. K nim patria nedávno objavené hormóny leptín (produkt tukového a iných tkaniv), ghrelín (ktorý sa vylučuje žalúdkom a inými tkanivami) a rastový hormón inzulínu podobný rastový faktor I (IGFI). Tieto hormóny ovplyvňujú reprodukčnú sústavu cez hypotalamohypofyzarný systém, ale existujú údaje aj o ich priamom vplyve na gonády. Mechanizmy účinku metabilických hormónov a úloha proteínkináz, transkripčných faktorov, sirna a mirna v sprostredkovaní účinku výživy, v kontrole ovariálnych funkcií a v predispozícii k nádorovej transformácii sú zatiaľ neznáme. Cieľom našej práce uskutočnenej na ovariálnych bunkách rôznych druhov bolo (1) potvrdiť, že výživa môže kontrolovať vylučovanie týchto hormónov, (2) preskúmať možnosť priameho vplyvu hormónov leptínu, ghrelínu a IGFI na funkcie ovariálnych buniek (proliferáciu, apoptózu, sekréciu hormónov) vrátane expresie signálnych látok, od ktorých záleží odolnosť buniek proti nádorovým ochoreniam ( hormóny estrogény, proliferačné, apoptotické a antiapoptotické peptidy, transkripčný antirakovinový faktor p53 a iné) a (3) zistiť vnútrobunkové sprostredkovatele (proteín kinázy, transkripčné faktory, sirna a mirna) účinku týchto hormónov a ich efekty na ovariálne bunky. Materiál a metódy Experimenty invivo boli uskutočnené na králikoch, časť ktorých podrobili 1mesačnéj 50% reštrikcii krmiva a injekciám IGFI a leptínu. Analýzu IGFI a leptínu v plazme uskutočnili pomocou RIA. 195

197 Invitro experimenty uskutočnili na ovariálnych bunkách (granulóznych bunkách a fragmentoch ovariálnych folikulov) králikov, ľudí, ošípaných a sliepok. Izolované bunky kultivovali bez a v prítomnosti rôznych dávok leptínu, ghrelínu, IGFI, protilátky proti IGFI, inhibítorov proteín kináz (PKA, MAPK, CDC2) a ich kombinácie. V osobitných pokusoch granulózne bunky králikov, ľudí a ošípaných podrobili transfekcii génovými cdna konštrukciami pre apoptózou stimulovanú proteín kinázu (ASKI) a transkripčné faktory p53, STAT1 a CREB1 a následne boli kultivované s leptínom, ghrelínom a IGFI. V niektorých experimentoch granulózne bunky ľudí transfekovali génovými sirna a mirna konštrukciami vytvorenými na základe génových databáz a inhibujúcimi produkciu proteín kináz a niektoré iné signálné látky. Expresiu látok spojených s proliferáciou, apoptózou, nádorovými transformáciami a vylučovanie hormónov hodnotili metódami RIA/IRMA, TUNEL, imunocytochémia a Western imunoblotting. Výsledky a diskusia Reštrikcia výživy vyvolávala znižovanie koncentrácie leptínu a IGFI v plazme krvi králikov. Injekcie IGFI mali opačný efekt. Prídavky leptínu, ghrelínu a IGFI (1100 ng/ml média) ku kultúre ovariálnych buniek králikov, ľudí, ošípaných a sliepok boli schopné ovplyvňovať produkciu hormónov (progesterón, testosterón, estradiol, IGFI, oxytocín, vasotocín a prostaglandíny F a E) a expresiu markerov proliferácie (PCNA, cyklín B10, apoptózy (TdT, bax, caspáza 3, ASK1), antiapoptotickej látky bcl2, proteín kináz PKA, MAPK, CDC2 a transkripčných faktorov p53, CREB1 a STAT1. Predchádzajúca reštrikcia krmiva a injekcie leptínu a IGFI modifikovali efekty leptínu, ghrelínu a IGFI.. Imunoneutralizácia IGFI bola schopná zabraňovať a meniť efekty leptínu na sekrečné funkcie ovariálnych buniek ľudí. Blokátory proteín kináz PKA, MAPK a CDC2 a transfekcia buniek génovými cdna konštrukciami pre ASK1, p53, STAT1 a CREB1 boli schopné meniť proliferáciu, apoptózu a sekrečné aktivity ovariálnych buniek, zároveň podstatne modifikovať (zabraňovať alebo posilňovať) efekty leptínu, ghrelínu a IGFI. Množstvo analyzovaných sirna a mirna konštrukcií bolo schopné aktivovať alebo inhibovať expresiu proliferačných, apoptotických a antinádorového peptídu p53 a vylučovanie steroidných hormónov a IGFI regulujúcich reprodukčné funkcie a predispozíciu k vývinu rakoviny. Naše pozorovania potvrdzujú, že vylučovanie metabolických hormónov leptínu, ghrelínu a IGFI sa kontroluje výživou. Dosiahnuté výsledky svedčia, že tieto hormóny môžu priamo kontrolovať základné funkcie ovariálnych buniek (proliferáciu, apoptózu, sekrečnú aktivitu) vrátane signálnych látok, ktoré môžu byť stimulátormi vývinu nádorových ochorení (estrogény, proliferačné a antiapoptotické peptidy) alebo sa podieľať na ich prevencii (apoptotické peptidy a transkripčný faktor p53). Nakoniec, vplyv leptínu, ghrelínu a IGFI na hormón IGFI, protein kinázy PKA, MAPK, CDC2, ASK1 a transkripčné faktory p53, STAT1 a CREB1 a schopnosť imunologických, farmakologických a génových regulátorov týchto vnútrobunkových látok ovplyvňujú základné funkcie ovárií a meniť účinky na nich hormónov demonštruje, že IGFI, proteín kinázy PKA, MAPK, CDC2, ASK1 a iné a transkripčné faktory p53, STAT1 a CREB1 môžu sprostredkovať účinky leptínu, ghrelínu a IGFI na ovariálne bunky cicavcov a vtákov. Záver Predstavené údaje nasvedčujú, že charakter výživy môže regulovať reprodukčné funkcie a predispozíciu ovárií k nádorovým ochoreniam cez hormóny leptín, ghrelín a IGFI, regulujúc aktivitu zodpovedajúcich génov cez vnútrobunkové proteín kinázy a ďalej cez transkripčné faktory p53, STAT1 a CREB1. Zároveň, druh výživy, výživou regulované metabolické hormóny, proteín kinázy, transkripčné faktory a génové cdna, sirna a mirna konštrukcie ich regulujúce môžu byť použité pre charakteristiku, predpoveď a reguláciu ovariálnych funkcií vrátane predispozície k nádorovým ochoreniam. 196

198 Literatúra u autora Kontaktná adresa: Doc. RNDr. Alexander Sirôtkin, DrSc. Výskumný ústav živočíšnej výroby, Slovenské centrum poľnohospodárskeho výskumu, Hlohovská 2, Nitra, SR. [email protected]. VPLYV CHRÓMU A KADMIA NA KVALITU VAJEC U JAPONSKÝCH PREPELÍC INFLUENCE OF CHROMIUM AND CADMIUM ON QUALITY OF JAPANESE QUAIL EGGS Skalická, M., Naď, P., Demeterová, M., Koréneková, B. Univerzita veterinárskeho lekárstva, Košice Abstract An experiment was conducted to evaluate the effect of chromium (Cr) and cadmium (Cd) on the quality of Japanese quail s eggs. Birds (n=60) were divided into 3 groups of 20 animals each. Group 1 was the control group. In the experimental group 2 was administered 0.12 mg Cr/d per quail in drinking water, whereas in group 3 were given a combination of 0.12 of Cd/d and 0.12 mg/cr. The distribution of Cd in the eggs, the eggs mass, and the strength and thickness of the shells were determined after 35 and 58 d of application. Addition of Cr had positive effect on the weight of eggs. The statistically significant decrease of eggshell strength (p<0.05) was found after 35 and 58 day of experiment in the CdCr group in comparison to control group. These data shows, that addition of Cr can improve quality parameters of quail ś eggs. Key words: chromium, cadmium, Japanese quail, egg, weight, strength, eggshell, thickness Úvod V súčasnej dobe sa do popredia záujmu výskumu zaradili esenciálne prvky, ktoré majú mimoriadny význam pre organizmus v rade katalytických, enzymatických, aktivačných a regulačných procesoch. Trojmocný chróm je esenciálny biogénny prvok, ktorý má vzťah k sacharidovému a lipidovému metabolizmu (Šimko a Šimková, 2004). Významným a potencionálnym zdrojom výskytu cudzorodých látok v potravinách živočíšneho pôvodu je kontaminácia potravinového reťazca pôda voda rastliny zviera človek. (LopezAlonso a kol, 2000, Ondrašovič a kol., 1997).V dnešnej ekonomicky náročnej dobe je potrebný komplexný prístup ku eliminácii negatívnych vplyvov životného prostredia vo vzťahu k poľnohospodárstvu, hlavne ku zdraviu zvierat. Kadmium je opisovaný ako jeden z prvkov s toxickým účinkom na zvieratá a ľudí (Massanyi a kol.,2002). Vysoké hladiny kadmia v diéte môžu spôsobiť zníženie produkcie vajec. Prepelica patrí medzi sťahovavé vtáky spomedzi kurovitých. Živí sa najmä rastlinnou potravou. Na Slovensku hniezdi na celom území od nížin až po horské oblasti. Japonské prepelice sú chované na produkciu vajec a mäsa (Koréneková a kol, 2004). Cieľom práce bolo sledovanie účinku Cr a Cd na váhu vajec Japonských prepelíc ako aj na pevnosť a hrúbku škrupiny. Materiál a metodika V experimente boli použité Japonské prepelice vo veku 40 dní v počte 60ks, rozdelené do 3 skupín po 20ks. Skupina C bola kontrolná. Skupina Cr, bola pokusná, kde bol denne podávaný chróm vo forme vodného roztoku CrCl 3.6H 2 O v dávke 0,12 mg Cr na 1 kus. V tretej pokusnej skupine CrCd bola podávaná kombinácia Cr+Cd, vo forme vodného roztoku CrCl 3.6H 2 O a CdCl 2.H 2 Ov dávke 0.12 mg Cr a 0.12 Cd na kus a deň. Prepelice boli kŕmené kompletnou kŕmnou zmesou HYD 10. Kŕmna zmes a voda boli podávané ad libitum. 197

199 Podmienky experimentu boli v súlade s etickými požiadavkami. Biologický pokus trval 58 dní. Hmotnosť vajec, pevnosť a hrúbka škrupiny boli stanovené na 35 a 58 deň experimentu. Pevnosť škrupiny bola stanovená metódou, ktorú uvádza Marcinka a Gažo (1964). Výsledky boli štatisticky spracované (ANOVA). Výsledky a diskusia Na 35 deň experimentu bola hmotnosť sledovaných vajec v kontrolnej skupine 10,79 g, pevnosť škrupiny 12,09 N a hrúbka škrupiny 0,25 mm. Po 35 dňovej aplikácii Cr sa mierne znížila hmotnosť vajec v pokusných skupinách Cr a CrCd (10,06g a 9,15g). Sahin a kol (2002) a Uyanik a kol (2002) nezistili vplyv chrómu na hmotnosť vajec (Tab.1). Na 58 deň sme zaznamenali v kontrolnej skupine hmotnosť mierne zníženú 10,00g, hrúbka škrupiny sa nezmenila a pevnosť škrupiny zosilnela na 13,05 N. Ani 58 dňová aplikácia Cr nezmenila nami zistené hodnoty na 35 deň. Aplikácia kombinácie CrCd nám znížila hmotnosť vajec a pevnosť škrupiny v porovnaní s kontrolnou skupinou na 35 a 58 deň. Zníženú pevnosť škrupiny zaznamenala aj Kottferová a kol (2004) po dlhdobej aplikácii kadmia u nosníc. Štatisticky významné zvýšenie (p<0.05) sme zaznamenali v pevnosti škrupiny na 35 a 58 deň v pokusnej skupine CrCd v porovnaní s kontrolou. Vplyv chrómu na kvalitu vajec Japonských prepelíc Analyzed 35 day 58 day parameters Control Cr Cr Cd Control Cr Cr Cd X Weight (g) Sd X max V (%) Eggshell X * * strength Sd (N) X max V (%) Eggshell X thickness Sd (mm) X max V (%) * štatistická významnosť na hladine p<0,05 Nami zistené výsledky naznačujú, že suplementácia chrómom veľmi neovplyvnila kvalitu vajec Japonských prepelíc, ale zmiernila negatívny vplyv kadmia hrúbku a pevnosť škrupiny. Literatúra 1. Koréneková, B., Skalická, M., Naď, P., Korének, M.: Magazín chovateľa, 78, 2004, Kottferová, J., 2004 Selected mineral substances, their importance, interactions and elimination from organism. Habilitation work, UVM, Košice, LopezAlonso M., Benedito J.L., Miranda M., Castillo C., Heranadez J., Shore R.F., 2000: The effect of pig farming on copper and yinc accumulation in cattle in Galicia, The Veterinary Journal, 160, Marcinka, Gažo, Pevnosť škrupiny vajec z klietkového chovu nosníc, II. Príspevok k stanoveniu pevnosti vaječnej škrupiny, Vedecké práce VUCHH v Ivanke pri Dunaji, 1964,2, Massanyi P., Kiss Zs., Toman R., Bárdos L (2002): Magyar Állatorvosok Lapja, 11,

200 6. Ondrašovič M., Ondrašovičová O., Vargová M., Kočišová A., 1997: Environmental problems in veterinary practice, DataHelp Košice, Sahin, K., Ozbey, O., Onderci, M., Cikim, G., Aysondu, M.H., 2002, Chromium supplementation can alleviate negative effect of heat stress on egg production, egg quality and some serum metabolites of laying Japanese quail. J. Nutr. 132, Šimko, Š., Šimková, Z.: CHRÓM V PRÍRODE A JEHO VÝZNAM V ORGANIZME, INFOVET, 4, 2004, Uyanik, F., Kaya, S., Kolsuz, A.H., Eren, M., Sahin, N., 2002, The effect of chromium supplementation on egg production, egg quality and some serum parameters in laying hens. Turk J. Vet. Anim. Sci. 26, Spracovanie príspevku bolo podporené grantom VEGA 1/2410/05 EPIDEMIOLOGICKÁ ŠTÚDIA OBSAHU TELESNÉHO TUKU V ORGANIZME V RÔZNYCH VEKOVÝCH SKUPINÁCH ĽUDÍ A RIZIKO JEHO VYSOKÉHO PODIELU Šramková, K. 1, Kolesárová, A. 1, Mrázová, J. 1, Ryšavá, L. 2 1 Katedra výživy ľudí, Fakulta agrobiológie a potravinových zdrojov SPU Nitra 2 Zdravotní ústav se sídlem v Ostravě Abstract The aim of the study was to evaluate body fat content in different age groups and risk of the extreme high values. In the study of the healthnutritional status parameter by means of body fat took part 2147 probands, namely 1719 of women (80,07 %) and 428 of men (19,93 %) at the age of 1483 years (average age 40,46 ± 16,70 years in complete, 40,42 ± 16,19 years in women, 40,65 ± 18,62 years in men). In randomly selected probands were with the aim overweight and obesity prevalence examination measured the body fat content using bioelectrical impedance analyse. According to the obtained body fat values, the probands were divided into three groups: slim 19 % (22,05 % of women and 6,78 % of men), normal 33,35 % (32,81 % of women and 35,51 % of men), overweight 20,35 % (18,85 % of women and 26,40 % of men), obesity 27,29 % (26,29 % of women and 31,31 % of men). It was confirmed the influence of the higher age as the risk factor of the overweight and obesity. Key words: body fat, overweight, obesity, civilisation diseases, nutrition factors Úvod Cieľom štúdie bolo preskúmať a zhodnotiť podiel telesného tuku v organizme ľudí rôznych vekových skupín a zhodnotiť riziko jeho vysokého podielu. Materiál a metodika V náhodne vybranom súbore 2147 osôb, z toho 1719 žien (80,07 % osôb) a 428 mužov (19,93 % súboru) vo veku 14 až 83 rokov sme vyšetrili telesný tuk metódou bioelektrickej impedančnej analýzy použitím prístroja Omron BF 300. Priemerný vek žien bol 40,42 ± 16,19 rokov, mužov 40,65 ± 18,62 rokov a priemerný vek celého vyšetrovaného súboru bol 40,46 ± 16,70 rokov. Najviac zastúpenými vekovými skupinami boli: 2130 rokov (24,69 %), 4150 rokov (21,84 %), 5160 rokov (20,91 %) (tab. 1, tab. 3). Veku maximálne 50 rokov zodpovedalo 69,40 % žien a 64,49 % mužov (68,42 % celého súboru), zvyšní probandi boli v staršom veku (tab. 2). 199

201 Tab. 1 Vekové zloženie súboru ženy muži spolu vek n % n % n % , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,35 4 0, ,47 spolu , , ,00 Tab. 2 Vekové zloženie súboru vek ženy muži spolu n % n % n % do 50 rokov , , ,42 50 rokov a viac , , ,58 spolu , , ,00 Výsledky a diskusia Podiel telesného tuku sme hodnotili v jednotlivých vekových skupinách osobitne u žien a mužov, ako aj spolu. Priemerný telesný tuk bol vyšší v ženskej v porovnaní s mužskou sledovanou časťou populácie (tab. 3), a to vo všetkých vekových kategóriách (tab. 4). Tab. 3 Priemerné hodnoty ( x ± s) sledovaných ukazovateľov v súbore (n = 2148) Skupiny vek (roky) priemer ± SD minimum maximum medián modus telesný tuk (%) priemer ± SD minimum maximum medián modus ženy (n = 1719) 40,42 ± 16,19 14,00 83,00 43,00 21,00 28,13 ± 8,82 4,60 48,90 28,70 29,50 muži (n = 428) 40,65 ± 18,62 14,00 83,00 43,00 22,00 20,87 ± 7,22 4,00 40,70 21,20 29,80 spolu (n = 2147) 40,46 ± 16,70 14,00 83,00 43,00 21,00 26,68 ± 9,00 4,00 48,90 26,70 29,80 Tab. 4 Priemerné hodnoty ( x ± s) telesného tuku Vek (roky) ženy (n = 1719) muži (n = 428) ,14 ± 5,09 14,32 ± 6, ,82 ± 5,29 16,26 ± 5, ,95 ± 6,08 19,10 ± 4, ,10 ± 5,57 22,33 ± 4, ,04 ± 5,09 25,51 ± 4, ,47 ± 3,95 27,27 ± 3, ,55 ± 4,20 26,14 ± 6, ,83 ± 5,28 27,48 ± 10,35 200

202 Jurkovičová (2005) zistila v epidemiologickej štúdii obyvateľov SR nasledujúce priemerné hodnoty telesného tuku: vo veku menej ako 25 rokov: u 19,7 % žien a 14,8 % u mužov, vo veku 2534 rokov: u 23,5 % žien a 17,9 % u mužov, vo veku 3544 rokov: u 28,4 % žien a 21,4 % u mužov, vo veku 4554 rokov: u 32,7 % žien a 24,3 % u mužov, vo veku 5564 rokov: u 36,1 % žien a 26,8 % u mužov, vo veku 6574 rokov: u 37,7 % žien a 28,6 % u mužov, vo veku 75 rokov a viac: u 38,7 % žien a 28,7 % u mužov. V súbore sme zistili nízku telesnú hmotnosť u 22,05 % žien a až o 15,27 % menej mužov (tab. 5). Normálnu telesnú hmotnosť na základe percentuálneho podielu telesného tuku mala približne tretina žien, ako aj mužov (32,81% žien a mužov o 2,7 % viac). Nadhmotnosť alebo obezitu sme pozorovali u 45,14 % žien a až u 57,71 % mužov (o 12,57 % viac). Z toho obezitou sa podľa obsahu tuku vyznačovalo 26,29 % žien a 31,31 % mužov (t.j. o 5,02 % viac). Rozdiel vo výskyte nadhmotnosti bol medzi ženami a mužmi o niečo vyšší ako v prípade obezity obezitou trpí o 7,55 % viac mužov v porovnaní so ženami. Výskyt nadhmotnosti a obezity sa s vekom zvyšoval (tab. 6) Normálnu hmotnosť pozorovala Jurkovičová (2005) u 41,7 % žien a 32,2 % mužov; nadhmotnosť u 24,8 % žien a 28,9 % mužov; a obezitu u 33,5 % žien a 38,9 % mužov. Normálna hmotnosť sa tak vyskytovala viac u žien (o 9,5 %), nadhmotnosť a obezita naopak viac u mužov (o 4,1 % a o 5,4 % viac). Nadhmotnosť alebo obezitu malo 58,3 % žien a 67,8 % mužov (o 9,5 % viac mužov). Tieto údaje boli vyššie ako v nami sledovanom súbore (v súbore Jurkovičovej, 2005 bolo viac žien a mužov s nadhmotnosťou alebo obezitou), avšak rozdiel medzi ženami a mužmi bol nižší (9,5 % v súbore Jurkovičovej versus 12,57 % v našom súbore, avšak vždy v prospech mužov). Tab. 5 Charakteristika postavy na základe telesného tuku ženy muži spolu n % n % n % štíhla , , ,00 normálna , , ,35 nadváha , , ,35 obezita , , ,29 201

203 Tab. 6 Charakteristika postavy na základe telesného tuku v rôznych vekových skupinách Telesný ženy muži spolu tuk (%) norma n % norma n % n % Menej ako 20 rokov (14 20 rokov) štíhla < ,38 < , ,63 normálna , , ,51 nadváha , , ,75 obezita , ,17 5 2, rokov štíhla < ,25 < , ,55 normálna , , ,66 nadváha , , ,91 obezita , , , rokov štíhla < ,25 < , ,16 normálna , , ,66 nadváha , , ,45 obezita , , , rokov štíhla < ,77 < ,00 7 1,49 normálna , , ,74 nadváha , , ,03 obezita , , , rokov štíhla < ,84 < ,00 3 0,67 normálna , , ,14 nadváha , , ,96 obezita , , , rokov štíhla < ,00 < ,00 0 0,00 normálna , ,78 1 0,68 nadváha , , ,18 obezita , , ,14 Pokračovanie tab. 6 Telesný ženy muži spolu tuk (%) norma n % norma n % n % rokov štíhla < ,00 < ,00 0 0,00 normálna , ,00 1 1,37 nadváha , ,76 6 8,22 obezita , , ,41 Viac ako 80 rokov (81 83 rokov) štíhla < ,00 < ,00 0 0,00 normálna , , ,00 nadváha , , ,00 obezita , , ,00 202

204 Obr. 1 Charakteristika postavy na základe telesného tuku v rôznych vekových skupinách % štíhla normálna nadváha obezita Menej ako 20 rokov rokov rokov rokov rokov rokov rokov Viac ako 80 rokov Záver Vyššie uvedené výsledky dokazujú vyšší podiel osôb žien, ako aj mužov s nadhmotnosťou a obezitou vo vyšších vekových kategóriách. V primárnej prevencii obezity sa odporúča udržiavať normálnu telesnú hmotnosť, resp. redukovať nadhmotnosť a obezitu najmä znížením emergetického príjmu, zmenou stravovacích zvyklostí a zvýšením pohybovej aktivity. Redukcia hmotnosti má priaznivý účinok aj na mnohé iné odchýlky (napr. s každým redukovaným kilogramom hmotnosti sa znižuje hladina celkového cholesterolu, LDLcholesterolu, zvyšuje sa hladina HDLcholesterolu. Literatúra 1. Jurkovičová, J Vieme zdravo žiť? Bratislava : Univerzita Komenského, s. ISBN X 2. Kleinwächterová, H., Brázdová, Z Výživový stav člověka a způsoby jeho zjišťování. Brno : Idvpz, s. ISBN Kontaktná adresa: Ing. Katarína Šramková, PhD., Katedra výživy ľudí, Fakulta agrobiológie a potravinových zdrojov Slovenská poľnohospodárska univerzita v Nitre, Tr. A. Hlinku 2, Nitra Práca bola riešená s podporou projektu VEGA 1/2321/05 a KEGA 3/5082/

205 CHOLESTEROLÉMIA FAKTOR CIVILIZAČNÝCH OCHORENÍ OVPLYVNITEĽNÝ VÝŽIVOU A RIZIKO JEHO NEPRIAZNIVÝCH HODNÔT Šramková, K. 1, Chlebo, P. 1, Dudriková, E. 2 1 Katedra výživy ľudí, Fakulta agrobiológie a potravinových zdrojov Slovenská poľnohospodárska univerzita v Nitre 2 Katedra hygieny a technológie potravín, Univerzita veterinárskeho lekárstva Košice Abstract The aim of the study was to monitor risk factor of civilisation disease total cholesterol in blood of 976 probands 814 females (83,40 %) and 162 men (16,60 %) at the age 1664 years. Normal blood cholesterol (5.0 mmol/l and less) was assed in 67,44 % women and 68,52 % men (67,62 % of all probands). High cholesterol (6.0 mmol/l and more) was evaluated in 9,34 % women and 12,96 % men (9,94 % of all probands). In the probands with higher age (in older people) was detected higher blood cholesterol too. Key words: blood cholesterol, risk factor, cardiovascular diseases, nutrition Úvod Biologicky hodnotná potrava pokrýva fyziologické potreby človeka úmerne k jeho potrebám a k podmienkam jeho prostredia (vek, pohlavie, druh vykonávanej práce, fyziologický stav). Mala by obsahovať všetky látky, ktoré organizmus potrebuje v potrebnom množstve a v optimálnom pomere, a nemala by obsahovať látky, ktoré môžu organizmus poškodzovať (Mikeš et al., 2004). Výživa spolu s pohybovou aktivitou sú rozhodujúcimi činiteľmi ovplyvňujúcimi chorobnosť a úmrtnosť na srdcovocievne ochorenia. Zvýšená koncentrácia hladiny cholesterolu v krvi je rizikovým faktorom kardiovaskulárnych chorôb. Cieľom štúdie bolo zistiť hladinu cholesterolu a vybrané antropometrické parametre u náhodne vybraných osôb. Materiál a metodika V skupine 976 náhodne vybraných osôb, z toho 814 žien (83,40 % žien) a 162 mužov (16,60 % mužov) vo veku 1664 rokov sme merali hladinu cholesterolu v krvi a hodnotili ju nasledovne: požadovaná (menej ako 5 mmol/l), hranične zvýšená (5,0 až 6,0 mmol/l) a vysoká (viac ako 6,0 mmol/l). Hodnoty cholesterolémie sme porovnávali medzi jednotlivými vekovými skupinami žien a mužov, ako aj spolu. Vekové zloženie súboru je uvedené v tab. 1. Najviac boli v celkovom súbore zastúpené osoby vo vekovom rozmedzí menej ako 25 rokov (33,40 %), 45 až 54 rokov (26,33 %), ako aj 35 až 44 rokov (16,91 %). Tab. 1 Vekové zloženie súboru ženy muži spolu vek n % n % n % < , , , , , , , , , , , , , , ,50 spolu , , ,00 Výsledky a diskusia Priemerná hodnota cholesterolémie bola v mužskej časti sledovanej populácie vyššia ako v ženskej (tab. 2). V jednotlivých vekových skupinách sa hladina cholesterolu v krvi u žien, ako 204

206 aj u mužov zvyšovala, pričom u žien bola primerná cholesterolémia v posledných troch vekových skupinách (u osôb vo vyššom veku 3564 rokov) vyššia ako v predchádzajúcich dvoch skupinách podľa veku (zodpovedajúcim veku 1634 rokov) (tab. 3). U mužov bola cholesterolémia vyššia v posledných dvoch vekových skupinách (vo veku 45 až 64 rokov) v komparácii s predchádzajúcimi (zodpovedajúcim veku 16 až 44 rokov). Jurkovičová (2005) zistila v epidemiologickej štúdii obyvateľov SR nasledujúce priemerné hodnoty cholesterolu: vo veku menej ako 25 rokov: u 4,30 % žien a 40,80 % u mužov, vo veku 2534 rokov: u 4,55 % žien a 4,59 % u mužov, vo veku 3544 rokov: u 4,94 % žien a 5,06 % u mužov, vo veku 4554 rokov: u 5,40 % žien a 5,30 % u mužov, vo veku 5564 rokov: u 5,83 % žien a 5,31 % u mužov, vo veku 6574 rokov: u 5,85 % žien a 5,22 % u mužov, vo veku 75 rokov a viac: u 5,65 % žien a 5,04 % u mužov. V súbore probandov sme pozorovali požadovanú cholesterolémiu u približne dvoch tretín (67,62 %) bez výraznejších rozdielov medzi ženami a mužmi (tab. 4). Vysokú hladinu cholesterolu v krvi mala takmer desatina probandov (9,94 %), a to 9,34 % žien a o 3,62 % viac mužov. Tab. 2 Priemerné hodnoty ( x ± s) v súbore (n = 2148) Skupiny ženy (n = 814) muži (n = 162) spolu (n = 976) vek (roky) 36,78 ± 13,45 41,20 ± 14,82 37,51 ± 13,77 cholesterol (mmol.l 1 ) 4,51 ± 8,82 4,56 ± 1,27 4,52 ± 1,21 Tab. 3 Priemerné hodnoty ( x ± s) cholesterolémie (mmol.l 1 ) Vek (roky) ženy (n = 814) muži (n = 162) < 25 4,28 ± 0,81 3,94 ± 0, ,17 ± 1,26 4,66 ± 1, ,39 ± 1,30 4,61 ± 1, ,78 ± 1,28 4,83 ± 1, ,23 ± 1,39 4,84 ± 1,61 Jurkovičová (2005) pozorovala v súbore osôb normálny cholestrol (menej ako 5,2 mmol/l) u 51,3 % žien a 57,8 % mužov; zvýšené hladiny cholesterolu (5,26,2 mmol/l) u 30,5 % žien a 29,5 % mužov; a vysoký cholesterol (6,2 mmol/l a viac) u 18,2 % žien a 12,7 % mužov. Tento výskyt bol v porovnaní s nami sledovaným súborom nižší v prípade požadovaných hladín cholesterolu a naopak vyššie pri hranične zvýšenom a vysokom cholesterole (v našom súbore bolo viac osôb s požadovaným a menej so zvýšeným a vysokým cholesterolom). Presné porovnanie však do určitej miery ovplyvňuje posun kritéria pre hodnotenie cholesterolu o 0,2 mmol/l. V celom súbore sa podiel osôb s požadovanou cholesterolémiou postupne zvyšoval v jednotlivých vekových skupinách so stúpajúcim vekom (tab. 5). Najvyšší podiel osôb s normálnym cholesterolom bol v najmladšej vekovej skupine (82,21 % vo veku 16 až 25 rokov) a naopak len 40,98 % probandov malo požadovaný cholesterol pri najvyššom sledovanom veku (55 až 64 rokov). Opačný trend bol pri výskyte vysokej (nežiaducej) cholesterolémie najmenej probandov (len 2,45 %) malo vysoký cholesterol v najmladšej vekovej skupine a najviac (25,41 %) zase v najstaršej skupine. 205

207 U žien sa podobne ako v celom súbore spolu s postupujúcou vekovou skupinou plynulo zvyšoval podiel osôb s vysokým cholesterolom a naopak postupne sa znižoval podiel tých, ktorí mali cholesterol v požadovanom rozsahu. U mužov bola situácia podobná v prípade požadovaného cholesterolu (podiel osôb bol najvyšší v najmladšej a najnižší v najstaršej skupine), ako aj v prípade výskytu vysokých hladín cholesterolu, avšak s výnimkou predposlednej skupiny podľa veku (4554 rokov), kde bol podiel osôb s vysokým cholesterolom nižší ako v posledných štyroch vekových skupinách (od 25 do 64 rokov). Tab. 4 Hladiny cholesterolu v krvi cholesterolémia (mmol.l 1 ) ženy muži spolu n % n % n % požadovaná , , ,62 hranične zvýšená , , ,44 vysoká 76 9, , ,94 Tab. 5 Cholesterolémia v rôznych vekových skupinách Cholesterol ženy muži spolu (mmol.l 1 ) norma n % norma n % n % Menej ako 25 rokov (1624 rokov) (n = 326) požadovaná < ,70 < , ,21 hranične zvýšená 5,06, ,49 5,06,0 3 7, ,34 vysoká > 6,0 8 2,81 > 6,0 0 0,00 8 2, rokov (n = 106) požadovaná < ,65 < , ,42 hranične zvýšená 5,06, ,65 5,06,0 2 9, ,04 vysoká > 6,0 4 4,71 > 6,0 4 19,05 8 7, rokov (n = 165) požadovaná < ,67 < , ,91 hranične zvýšená 5,06, ,33 5,06,0 1 6, ,00 vysoká > 6,0 12 8,00 > 6,0 3 20, , rokov (n = 257) požadovaná < ,72 < , ,03 hranične zvýšená 5,06, ,60 5,06, , ,35 vysoká > 6, ,68 > 6,0 6 13, , rokov (n = 122) požadovaná < ,80 < , ,98 hranične zvýšená 5,06, ,15 5,06, , ,61 vysoká > 6, ,05 > 6,0 8 20, ,41 K tukom v potrave, ktoré majú vplyv na hladiny tukových látok v krvi a na ovplyvnenie celkového kardiovaskulárneho rizika, patria najmä: cholesterol, nasýtené a nenasýtené tuky (resp. mastné kyseliny) a osobitná forma nenasýtených mastných kyselín tzv. transmastné kyseliny. Zdrojom exogénneho cholesterolu sú najmä vnútornosti, vajcia a iné, výlučne živočíšne potraviny. V súčasnosti sa odporúča znížiť množstvo prijímaného exogénneho cholesterolu na najviac 300 mg denne (Jurkovičová, 2005). Všetky doterajšie poznatky potvrdzujú, že nasýtené mastné kyseliny zvyšujú hladinu celkového cholesterolu aj LDLcholesterolu v krvi a naopak, nenasýtené mastné kyseliny ich znižujú. Aterogénny potenciál nasýtených mastných kyselín je však podstatne vyšší (približne dvojnásobný) ako antiaterogénny účinok nenasýtených mastných kyselín (Bada, 2001, Hegsted et al., 1995). 206

208 Epidemiologické štúdie potvrdili priamu a silnú súvislosť medzi príjmom nasýtených tukov v potrave a výskytom ischemickej choroby srdca (Kromhout et al., 1995). Nenasýtené mastné kyseliny znižujú hladinu LDLcholesterolu, ak v strave nahradia nasýtené mastné kyseliny (Stone, 2002). Transmastné kyseliny zvyšujú hladiny LDLcholesterolu, znižujú hladiny HDLcholesterolu (Criqui, Rindel, 1994), zhoršujú pomer celkového cholesterolu k HDLcholesterolu, zvyšujú aj hladiny lipoproteínu(a) a triacylglycerolov, čiže ich celkový negatívny potenciál je vyšší ako potenciál nasýtených mastných kyselín. Transmastné kyseliny sa vyskytujú v prírode sú výsledkom anaeróbnej bakteriálnej fermentácie v tráviacom trakte prežúvavcov a od nich sa dostávajú do potravinového reťazca. Ďalším zdrojom je priemyselné spracovanie olejov (stužovanie, hydrogenácia olejov) (Jurkovičová, 2005). Správnou výživou možno znížiť hladinu sérového cholesterolu, a tým zabrániť alebo spomaliť vznik a priebeh ischemickej choroby. Metaanalýzy epidemiologických údajov ukázali, že pokles hladiny celkového cholesterolu o 1 % je spojený s poklesom kardiovaskulárneho rizika o 23 %. Mnohé rizikové faktory kardiovaskulárnych chorôb (vysoký obsah cholesterolu, ale aj obezita, diabetes, vysoký krvný tlak, fajčenie, fyzická inaktivita) sa dajú modifikovať zmenou stravovania a životného štýlu. Úprava stravovania v rámci kardiovaskulárnej prevencie je aktuálna pri zvýšených hladinách celkového cholesterolu, LDLcholesterolu, triacylglycerolov a pri nízkej hladine HDLcholesterolu. Záver U dospelých osôb sme zistili požadovaný cholesterol u približne dvoch tretín, hranične zvýšený u pätiny a vysoký takmer u desatiny súboru.viac osôb s požadovaným cholesterolm bolo u mužov (aj keď s neveľkým rozdielom v porovnaní so ženami), hranične zvýšený cholesterol mala väčšia časť ženskej sledovanej populácie a vysoký cholesterol sa vyskytoval naopak viac u mužov. Primárnu prevenciu civilizačných ochorení možno podporiť udržiavaním normálnych hodnôt cholesterolémie, ako aj indexu telesnej hmotnosti BMI a najmä dosiahnutím optimálnej telesnej hmotnosti predovšetkm u mužov. U nich sme totiž pozorovali vyššiu telesnú hmotnosť, ako je ich ideálna. Literatúra 1. Bada, V Výživa v prevencii kardiovaskulárnych ochorení podľa záverov 5. medzinárodnej koferencie o preventívnej kardiológii v Osake, alebo čo spája Okinawu so Slovenskom. In: Cardiol., 2001, 10, Criqui, M.H., Rindel, B.L Does diet or alcohol explain the French paradox? In: Lancet, 1994, 344, Hegsted, D.M., McGandy, R.B., Myers, m.l. et al Quantitative effects of dietary fat on serum cholesterol levels in man. In: Am J Clin Nutr, 1995, 17, Jurkovičová, J Vieme zdravo žiť? Bratislava : Univerzita Komenského, s. ISBN X 5. Kromhout, D., Menotti, A., Bloemberg, B. et al Dietary saturated and trans fatty acids and cholesterol and 25year mortality from coronary heart disease: the Seven Countries Study. In: Prev Med, 1995, 24, Mikeš, Z., Filipová, S., Bada, V. et al Komentár k odporúčaniam. In: Cardiol., 2004, 13, 3, Stone, N.J Diet, nutritional issues, and obesity. In: Textbook of cardiovascular medicine. Second edition. Ed.: Topol, E.J., Philadelphia, Lippincott, Williams, Wilkins, s. Kontaktná adresa: Ing. Katarína Šramková, PhD., Katedra výživy ľudí, Fakulta agrobiológie a potravinových zdrojov Slovenská poľnohospodárska univerzita v Nitre, Tr. A. Hlinku 2, Nitra Práca bola riešená s podporou projektu KEGA 3/5082/

209 VYUŽITÍM FYTOTERAPEUTÍK MOŽNO PRISPIEŤ OCHRANE BIOSFÉRY A KLÍMY USE OF PHYTOTHERAPEUTICS MAY IMPROVE THE BIOSPHERE & CLIMATE 1 Šutiak, V., 1 Šutiaková, I., 2 Benhammou, N., 1 Skalka, J., 1 Sabová, L. 1 University of veterinary medicine, Komenského 73, Košice, Slovakia. 2 University Abou Bekr Belkaïd, Imama, BP119, Tlemcen, Algeria. Abstract In this contribution we are dealing with the worsening of global biosphere conditions especially in the period of last 3 decades of years. We point to risk of intensive chemicalizations, as the main factor responsible for the worsening of the global state of biosphere. It contributes to increase of various oxides in biosphere & ROS radicals in animal body, which have dangerous effect on living creature health. We also point to the eventuality for at least partial supplementation of chemotherapeutics with phytotherapeutics. In this way could be also initialized at least the mildering of the dangerous biosphere conditions & evoked the reduction of mentioned dangers, also thanks to therapeutic effects of mentioned phytotherapeutics. Úvod V ostatných 3 dekádach rokov zaznamenali sa značné zhoršenia stavu prírody i klimatických pomerov pre život temer väčšiny druhov živočíchov biosféry. Na tieto skutočnosti poukazujú štúdie z rôznych vedných oblasti našej planéty (Anonymus 1999, 2003, ac). Cieľ práce V tejto práci chceme poukázať na kontemporálne riziká biosféry a stavu klímy vo väzbe na zvieratá a človeka, ktoré sa za ostatné 3 dekády rokov evidentne zhoršujú a tým ohrozujú nielen zdravotný stav, ale paralelne aj ich produkčné a reprodukčné schopnosti na jednej strane ako aj ich efektívnosť a účinnosť na strane druhej. Materiál a Metodika V práci využívame dostupne literárne pramene poukazujúce na výskyt niektorých rizikových javov a fenoménov nielen v biosfére, ale aj vzhľadom na klimatický stav v období štúdia a observácie v ostatných 3 dekádach rokov. Výsledky a Diskusia Štúdiom literatúry sme zistili (Anonymus 1999, 2003, ac), že v ostatných 3 desaťročiach bolo zaregistrované globálne znečisťovanie a otepľovanie biosféry a zhoršenie klimatických pomerov na zemegule s prejavmi vysušovania pôdy, ale aj iných komplikácií tak litosféry ako aj biosféry (obr. 1), čo ohrozuje v značnej miere mnohé atribúty života tak animálnych živočíchov ako i človeka. Napr. v dôsledku výkyvov teplôt sa vysušuje nielen pôda, ale aj trávnaté a lesné porasty. Tie sa následne stavajú veľmi zápalné a náchylne na požiare, ktoré sa v ostatnom období objavujú nielen v tropických pásmach zeme, ale aj v rôznych priľahlých subtropických regiónoch, ba dokonca v značnej miere už i v južných oblastiach Európy. V tomto smere majú v Európe primát najmä prímorské krajiny. V týchto oblastiach sú uvedené požiare veľmi hrozivé a prenášajú sa nie zriedka aj do dedinských a mestských aglomerácii, kde ohrozujú nielen lesné a poľné porasty prírody, ale často zasahujú a ohrozujú aj obytné štvrte a priemyselné zóny. Uviesť však treba, že ohrozované sú nielen vyššie uvedené štáty, ale z roka na rok viac a viac sa požiare vyskytujú aj v ďalších zónach, včítane teritórií centrálnej Európy. Pritom tieto požiare dostavajú charakter častejšieho objavovania sa s narastajúcim trendom výskytu a dosahujú veľmi často rozsiahly teritoriálny rozsah a veľmi 208

210 signifikantný dosah s nebezpečím i pre vzdialené oblasti od mimoriadne exponovanej oblasti tropickej zóny zemegule. V dôsledku vysokých teplôt sa vysušuje nielen pôda ale aj trávnaté a lesné porasty. Tie sa následne stavajú veľmi zápalné a často náchylne na vznik požiarov. Obr. 1. Pohľad na štruktúru a charakter pôdy po dlhých obdobiach bez dažďa. V ostatnom období objavujú sa nielen v tropických pásmach zeme, ale aj v rôznych priľahlých subtropických regiónoch, ba dokonca v značnej miere už i v južných oblastiach Európy. V týchto oblastiach sú požiare veľmi hrozivé a nie zriedka sa prenášajú aj do dedinských a mestských aglomerácii, kde ohrozujú nielen lesné a poľné porasty, ale často zasahujú a ohrozujú aj obytné štvrte a priemyselné zóny. Uviesť však treba, že ohrozované sú nielen vyššie uvedené štáty, ale z roka na rok viac a viac sa požiare vyskytujú aj v ďalších teritóriách centrálnej Európy (Maďarsko, Slovensko, Česko, Rakúsko, Ukrajina, Bulharsko, Rumunsko). Pritom aj v týchto teritóriách dostavajú charakter nielen častejšieho objavovania sa ale aj výskytu (Anonymus c), ale aj rozsiahlejšieho charakteru lebo dosahujú veľmi často značný teritoriálny rozsah, signifikantný dosah a nebezpečie i pre vzdialené oblasti od exponovanej oblasti tropickej a subtropickej zóny zemegule (obr. 2). Obr. 2 Výskyt požiarov v lesných porastoch. Počas požiarov sú poškodzované a ohrozované nielen rastlinné ale aj živočíšne spoločenstvá, pričom najnebezpečnejšie sú ohrozované najstaršie a najmladšie vekové kategórie. Požiare ohrozujú život nielen priamo teplotou, ale aj nepriamo produkciou rôznych oxidov, ROS radikálov atď., ktoré tiež nebezpečne poškodzujú biosféru (Anonymus a.c). Obr. 3. Emisie a imisie priemyselných komplexov. 209

211 Biosféru a jej kvalitu intenzívne poškodzujú aj emisie celého radu komunálnych teplárni a energoblokov, ďalej rôznych priemyselných komplexov ale aj chemickofarmaceutických podnikov. Z ich výroby sa dostavajú do ovzdušia tiež značné množstva rôznych oxidov, ROS radikálov, ale aj metalických emisií (Obr. 3), ktoré tiež poškodzujú biosféry zeme jednak lokálne, ale aj v široko okolitom prostredí, ba dokonca aj viaceré kontinenty. Okyslené dažďové zrážky, zhoršujú kvalitu pôdy, vôd a potravy (krmív pre zvieratá a potravín pre človeka). Ich kvalita môže byť nimi narušená v dôsledku obsahu rezíduí, ktoré môžu poškodzovať ich zdravie. Emisie nebezpečne poškodzujú aj stav a kvalitu prírody a dokonca aj v odľahlých teritóriách zeme. Má sa zato, že poškodzujú napr. i hrúbku polárnych ľadovcov, ktoré sa topia a zvyšujú morskú hladinu a narúšajú aj klimatické pomery (Obr. 4). Obr. 4 Detailný pohľad na osud niektorých morských ľadovcov. Pričítava sa im i podiel na vzniku takých fenoménov ako sú dažďové víchrice, ale aj ďalšie fenomény (Obr. 5 a 6) a to zvlášť v ostatných rokoch. Tieto excesy počasia nie zriedka prinášajú celý rad problémov odvodených z povodňových záplav spojených s poškodzovaním nielen populácií rastlín, a zdravotného stavu živočíchov, ale navodzujú i materiálne straty. Obr. 11 Ničivé tornádo navodzujúce jednak záplavy, ale aj demoláciu stavieb. Pri dažďových zrážkach dochádza ku prieniku celého radu atmosférických emisií z ovzdušia i do vody, pôdy a do biomasy, ktoré tiež značne znehodnocujú. Obr. 6. Povodne ako príčina komplikácii zdravia spoločenstva zvierat. 210

212 Splašky emisií a kontaminantov menia značne fyzikálnochemické zloženie vody, krmiva a potravy, ktoré strácajú zdravotnú nezávadnosť a navodzujú aj katastrofy (Obr. 7). Škodliviny vstupujúce do organizmus živočíchov poškodzujú enzýmy ich organizmu a preto neprekvapuje narastajúci výskyt celého radu tzv. novších ochorení v ostatných desaťročiach. Obr.16. Výskyt otráv rýb vo vodných tokoch v dôsledku jej chemickej kontaminácie Ukazuje sa, že v snahe o zabezpečenie normálnej existencie živočíchov v narušenej biosfére bude potrebné hľadať nové spôsoby ako zabezpečiť ochranu ich zdravotného stavu pred zhoršením napr. aj využitím všetkých možných alternatívnych a doplnkových spôsobov liečby pacientov. Totižto paralelne s rozsiahlou chemickou intenzifikáciou začali sa aj u nás objavovať najmä v ostatnom desaťročí rôzne zdravotné komplikácie reprezentantov živočíšnej ríše. Napr. objavenie sa u zvierat takých nebezpečných komplikácií ako sú nárast nádorových a orgánových ochorení, BSE, H5N1 a niektorých ďalších viróz na jednaj strane. Avšak aj nárast výskytu celého radu civilizačných ochorení ľudí na strane druhej. Toto všetko ukazuje na potrebu ozdravenia klímy a životného prostredia, napr. aj zlepšením prístupu ku chemizácii prírody a života napr. čiastočným nahradzovaním chemoterapeutík fytoterapeutikami, zvlášť tam, kde je to možné. Pre tieto účely sme pripravili pre našich študentov 2 fytoterapeutické príručky pre pedagogické účely domácich, ale aj zahraničných študentov aby sa dali využiť v uvedenom smere v praxi (Šutiak et al.2001, 2002) a tým prispieť k mierneniu komplikácií v praxi. Záver V tomto príspevku pojednávame o zhoršovaní sa globálnych podmienkach života rôznych živočíchov. Ukazuje sa že nemalý podiel na tomto zhoršovaní má chemizácia národného hospodárstva. Jej rizikové účinky a dopady by bolo možne zmierniť ak by sa pristúpilo keď nie celosvetovo aspoň v Európe k určitému nahradzovaniu niektorých chemoterapeutík fytoterapeutikami, tam kde by to bolo užitočne. V práci poukazujeme na fakt, že na našej univerzite sme vydali dve učebné pomôcky, ktorými trend suplementácie chceme podporiť. Publikovanie tohto príspevku bolo podporené VEGA grantom MŠ SR čís Literatúra Anonymus : 2007a, Anonymus : 2007b, 450ludicategoryje 7xidje Anonymus : 2007c, Anonymus : 2006, / /index.html. Anonymus: 2005, newsroom/ en/focus/ 2005/ /index.html. Anonymus: 2003, english/ newsroom/ focus/2003/water.htm. Anonymus: 1999, FOCUS/ E/SOFI/ home.htm. Šutiak V. et al.: Príručka veterinárskej 211

213 fytoterapie. UVL Košice, 2001, Šutiak V. et al.: A Handbook of Veterinary Phytotherapy. UVM Košice. 2002, 185. Address of corresponding author is as follows: Prof. MVDr.Václav Šutiak, PhD., Institute of pharmacy and pharmacology, UVM, Komenský 73, Košice, [email protected]. VYŠETRENIE FREKVENCIE MIKROJADIER V PERIFÉRNYCH LYMFOCYTOCH OVIEC NA ODHAD GENOTOXICKÉHO RIZIKA V POTRAVOVOM REŤAZCI MEASURMENT OF MICRONUCLEI FREQENCY IN SHEEP PERIPHERAL LYMFOCYTES FOR GENOTOXIC RISK ASSESSMENT OF AGENS FROMFOOD CHAIN Šutiak, V., *Šutiaková, I., Kovalkovičová, N., Legáth, J. Pistl, J. University of Veterinary Medicine, Komenského 73, Košice, Slovak Republic, fax: / , [email protected]. *Faculty of Humanity and Natural Sciences Prešov University, 1, 17th November St Prešov, Slovak Republic, [email protected]. Abstract In this work was studied the frequency of micronuclei in the peripheral lymphocytes during the autumn period in ecologically Improved Wallachian sheep. The frequency of micronuclei was 22,11 ± 13,72 per 1000 binucleated cells in peripheral lymphocytes of sheep and NDI value was 1,87 ± 0,125.With view to the continuing presence of different genotoxic substances in the environment the importance of using cytogenetic biomarkers to prevent health disturbances and produce ecological food. Úvod Prítomnosť rôznych xenobiotík vo vzduchu, pôde, vode a rastlinách môže byť jednou z ciest ich preniknutia do potravového reťazca ľudí a zvierat. V týchto súvislostiach hospodárske zvieratá zvlášť pasúce sú vhodnými bioindikátormi a to vo väzbe na kvalitu potravy pri aplikovaní cytogenetických biomarkerov (Cristaldi a kol., 2004, Kang a kol., 2005, Gichner a kol., 2007). Cytogenetické zmeny v kultúrach periférnych lymfocytov ako sú chromozómové aberácie (CHA), sesterské výmenné chromatídy (SCE) a mikrojadrá (MN) slúžia ako skoré biomarkery po genotoxických expozíciach (Norppa, 2004). Frekvencia mikrojadier, resp. mikrojadrový test je pomerne preferovaným cytogenetickým biomarkerom pre jeho jednoduchosť, spoľahlivosť, ako aj vypovedaciu hodnotu (Fenech, 2006). Mikrojadrový test sa využíva aj pri in vitro štúdiach na odhad genotoxicity a cytoxicity rôznych chemikálií, pesticídov a iných zlúčenín na ľudské a živočíšne kultúry (Kovalkovičová a kol. 2000, Lioi a kol., 1998, Pistl a kol., 2001).V uvedenej práci sme sa cielene zaoberali štúdiom spontánnej frekvencie mikrojadier ako aj bunkovou proliferáciou v periférnych lymfocytoch oviec z ekologick0ho chovu a to za účelom možnosti porovnávania a štandardizovania výsledkov z rôznych analýz uvedeného charakteru. Materiál a metódy Zvieratá a biologický materiál: Pre uvedené štúdie sme odoberali krv od bahníc (n= 44) z lokalíty (L.,), v jesennom období (r.2004), plemena zušľachtená valaška, vo veku 13 rokov. Krv sme odoberali z vena jugularis do heparínu (100 m.j./ ml krvi).zdravotný stav zvierat bol dobrý. Konvenčná cytogenetická metóda: heparinizovanú krv (0,4 ml) sme kultivovali v 7,0 ml média Panserin 702 Chromosome médium Schromocell, suplementované s fetálnym bovinným sérom (FBS), rastovým faktorom fytohemaglutinínom (fy PAN Systems GmbH, Biotechnologische produkte, Germany). Do kultivačného média sme pridali antibiotiká, a to 212

214 penicilín G (100 IU/ ml) a streptomycín (100 µg/ ml) (fy PAN Systems GmbH, Biotechnologische produkte, Germany) a 7,5 %ný NaHCO 3 (fy Sevac, ČR). Kultivácia konvenčnou metódou trvala 44 hodín v termostate pri 37,5 º C. Mikrojadrový test: Po 44 hodinovej kultivácii sme pridali cytochalazín B (2 mg/ ml, fy Sigma USA) v DMSO do kultivačných médií vo finálnej koncentrácií 6,0µg/ ml. Lymfocytové kultúry sme kultivovali ešte 28 hodín. Celkove trvala kultivácia lymfocytovýh kultúr 72 hodín pri 37,5 º C. Kultúry sme fixovali zmesou metanol: kyselina octová v pomere 3:1 (v/v). Preparáty sme robili na nasledujúci deň, ktoré sme ofarbili s 10% roztokom Giemsa Romanowski vo fosfátovom pufri (ph 6,8) počas 58 minút. Hodnotenie metafázových preparátov: preparáty sme hodnotili na mikoskope Nikon s použitím softwaru Animal a Photostyler (fy Nikon ) pri 400 a 1000 násobnom zväčšení. Distribúciu dvojjadrových buniek aj s mikrojadrami sme hodnotili zvlášť pre každého donora a frekvenciu mikrojadier sme prepočítali na 1000 dvojjadrových buniek. Výpočet bunkovej proliferácie: Bunkovú proliferáciu sme vypočítali podľa Eastmonda a Tuckera (1989): NDI= [ MI + (2 M2 + 3 M3 + 4 M4)] / N Štatistické spracovanie výsledkov: štatistické analýzy z výsledkov štúdia sme spracovali softwarom Sigma Stat (Jandel Scientific, descriptive statstics). Výsledky Z tabuľky č.1 vyplýva, že u bahníc bol priemerný počet dvojjadrových buniek s jedným mikrojadrom 21,318 ± 13,022 s dvoma mikrojadrami 0,477 ± 0,731 a s troma mikrojadrami 0,0227 ± 0,151 na jednu bahnicu. Celkový počet buniek obsahujúcich mikrojadrá bol 941. Priemerný počet mikrojadier na jednu bunku je 0,0221. Priemerný počet mikrojadier na 1000/ dvojjadrových buniek je 22,114 ±13,720. Priemerná hodnota deliaceho jadrového indexu pre všetky analyzované bahnice je 1,868 ± 0,125. Tabuľka č. 1 Frekvencia mikrojadier v periférnych lymfocytoch bahníc a hodnoty NDI Donor 1 MN 2 MN 3MN > 3MN Bunky Celkový Počet NDI (n) s MN počet MN na MN 1000/DB Priemer 21,318 0,477 0,0227 0,0 21,568 22,114 22,114 1,868 Std.Dev 13,022 0,731 0,151 0,0 13,381 13,720 13,720 0,125 Std. Error 1,963 0,110 0,0227 0,0 2,017 2,068 2,068 0,0189 Rozsah 68,0 3,0 1,0 0,0 68,0 70,0 70,0 0,588 Max. 72,0 3,0 1,0 0,0 72,0 74,0 74,0 2,092 Min. 4,0 0,0 0,0 0,0 4,0 4,0 4,0 1,504 Distance P Value: 1MN 0,214 < 0,001 2MN 0,379 < 0,001 3MN 0,537 < 0,001 >3MN 0,0 1,0 Bunky s MN 0,221 < 0,001 Celkový počet MN 0,231 MN/ 1000 dvojjadr. Buniek 0,231 NDI 0,202 < 0,001 Vysvetlivky: MN mikrojadro, DBdvojjadrové bunky, NDIjadrový deliaci index, 213

215 Diskusia Na význam biomonitorovacích štúdií živej populácie v 21. storočí poukázal Gerhardt (2000). Populácie hospodárskych zvierat sú vystavené kumulovaným genotoxickým účinkom relatívne kontinuálne v rôzne dlhých časových úsekoch a v rôzne zaťažených oblastiach (Di Berardino a kol., 1997, Cristaldi a kol. 2004). V predchádzajúcich rokoch Šutiaková a kol. (2002) stanovili spontánnu frekvenciu mikrojadier v periférnych lymfocytoch oviec na farmách s konvenčným a ekologickým spôsobom hospodárenia. Ich frekvencia bola 23,31 ± 8,16 a 19, 94 ± 4,37/ 1000 dvojjadrových buniek. Podobne ako u ľudí, aj u oviec existuje značná variabilita vo frekvencii mikrojadier, ktorá môže byť ovplyvnená niekoľkými faktormi ako je pohlavie, spôsob života, prostredie individuálna mutagénna citlivosť a podobne, čo napokon vyplýva aj z uvedených výsledkov. Preto sú potrebné biomonitprovacie štúdie aj v tomto smere, aby sme vedeli určiť napríklad hygienickú hladinu bezpečnosti predpokladaných genotoxínov pre chovné stádo (Rubeš a kol. 1992, Šutiaková a kol. 2002, Šutiaková a kol., 2004).Pri týchto biomonitorovacích štúdiách má význam simultánne vyšetrenie frekvencie mikrojadier a jadrového deliaceho indexu. Je ale treba poznamenať, že lymfocytárna proliferácia je komplexný systém, ktorý môže byť ovplyvnený mnohými faktormi (Snyder, Wale., 1991). Vyšetrenie cytogenetických biomarkerov má význam aj pri ekologickej výrobe potravín. Podľa Bröckera (1998), ekologické farmy majú spĺňať určité špeciálne požiadavky z environmentálneho hľadiska, a to v súvislosti s primárnou poľnohospodárskou produkciou. Produkty z takýchto fariem by mali byť jednoznačne definované a oddelené od konvenčných produktov. Práca bola podporovaná Grantami Vega: 1/ 2408/05, 1/4375/07 a Národným referenčným pracoviskom pre pesticídy pri UVL v Košiciach. Literatura 1. Bröcker,R.: Perspektiven der ökologischen Tierhaltung Grenzen der ökologischen Tierhaltung. Deutsche Tierärtze, 105, , Cristaldi,M., Iearadi,L.A., Udroin,I., Zilli,R.: Comparative evaluation of background micronucleus frequencies in domestic mammals. Mutat. Res., 559, 19, Di Berardino, D. a kol.: Spontaneous rate of sister chromatid exchanges (SCEs) in mitotic chromosomes of sheep (Ovis aries L.) and comparison with cattle (Bos Taurus L.), goat (Capra hircus L.) and river buffalo (Bubalus bubalis L.). Hereditas, 127, , Eastmond, D.A., Tucker, J.: Identification of aneuploidyinducing agents using cytokinesisblocked human lymphocytes, and an antikinetochore antibody. Environ. Mol. Mutagen. 13, 34 43, Fenech, M.: Cytokinesisblock micronucleu assay evolves into a cytomi assay of chromosomal instability, mitotic dysfunction and cell death. Mutat.Res., 600, (12), 5866, Gichner, T., Lovecka, P., Kochánková, L., Macková, M., Demnerová, K.: Monitoring toxicity, DNA damage, and somatic in tobacco plants growing in soil heavily polluted with polychlorinated biphenyls. Mutat. Res., 629, 16, Gerhardt, A.: Biomonitoring for 21 th century.environ. Res. Forum, 9, 111, Kang, CH.M., Lee, H.J., Ji, Y.H., a kol.: A cytogenetic study of Korean native goat bred in the nuclear power plant using the micronucleus assay. J. Radiat. Res., 46, , Kovalkovičová,N., Kačmár, P., Šutiaková, I., Šulík, E., a kol.: Asssessment of the ability of endosulfan o induce micronuclei in vitro in cultured sheep by lymphocytes. J. Trace Microprobe Techn.18, , Lioi, M.B., Scarfi, M.R., Santoro, A., Barbieri, R. a kol.: Genotoxicity and oxidative stress induced by pesticide exposure in bovine lymphocyte cultures in vitro. Mutat. Res. 403, 1320, Norppa, H.: Cytogenetic biomarkers and genetic polymorphisms. Toxicology Lett., 149, ,

216 12. Pistl, J., Kovalkovičová, N., Kačmár, P., Kusová, I., Mikula, I., Šutiaková, I.: Effect of endosulfan on peripheral sheep leucocytes in vitro. Vet. Hum. Toxicol., 43, 7882, Rubeš, J. a kol.: Cytogenetic monitoring of farm animals under conditions of environmental pollution. Mutat. Res., 283, , Snyder, C.A., Walle, C.D.: Lymphocyte proliferation assays as potential biomarkers for toxicant exposures. J. Toxicol. Environ. Health, 34, 1, , Šutiaková, I., Maraček, I., VLčková, R., Šutiak, V.: Porovnanie frekvencie mikrojadier v periférnych lymfocyoch oiec pri riadenej a prirodzenej reprodukcii. In: Zborník Rizikové faktory potravového reťazca IV. Nitra, 2004, Šutiaková, I., Šulík, E., Rimková, S., a kol.: Aplikácia cyogenetických metód pri prevencii zdravia hospodárskych zvierat, Účelová činnosť čís.7, Košie, VÚVM, 2002, 32s. Address of corresponding author is as follows: Doc. RNDr.Irena Šutiaková, PhD., Institute of pharmacy and pharmacology, UVM, Komenský 73, Košice. MOŽNOSTI VYUŽÍVANIA IMELA BIELEHO (V. ALBUM) VO VETERINÁRNEJ PRAXI A NIEKTORÉ JEHO ČRTY POSSIBILITIES FOR THE USE OF V. ALBIUM IN VETERINARY PRACTICE AND CERTAIN ITS CHARACTERISTICS 1 Šutiak, V., 2 Benhammou, N., 1 Šutiaková, I., 1 Šutiak, R. 1 University of veterinary medicine, Komenského 73, Košice, Slovakia. 2 University Abou Bekr Belkaïd, Imama, BP119, Tlemcen, Algeria. Abstract Various stressors induce various damages & defects of nucleic acid. Some of these problems may be treated by certain chemotherapeutics & phytotherapeutics. However with the use of chemicalization & chemotherapeutics are lately connected also some dangerous changes both the climate & nature & this is why are newly advised for their dosing & use also certain useful phytotherapeutics, especially, when it is such chance. In this text we would like to point on the plant V. album L. which may be used for the treatment of more than 20 various indications in veterinary medicine thanks to containing more than 25 active ingredients present in the herbal mass. Up to now there were used various preparation forms from it e.g. decoctions (3540 g of herb per 1l of water) & to large animals can be used 1/3 ½ of glass volume several times per day. Infusum may be also prepared (use 4 teaspoonful of powdered herb & pour 1000 ml of boiled water over the drug & allow it to stand for 15 min. with stirring occasionally). From this solution can be administered 0.5 l of solution 2 x a day to large animals; to middle animals use 58 of tablespoonful 23 x a day and for small animals use 24 teaspoonful volume 24 x a day of cooled preparation & adapt doses to size & health state of animals. In further part we present results of studies in which we expressed extensity & intensity of white mistletoe distribution in two Košice localities. We registered significant differences in both extensity and intensity of infestation in Košice deciduous trees. Chemical analyses of two different samples of dried V. album L. plant (leaves and stems) demonstrated that in stems were present higher contains of phenols as in leaves & stems demonstrated higher reduction power & higher % of antioxidant activity as the leaves. In the further part we briefly discuss about obtained results & also present our experience with this plant for the practical usage, as well as for their propagation. This text has been supported by the Vega grant No Úvod Aj v ostatných desaťročiach pokračuje záujem najmä humánnych klinikov, niektorých veterinárskych, zootechnických pracovníkov, ale aj odborníkov ďalších profesií (Büssing et al. 1999, Timoschenko et al. 1993, 2001) o imelo biele (V. album L.) s cieľom jeho využitia pre 215

217 prax (Cebovic et al. 2003, Droppová et al. 2006, Elsasser et al. 2001, Šutiak 2006 a i.). Tento fakt neprekvapuje, nakoľko pre jeho využitie ako liečiva sa doposiaľ našlo pomerne široké pole aplikácií (Habeck 2003, Lenartz et al. 2000, Schöffski et al. 2005, Stein et al a iní). S problematikou imela bieleho sa aj my čiastočne zapodievame a o jeho účinkoch sme tiež už doposiaľ publikovali niekoľko zdelení (Šutiak et al. 2006, 2007, Šutiak a Šutiaková 2007). Cieľom tohto príspevku je informovať širokú odbornú verejnosť o niektorých našich ďalších výsledkoch štúdia. Materiál a metodika. V našej práci sme najskôr študovali výskyt imela bieleho v nižšie uvedených 2 lokalitách Košíc, a sledovali sme ho jednak vizuálne, ale i opticky, pričom sme najskôr zisťovali výskyt ružíc imela bieleho v celkovom množstve rastúcich stromov v 2 lokalitách s označením KS a Q NU. Okrem toho sme prepočítali a vyjadrili aj intenzitu výskytu jeho ružíc u atakovaných listnatých stromov a to v oboch prípadoch ako priemery a smerodajné odchýlky. Pre optické dokumentačné snímanie sme použili fotoaparát Pentax japonskej výroby a 35 mm farebný film (ISO 100) tiež japonskej výroby. Potom sme sledovali i celkový obsah fenolových látok v listoch a v stonkách imela bieleho metódou Singletona a Rossiho (1965), redukčné schopnosti imelových výťažkov z oboch časti imela podľa Oyaizu (1986), ich aktivitu pre vychytávanie DPPH radikálu podľa SanchezMorena et al. (1998) a inhibičnú schopnosť DPPH radikálu fenolovými extraktmi s využitím metódy prepočítania podľa Yena and Duha (1994). Výsledky a diskusia. Štúdium výskytu imela bieleho (Foto 1 až 3) v ďalej uvedených dvoch Košických lokalitách KS a QNU ukázalo, že zamorenie obidvoch lokalít sa medzi sebou signifikatne líši jednak čo do extenzity, ale aj čo do intenzity zamorenia. Zatiaľ čo pri prepočte na celkový počet stromov bola extenzita zamorenia medzi lokalitami KS a QNU len na úrovní P< 0,01 (obr. 1) tak i pri prepočte na napadnuté stromy lokalít bola signifikantnosť rozdielov na úrovni P < 0,001 (Obr. 2). Sledovanie celkového obsahu fenolových látok v listoch a v stonkách ukázalo, že v stonkách bol obsah fenolových látok viac ako 2 násobne vyšší (Tab. 1.) ako v listoch a rovnako bola v nich vyššia i redukčná aktivita (pozrite Tab. 2). Porovnania so substanciálnym vitamínom C však ukázali, že aj v stonkách bola tato aktivita podstatne nižšia v porovnaní s vitamínom C. Okrem toho študovali sme aj antioxidačnú aktivitu fenolových látok v extraktoch zo stonkov a listov imela bieleho, vyjadrenú ako % inhibície (Tab. 3A a 3B). Aj v týchto štúdiách sa ukázalo, že extrakty fenolových látok zo stonkov boli podstatne účinnejšie než z listov a v stonkách sa viac približovali efektívnosti vitamínu C ako v prípade listov. Foto 1. Imelo vegetujúce. Foto 2. Imelo vysušené. Foto 3 Imelo prípravkov 216

218 [Mean values & st. deviation] Fig. 1. Occurence of White mistletoe bunches of the total number of deciduous trees in Košice localities: 1 & 2 ** 1 2 [Localities : 1 = KS; 2 = QNU; ** = P<0.01] Tab. 1. Contents of total phenols in V. album stems and in leaves 2 Ordering Nos. Parts of V. album Concentration in mg. g 1 1. Stems ± Leaves ± = analysis made by N. Benhammou. [Number of bunches / 1tree] Fig. 2. An overview of the occurence of White mistletoe s bunches in the attacked deciduous trees in Košice localities: KS & QNU 0 *** 1 2 [Localities : 1 = KS; 2 = QNU; *** = P<0.001] Tab. 2. Reduction power of the extracts of the phenolic compounds from stems and leaves of V. album L. expressed in Absorbance OD unites (700 nm) Ord. No. Concent. (mg/ml) V. album stems V. album leaves Ascorbic acid ± 0, ± ± ± ± ± ± 0, ± ± ± 0, ± ± ± 0, ± ± = analysis made by N. Benhammou. Tab. 3 A. Antioxidant activity of the extracts of the phenolic compounds of stems and leaves of V.album expressed as % of inhibition 2. Conc. Fraction of the residual DPPH (DPPH REM) plotted (g L ) versus the concentration of antioxidants % of inhibition (V. album stem) a % of inhibition (V. album leaves) A C 1 C 2 T V. album stem a a a A = Antioxidant; C 1 = (g.l 1 ) of antixidants; C 2 = (mg A per g DPPH ); T = Time at steady state (min.); a = non analyzed result; 2 = analyzed by N. Benhammou; C 1 ; 2 = Concentration. V. album leaves a a a 217

219 Zvýšený záujem tak odborníkov ako aj pacientov o imelo biele neprekvapuje, lebo jeho využívanie má aj v našich krajoch už po stáročia veľkú tradíciu. V minulosti sa využívalo najskôr pre tzv. nemedicínske účely (napr. pre civilnookrasné účely, pre dekoráciu príbytkov, ako obradný prostriedok tak pri tradičných, ako aj rôznych kultových ceremóniách ap. (Burian 2006 a i.). Tab. 3 B. Antioxidant activity of the extracts of the phenolic compounds of stems and leaves of V. album Continuation of the Table 3A 2. Ethanolic extract of V. album EC50 (mg antioxidant per g DPPH) Time (TEC50) AE ( 10 3 ) Total phenolic content (mg g 1 ) Stems ,091 ± Leaves ,035 ± = analysis made by N. Benhammou. Dôležitejšie je však jeho využitie pre medicínske účely. Deje sa tak vďaka obsahu látok ako sú cholín, acetylcholín, flavonoidy, oligo a polysacharidy, neamino a aminokyseliny, amidy, peptidy, bielkoviny ako aj alkaloidy, slizy, vosky, silice, lektíny, rôzneminerálie a niektoré ďalšie látky (Cebovic et al. 2003, Droppová et al. 2006, Elsasser et al. 2001, Habeck 2003, Lenartz et al. 2000, Schöffski et al. 2005, Stein et al. 1998, Šutiak 2006, Šutiak a Šutiaková a i.). V ostatných rokoch sa študuje jeho účinok aj v súvislosti s účinkom RAS radikálov (WonHo et al. (2004), ale aj s výskytom takých nebezpečných látok v organizme živočíchov a biosféry ako sú : 8OHguanín, 2OHadenín, hypoxantín, 2aminoimidazoly, 5formyluracil, xantín, 5OHcytozín, 5OHuracyl, cistymínglykol a niektoré ich metabolity resp. biotransformáty. Domnievame sa, že tu prezentované naše poznatky sú tiež cenné a môžu prispieť ku dokresleniu užitočnosti jeho využívania v praxi. V medicíne sa pre liečbu často odporúčali injekcie, ale využiť možno zvlášť vo veterinárstve aj maceráty, nálevy a odvary (napr. odvar z 3540 g masy sa pripravuje 1 l nálevu). Tie sa môžu podávať v objeme 1/3 až ½ šálky u veľkých zvierat niekoľko krát za deň. Pripraviť sa môžu aj maceráty a nálevy (napr. zo 4 čajových lyžičiek práškového imela, ktoré sa preleje 1l vriacej vody a občas premieša). Po ocedení roztok sa odporúča podávať krave a koňovi v množstve 0,5 L 2 x denne; stredným zvieratám sa odporúča dávkovať 23 x denne 58 a malým zvieratám 24 x za deň 24 polievkové lyžice roztoku po vychladení. Pritom sa dávky prispôsobia veľkosti a stavu zvieraťa. Záver V práci sa najskôr pojednáva o základných charakteristikách, vlastnostiach a účinkoch imela bieleho, ďalej o možnostiach jeho aktuálneho využitia jednak v terénnej, ďalej vo výskumnej ale aj v pedagogickej praxi rôznych odborov. Popritom v práci prezentujeme aj naše výsledky štúdia extenzity a intenzity výskytu imela bieleho v 2 lokalitách Košíc. Okrem toho uvádzame aj výsledky jeho štúdia a analýz najmä na obsah fenolových látok v listoch a v stonkách imela bieleho, ale aj úroveň jednak ich redukčnej aktivity. Chceli by sme pritom vyjadriť naše presvedčenie, že tu spracovaný text môže byť užitočný pre rôznych pracovníkov v oblasti vedy, výskumu, vývoja ako aj pre oblasť výroby tejto skupiny liečiv a prípravkov. Nakoniec ešte chceme uviesť, že táto práca mohla vzniknúť vďaka podpore finančnými grantmi Vega čís Literatúra Burian L.: 2006, 1, file= viewtopic&t= 87, koncová časť. Büssing A. et al.: Eur. J. of Biochemistry, 262, 1999, 79. Cebovic T. et al.: Toxicol. Letters, 144, 1, 2003, 117. Droppová L. et al.: 2006, 14, modules.php?name=forums &file=viewtopic&t=124. Elsasser B.U. et al.: Cancer 91, 2001, 998. Habeck M.: Drug Discovery Today, 8, 2, 2003, 52. Lenartz D. et 218

220 al.: Anticancer Res., 20, 2000, Oyaizu, M.: Jpn. J. Nutr., 44, 1986, 307. Sanchez M C. et al.: J. Sci. Food and Agricult., 76, 1998, 270. Schöffski P. et al.: Eur. J. of Cancer, 41, 2005, Singleton C.P. and Rossi J.A.: J. of Enol. and Viticult., 16, 1965, 144. Stein G.M. et al.: Eur. J. of Cancer 34, 7, 1998, Timoshenko A.V. et al.: Biol. Chem.HoppeSeyl., 374, 1993, 237. Timoshenko A.V. et al.: Eur. J. of Cancer, 37, 2001, Šutiak V.: 2006,12, modules.php?name =Forums&file=viewtopic&t =87. Šutiak V. et al.: Zborník z medzinárodnej konferencie Rizikové faktory potravového reťazca, Nitra, , 293. Šutiak V., Šutiaková I.: 2007,12, modules.php?name= Forums& file=viewtopic&t =7306. Šutiak et al.: 2007, 12, php? name=forums&file =viewtopic&t= WonHo K. et al.: Mol. Pharm., 66, 2004, Yen G.C. and Duh P.D.: J of Agr. & Food Chem., 42, 1994, 629. Address of corresponding author is as follows: Prof. MVDr.Václav Šutiak, PhD., Institute of pharmacy and pharmacology, UVM, Komenský 73, Košice. ASPERGILLUS SEKCIA FLAVI POTENCIÁLNY PRODUCENT MYKOTOXÍNOV ASPERGILLUS SECTION FLAVI POTENTIAL PRODUCENTS OF MYCOTOXINS Tančinová, D. Dovičičová, M. Labuda, R. Katedra mikrobiológie, Fakulta biotechnológie a potravinárstva, Slovenská poľnohospodárska univerzita, Nitra; [email protected] Abstract The samples of poultry feed mixtures were obtained from State Veterinary and Food Institute in Nitra; wheat, soya and sunflower were obtained from large granaries; wheat bran were collected from mill and wheat (crop 2006) from the different producers. We isolated the numbers of Aspergillus section flavi (A. flavus, A. parasiticus and A. nomius), which are important potential producents of mycotoxins. From analysed samples from Aspergillus section flavi were detected only isolates of species Aspergillus flavus. The frequency of occurrence of Aspergillus flavus ranged from 0 % (wheat, conventional agriculture) to 83.3 % (sunflower). From the total number of 415 isolates tested for their ability to produce aflatoxins in vitro, using a thin layer chromatography technique (TLC), only three isolates produced aflatoxin B 1. Aflatoxigenic isolates were isolated from poultry feed mixture and the possible source of contamination of this poultry feed mixture was extracted soybean grout, which is imported to our country from South America % of tested Aspergillus flavus isolates (using TLC) were able to produce in vitro cyclopiazonic acid. Key words: Aspergillus section flavi, aflatoxins, cyclopiazonic acid, wheat, wheat bran, soya sunflower, poultry feed mixtures Úvod Mikroskopické huby skupiny Aspergillus flavus pútajú pozornosť už dlhé obdobie pre ich všadeprítomnosť a rozšírenie v rôznych ekologických prostrediach, pre ich využitie v potravinárskom priemysle ako i schopnosť produkovať viaceré mykotoxíny (Cotty, 1994). Aflatoxíny sú produkované tromi blízkymi druhmi Aspergillus nomius, A. flavus a A. parasiticus a niekoľkými ďalšími druhmi, ktoré sa nevyskytujú v potravinách (Frisvad a Thrane, 2002). Izoláty A. flavus produkujú aflatoxíny typu B (B 1 a B 2 ), alebo kyselinu cyklopiazónovú, alebo obidva, alebo žiadny mykotoxín (Pitt, 1993). A. parasiticus a A. nomius prudukujú aflatoxíny B aj G, ale neprodukujú kyselinu cyklopiazónovú (Samson a Frisvad, 1991). Kyselina cyklopiazonová sa vyskytuje v obilninách (Gallagher et al., 1978) a v podzemnici olejnej (Lansden a Davidson, 1983; Fernández Pinto et al., 2001) ako spolukontaminant s aflatoxínmi (Cole, 1986). 219

221 Cieľom práce bola izolácia druhov Aspergillus sekcia flavi a testovanie ich schopnosti produkovať mykotoxíny aflatoxíny a kyselinu cyklopiazónovú v podmienkach in vitro. Materiál a metodika Vzorky pšenice, slnečnice a repky zo zberov 2003 a 2004 boli odoberané z veľkokapacitných skladov a to od naskladnenia až po vyskladnenie. Vzorky pšeničných otrúb boli odoberané z mlyna (Nitriansky región). Vzorky pšenice zberanej v roku 2006 boli odoberané od producentov (prvovýroba) z dvoch typov obhospodarovania pôdy tzv. konvenčného a tzv. ekologického. Na izolácie skupiny Aspergillus flavus sme použili platňovú zrieďovaciu metódu, resp. pri pšenici zberanej v roku 2006 metódou ukladania povrchovo vysterilizovaných zŕn na agarové platne. Agarové platne DRBC agar (agar s dichloranom bengálskou červeňou a chloramfenikolom) a sladinový agar boli inkubované 5 dní pri teplote 25 ± 1 o C v tme. Po inkubácii sme vyrastené kolónie zástupcov rodu Aspergillus preočkovali na identifikačné živné pôdy CYA (Czapkov agar s kvasničným extraktom; Klich, 2002), CY20S (Czapkov agar s kvasničným extraktom a 20 % sacharózy; Klich, 2002) a MEA (agar so sladinovým extraktom; Samson et al., 2002) Identifikáciu izolátov sme robili podľa príslušných identifikačných kľúčov (Klich, 2002; Samson, et al., 2002). Stanovenie toxinogenity izolátov skupiny A. flavus in vitro na schopnosť produkovať aflatoxíny a kyselinu cyklopiazónovú Na dôkaz produkcie aflatoxínu B 1 a kyseliny cyklopiazónovej sa použila metóda Filtemborg et al. (1995) a Samson et al. (2002). Z čistých kultúr boli lancetou z kolónií vyrezané tri kúsky mycélia so živnou pôdou (CYA pre intracelulárne toxíny kyselina cyklopiazónová a YES agar s kvasničným extraktom a sacharózou; Samson et al., 2002 pre extracelulárne toxíny aflatoxíny;) s celkovou plochou približne 1 cm 2. Výseky boli prenesené do 2 ml Eppendorfovej skúmavky, následne bolo pridaných 0,5 ml chloroformmetanolovej zmesi (2:1 v/v) a obsah skúmavky bol 2 minúty trepaný na vortexe. 20 µl tekutej fázy bolo nanesených na chromatografickú platňu. Ako vyvíjacia sústava bola použitá zmes toluénu, etylacetátu a kyseliny mravčej (5:4:1 v/v/v). Aflatoxín B 1 pod UV svetlom 366 nm žiari modro a dosahuje retenčný faktor (R f 0,36). Kyselina cyklopiazonová sa vizujalizuje postrekom AlCl 3 s následným zahriatím na cca 120 o C po dobu 3 min. Kyselina cyklopiazonová je detekovateľná ako tmavozelená až čierna škvrna (pri dennom svetle). Po následnom nástreku metanolového roztoku metylbenzotiazolonhydrochloridu (MBTH) a zahriatí na cca 120 o C sa pod UV svetlom pri 365 nm javí ako fluoreskujúca žltá škvrna s R f =1,80. Výsledky a diskusia Zo zástupcov Aspergillus sekcia flavi sme v našich vzorkách detegovali len izoláty, ktoré boli na základe makromorfologických a mikromorfologických znakov identifkované ako Aspergillus flavus. Ani jeden izolát nebol identifikovaný ako A. parasiticus, resp. A. nomius, ktorý ešte nebol na území Slovenska detegovaný vôbec. Výsledky kontaminácie vzoriek A. flavus uvádzame v Tab. 1. Z 415 testovaných izolátov (Tab. 2) Aspergillus flavus, len tri produkovali aflatoxín B 1. Klich a Pitt (1988) uvádzajú, že medzi jednotlivými kmeňmi aflatoxinogénnych druhov sú výrazné rozdiely v schopnosti produkovať aflatoxíny. Frisvad et al. (2006) uvádzajú, že len asi polovica známych izolátov Aspergillus flavus je schopná produkovať aflatoxíny. De Oliveira et al. (1998) zistili produkciu aflatoxínov skupiny B u 44 % testovaných izolátov. Vaamonde et al. (2003) detegovali výskyt aflatoxinogénnych izolátov z búrskych orieškov, pšenice a sóje. Najviac aflatoxinogénnych izolátov vyizolovali z búrskych orieškov (73 % pozitívnych izolátov), menej v pšenici (13 %) a najmenej z sóje (5 %). Ako uvádzame vyššie produkciu aflatoxínu B 1 sme detegovali u troch izolátov A. flavus, ktoré boli vyizolvané z jednej kŕmnej zmesi pre hydinu. Zložkou kŕmnej zmesi je sójový extrahovaný šrot, ktorý je k nám dovážaný z Južnej Ameriky. Problematikou toxinogenity A. flavus v danej oblasti sveta sa zaoberali Magnoli et al. (1998) testovali izoláty vyizolované z kŕmnych zmesí pre hydinu na schopnosť 220

222 produkovať aflatoxíny. Aflatoxíny produkovalo len 10 % zo všetkých testovaných kmeňov. Z ostatných analyzovaných komodít sme toxinogénny izolát nedetegovali. Podobne aj Piecková a Jesenská (2001) nezistili ani jeden izolát A. flavus schopný produkovať aflatoxíny z kukuričných produktov. Na schopnosť produkovať kyselinu cyklopiazónovú sme testovali izoláty vyizolované z pšeničných otrúb, pšenice, slnečnice a repky. Z 86 testovaných izolátov A. flavus produkovalo kyselinu cyklopiazónovú 59 izolátov tj. 68,6 %. Vaamonde et al. (2003) taktiež uvádzajú vysoké percento izolátov schopných produkovať tento toxín (94 % izolátov vyizolovaných z búrskych orieškov, 93 % z pšenice a 73 % z sóje). Izoláty z našich vzoriek slnečnice, repky, a pšeničných otrúb sa vyznačovali 100 % schopnosťou produkovať kyselinu cyklopiazónovú. 54 % resp. 57 % schopnosť produkovať toxín sme detegovali u izolátov z pšenice. Tabuľka 1: Kontaminácia vzoriek Aspergillus flavus Analyzované komodity Pôvod vzoriek Počet analyzovaných vzoriek Výskyt Aspergillus flavus vo vzorkách Počet % pozitívnych pozitívnych vzoriek vzoriek Kŕmne zmesi Štátny veterinárny a pre hydinu potravinový ústav ,9 Pšeničné Mlyn otruby ,5 Pšenica Veľkokapacitné silá zber 2003, , Repka Veľkokapacitné silá zber 2003, , Slnečnica Veľkokapacitné silá zber 2003, , Pšenica zber ekologické poľn , konvenčné poľn Tabuľka 2: Testované izoláty Aspergillus flavus na schopnosť produkovať mykotoxíny v podmienkach in vitro Analyzované komodity aflatoxín B 1 kyselina cyklopiazónová Kŕmne zmesi pre hydinu 3 * /187** nt Pšeničné otruby 0/108 18/18 Pšenica zber 2003, /15 4/7 Repka zber 2003, /13 10/10 Slnečnica zber 2003, /52 11/11 Pšenica ekolog. poľn. (zber 2006) 0/40 16/40 Pšenica konvenč. poľn. (zber 2006) 0/0 0/0 Σ 3/415 59/86 * počet izolátov schopných produkovať daný mykotoxín ** celkový počet testovaných izolátov produkovať daný mykotoxín nt izoláty netestované na produkciu daného mykotoxínu 221

223 Záver Z analyzovaných vzoriek kŕmnych zmesí pre hydinu, pšeničných otrúb, pšenice, repky a slnečnice sme detegovali zo zástupcov Aspergillus sekcia flavi len izoláty patriace do druhu Aspergillus flavus. Frekvencia výskytu A. flavus sa pohybovala od 0 % (pšenica, ekologické poľnohospodárstvo) po 83,3 % (slnečnica). Zo 415 izolátov testovaných na schopnosť produkovať aflatoxíny v podmienkach in vitro sme schopnosť produkovať aflatoxín B 1 detegovali u troch izolátov A. flavus. Aflatoxinogénne izoláty boli vyizolované z kŕmnej zmesi pre hydinu a pravdepodobným zdrojom kontaminácie bol sójový extrahovaný šrot, ktorý sa k nám dováža z Južnej Ameriky. Z 86 izolátov A. flavus testovaných na schopnosť produkovať kyselinu cyklopiazónovú mykotoxín produkovalo 68,6 % izolátov. Schopnosť produkovať mykotoxíny je geneticky determinovaná a mikroskopická huba môže túto schopnosť stratiť alebo naopak aj získať, preto je potrebné tejto problematika z hľadiska produkcie bezpečnosti potravového reťazca venovať stálu pozornosť. Literatúra Tento príspevok vznikol s finančnou podporou projektu VEGA 1/3456/06 COLE, R.J Etiology of turkey X disease in retrospect:a case for the involvement of cyclopiazonic acid. In Mycotoxin Res., 2, 1986, pp. 37. COTTY, P. J Comparison of four media for the isolation of Aspergillus flavus group fungi. In Mycopathologia, 125, 1994, pp FERNÁNDEZ PINTO, V. PATRIARCA, A. LOCANI, O. VAAMONDE, G Natural cooccurrence of aflatoxin and cyclopiazonic acid grown in Argentina. In Food. Addit. Contam., 18, 2001, pp FILTENBORG, O. FRISVAD, J.C. THRANE, U. LUND, F Screening methods for secondary metabolites produced by fungi in pure culture. In Samson, R.A. Hoekstra, E.S. Frisvad, J.C. Filtenborg, O. (ed.) Introduction to foodborne fungi. Baarn : Centraalbureau voor Schimmelcultures, 1995, pp FRISVAD, J.C. THRANE, U Mycotoxin production by common filamentous fungi. In Samson, R.A. Hoekstra, E.S. Frisvad, J.C. Filtenborg, O.: Introduction to food and airborne fungi. Utrecht : Centraalbureau voor Schimmecultures, 2002, pp FRISVAD, J.C. THRANE, U. SAMSON, A. PITT, J.I Important mycotoxins and the fungi which produce them. In Hocking, A.D. Pitt, J.I. Samson, R.A. Thrane, U. (ed.): Advances in Food Mycology. New York : Springer, 2006, pp GALLAGHER R.T. RICHARD, J.L. STAHR, H.M. COLE, R.J Cyklopiazonic acid production by aflatoxingenic and nonaflatoxigenic strains of Aspergillus flavus. In Mycopathologia, 66, 1978, pp KLICH, M.A Identification of common Aspergillus species. Wageningen : Ponsen &Looijen, 2002, 116p. ISBN KLICH, M.A. PITT, J.I Differentiation of Aspergillus flavus from Aspergillus parasiticus and other closely related species. In Trans. Br. Mycol. Soc., 91, 1988, pp LANSDEN, J.A. DAVIDSON, J.I Occurrence of cyclopiazonic acid in peanuts. In Appl. Environ. Microbiol., 45, 1983, pp MAGNOLI, C. DALCERO, A.M. CHIACCHIERA, S.M. MIAZZO, R. SAENZ, M.A Enumeration and identification of Aspergillus group and Penicillium species in poultry feeds from Argentina. Mycopathologia, 142, 1998, pp PIECKOVÁ, E. JESENKÁ, Z Fusarium moniliforme, F. subglutinans and Aspergillus flavus in maize products in Slovakia. In Czech Mycology, 53, 2001, pp PITT, J.I Corrections to species names in physiological studies on Aspergillus flavus and Aspergillus parasiticus. In J. Food Prot., 56, 1993, pp

224 SAMSON, R.A. FRISVAD, J.C Current taxonomic conceps in Penicillium and Aspergillus. In Chelkowski, J. (ed.): Cereal Grain, Mycotoxin, Fungi and Quality in drying and storage. Amsterdam : Elsevier, pp SAMSON, R.A. HOEKSTRA, E.S. FRISVAD, J.C. FILTENBORG, O Introduction to food and airborne fungi. Utrecht : Centraalbureau voor Schimmecultures, 2002., 389 p. ISBN VAAMONDE G. PATRIARCA, A. PINTO, V.F. COMERIO, R. DEGROSSI, C Varability of aflatoxin and cyclopiazonic acid production by Aspergillus section flavi from different substrates in Argentina. In Intern. J. Food Microb. 88, 2003, p BIODIVERSITY VARIATION IN THE FIVE SLOVAK CATTLE BREEDS BY MICROSATELLITE DATA Židek, R., 1 Jakabová, D. 1, Trandžík, J. 1, Rajtárová, K 1, Massányi, P. 2, Jakab F. 3, Kozlík P 1, Buleca Jr. J. 4, Martvoňová M. 5 1 State Breeding institute, Nitra, Slovak Republic, 2 Slovak Agricultural University, Nitra, Slovak Republic, 4 University of Veterinary Medicine, Košice, Slovak Republic, 3 State Breeding Inspection, Nitra, Slovak Republic, 5 Constantine the Philosopher University, Nitra Abstract Genetic variability and relationships among five Slovak cattle breeds (Holstein, Pinzgau, Limousin, Slovak Spotted and Charolais) were investigated separately using 11 microsatellite markers (BM1824, BM2113, ETH3, ETH10, ETH225, INRA23, SPS115, TGLA53, TGLA122, TGLA126, TGLA222). Allele frequency, heterozygosity (H O, H E ) and PIC values were investigated. For microsatellite markers Fstatstic F IS, F IT, F ST parameters were calculated. The goal of the study was detection of genetic diversity of the 5 purebred populations of Slovak breeds Holstein, Pinzgau, Limousin, Slovak Spotted and Charolais using microsatellite datas. Key words: biodiversity, Fstatistic, microsatellite, cattle Introduction DNAbased molecular markers have a very high polymorphism level and have been successfully used for evaluation of genetic diversity and variation in breeding programs and to access the level of genetic conservation schemes (Almeida et al., 2000). Over two thousand microsatellite sequences have been identified in cattle genome. They became the most numerous class of genetic markers used in animal breeding studies (Kemp et al., 1995, Arranz et al., 1996) due to their frequency in the genome, high degree of polymorphism and relatively easy and rapid identification. Many studies have shown the usefulness of microsatellite DNA markers to evaluate genetic diversity and relationships between cattle populations (IbeaghaAwemu, 2004, Cymbron et al., 2005, Pandey et al., 2006 and the others). Aim of the present study was to provide information on the genetic structure in Holstein cattle in Slovakia based on polymorphism of 11 DNA microsatellite loci (BM1824, BM2113, ETH3, ETH10, ETH225, INRA23, SPS115, TGLA53, TGLA122, TGLA126, TGLA222). In our work the allele frequency and statistical indexes as PIC, H O, H E, F IS, F ST were investigated. The goal of the study was detection of the genetic diversity of the 5 purebred populations of Slovak breeds Holstein, Pinzgau, Limousin, Slovak Spotted and Charolais. Materials and methods 392 animals of 5 cattle breeds (Holstein, Charolais, Limousin, Slovak Pinzgau and Slovak Spotted) originate from Slovak region were analyzed.they were analyzed for the polymorphism of 11 microsatellite DNA markers designated as: BM1824, BM2113, ETH3, ETH10, ETH225, 223

225 INRA23, SPS115, TGLA53, TGLA122, TGLA126, and TGLA222.Whole blood samples were taken from jugular vein into the tubes containing Nacitrate (3.8%). DNA extraction for DNA test basically followed the protocol of Promega (Wizard Genomic DNA Purification Kit). DNA was amplified in one multiplex PCR (StockMark for Cattle, AB). PCR reaction was performed according to the PCRprotocol for Bovine II v. 2 developed by Applied Biosystem (AB). The reactions were carried out on a thermocycler MJ Research (PTC 200). Products of PCR were processed electrophoreticaly on DNA sequencer (ABI 310, AB). Size of analyzed DNA fragments was determined in base pairs using computer package GeneScan v. 3.7 (AB). The amount of variation in each population was measured with the average number of alleles per locus and observed (Ho), expected (He) heterozygosity (Nei, 1987) and PIC value (Botstein et al.,1980) were calculated with the POWERMARKER 3.23 (Liu and Muse, 2003). Population structure was evaluated by the hierarchical F statistics F IS, F ST (Weir and Hill, 2002) using POPGENE software (version 1.31) (Yeh et al., 1999). Distance measures were estimated by the method of Nei (1972). Phylogenetic trees were constructed by using of unweighted pair group method with the arithmetic average (UPGMA; Sneath and Sokal, 1973) from distance using the POWERMARKER Results and discussion Totally 112 alleles in all loci using codominant microsatellite markers were detected. Genetic marker heterozygosity based on microsatellite data ranged ( ) and ( ) for H O and H E respectively. The highest values of H O were observed in TGLA227, and the lowest in ETH10. The highest values of H E were detected in TGLA53 and the lowest in SPS115. The results pooled by the breeds (Table 1) showed the H O values ranged from (Slovak Pinzgau) to (Charolais) and H E from (Slovak Pinzgau) to (Charolais). Table 1. Genetic structure of Slovakian cattle populations n genotype allele no. no. He Ho PIC Holstein Charolais Limousin Slovak Pinzgau Slovak Spotted Slovak population of Pinzgau cattle presented lower then expected heterozygosity as German Pinzgau population (0.71) but higher value then French Charolais population (0.66) (Cymbron et al., 2005). Comparable results of observed heterozygosities in Charolais breed were described by Wiener et al., (2003).The general heterozygosity was lower in Chinese native population ( ) (Zhou et al., 2005). Observed heterozygosity in Slovak Holstein population (0.707) was higher then observed in North American Holsteins (0.61) reported by Vallejo et al. (2003) and Holstein population (0.513) reported by Machado et al. (2003). The highest polymorphism showed the microsatellite locus TGLA122 (19 alleles), the lowest on the other side the loci BM182, ETH225 and SPS115 (6 alleles). An average of alleles occurred per microsatellite locus. Fstatistics was computed separately. For microsatellite markers F IS, F IT, F ST parameters were calculated. Value of F IS ranged from (ETH3) to (INRA23). The main value was and indicates 0.9% gene fixation within analyzed breeds. This value is lower than results obtained by Pandey et al., (2006) in Indian cattle population (0.188). F IT value varied from (TGLA227) to (ETH10). F IT value for all breed and all loci was and represents 8.8% fixation of genes around breed pool. Degree of genetic differentiation of subpopulations F ST ranged from (SPS115) to (ETH10) and indicates between breed 224

226 variability. 35.3% of between breed variability was observed in ETH10 loci. Total variability between analyzed breed was 7.9%. The highest value of F ST (0.130) was observed in British cattle population (Wiener et al., 2004). The similar results were observed in Italian population of cattle breeds. Differentiation between three breeds analyzed by Moioli et al., (2004) was 6% (Fst 0.060). Our results were comparable with middleeuropean study of Čítek (2006). Genetic distance was computed by using Nei (1972). The shortest genetic distance was observed between Slovak Spotted and Limousin (0.046) breeds and the highest between Limousin and Holstein population (0.463). Close genetic distance was observed between Slovak Spotted and beef cattle breeds. Similar results were described in IbeaghaAwemu (2004). The shortest genetic distance was between Slovak Pinzgau and Slovak Spotted breeds (0.027). Close relation between Pinzgau and Simmental (equivalent of Slovak Spotted) breeds was not detected by Cymbron et al. (2005). These differences could be caused by different breed origin. Relevant distance between Holstein and another cattle breed was observed by Machado et al. (2003). Similar genetic distance between Limousin and Charolais breeds (0.138) was observed in Maudet et al. (2002). Phylogenetic trees were constructed using microsatellite by the UPGMA method (Figure 2). Figure 2: UPGMA tree constructed from D S distances showed the relationship among 5 selected breeds based separately on 11 microsatellite markers Microsatellite SS PI I LI CH HO HO Holstein, CH Charolais, LI Limousin, PI Slovak Pinzgau, SS Slovak Spotted Results have confirmed that the microsatellite loci are powerful tool for population characterization. Microsatellite data classified the Limousin population as closely related with Slovak Pinzgau and Slovak Spotted breeds. References 1. ALMEIDA, S. E. M., MACHADO, M. S. N., STEIGLEDER, C. S. (2000): Genetic diversity in a Brazilian bovine herd based on four microsatellite markers. Genetic and Molecular Biology, 23, 2000, ARRANZ, J. J., BAYÓN, Y., SAN PRIMITIVO, F. (1996): Comparison of protein markers and microsatellite in differentiation of cattle population. Anim. Genet. 27, BOTSTEIN, D., WHITE, R. L., SKOLNICK, M. (1980): Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms. American Journal of Human Genetics, 32, 1980,

227 4. ČÍTEK, J., PANICKE, L., ŘEHOUT, V., PROCHÁZKOVÁ, H. (2006): Study of genetic distance between cattle breeds of Central Europe. Czech J. Anim. Sci, 51, 2006, CYMBRON, T., FREEMAN, A. R., MALHEIRO, M. I., VIGNE, J. D., BRADLEY, D. G. (2005): Microsatellite diversity suggests different histories of Mediterranean and Northern European cattle populations. Proc. R. Soc. B, 272, 2005, IGEAGHAAWEMU, E. M., JANN, O. C., WEIMANN, C., ERHARDT, G. (2004): Genetic diversity, introgression and relationships among West/Central African cattle breeds. Genet. Sel. Evol., 36, 2004, KEMP, S. J., HISHIDA, O., WAMBUGU, J., RINK, A., LONGERI, M. L., MA, R. Z., DA, Y., LEWIN, H. A., BARENDSE, W., TEALE A. J. (1995): A panel of polymorphic bovine, ovine and caprine microsatellite markers. Anim. Genet. 26, MACHADO, M. A., SCHUSTER, I., MARTINEZ, M. L., CAMPOS, A. L. (2003): Genetic Diversity of Four Cattle Breeds Using Microsatellite Markers. R. Bras. Zootech., 32, 2003, MAUDET, C., LUIKART, G., TABERLET, P. (2002): Genetic diversity and assignment tests among seven French cattle breeds based on microsatellite DNA analysis. J. Anim. Sci., 80, 2002, MOIOLI, B., NAPOLITANO, F., CATILLO, G. (2004): Genetic diversity between Piedmontese, Maremmana, and Podolica Cattle Breeds. Journal of Heredity, 95, 2004, NEI, M. (1972): Genetic distance between populations. Am. Nat. 106, 1972, NEI, M. (1987): Molecular Evolutionary Genetics, Columbia University Press, New York, PANDEY, A. K., SHARMA, R., SINGH, Y., PRAKASH, B. B., AHLAWAT, S. P. S. (2006): Genetic diversity studies of Kherigarh cattle based on microsatellite markers. Journal of Genetics, 85, 2006, PIRY, S., ALAPETITE, A., CORNUET, J. M., PAETKAU, D., BAUDOUIN, L., ESTOUP, A. (2004) GeneClass2: A Software for Genetic Assignment and FirstGeneration Migrant Detection. Journal of Heredity, 95, 2004, SNEATH, P. H. A., SOKAL, R. R. (1973): Numerical Taxonomy. W. H. Freeman&Co, San Francisco, VALLEJO, R. L., LI, Y. L., ROGERS, G. W., ASHWELL, M. S. (2003): Genetic Diversity and Background Linkage Disequilibrium in the North American Holstein Cattle Population. J. Dairy Sci., 86, 2003, WEIR, B. S., HILL, W. G. (2002): Estimating Fstatistics. Annu. Rev. Genet. 36, WIENER, P., BURTON, D., AJMONEMARSAN, P., DUNNER, S., MOMMENS, G., NIJMAN, I. J., RODELLAR, C., VALENTINI, A., WILIAMS, J. L. (2003): Signatures of selection patterns of microsatellite diversity on a chromosome containing a selected locus. Heredity, 90, 2003, WIENER, P., BURTON, D., WILLIAMS, J. L. (2004): Breed relationships and definition in British cattle: A genetic analysis. Heredity, 93, 2004, YEH, F. C., YANG, R. C., BOYLE, T. (1999): POPGENE Version Microsoft Windowsbased freeware for population genetics analysis, available on the internet: ( 21. ZHOU, G.L., HIN, H.G., ZHU, Q., GUO, S. L., WU, Y. H. (2005): Genetic diversity analysis of five cattle breeds native to China using microsatellite. Journal of Genetics, 84, 2005, KONTAMINÁCIA DIVOŽIJÚCEJ ZVERI PERZISTENTNÝMI ORGANICKÝMI LÁTKAMI V SLOVENSKEJ REPUBLIKE CONTAMINATION OF THE WILD ANIMALS WITH PERSISTENT ORGANIC POLLUTANTS IN THE SLOVAK REPUBLIC Zmetáková, Z., Šalgovičová, D. Výskumný ústav potravinársky, Bratislava Abstract The aim of Monitoring of game and fish, the one of three subsystems of the Partial Monitoring System Food and Feed Contamination, implemented in 1995, is observation of entrance of contaminants into the organism of freeliving animals and fish, representing typical 226

228 bioindicators of environment as well as of foodstuffs for human consumption. Within the project, group of predators (wild boar, rabbit, hare, hunting bird, deer and damagecausing animals) and two species of fish (predatory freshwater fish and nonpredatory freshwater fish) are monitored. The aim of this paper is to evaluate level of the contamination with persistent organic pollutants (aldrin, dieldrin, heptachlor, hexachlorbenzene, DDT, PCBs) in the Slovak Republic. Within the Monitoring of game and fish subsystem, total of 5753 samples were analysed. Higher values of over limited samples were found in freshwater fish. The highest values exceeding the hygienic limits were found for PCB and DDT. The districts of Eastern Slovakia seem to be the most contaminated. Úvod Perzistentné organické látky (POPs) sú zlúčeniny, ktoré predstavujú v súčasnosti jeden z najvážnejších environmentálnych problémov. Sú to znečisťujúce látky, ktoré sú organického pôvodu, ale ich chemická štruktúra je natoľko zmenená, že sa rozkladajú len veľmi pomaly a dlhodobo pretrvávajú v prírode a organizmoch. Charakterizuje ich vysoká rozpustnosť v tukoch a schopnosť hromadiť sa v tukových tkanivách živých organizmov. Ich trvácnosť v prostredí, schopnosť bioakumulácie a prenosu na veľké vzdialenosti má za následok znečistenie a poškodzovanie živých organizmov aj v odľahlých oblastiach, v ktorých sa ich výskyt vôbec nepredpokladal (Hegyi, Mistrík, 2001). Môžu spôsobovať vážne zdravotné a environmentálne problémy, ktoré zahrňujú karcinogenitu, reprodukčné poruchy, zmeny vývojového a imunitného systému a endokrinné poruchy, čo môže viesť k zníženiu reprodukčnej schopnosti a v extrémnych prípadoch ku strate biologickej diverzity (Holoubek, 2003). Väčšina POPs (95 98%) sa dostáva do ľudského organizmu konzumáciou kontaminovaných potravín (Petrlík, Havel, Přibylová, 2001). Do potravinového reťazca sa dostávajú prostredníctvom bentických a nižších organizmov. Bioakumulácia v týchto organizmoch spôsobuje zvýšenie koncentrácie polutantov u predátorov a rýb. Obsahy POPs v biote poukazujú na znečistenie životného prostredia Slovenskej republiky v určitých lokalitách (Košutzký, Šalgovičová, 2001). Materiál a metodika Monitoring poľovnej zveri a rýb (ďalej MPZ) sa realizuje od roku 1995 a je súčasťou Monitoringu životného prostredia Slovenskej republiky. MPZ je jedným z troch subsystémov Čiastkového monitorovacieho systému Cudzorodé látky v potravinách a krmivách. Cieľom MPZ je získať podklady o hladinách kontaminantov v organizmoch voľne žijúcej zveri a rýb ako jedného z hlavných bioindikátorov znečistenia životného prostredia Slovenskej republiky, nakoľko predstavujú primárnych konzumentov vo svojich ekosystémoch. Realizáciu monitoringu (vypracovanie metodiky, plánu odberov vzoriek, vykonanie analýz a prípravu ročných správ) koordinuje Štátna veterinárna a potravinová správa SR. Na odberoch vzoriek sa podieľali Regionálne veterinárne a potravinové správy v spolupráci s organizáciami Slovenského poľovníckeho zväzu a lesných správ i Slovenského rybárskeho zväzu. Analýzy vykonávali tri akreditované pracoviská Štátnej veterinárnej a potravinovej správy Bratislava, Dolný Kubín a Košice. Celkovú stratégiu MPZ schvaľuje Výskumný ústav potravinársky, ktorý tiež zabezpečuje koordináciu monitoringu, spracovávanie a vyhodnocovanie získaných informácií a oponentúry ročných správ. Výsledky a diskusia Celkovo bolo za celé sledované obdobie ( ) vykonaných 5753 analýz rôznych druhov vzoriek bioty. Boli odoberané vzorky diviaka, dravých a lovných vtákov (husi, kačice), vzorky vysokej zveri (jeleň a srnec), vzorky rýb (dravých i nedravých), vzorky škodnej srstnatej zveri, zajacov a králikov a vzorky korýtka riečneho. Sledovaných a analyzovaných bolo osem perzistentných organických látok (aldrín, dieldrín, heptachlór, DDT, PCB, hexachlórbenzén, dioxíny a furány). Pravidelný monitoring POPs sa začal robiť v roku 2004, predtým sa uvedené organické látky sledovali len ojedinele. 227

229 Aldrín v biote predstavuje prakticky nulové hladiny. Celkovo bolo sledovaných 243 vzoriek. U vysokej zveri sa 72 analýz vykonalo v rokoch (priemerný nález veľmi nízky 0,001 mg.kg 1 tuku). Ojedinelé pozitívne nálezy aldrínu boli v Slovenskej republike zistené iba v roku 1990 vo svalovine vysokej zveri (jeleň, srnec) v okresoch Žilina, Banská Bystrica a Detva a v roku 2003 u sladkovodných nedravých rýb v okrese Trebišov. Hodnoty DDT v biote vykazujú veľmi nízke obsahy. Celkovo bolo analyzovaných 860 vzoriek. U dravých vtákov a sladkovodných nedravých rýb sú priemerné hladiny vyššie následkom kumulácie DDT cez prirodzený potravný reťazec. Vylučovanie DDT z telových tukových rezerv do vajec (žĺtok) dravých vtákov tiež potvrdzuje skutočnosť kumulácie DDT, ale aj cestu prirodzeného zbavovania sa zásob DDT z tela. Mierny nárast rezíduí DDT prezentuje skutočnosť, že u sladkovodných rýb nedravých sme v roku 1987 zaznamenali priemernú hodnotu 0,52 mg.kg 1 tuku a poslednom roku sledovania (2006) 0,87 mg.kg 1 tuku. V roku 2005 sa u nedravých rýb prudko zvýšil obsah DDT na 3,741 mg.kg 1, čo spôsobila jedna nadlimitná vzorka pochádzajúca z okresu Michalovce. Ešte vyšší nález bol zistený v roku 1998 a to 4,66 mg.kg 1 tuku. U sladkovodných rýb dravých sme zistili nižší obsah DDT ( v roku ,33 mg.kg 1 a v ,25 mg.kg 1 tuku). Priemerné nálezy DDT v svalovine diviaka poklesli z 0,152 mg.kg 1 tuku v roku 1986 na 0,021 mg.kg 1 tuku v roku V Českej republike bol priemerný nález DDT v roku ,009 mg.kg 1 tuku. K poklesu priemerných nálezov DDT v sledovanom období rokov 1986 až 2006 došlo v svalovine vysokej zveri (z 0,018 na 0,007 mg.kg 1 tuku) ako aj v svalovine králika resp. zajaca (z 0,211 na 0,012 mg.kg 1 tuku). Z geografického zhodnotenia výskytu DDT v sladkovodných rybách nedravých vyplýva, že najvyššie priemerné hladiny DDT sa vyskytovali v Košickom a Prešovskom kraji, kde boli zistené vzorky s nadlimitnými hodnotami. Nadlimitné hodnoty sa vyskytli najmä v okrese Michalovce, Stropkov a Košice. Vyššie hladiny boli zaznamenané i v okresoch Rožňava, Košice okolie a Trnava. V ostatných regiónoch Slovenskej republiky boli priemerné hladiny DDT veľmi nízke do 1% povolenej limitnej hodnoty. Počty vyšetrovaných vzoriek (celkom 46) u poľovnej zveri, rýb a dravých vtákov v podmienkach SR naznačujú, že rezíduá dieldrínu sa v biote v našej oblasti prakticky nevyskytujú. Len v roku 2003 sa zistili pozitívne nálezy u sladkovodných rýb nedravých v okrese Trebišov. Obdobná situácia je i v Českej republike, kde sa pozitívne nálezy (nálezy vyššie ako limit detekcie) obsahu dieldrínu v biote vyskytujú len ojedinele. Celkovo bolo analyzovaných 207 vzoriek bioty. Hodnoty heptachlóru sú veľmi nízke u väčšiny sledovaných druhov. Najvyšší obsah heptachlóru sme zaznamenali u sladkovodných rýb dravých v rokoch 2004 a 2005 (0,0365 a 0,037 mg.kg 1 tuku). U diviakov a vysokej zveri sa analýzami zistili nízke hladiny, v niektorých prípadoch (diviak) pravdepodobne aj konzumáciou potravy z poľnohospodárskych kultúr. Počet vykonaných vyšetrení na rezíduá hexachlórbenzénu (842 vzoriek) dáva dostatočný prehľad o hodnotách hexachlórbenzénu v biote, ktorého rezíduá sú prakticky zanedbateľné. Zvýšený obsah (3,548 mg.kg 1 tuku), spôsobený dvoma nadlimitnými vzorkami pochádzajúcimi z okresu Nitra, bol zaznamenaný len v roku 2006 v svalovine vysokej zveri. Najviac analýz (359) sa vykonalo vo svalovine vysokej zveri, z ktorých názorne vidieť ako sa menili hladiny hexachlórbenzénu. Od roku 1986 do roku 2001 došlo k poklesu obsahu z 0,025 na 0,005 mg.kg 1 tuku, potom hodnoty hexachlórbenzénu do roku 2005 mierne rástli na 0,009 mg.kg 1 tuku. K výraznému vzostupu hladiny došlo až v poslednom sledovanom roku, kedy sa vyskytli dve vzorky prekračujúce povolený limit a tak priemerná hodnota 3,548 mg.kg 1 tuku bola vyššia až o 3,348 mg.kg 1 v porovnaní s limitnou hodnotou (0,2 mg.kg 1 ). Priemerný obsah hexachlórbenzénu v svalovine diviaka v rokoch bol 0,038 mg.kg 1 tuku, pričom priemerné nálezy poklesli z 0,13 mg.kg 1 tuku v roku 1988 na 0,003 mg.kg 1 tuku v roku 2000, pričom v Českej republike sa priemerný nález HCB vo svalovine diviaka v roku 2000 pohyboval na úrovni 0,005 mg.kg 1 tuku. Rovnakú hodnotu (0,005 mg.kg 1 ) sme zistili v roku 2005 aj na Slovensku, v nasledujúcom roku sa priemerný nález mierne zvýšil na 0,009 mg.kg 1 tuku a v Českej republike mal hodnotu 0,001 mg.kg 1 tuku. Najvyšší obsah hexachlórbenzénu v sladkovodných rybách dravých bol v roku 1987 (0,062 mg.kg 1 tuku), v ďalších rokoch klesal. 228

230 Obsah HCB v nedravých sladkovodných rybách sa menil z 0,180 mg.kg 1 v roku 1987 na 0,047 mg.kg 1 tuku v roku Nálezy hexachlórbenzénu v svalovine králika resp. zajaca poklesli z 0,031 mg.kg 1 (rok 1999) na 0,003 mg.kg 1 tuku (rok 2006). Prítomnosti rezíduí PCB v biote sa venuje v podmienkach SR významná pozornosť, pričom v rokoch sa odobralo celkom 3555 vzoriek. SR bola v minulosti producentom polychlórovaných bifenylov a ich významným exportérom pre výhodné technologické vlastnosti PCB a ich mnohopočetné priemyselné využitie (ako plastifikátory, ohňovzdorné vlastnosti, nosiče pesticídov a plnidlá do farieb). Priemyselná výroba bola sústredená do závodu na východnom Slovensku (Chemko Strážske). Z uvedeného aspektu sa východoslovenský kraj zaradil medzi rizikové lokality, čo potvrdzujú aj každoročné nálezy pozitívnych vzoriek PCB v pravidelnom monitoringu poľovnej zveri a rýb v SR. Priemerné hodnoty PCB sa vo svalovine dravých vtákov v sledovanom období pohybovali v rozpätí 0,00210,887 mg.kg 1 tuku. V závislosti od kumulácie potravy z prirodzeného potravinového reťazca sa u vtákov analyzovali vysoké obsahy PCB hlavne v okresoch Stará Ľubovňa a Sobrance. Na zvýšený obsah PCB v svalovine diviaka (0,0124,05 mg.kg 1 ) a králika resp. zajaca (0,00050,839 mg.kg 1 ) mal takisto vplyv druh skonzumovanej potravy rastlinného pôvodu. Významnejšia kumulácia PCB sa pozoruje hlavne u sladkovodných dravých rýb (0,00634,918 mg.kg 1 tuku, 553 vzoriek) a sladkovodných nedravých rýb (0,002109,483 mg.kg 1 tuku, 865 vzoriek). Vo všetkých prípadoch musíme poukázať na dôležitosť lokality ulovenej zveri a ryby. Prevažná väčšina hodnôt prevyšujúcich povolené limity PCB v biote sa vyskytuje vo východoslovenskom kraji hlavne lokalitách blízkych závodu na výrobu PCB, prípadne na možné zdroje PCB vyplavené zo skládok z okolia závodu do vodných tokov a jazier. Napriek zákazu výroby PCB v roku 1984 sa pozoruje zvýšený výskyt PCB hlavne v lovných rybách niektorých vodných tokov a Zemplínskej šírave, kde sa v roku 2002 nariadili mimoriadne veterinárne opatrenia a zákaz lovu a konzumácie rýb. Možná kontaminácia prostredia s látkami PCB sa náhodne môže vyskytnúť aj v iných regiónoch napr. z kontaminovaných transformátorových olejov, alebo iných zdrojov o čom svedčia akcidentálne nálezy rezíduí napr. u srncov alebo inej zveri v relatívne čistých nepriemyselných oblastiach. Sú však len ojedinelé. Ryby intenzívne biokoncentrujú POPs z prostredia, v ktorom žijú (z vody a sedimentu). Vyššie obsahy polychlórovaných bifenylov vo vzorkách sladkovodných rýb nedravých sa vyskytli v Prešovskom a Košickom kraji. V ostatných krajoch Slovenskej republiky sa hodnoty pohybovali do 0,1 mg.kg 1 tuku okrem okresov Banská Bystrica a Šaľa, kde priemerné nálezy boli do 0,4 mg.kg 1 tuku, čo predstavuje hodnoty do 33% povolenej limitnej hodnoty. Vo východoslovenskom regióne bolo zistených 282 nadlimitných hodnôt (vyšších ako platné limitné obsahy Potravinového kódexu SR). Vzorky rýb pochádzali najmä z okresu Michalovce (ryby zo Zemplínskej šíravy), Poprad, Trebišov, Vranov nad Topľou, Humenné. Vyššie hladiny boli zaznamenané i v okresoch Stropkov, Sobrance a Trenčín. Vzorky rýb zo Zemplínskej šíravy vykazovali extrémne vysoké nálezy, čo predstavuje obsahy až do % povolenej limitnej hodnoty (vzorky odoberané ÚPKM Bratislava v rokoch ). Vyššie obsahy polychlórovaných bifenylov vo vzorkách škodnej srstnatej zveri sa vyskytli v Prešovskom a Košickom kraji. V ostatných krajoch Slovenskej republiky sa obsahy pohybovali do 0,75 mg.kg 1 tuku okrem okresu Martin a Dolný Kubín, kde priemerné nálezy predstavujú hodnoty do 117 % a 130 % povolenej limitnej hodnoty. Na tomto percente sa podieľala nadlimitná vzorka z obce Tučianske Jaseno. Vo východoslovenskom regióne bolo zistených deväť nadlimitných nálezov škodnej srstnatej zveri najmä z okresu Michalovce (z okolia Chemka Strážske), Humenné (obec Brekov), Poprad (obec Starý Smokovec), Kežmarok (obec Stará Lesná). Vzorky škodnej srstnatej zveri z oblasti Chemko Strážske vykazovali extrémne vysoké nálezy, čo predstavuje obsahy až do 9320% povolenej limitnej hodnoty (vzorky odoberané Regionálnou veterinárnou správou Michalovce v roku 1999). Obdobná situácia ako u škodnej srstnatej zveri je i u vzoriek vysokej zveri (jeleň, srnec). Nadlimitné vzorky boli zistené najmä v okresoch Michalovce a Vranov nad Topľou, kde bolo za celé sledované obdobie zistených trinásť vzoriek prekračujúcich platné limitné hodnoty. Vyššie priemerné nálezy boli zistené i v okrese Bytča. Vyhotovené mapky nálezov PCB v biote (ryby, vysoká zver) jednoznačne poukazujú na 229

231 kontamináciu prevažne východoslovenského regiónu. Prítomnosť vysokoperzistentných látok typu PCB sa však nevylučuje ani v iných oblastiach, ak došlo ku kontaminácii prostredia a zdrojov potravy zveri a rýb. Monitorovaniu PCB sa v Slovenskej republike venuje naďalej významná pozornosť. Biota predstavuje vhodný modelový objekt na získavanie informácií o nutnosti riadenia opatrení pre riešenie kontaminácie prostredia a ohrozovanie bezpečnosti potravín a potravinového reťazca. Záver Algrín, dieldrín a heptachlór sa v biote nachádzali vo veľmi malých koncentráciách. Vyššie priemerné nálezy mal hexachlorbenzén, kde sa v roku 2006 analyzovali dva nadlimitné nálezy v svalovine vysokej zveri ulovenej v okrese Nitra. Vysoké boli aj obsahy DDT vo vzorkách pochádzajúcich z Košického a Prešovského kraja hlavne u sladkovodných rýb. Extrémne zaťaženie bioty PCB stále pretrváva i napriek tomu, že ich výroba bola v Chemku Strážske zastavená pred vyše dvadsiatimi rokmi (1984). Vysoké nálezy sa nachádzali najmä u sladkovodných rýb, no nadlimitné vzorky sa našli aj u vysokej zvery, lovných vtákov, diviaka a srstnatej škodnej zveri zväčša vo východoslovenskom regióne. Od roku 2004 sa perzistentné organické látky sledujú pravidelne, čo prispieva k lepšiemu monitoringu životného prostredia Slovenskej republiky. Uvedenej problematike je potrebné aj naďalej venovať zvýšenú pozornosť. Iba cielenou redukciou chemických látok v poľnohospodárstve a životnom prostredí možno minimalizovať prienik POPs do potravinového reťazca a tým zabrániť ich dlhodobému a chronickému pôsobeniu na organizmus človeka. Literatúra Bíreš, J. a kol.: Monitoring poľovnej, voľne žijúcej zveri a rýb v Slovenskej republike. Správa za rok ŠVPS SR, Bratislava, 69 s. Drápal, J. a kol.: Kontaminace potravinového řetězce cizorodými látkami, situace v roce Informační bulletin č.1/2007, Státní veterinární správa České republiky,, 2007, 181 s. Hegyi, L., Mistrík, M.: Perzistentné organické polutanty a Slovensko. Spoločnosť priateľov Zeme, Košice, 2001, 95 s. Holoubek, I.: Hodnocení rizik persistentních organických polutantů v agrárním ekosystému. TOCOEN, 2003, 36 s. Košutzký, J., Šalgovičová, D.: Biota. Monitoring perzistentných organických látok v Slovenskej republike. Počiatočná pomoc SR pri plnení záväzkov vyplývajúcich zo Štokholmského dohovoru o POPs. Technická správa č. 2, časť 1, kapitola 10, s Petrlík, J., Havel, M., Přibylová, J.: Perzistentní organické látky jed v srdci Evropy. Ekologické sdružení Děti Země, 2001, 64 s. Kontaktná adresa: Ing. Zuzana Zmetáková, PhD., Výskumný ústav potravinársky, Priemyselná 4, Bratislava, tel.: 02/ , [email protected] 230

232 OBSAH Histologický obraz semenníkov japonských prepelíc vystavených dlhodobej hypodynamii 4 Histological picture of Japanese quail testes subjected to longterm hypodynamy 4 Almášiová, V., Cigánková, V., Holovská, K., Zibrín, M., *Massányi, P., ** Škrobánek P. 4 Obsah niektorých anorganických kontaminantov a vybrané mikrobiologické ukazovatele kvality mäsa pstruha dúhového (Oncorhynchus mykiss) z farmového chovu 8 Content of some inorganic pollutants and selected microbiological indicators ofmeat quality of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) from the fish farm 8 Andreji J., Stráňai I., Kačániová M*., Naď P**., Skalická M**. 8 Vplyv experimentálneho podania niklu na kvalitu žĺtka a hmotnosť vajec 11 Effect of experimental administration of nickel on egg weight and egg yolk quality of market eggs11 Arpášová, H., Massányi, P., Capcarová, M., Kolesárová, A., Kalafová, A., Schneidgenová, M., Lukáč, N. 11 Kontaminácia pôdy Cd, Pb, Zn a Co pri obci Hontianske Nemce 17 The soil contamination with Cd, Pb, Zn and Co by the Hontianske Nemce village 17 Árvay, J., Bajčan, D., Čéry, J., Musilová, J. 17 Zmeny zastúpenia jednotlivých štruktúr semenníka potkana po jednorazovej aplikácii niklu. 20 Changes of testicular structure rate after an intraperitoneal administration of nickel in rats. 20 Bábiková, L., Toman, R., Massányi, P., Hluchý, S., Golian, J., Lukáč, N. 20 Subchronické pôsobenie niklu na morfometrické ukazovatele semenníka potkana 23 Subchronic effect of nickel on the morphomeric parameters of the rat testis 23 Bábiková, L., Toman, R., Massányi, P., Lukáč, N., Hluchý, S., Golian, J. 23 Metalická záťaž aluviálnych pôd v Ipeľskom regióne 26 Metallic load of alluvial soils in region Ipeľ 26 Bajčan, D.; Árvay, J.; Harangozo, Ľ.; Čéry, J.; Timoracká, M. 26 Lipid metabolism changes resulted to liver steatosis: correlation with histological severity of disease in chronic hepatitis B and C. 30 Bartoš, V. 1,3, Krkoška, D. 2, Slávik, P. 3, Lauko, Ľ. 3, Szépeová, R Hepatic steatosis as a risk factor for regeneration liver potential: analysis of histological, biochemical and MR spectroscopical findings. 31 Bartoš, V. 1,4, Urdzik, J. 2, Bittšanský, M. 3, Slávik, P. 4, Fani, M. 2, Drgová, A Genetic diversity among horse populations using microsatellite markers 33 Burócziová M. 1, Říha J. 1, Židek R. 2, Trandžík J. 2, Jakabová D Stanovenie rizikových prvkov v pôdach lokalít Brekov a Dunajská Streda využitím selektívnej sekvenčnej extrakcie podľa Ziehena a Brümmera 37 The assessment of trace elements in soils of areas Brekov and Dunajská Streda with used sequential extraction by Ziehen and Brümmer 37 J. Čéry, T. Tóth, S. Melicháčová, M. Timoracká 37 Vplyv Niklu a Zinku na Numerické Zmeny Chromozómov Králika 41 Effect of Nickel and Zinc on Rabbit Numerical Chromosomal Abberations 41 Čurlej J 1,2., Massanyi P 2., Chrenek P Výskyt potenciálne toxinogénnych druhov rodu Aspergillus a jeho teleomorf v potravinárskej pšenici domáceho pôvodu v úrode Occurrence of potentially toxigenic species of genus Aspergillus and its teleomorphs in food wheat of Slovak origin harvested in Dovičičová, M., Tančinová, D., Labuda, R

233 Kvantitatívne hodnotenie obličiek Clethrionomys glareolus z ekosystémov v Novákoch 48 Quantitative analysis of kidneys of Clethrionomys glareolus from ecosystems in Novaky 48 1 Drábeková, J., 2 Jančová, A., 3 Massányi, P., 3 Lukáč, N. 48 Využití blízké infračervené reflektanční spektroskopie pro stanovení obsahu histaminu ve tvarůžcích 52 Application of nearinfrared reflectance spectroscopy to the analysis of histamine content in cake of cheese 52 Dračková, M., Standarová, E., Kordiovská, P., Borkovcová, I., Janštová, B., Navrátilová, P., Vorlová, L., Bartáková, K. 52 Výskyt toxinogénnych druhov rodu Penicillium v potravinárskej pšenici 56 Occurrence of toxigenic Penicillium species in wheat 56 Felšöciová, S., Labuda, R., Tančinová, D., 56 Does ultraviolet radiation influence on heavy metal bioavailability in aquatic ecosystems? 60 Formicki G., Stawarz R., Zamachowski W., Zakrzewski M., Łaciak T. 60 Kontaminácia vlhkého kukuričného zrna mykotoxínmi 63 Natural contamination with mycotoxins in high moisture corn 63 1 Gálik, B., 1 Bíro, D., 1 Juráček, M., 1 Šimko, M., 2 Golian, J., 1 Michálková, J. 63 Mikrobiologická kontrola hygieny a sanitácie pri spracovaní jatočnej hydiny 68 Microbial control of hygiene and sanitation in poultry plant. 68 Golian, J., Čapla,., Sokol, J., Zajác, P., 68 Vplyv kadmia na celkový obsah polyfenolických látok v slnečnici a horčici. 71 The influence of cadmium on total polyphenolic substances content 71 Harangozo, Ľ., Árvay, J., 71 Mäso kačice divej (Anas platyrhynchos) ako doplnok vo výžive ľudí 74 Meat of wild duck (Anas platyrhynchos) as supplement in the people nutrition 74 Haščík, P, Gašparík, J., Čuboň, J., Vladárová, D., Kulíšek, V., Kačániová, M., Bobko, M. 74 Colonic Health and Short Chain Fatty Acids 78 Hijová, E., Chmelárová, A. 78 The influence of low levels of protein and sex on some carcass parameters and nutrient compositions in broilers meat 82 Horniaková, E., Abas Kamaran A. 82 Aplikácia homeopatík ako prevencia diarhoického syndrómu u odstavčiat 87 Application of homeopathics as prevention against diarrhoic syndrome in weaned piglets 87 Húska M., Dudríková E., Buleca J. 87 Vplyv emisií na zdravie oviec v Spišskom regióne 91 Emission influence to health of sheep in Spiš region 91 Húska M., Bíreš J., Dudríková E., Buleca J. 91 Porovnanie vplyvu magnetického poľa s rôznou dĺžkou pôsobenia s vplyvom magnetického poľa s rôznou indukciou počas inkubácie násadových vajec na liahnutie kurčiat hybrida ISA 715 Vedette. 94 The comparison of influence of the magnetic field with different length effect with influence of the megnetic field with different induction during incubation of hatched eggs for hatching of hybrid ISA 715 Vedette 94 Jedlička, J. 94 Obsah minerálnych látok v mäse králikov po experimentálnom podaní niklu a zinku

234 152 UPU Beňačka, UPU Lovásová, 102 UTP UPU Lukačínová, UTP UTP UPỤ UTP 138 VII Rizikové faktory potravového reťazca, , Nitra TUThe level of mineral substances in the meat of rabbit after an experimental nickel and zinc administrationut TUKalafová, A.UPU UPU, Kolesárová A.UPU UPU, Zaujec, K.UPU UPU, Mojto J.UPU UPU, Massányi, P.UPU UPU, Lukáč, N.UPU UPU, Kováčik, J.UPU UPU, 1 1 Schneidgenová, M.UPU UPU, Čupka, P.UPU TUA novel functional food candidate, the lycopene containing egg*ut 102 TUKerti A., Szabó Cs., Bárdos L.UT TUEffect of apple cider vinegar on immune status of chickenut 105 TUKiss, Zs., Szabó, Cs., Lakner, H., Gregosits, B., Bárdos, L.UT TUAnalýza vplyvu prídavku škoricovej silice na kvalitu mäsa kurčiatut 109 TUAnalysis of influence cinnamon essential oil on quality chicken meatut 109 TULagin, L. Bobko, M. Ducková, V.UT TUSelected metabolic indices in sow s blood after probiotic administrationut 113 TULink, R., Kováč, G.,UT 113 TUPerformance of weaned pigs after administration of BioPlus 2BUT TULink, R., Kováč, G.UT TUNecrotická enteritída a ukazovatele oxidačného stresu u kurčiatut 118 TUNecrotic enteritis and oxidative stress parameters in chickensut TULovásová, E., ŠkardováUPU UPU, I., SesztákováUPU UPU, E.,Ništiar, F.UT TUStructurar changes of Hamster Testes after experimental Cobalt AdministrationUT 121 1* TULukacUPU UPU, N., MassanyiUPU UPU, P., ZakrewskiUPU UPU, M., TomanUPU UPU, R., CigankovaUPU, StawarzUPU UPU, R., FormickiUPU UPU, G., 4 4 SomosyUPU UPU, Z., ForgacsUPU UPU, Zs.UT 121 TUReprodukčné parametre počas multigeneračnej intoxikácii ťažkými kovmi u potkanovut 126 TUReproduction parameters during multigeneration intoxication with heavy metals in ratsut TULukačínováUPU UPU, A., BeňačkaUPU UPU, R., LovásováUPU UPU, E., HijováUPU UPU, E., NištiarUPU UPU, F.UT 126 TUViscoelastic properties of processed cheese as a function of pectin concentrationut 130 TUMacků, I., Buňka, F., Pavlínek, V., Kráčmar, S., Hrabě, J.UT TUŠtúdia výskytu potravinových alergií v regióne Hornej NitryUT 134 TUStudy and occurence of food allergy in region Horna NitraUT 134 TUMarcinková, M.UT TUHistologická analýza kostného tkaniva králikov po aplikácii Ni a ZnUT TUHistological analysis of rabbit s bone tissue after administration of Ni and ZnUT TUMartiniaková, M.UPU UPU, Omelka, R.UPU UPU, Grosskopf, B.UPU UPU, Chovancová, H.UPU UPU, Chrenek, P.UPU TUThe Content of Mercury in Selected Samples of Freshwater Algae and SeaweedsUT TUMišurcová, L.UPU UPU, Stratilová, I.UPU UPU, Škrovánková, S.UPU UPU, Kráčmar, S.UPU TUVýskyt reziduí tetracyklinových antibiotik v syrovém kravském mléceut 145 TUOccurrence of tetracycline antibiotics in raw cowۥs milkut 145 TUNavrátilová P., Borkovcová I., Dračková M., Janštová B., Vorlová L.UT TUTetrahymena pyriformis ako biosenzor na stanovenie toxických organofosfátovut TUNištiar, F.,UPU R.,UPU E.,UPU A.UPU TURisk and Beneficial uses of Sea Algae (Ulva lactuca Linnaeus) in Animal FeedstuffsUT 152 TUOkab, A. B.UT TUObsah jódu v surovom kravskom mlieku v niektorých regiónoch SlovenskaUT 159 TUIodine concentration in raw cow milk in some Slovakian regionsut 159 TUPaulíková, I., Seidel, H., Nagy, O., Kováč, G., Reichel, P., Konvičná, J.UT TUVplyv leptínového génu na vybrané jatočné ukazovatele hovädzieho dobytkaut 162 1, 4 233

235 187 UPU V.UT UTP UTP VII Rizikové faktory potravového reťazca, , Nitra TUThe influence of leptin gene to selected butcher indicators of beefcattleut 162 TUPavličová, S., Kačániová, M., Angelovičová, M.UT TUVzťah medzi leptínovým génom a živou hmotnosťou jednotlivých plemien ošípanýchut 167 TURelation between leptin gene and body weight in selected pigs breedsut 167 TUPavličová, S., Kačániová, M., Angelovičová, M.UT TUThe influence the additive on rheology of the wheat flour doughut TUPečivová UPU UPUP, HraběUPU UPU,J., Pavlínek UPU TUVplyv odrody na obsah vitamínu C v ľuľku zemiakovom (Solanum tuberosum L.)UT 172 TUThe variety influence on vitamin C content in potatoe (Solanum tuberosum L.)UT 172 TUPeltznerová, L., Musilová, J., Harangozo, ĽUT TUSenzitivita druhov skupiny Alternaria infectoria na cykloheximidut 176 TUSensitivity of Alternaria infectoria on cycloheximideut 176 TUPiovarčiová, Z., Labuda, R., Tančinová, D.UT TUGlazúrovanie rýbut 179 TUGlazing of fishut 179 TUPopelka, P., Nagy, J., Žoldoš, P.*, Marcinčák, S.UT TUParametry bourání jatečných těl skotu v rámci tříd zmasilosti SEUROP.UT 182 TUCutting parameters of carcasses in the SEUROP meatiness classes.ut 182 TUŘíha J., Homola M., Bjelka M., Burócziová M.UT TUVliv stupňovaných dávek půdního manganu a zinku na jejich obsah a distribuci v rostlinách rajčatut 187 TUEffect of gradational amounts of soil manganese and zinc on their content and distribution in tomato plantsut 187 TURop, O., Valášek, P., Kráčmar, S.UT TUHodnotenie motility a koncentrácie spermií králikov po experimentálnom podaní niklu a zinkuut 190 TUMotility and concentration rabbit spermatozoa Evaluation after experimental nickel and zink administrationut TUSchneidgenová, M., Kalafová, A., Chrenek, P.UPU UPU, Massányi, P., Lukáč, N.UT TUSignálné látky sprostredkujúce vplyv výživy na funkcie ovárií a ich predispozíciu k vývinu rakovinyut 194 TUSignalling substances mediating effect of nutrition on ovarian functions and their predisposition to cancer developmentut 194 TUSirotkin, A., (1,2) Švarcová, O.,(2), Rafay, J.,(1) Chrastinová, Ľ, (1), Makerevič A., (1), Grossmann, R., (3), Benčo, A., (2), Pavlova, S., (2), Lauková, M., (4), Kotwica, J.,(5), Ovcharenko, D., (6), Mlynček, M., (7), Bulla, J. (4)UT 194 TUVplyv CHRÓMU a kadmia na kvalitu vajec u Japonských prepelícut 197 TUInfluence of CHROMIUM AND CADMIUM on quality of Japanese quail eggsut 197 TUSkalická, M., Naď, P., Demeterová, M., Koréneková, B.UT TUepidemiologická štúdia obsahu telesného tuku v organizme v rôznych vekových skupinách ľudí a riziko jeho vysokého podieluut TUŠramková, K.UPU UPU, Kolesárová, A.UPU UPU, Mrázová, J.UPU UPU, Ryšavá, L.UPU TUCholesterolémia faktor civilizačných ochorení ovplyvniteľný výživou a riziko jeho nepriaznivých hodnôtut TUŠramková, K.UPU UPU, Chlebo, P.UPU UPU, Dudriková, E.UPU TUVyužitím fytoterapeutík možno prispieť ochrane biosféry a klímyut 208 TUse of phytotherapeutics may improve the biosphere & ClimAteUT

236 TPU TPU UPU Jakabová, UTP VII Rizikové faktory potravového reťazca, , Nitra UPUŠutiak, V., UPU UPUŠutiaková, I., UPU UPUBenhammou, N., UPU UPUSkalka, J., UPU UPUSabová, L.UT 1 TUVyšetrenie frekvencie mikrojadier v periférnych lymfocytoch oviec na odhad genotoxického rizika v potravovom reťazciut 212 TUMeasurment of micronuclei freqency in sheep peripheral lymfocytes for genotoxic risk assessment of agens fromfood chainut 212 TUŠutiak, V., *Šutiaková, I., Kovalkovičová, N., Legáth, J. Pistl, J.UT TUMožnosti využívania Imela bieleho (V. album) vo veterinárnej praxi a niektoré jeho črtyut 215 TUPossibilities for the use of V. albium in veterinary practice and certain its characteristicsut UPUŠutiak, V., UPU UPUBenhammou, N., UPU UPUŠutiaková, I., UPU UPUŠutiak, R.UT TUAspergillus sekcia flavi potenciálny producent mykotoxínovut 219 TUAspergillus section flavi potential producents of mycotoxinsut 219 TUTančinová, D. Dovičičová, M. Labuda, R.UT TUBiodiversity variation in the five Slovak cattle breeds by microsatellite dataut TUŽidek, R.,UPU D.UPU UPU, Trandžík, J.UPU UPU, Rajtárová, KUPU UPU, Massányi, P.UPU UPU, Jakab F.UPU UPU, Kozlík P UPU UPU, Buleca 4 5 UPU, Martvoňová Jr. J.UPU M.UPU TUKontaminácia divožijúcej zveri perzistentnými organickými látkami v Slovenskej republikeut 226 TUContamination of the wild animals with persistent organic pollutants in the Slovak RepublicUT 226 TUZmetáková, Z., Šalgovičová, D.UT 235

237 UPOĎAKOVANIE UKonferencia bola podporená prostredníctvom projektov UAPVV UVEGA 1/2417/05 Ďakujeme našim sponzorom za pomoc pri organizovaní seminára. Taktiež ďakujeme pracovníčkam Vydavateľstva pri SPU v Nitre za pomoc pri zostavovaní a vydaní zborníka.