SLOVENSKÁ POĽNOHOSPODÁRSKA UNIVERZITA V NITRE

Transcription

1 SLOVENSKÁ POĽNOHOSPODÁRSKA UNIVERZITA V NITRE FAKULTA BIOTECHNOLÓGIE A POTRAVINÁRSTVA KATEDRA FYZIOLÓGIE ŽIVOČÍCHOV VI. CELOSLOVENSKÝ SEMINÁR Z FYZIOLÓGIE ŽIVOČÍCHOV Júna 2005 Nitra, Slovenská republika

2 SLOVENSKÁ POĽNOHOSPODÁRSKA UNIVERZITA V NITRE FAKULTA BIOTECHNOLÓGIE A POTRAVINÁRSTVA KATEDRA FYZIOLÓGIE ŽIVOČÍCHOV ZBORNÍK z vedeckého seminára s medzinárodnou účasťou VI. CELOSLOVENSKÝ SEMINÁR Z FYZIOLÓGIE ŽIVOČÍCHOV Júna 2005 Nitra, Slovenská republika

3 Redakčná rada: Ing. Marcela Kramárová, PhD doc. MVDr. Peter Massányi,PhD. Ing. Norbert Lukáč, PhD. Schválil rektor Slovenskej poľnohospodárskej univerzity v Nitre dňa ako zborník z vedeckého seminára s medzinárodnou účasťou ISBN

4 Vedecký výbor: prof. László Bárdos, DVM, PhD. Szent István University, Budapest Dr. Robert Stawarz Pedagogical University, Krakow prof. Ing. Jozef Bulla, DrSc. SPU, FBP, KFŽ, Nitra, SR prof. MVDr. Juraj Pivko, DrSc. SPU, FBP, KFŽ, Nitra, SR prof. Ing. Jaroslav Kováčik, PhD. SPU, FBP, KFŽ, Nitra, SR prof. RNDr. Michal Zeman, DrSc. PrF. Uk Bratislava prof. MVDr. Imrich Maraček, DrSc. UVL Košice prof. Ing. Imrich Beseda, DrSc. TU Zvolen doc. Ing. Miroslav Valent, PhD. WVU, USA MVDr. Juraj Koppel, DrSc. SAV, UFHZ, Košice Organizačný výbor: prof. Ing. Jaroslav Kováčik, PhD. doc. MVDr. Peter Massányi, PhD. Ing. Marcela Kramárová, PhD. Ing. Jiřina Zemanová Ing. Peter Čupka Bc. Monika Schneidgenová Alena Balážová Viera Bösel Recenzenti: prof. Ing. Jaroslav Kováčik, PhD. prof. MVDr. Juraj Pivko, DrSc. doc. MVDr. Peter Massányi, PhD. doc. Ing. Jozef Golian, Dr. Ing. Jozef Trandžík, PhD. RNDr. Alena Jančová, PhD. doc. Ing. Jaroslav Slamečka, PhD.

5 Názov publikácie: VI. Celoslovenský seminár z fyziológie živočíchov Druh publikácie: Zborník vedeckých prác Autori publikácie: Kolektív autorov Zborník zostavili: Ing. Marcela Kramárová, PhD. doc. MVDr. Peter Massányi, PhD. Ing. Norbert Lukáč, PhD. Vydavateľ: Slovenská poľnohospodárska univerzita v Nitre Náklad: 80 ks Rok vydania: 2005 Tlač: Vydavateľské a edičné stredisko SPU v Nitre Počet strán: 350 ISBN

6 Vážení účastníci, milí priatelia dovoľujem si Vás privítať na už tradičnom VI. Celoslovenskom seminári z fyziológie živočíchov s medzinárodnou účasťou. Tak ako po iné roky aj teraz ho organizačne zabezpečuje Katedra fyziológie živočíchov, Fakulty biotechnológie a potravinárstva. Cieľom seminára je na základe vzájomnej previazanosti medzi pracoviskami vedeckých ústavov a univerzít u nás aj v zahraničí, uplatniť možnosti vzájomnej diskusie, sprostredkovania najnovších informácií z oblasti fyziológie živočíchov, bližšieho poznania a nadviazania ďalších pracovných kontaktov. Vážime si, že pozvanie do Nitry prijali kolegovia z univerzít a vedecko-výskumných inštitúcií, naši poprední odborníci v oblasti fyziológie živočíchov. Osobitne sme potešení účasťou zahraničných hostí, s ktorými máme dlhoročné pracovné kontakty. Želáme účastníkom vedeckého seminára tvorivé prostredie pre prezentáciu svojich príspevkov, veľa podnetných myšlienok a príjemný pobyt na Slovenskej poľnohospodárskej univerzite v Nitre. Vyslovujeme poďakovanie členom vedeckého a organizačného výboru za ich významný podiel, spoluprácu pri organizovaní tohto seminára a všetkým účastníkom vedeckého podujatia za ich aktívnu účasť na ňom. prof. Ing. Jaroslav Kováčik, PhD. za organizačný výbor

7 DOMINANTNÉ PREOVULAČNÉ A ATRETICKÉ TERCIÁRNE FOLIKULY VAJEČNÍKOV OVIEC PO ASISTOVANOM ESTRE A OVULÁCII. DOMINANT PREOVULATORY AND ATRETIC TERTIARY FOLLICLES IN EWES OVARY AFTER OESTRUS SYNCHRONIZATION AND INDUCTION OF OVULATION. Antal J., Maraček I., Halagan J., Katedra normálnej anatómie, histológie a fyziológie, Ústav fyziológie, Univerzita veterinárskeho lekárstva, Košice. Abstract This work was focused on observation and evaluation of the surface tertiary follicles based on simultaneous use of the biometrical, parameter and determination of the oestradiol-17β (E 2 ) and progesterone (P 4 ) concentration in the follicular fluid of the largest follicles from ovaries of Slovak Tsigai ewes after oestrus synchronization and stimulation of the ovulation rate (OR). It can be occluded from performed observations the oestradiol-17β levels in follicular fluid of the selected dominant tertiary follicles are increased significantly as compared with the large atretic follicles (P<0.001). Úvod Vaječník dospelých oviec obsahuje primordiálnych folikulov, ktoré sú tzv. zásobárňou folikulov. Z tohto množstva počne svoj rast asi pod vplyvom FSH a na povrchu sa objavia už len v počte folikulov (1,2,3).Dominantné preovulačné alebo antrálne terciárne folikuly sú výsledkom procesu dominancie v terminálnej fáze selekcie terciárnych folikulov vaječníkov. Tieto na jednej strane zasahujú do kôry vaječníka a na strane druhej prominujú na jej povrch. Na priebeh procesu dominancie v prirodzenej aj asistovanej ruji oviec vplývajú viaceré faktory : 1./kondícia a hmotnosť tela, 2./ sezóna, 3./ vek, 4./ plemenná príslušnosť, 5./ hormonálne ošetrenie, 6./ počet CL z predošlého estrálneho cyklu, 7./ koncentrácia leptínu (7). Práca bola zameraná na sledovanie dominantných preovulačných a atretických folikulov bahníc slovenská cigája v asistovanom estre a stimulácii ovulačného pomeru (OR ovulation rate). Materiál a metodika Boli zaradené bahnice plemena slovenská cigája (SC) vo veku 3-7 rokov. Zvieratá boli držané v podmienkach úžitkového chovu. V prvej 1

8 kontrolnej skupine bolo 6 bahníc v luteálnej fáze ( deň ) estrálneho cyklu v jesennom estrickom období pripúšťania. V druhej skupine 5 oviec bolo v estrickom období synchronizovaných metódou skrátenia pohlavného cyklu i. m. dávkou 125µg kloprostenolu. V tretej skupine u 5 bahníc sme indukovali estrus 40 mg fluórogestonacetátu (FGA) v pošvovom tampóne v mimo sezónnom období (anestrus) v poslednej dekáde apríla. Po vysadení tampónu sme i. m. podali 500 M. J. ecg (sérový extrahypofyzárny gonadotropín). V štvrtej skupine bolo 6 bahníc ošetrených FGA ako v tretej skupine ale po vysadení tampónu im bolo i. m. podané ecg v dávke 1000 M..J. Vaječníky sa po excidácii fixovali v 10% formalíne. Po fixácii sa merala dĺžka (najdlhšia pozdĺžna os), šírka (na pozdĺžnu os kolmo v horizontálnej rovine a výška (na pozdĺžnu os kolmo vo vertikálnej rovine) posuvným meradlom. Na povrchu sme zmerali veľkosti a zistili počet terciárnych folikulov, ktoré sme zatriedili podľa veľkostí do jednotlivých kategórií. Vaječníky boli zaliate do parafínu a štandardne histologicky spracované, ako uvádzame inde (4). Podľa histologického nálezu boli diferencované dominantné ovulácie schopné (DOF) a atretické (AF) povrchové terciárne folikuly. Zo štvrtej skupiny boli vaječníky použité pre aspiráciu tekutiny z veľkých povrchových folikulov pre stanovenie koncentrácie 17β-estradiolu (E 2 ) a progesterónu (P 4 ), ako to uvádzame inde (5 ). Zo získaných hodnôt sme vypočítali priemernú hodnotu a smerodajnú odchýlku (δ n-1 ) a štatisticky analyzovali Studentovým t- testom. Výsledky a diskusia Výsledky sledovania a hodnotenia veľkostných kategórií povrchových terciárnych folikulov po nábore a nástupe selekcie s uvedením veľkosti najväčšieho folikulu sú zhrnuté v tabuľke 1. Na obrázku 1 je grafické znázornenie signifikantné zvýšenie koncentrácie 17β-estradiolu (E 2 ) v tekutine dominantných ovulácie schopných folikulov (DOF) oproti atretickým folikulom (AF). Podobne na obr. 2 je vidieť štatisticky nepreukazný rozdiel v koncentrácii progesterónu (P 4 ) v tekutine folikulov DOF v porovnaní s AF. Po stimulácii výskytu vyššieho OR podaním 1000 M.J. ecg v čase vysadenia tampónov FGA zaznamenaná signifigantne zvýšená koncentrácia 17β-estradiolu v tekutine dominantných ovulácie schopných terciárnych folikulov na povrchu vaječníka podporuje literárne údaje, že podané prípravky na báze gonadotropínov podporujú vývoj ovulačných 2

9 Tabuľka 1 Povrchové terciárne folikuly vaječníkov plemena cigája v luteálnej fáze a po asistovanom estre synchronizáciou skrátením, ako aj s predĺžením pohlavného cyklu. Skupina Počet zvier. Laparotómia Folikuly F<3 mm F>3mm Σ Max F(mm) 5 14,8 ± 3,5 9,5 ± 2,6 3,8 ± 1,1 8,4 Luteálna fáza ( deň) 6 14, 9 ± 3,1 10,3 ± 2,1 2,7 ± 1,2 5,5 cyklu Sezóna pripúšťania 48 h po PGF 2α Mimo sezóny FGA+500MJ ecg Mimo sezóny FGA MJ e CG 5 12,6 ± 2,6 8,4 ± 1,8 4,2 ± 1,7 7,8 6 16,2 ± 3,8 8,2 ± 2,2 6,9 ± 1,8 8,8 folikulov v procese dominancie v terminálnej fáze výberu terciárnych folikulov v čase estru (5,6,7). Obr.1. Porovnáva hodnotu E 2 u DOPR a ATR folikulu. ecg Obr.2. Porovnáva hodnotu P u DOPR a ATR folikulu. ecg nmol/l (tisíc) E nmol/l P DOF 1 AF 20 0 DOF AF 3

10 Záver Výsledky poukazujú na to, že pri synchronizácii ruje oviec v jesennom estrickom období pripúšťania cloprostenol okrem luteolýzy vplýva aj na výber dominantných terciárnych folikulov. V mimosezónnom období anestrie indukcia ruje fluórogestonacetátom a po jeho vysadení podaný ecg pravdepodobne rozhodujúcim spôsobom ovplyvňuje proces dominancie v terminálnej fáze výberu dominantných ovulácie schopných terciárnych folikulov a tým sa podiela na zvyšovaní OR. Literatúra 1. Cahill, L.P., Mariana, J.C., Mauléon, F. 1979: Total follicular populations in ewes of high and low ovulation rates. J. Reprod. Fert., 55, Driancourt, M.A., Gibson, W.R., Cahill, L.P. 1985: Follicular dynamics throughout the oestrus cycle in sheep. Reprod. Nutr. Dev., 25, Driancourt, M.A. 1994,: Lack of between-follicle interactions in the sheep ovary Reprod. Nutr. Dev., 34, Maraček, I., Elečko, J., Choma, J., Bekeová, E., 1983: Folikulárny systém vaječníkov kráv posynchronizácii ruje luteolytickým pôsobením cloprostenolu. Vet. Med. 28: Maraček, I., Krajničáková, M., Kostecký, M., Gréserová, G., Valocký, I. 2002: Tertiary follicular growth wave dynamics after oestrus synchronization and superovulation. Acta Vet. Brno, 71, Mc Natty, K.P., Gibb, M., Dobson, C., Ball, K., Coster, J.,Heath, D., Thurley, D.C. 1982: Preovulatory follicular development in sheep treated with PMSG and/or prostaglandin. J. Reprod. Fert., 65, Vlčková, R., Lacková, Z., Antal, J., Maraček, I. 2005: Povrchové terciárne folikuly ovárií bahníc po odstave jahniat a ich zmeny počas indukovaného estru v riadenej reprodukcii. In: Zborník prác a abstraktov prezentovaných na 81. Fyziologických dňoch konaných februára 2005 v Košiciach, Ed,. P Švorc, Vydal: ZZ design studio Ing, Zvonimír Záviš, Páca bola vytvorená pri riešení grantu VEGA 1/0612/03. 4

11 VPLYV HORMÓNOV GHRELÍNU A LEPTÍNU NA EXPRESIU TRANSKRIPČNÝCH FAKTOROV CREB, STAT-1, APOPTÓZU, PROLIFERÁCIU A SEKREČNÚ AKTIVITU U KULTIVOVANÝCH OVARIÁLNYCH BUNIEK OŠÍPANÝCH INFLUENCE OF HORMONES GHRELIN AND LEPTIN ON THE EXPRESION OF TRANSKRIPTION FACTORS CREB,STAT, APOPTOSIS, PROLIFERATION AND SECRETORY AKTIVITY IN CULTURED PORCINE OVARIAN CELLS Benčo, A., Sirotkin A.V., Pavlová S., Alžbeta Tandlmajerová, Monika Mesárošová Abstract The goal of our experimental work was to study an effect of hormones ghrelin and leptin on proliferation (expression PCNA, cyclin B- 1,MAPK/ERK1,2 markers of proliferation), apoptosis (expression of apoptosis related peptides ASK-1,p53, bax), antiapoptotic peptide Bcl-2, transcription factors CREB and STAT-1 and release of progesterone in cultured porcine ovarian granulosa cells. It was observed, that leptin increases the percentage of cells containing PCNA, MAPK/ERK1,2, cyclinb-1 ASK-1, p53, bax, Bcl-2, STAT-1 and decreased the proportion of cells containing CREB but not affects progesterone secretion. Ghrelin increased the expression of PCNA, MAPK/ERK1,2, cyclin B-1, ASK-1, p53, bax, STAT-1 and progesterone secretion, decreased the percentage of cells containing Bcl-2 and CREB. The obtained results suggest that both leptin and ghrelin are involved in control of porcine ovarian functions: these hormones can be activators of proliferation, apoptosis and stimulators of progesteron secretion. Furthermore, the influence of these hormones on CREB-1, STAT-1 indicates, that these transcription factors could be potential mediator of their action on the ovary. Úvod Hormóny leptín a ghrelín majú potenciál regulovať funkcie buniek reprodukčných a nereprodukčných sústav. Leptín môže stimulovať proliferáciu GH3 buniek u človeka (Liu a kol.2005), stimuluje apoptózu osteoblastov u ľudí (Soroceanu kol. 2004) a je schopný stimulovať a transkripčný faktor CREB-1 v ovariálnych bunkách králikov. (Pivko 2003) Ghrelín stimuluje priliferáciu Leydigovych buniek človeka (Tena-Sempere 2005), zvyšuje apoptózu v ľudských bunkách NCL-H295 a SW-13 (Belloni 5

12 a kol.2004 ) Nie je známe cez ktoré transkripčné faktory ghrelín ovplyvňuje rôzne typy buniek. Vplyv ghrelínu a leptínu na reprodukčné funkcie ošípaných a iných cicavcov nie je preskúmaný. Neznáme sú aj vnutrobunkové sprostredkovatele ich účinku (proteínkinázy a transkripčné faktory). Cieľom našej práce bolo preskúmať vplyv hormónov leptínu a ghrelínu na funkcie ovariálnych buniek ich proliferáciu, apoptózu, sekrečnú aktivitu a vnútrobunkové signálne látky. Konkrétne sme sledovali vplyv leptínu a ghrelínu na akumuláciu proliferačných peptídov (PCNA a cyklínu B-1), kinázy MAPK/ERK1,2, apoptotických peptidov (ASK-1, p53, bax) antiapoptotického peptidu Bcl-2 transkripčných faktorov CREB a STAT-1 a sekréciu progesterónu v kultivovaných ovariálnych bunkách ošípaných. Materiál a metodika Ako materiál boli použité granulózne bunky z ovárii ošípaných plemena biela ušľachtilá. Ošípané vo veku dní boli na konci puberty pred začiatkom pohlavnej cykliky. Granulózne bunky aspirované z folikulov boli kultivované a spracované v kultivačných platničkách - chamber-slides (Nange Nunc International, Naperville,USA ) podľa Sirotkin a kol., (2003). Po vytvorení monovrstvy k jednej skupine buniek sme pridávali hormón leptín (Sigma, St.Louis,USA) v koncentráciách 0, 1, 10, 100 ng / ml. Ku druhej skupine sme pridávali ghrelín (Peptides International, Louiseville, USA) v dávkach 0, 1, 10, 100 ng /ml. Po pridaní prídavkov sme bunky kultivovali 2 dni. Po kultivácii boli bunky zafixované v 4 % paraformaldehyde pre imunocytochémiu. Médium sa podrobilo RIA na prítomnosť progesterónu. Prítomnosť jednotlivých markerov v bunkách bola analyzovaná imunocytochemickou metódou (Osborn a Isenberg 1994, Sirotkin a kol., (2003). Progesterón bol analyzovaný pomocou RIA súpravy firmy (DSL, Webster, USA) podľa návodu výrobcu. Preukaznosť rozdielov s kontrolou (bunky bez prídavkov) sme analyzovali Paired t- testom pomocou štatistického softwaru Sigma Plot 8.0 (Jandel, Corte Madera, USA). VÝSLEDKY Zistili sme, že určité množstvo buniek po kultivácii obsahovalo PCNA, cyklín B-1, MAPK/ERK1,2, ASK-1, p53, bax, bcl-2, CREB, STAT-1 a progesterón. Leptín zvyšoval percento granulóznych buniek obsahujúcich PCNA, cyklín B-1, MAPK/ERK1,2, ASK-1, p53, bax, bcl-2 a STAT-1, znižoval percento buniek obsahujúcich CREB a neovplyvňoval sekréciu progesterónu. Ghrelín zvyšoval percento buniek obsahujúcich PCNA, cyklín B-1, MAPK/ERK1,2 ASK-1, p53, bax, STAT-1 a sekréciu 6

13 progesterónu a znižoval percento buniek obsahujúcich bcl-2 a CREB. Číselné hodnoty sú úvedené v tabuľke č.1 a 2. Vplyvy hormónov na PCNA a p53 sú znázornené na Obr.č.1,2. Tabuľka č.1 Vplyv leptínu a ghrelínu na % buniek obsahujúcich markery proliferácie a apoptózy % buniek obsahujúcich : Prídavky / dávka ng / ml Leptín Ghrelín PCNA 35,6±2,98 (1000) 52,1±2,12 (1000) 74,6±2,17 (1000) 83,6±2,17 (1000) 72,7±3,76 (1000) 83,3±1,91 (1000) 83,3±2,61 (830) 87,10±2,33 (1000) MAPK/ER K1,2 55,8±1,35 (1000) 58,7±1,56 (1000) 55,2±2,20 (1000) 61,9±1,29 (1000) 48,50±1,25 (1000) 65,0±1,09 (1000) 61,1±1,23 (1000) 56,0±1,24 (1000) CyklínB-1 ASK-1 P53 51,8±2,04 (1000) 53,9±2,42 (870) 54,00±2,8 (1000) 60,1±3,8 (920) 61,8±3,12 (1000) 64,8±4,26 (1000) 66,8±3,72 (1000) ±3,4 (1000) 50,7±1,94 (1000) 53,9±1,5 (1000) 53,5±2,27 ( ,1±1,08 (1000) 58,11± 2,48 (1000) 63,1±3,1 (1000) 66,3±2,23 (1000) 67,1±2,5 (1000) 26,31±1, 8 (1000) 41±2,26 (1000) 49,9±2,8 8 (1000) 55,64±3, 97 ( ,7±3,6 2 (1000) 45,4±2,1 8 (1000) 53,6±3,1 6 (830) 57,3±3,4 9 (1000) 7

14 Tabuľka č.2 Vplyv leptínu a ghrelínu na markery apoptózy, transkripčné faktory a vylučovanie progesterónu % buniek obsahujúcich : Prídavky / dávka ng / ml BAX Bcl-2 CREB STAT-1 progesterón 0 44,±1,5 49,5±0,93 93,40±1,20 30,6±2,26 12,34±0,63 (1000 (1000) (1000) (1000) (1000) 1 50,8±2,6 53,3±1,04 88,80±1,80 39,6±2,08 11,94±1,20 (1000) (1000) (870) (1000) (1000) Leptín 10 56,3±2,36 55,4±0,85 82,00±1,46 40±3,09 11,98±0,90 (950) (950) (1000) (1000) (1000) ,1±1,56 60,5±1,00 76,50±1,07 48±0,35 11,43±0,35 Ghrelín % buniek obsahujúcich p (1000) 61,1±1,05 (1000) 62,6±1,67 (1000) 67,5±1,72 (1000) 67,7±1,84 (920) Pridaná dávka ghrelinu a leptinu ( ng /ml média) (1000) 56,1±1,28 (1000) 53,1±1,18 (1000) 50,1±0,77 (1000) 55,0±1,26 (920) (920) 72,20±1,34 (1000) 47,20±20 (1000) 32,60±1,17 0 (1000) (1000) 51±2,47 (1000) 49,7±3,19 (1000) 54,6±2,8 (1000) 57,5±3,99 (1000) (1000) 11,16±0,86 (1000) 12,52±2,55 (1000) 9,70±0,61 (1000) 12,08±1,02 ( signifikantné rozdiely v porovnaní s kontrolou (bez prídavkov) (p<0,05). Hodnoty ukazujú priemer(% buniek obsahujúcich antigén) smerodajnú odchýlku Údaje v zátvorke predstavujú počet analyzovaných buniek Obr.č.1Vplyv ghrelínu a leptínu Obr.č.2 70 Vplyv ghrelínu a leptínu na % 60 granulóznych buniek na % granulóznych buniek obsahujúcich p53 50 obsahujúcich PCNA - signifikantné rozdiely v porovnaní s kontrolou (bez prídavkov) (p<0,05) Hodnoty ukazujú priemer (% buniek obsahujúcich antigén) smerodajnú odchýlku * 8 % buniek obsahujúcich PCNA * * * * * * Pridaná dávka ghrelinu a leptinu (ng /ml média)

15 Diskusia Zistili sme ako prví, že leptín zvyšuje proliferáciu ovariálnych buniek (% buniek obsahujúcich PCNA, MAPK/ERK1,2 cyklín B-1). Naše výsledky sa zhodujú s pozorovaniami Liu a kol.(2005), že leptín stimuluje proliferáciu GH3 buniek u človeka.zistili sme, že leptín stimuluje apoptózu, nakoľko zvyšuje % buniek obsahujúcich ASK-1, p53, bax v granulóznych bunkách vaječníkov ošípaných. Podobné výsledky dosiahol Soroceanu a kol.(2004) pri pozorovaní vplyvu leptínu na osteoblasty. Naše pozorovania sú prvým svedectvom o možnosti stimulačného vplyvu leptínu na proliferáciu a apoptózu ovariálnych buniek. V našich pokusoch leptín znižoval % buniek obsahujúcich vnútrobunkové signálne látky CREB a percento buniek obsahujúcich MAPK/ERK1,2 a STAT-1, neovplyvňoval sekréciu progesterónu čo je prvým svedectvom toho, že tieto signálové látky môžu byť sprostredkovateľmi účinku leptínu. Zistili sme, že ghrelín aktivuje proliferáciu (% buniek obsahujúcich PCNA,MAPK/ERK1,2 cyklín B-1) ovariálnych buniek ošípaných, čo potvrdzujú údaje Tena-Semperu (2005) dosiahnuté na Leydigovych bunkách človeka. Naše výsledky sa zhodujú aj s výsledkami Belloniho a kol.(2004) o proapoptotickom účinku ghrelínu na neovariálne bunky, pozorovali sme proapoptotický vplyv aj na ovariálne bunky (ghrelín zvyšoval % buniek obsahujúcich ASK-1, p53 a bax) Ako prví sme dokázali, že ghrelín zvyšuje percento buniek obsahujúcich expresiu vnútrobunkových signálnych látok CREB,sekréciu progesterónu a znižuje expresiu STAT v ovariálnych granulóznych bunkách ošípaných. Toto nasvedčuje tomu, že tieto transkripčné faktory sú potencionálnymi sprostredkovateľmi účinku ghrelínu na vylučovanie progesterónu.ghrelín môže ovplyvňovať aj sekrečnú aktivitu ovariálnych buniek. Záver Leptín a ghrelín sú zapojené do regulácie funkcii ovárii ošípaných. Tieto hormóny môžu byť aktivátormi priliferácie a apoptózy a regulátormi sekrečnej aktivity. Ich vplyv na CREB a STAT môže svedčiť o tom, že tieto transkripčné faktory môžu byť potencionálnymi sprostredkovateľmi účinku leptínu a ghrelínu na ováriá ošípaných. Poďakovanie Srdečne ďakujem za podporu a technickú asistenciu pani Kataríne Tóthovej, Ing. Žofii Kuklovej a za finančnú podporu APVP

16 Literatúra Belloni A.S.et al.(2004) : Effect of ghrelin on the apoptotic deletion rate of different types of cells cultured in vitro. Mol Med.2004, Liu YL. Et al.(2005) : Effect of leptin on growth hormone secretion and apoptosis of GH3 cells.sheng Li Xue Bao (2005), Pivko, J: Regulation and evaluation of ovarian funktion and embryogenesis in normal and transgenic animals in vitro and in vivo.nitra, Research Institute of Animal Production, 2003, Sirotkin A.V. et al. (2003): Involvement of MAP kinase in the mediation of GH action on ovarian granulosa cells. Mol. and Cell. Endocr. 205, Soroceanu MA. et al. (2004) : Rosiglitasone impacts negatively on bone by promoting osteoblast/osteocyte apoptosis. Endocrinology (2004), Tena Sempere : Exploring the role of ghrelin as novel regulator of gonadal function. Growth Horm and IGF Res (2005)

17 VÝŽIVA DETÍ RÓMSKEHO ETNIKA Z BANSKEJ BYSTRICE NUTRITION OF CHILDREN OF ROMANIAN ETHNIC FROM BANSKÁ BYSTRICA Cudráková, Z. Katedra biológie FPV Univerzita Mateja Bela Banská Bystrica Abstract Supposed unhealthy diet habits and food composition may have adverse consequence for pathological blood serum lipids concentrations, genesis of obesity, high blood pressure, development of diabetes and atherosclerosis. Some facts about nutrition were obtained by questionnaire method from 42 Romanian children, which were came from Slovak district city Banská Bystrica. Known association between formation of atherosclerosis and nutrition should lead to search the other important predictors for cardiovascular disease. Key words: nutrition, Romanian children, cardiovascular disease Úvod Zhrošujúci sa zdravotný stav, následné kardiovaskulárne ochorenia majú značne vysoké zastúpenie vďaka chybnému životnému štýlu, v ktorom nutričný faktor zohráva významnú úlohu. Podľa nedávnych výskumov je prevalencia kardiovaskulárnych rizikových faktorov u Rómov nezvyčajne vysoká: fajčenie, extrémny alkoholizmus, vysoký výskyt nadváhy a obezity, hypertriglyceridémia, nízke hladiny ochranného HDL-cholesterolu, nízke zásobenie niektorými antioxidačne ochrannými látkami (4). U rómskych obyvateľov bola pozorovaná vysoká spotreba mäsových výrobkov, sladkostí, nízka konzumácia ovocia a zeleniny, vyššia konzumácia alkoholu, cigariet. Donedávna Rómovia využívali rastlinné produkty s nízkym podielom mäsa a tuku. Ich súčasná stravovacia anamnéza je výsledkom celospoločenskej krízy, ktorá smeruje k nárastu civilizačných ochorení. Materiál a metódy Cieľom tejto štúdie bolo prostredníctvom dotazníka vyhodnotiť výživu detí rómskeho etnika z Banskej Bystrice. Základné informácie o nutričnom režime a zdravotnom štýle v rodinách sme získali od 42 rómskych respondentov vo veku 6-18 rokov, ktorí sa v tom istom roku zapojili do sérii vyšetrovaní koncentrácie sérových lipidov, za účelom objasnenia hlavných prediktorov aterosklerózy. 11

18 Výsledky a diskusia Graf 1 poukazuje na frekvenciu stravovania rómskych detí. Graf 1. Frekvencia stravovania sa za deň u rómskych detí z Banskej Bystrice 3% 10% 10% 3% 39% 5% 30% 2-krát 3-krát 4-krát 5-krát 6-krát 7-krát 8-krát 21,4% detí vynecháva raňajky, 54,8% uvádza pravidelnú desiatu. 7,14% vynecháva obed. Olovrant pravidelne konzumuje 30,1% detí. Večeru konzumuje 71,4% detí, nepravidelne 16,7%. Druhú večeru jedáva 35,7% detí. Zaujímavosťou je preferovanie čierneho chleba u 54,8% respondentov, ale 33,3% detí jedáva biele pečivo. Avšak 73,8% rómskych detí každodenne konzumuje múčne jedlá, 33,33% solí jedlo vždy, 31% niekedy a 21% respondentov udáva dennú konzumáciu slaného jedla. Potrebný denný prísun ovocia má 33,33%, ale 7,4% absolútne vylučuje ovocie z jedálneho lístka. 14,3% uvádza denný prísun zeleniny, ale 23,8% zeleninu odmieta úplne. Denná konzumácia zemiakov je u 57,1% opýtaných. Strukoviny nekonzumuje 19% detí. Najželateľnejší typ tepelného spracovania mäsa je pečené (40,5%), tab. 1. Tabuľka 1 typ tepelnej úpravy mäsa percento respondentov varené 21,4% vysmažené 21,4% dusené 19% pečené 40,5% Vyhodnotilo sa, že 7,1% rómskych detí denne jedáva fast food, 23,8% dvakrát týždenne (graf 2). Väčšina respondentov uprednostňuje sladené nápoje-73,8%, alkohol pije príležitostne 26,2% detí. Záver Je zrejmé, že k vývinu kardiovaskulárnych ochorení dochádza už u mladej rómskej generácie (1,2). Veď 16,7% z detí uvádza, že ich rodičia trpia diabetom a rakovinou, u 9,5% sa vyskytuje obezita, 4,8% rómskych 12

19 rodičov hypertenziou, 9,5% rodičov berie lieky na srdce a prekonali infarkt myokardu. Monitoring faktorov vzniku ischemickej choroby srdca sa u Rómov na Slovensku zatiaľ neuskutočnil. Získané výsledky tejto práce môžu byť jedným z podnetov vedúcich k cielenému výskumu ďalších prediktorov aterosklerózy u slovenských Rómov, za účelom získania kvalitných informácii, potrebných pre predikciu kvality zdravotného štýlu. percentuálny podiel Frekvencia konzumácie "fast food"u rómskych detí z Banskej Bystrice 40,00% 30,00% 20,00% 10,00% 0,00% 33,30% 23,80% 1-krát/týž 2-krát/týž 3-krát/týž 4,80% 2,40% 7,10%7,10% 2,40% 7,10% 5-krát/týž vôbec denne 1-krát/mes 2-krát/mes početnosť konzumácie Literatúra 1. RANDALL, C.W., DEAN, J.M. and ROGERS, M.C.: Gypsies and Acute Medical Intervention, Pediatrics 1983, 72, s JAMES D.T.: Gypsies and American Medical Care, Anals of Internal Medicine, 1985, 102, s CUDRÁKOVÁ, Z.: Niektoré problémy výživy u detí rómskeho etnika, in Aktuálne otázky kvality a hygieny potravín v SR, Slovenská spoločnosť pre výživu, Banská Bystrica, 2004, s KAČALA, GINTER: Porovnanie výživy Slovákov, Maďarov a Rómov na národnostne zmiešanom území Slovenska, Med Monitor 1, 2002, s

20 VPLYV MEDI, KADMIA, HORĆÍKA, KOBALTU, ZINKU A BARIA NA ENZYMATICKÚ AKTIVITU V BACHORE EFFECT OF COPPER, CADMIUM, MAGNESIUM, COBALT, ZINC AND BARIUM ON RUMINAL ENZYME ACTIVITIES Faixová, Z., * Faix, Š., Maková, Z. Ústav patologickej fyziológie, UVL, Komenského 73, * hospodárskych zvierat SAV, Šoltésovej 3, Košice Ústav fyziológie Abstract In vitro incubation experiments were conducted to evaluate the influence of ions on ALT, AST, GGT and GDH activities of rumen fluid. Rumen fluid was collected from six fistulated ewes. Zn, Cu, Cd, Mg, Co and Ba were each added to 10 ml of rumen fluid to obtain final concentrations of 5 mmol/l. After the addition of each ion, the mixture was shaken and incubated for 30 min. at 37 0 C prior to enzyme activity assay with or without ions using spectrophotometric methods. Cd stimulated ALT and AST acivity. Cu inhibited GDH activity and it stimulated GGT activity. Mg stimulated GDH activity. Co stimulated ALT, AST and GDH activity. Zn increased ALT, AST and GDH activity and inhibited GGT activity. Úvod Nutričné požiadavky prežúvavcov sa odlišujú od požiadaviek zvierat s jednoduchým žalúdkom. Bachorové mikroorganizmy dokážu syntetizovať dostatok aminokyselín z amoniaku či iného zdroja dusíka, uhlíkatých kostier a sírnych prekurzorov. Mnoho prác sa zaoberá štúdiom vplyvu faktorov na aktivitu enzýmov v bachore, ktoré zohrávajú dôležitú úlohu v metabolizme dusíkatých látok (Ravindra a Vaithiyanthan, 1990, Pal ai., 1998, Santra a Karim, 2002, Várady a i., 2004). Cieľom našej práce bolo sledovať vplyv niektorých íonov na aktivitu vybraných enzýmov v bachorovej tekutine oviec. Materiály a metódy V pokuse sme použili šesť oviec s bachorovou fistulou. Zvieratá boli kŕmené denne senom at libitum a 300 g jačmeňa. Bachorový obsah bol odobratý dve hodiny po nakŕmení a prefiltrovaný cez 4 vrstvy gázy. Jednotlivé prvky Cd, Cu, Mg, Co, Ba a Zn vo forme chloridov boli pridávané do 10 ml bachorovej tekutiny tak, aby výsledná koncentrácia každého prvku bola 5 mmol/l. Bachorová tekutina bola inkubovaná 30 min pri 37 0 C. Enzymatická aktivita AST, ALT, GGT a GDH bola stanovená 14

21 spektrofotometricky. Štatistická významnosť bola stanovená párovým Studentovým t- testom. Výsledky a diskusia V tabuľke 1 je uvedný vplyv medi, kadmia, horčíka, kobaltu, bária a zinku na aktivitu niektorých enzýmov v bachorovej tekutine oviec. 157,8± 72,1± 8,2 * 168,4± 7,3 *** Tabuľka 1 :Vplyv bivalentných iónov na enzymatickú aktivitu v bachorovej tekutine. Bivalentný ión (5 ALT AST GGT GDH mmol/l koncentrácia) ZnCl 2 186,6 ±5,9 *** 10,3 ** BaCl 2 120,5± 114,3± 91,5±7,3 NS 86,1±8,7 NS 11,5 NS 5,8 NS CoCl 2 146,6± 172,6± 323,6± 327,6±7,5 *** 5,1 *** 6,5 *** 21,66 NS CdCl 2 124,6± 8,5 * 127,1± 7,1 * 89,1±5,0 NS 106,0±15,9 NS MgCl 2 107,4± 5,0 NS 110,1± 4,8 NS 131,6±12,3 NS 156,1± 11,7 ** CuCl 2 104,3± 122,4± 118,3±6,7 * 43,9±6,0 ** 7,7 NS 8,6 NS Výsledky sú vyjadrené ako percento inhibície alebo aktivácie enzýmu v porovnaní s enzymatickou aktivitou v bachorovej tekutine bez bivaletných iónov. Hodnoty sú vyjadrené ako priemer ± SEM, n = 6, *P <0,05; **P<0,01 a ***P<0,001. Výsledky práce ukázali, že skúmané prvky môžu ovplyvniť aktivitu niektorých enzýmov v bachore. Meď je esenciálny prvok. Kovové prvky ako meď, kadmium, zinok a olovo sa môžu viazať na sulfhydrylové skupiny v bielkovinách, čím menia enzymatickú aktivitu. Výsledky našich pokusov ukázali, že meď inhibovala GDH aktivitu a stimulovala GGT aktivitu. Wallace a Mc Kain (1996) zistili, že Cu znižovala peptidázovú aktivitu Prevotella ruminicola o 15%. Podobné výsledky dosiahli Fahmy a i. (1998), ktorí popísali, že Cu znižovala ureázovú aktivitu v bachore tiav o 14%. Ozcan (2002) zistil pokles aktivity AST v plazme potkanov kŕmených zvýšenými dávkami medi a zinku. Naproti tomu Zaki ai. (2002) zistili zvýšenú aktivitu ALT a AST v plazme japonských prepelíc kŕmených zvýšenými dávkami medi. 15

22 Výsledky našich pokusov naznačili, že kobalt a zinok v 5 mmol/l koncentrácii stimulujú aktivitu ALT a GDH v bachorovej tekutine oviec.naše výsledky sú porovnateľné s výsledkami Wallace a Mc Kaina (1996), ktorí zistili, že Co, Mn a Zn stimulovali dipeptidázovú aktivitu P. ruminicola o 189, 30 a 26%. Naproti tomu Martinez a i. (2002) ukázali, že Sn, Hg, Cu a Zn v 5 mmol/l koncentrácii znižujú aktivitu amylázy o 90, 82, 65 a 44% v bachorovej tekutine. V našich pokusoch kadmium stimulovalo aktivitu ATL a AST. Podobné výsledky zistili El-Sebai a i. (1994), ktorí opísali zvýšenú aktivitu AST a GGT v plazme kurčiat kŕmených zvýšenými dávkami kadmia. Neskôr Bersenyi a i. (2003) popísali zvýšenú aktivitu ALT v plazme králikov kŕmených s prídavkom kadmia. Záver Výsledky tejto práce naznačujú, že prvky ako meď, kadmium, horčík, kobalt, zinok a bárium môžu ovplyvniť aktivitu enzýmov v bachorovej tekutine oviec, ktoré zohrávajú dôležitú úlohu v metabolizme dusíkatých látok. Oni môžu následne ovplyvniť dusíkatý metabolismus v bachore. Literatúra Bersenyi, A., Fekete, S.G., S.G., Szocs, Z., Berta, E.: Effect of ingested heavy metals (Cd, Pb and Hg) on haematology and serum biochemistry in rabbits. Acta Vet. Hung 51, 2003, El-Sebai, A., Abaza, M., Szilagyi, M., Szalay a ďalší (eds.): Physiological and biochemical parameters in chicken exposed to cadmium. Menden- und Spurenelemente. 14. Arbeistagung, Jena, Nov 25-26, 1994, Fahmy, A.S., Abadir, N.Y., Abd-Alla, B.M.: Purification and characterisation of urease from ruminal fluid of camel (Camelus dromedarius). J. Camel Practice Research 5, 1998, Martinez, T.F., Diaz, M., Moyano, F.J.: Inhibition of amylases present in ruminal particle-associated microorganisms. J. Sci. Food Agr. 82, 2002, Ozcan, M.: The effect of high zinc and copper on ALT, AST, LDH, CK, glucose, total protein and albumin in rats. Assuit Vet. Med. J. 48, 2002: Pal, D.T., Karma, D.N., Pathak, N.N., Bisht, G.S.: Influence of rumen ciliate protozoa and protein level on rumen fermentation, enzyme activities and blood metabolites in crossbred cattle calves. J. Appl. Res. 13, 1998,

23 Ravindra, K., Vaithiyathan, S.: Occurrence, nutritional sigificance and effect on animal productivity of tannins in tree leaves. Anim. Fed Sci. Tech. 30, Santra, A., Karim, S.A.: Influence of ciliate protozoa on biochemical changes and hydrolytic enzyme profile in the rumen ecosystem. J. Appl. Microbiol. 92, Várady, J., Zachar, P., Sopková, D., Jankurová, J., Várady, M.: Urea turnovers, pool and clearence at synthetic and semisynthetic diets in sheep. Proc. of 5 Middle European Buiatrics Congress, June 2-5, 2004, Hajdúszoboszló, Hungary, Wallace, R.J., Mc Kain, N.: Influence of 1, 10 phenanthroline and its analogues, other chelators and transition metal ions on dipeptidase activity of the rumen bacterium, Prevotella ruminicola. J.Appl.Act. 81, 1996, Zaki, M.S., Osfor, M.H., El-Yamani, A.T.: Some nutritional and clinicopathological studies in Japanese quails exposed to a recently used pesticide (copper oxychloride). Bull. Nat. Res. Centr. 27, 2002,

24 EFFECT OF RESVERATROL ON THE TESTOSTERONE PRODUCTION OF MOUSE PRIMARY LEYDIG CELL CULTURE 1 Forgács, Zs, 2 Somosy, Z, 2 Telbisz, Á, 3 Massányi, P, 3 Lukác, N 1 National Institute of Chemical Safety, Budapest, Hungary 2 National "Frederic Joliot-Curie" Research Institute for Radiobiology and Radiohygiene, Budapest, Hungary 3 Slovak University of Agriculture, Nitra, Slovak Republic Summary Resveratrol (Res) is a phytoestrogen and antioxydant of the red grape, which translocates and presents into the red wine. This compound is a known modulator of the balance of different sex hormones and founded to be an agonist of estrogen and androgen receptors. In our experiments primary cultures of mouse Leydig cells were exposed to resveratrol at the concentration range of µm for 48 hours. Testosterone (T) content of the culture media was measured by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). The effect of Res on the T production was studied also in the presence of maximally stimulating amounts of human chorionic gonadotropin (1 IU/ml hcg) or dibutyryl cyclic adenosine monophosphate (1 mm db-camp). Res did not reduce the basal T production of Leydig cells up to 100 µm concentration. Moreover, interestingly Res stimulated the basal T production in the µm concentration range. Whereas hcg (an LH receptor agonist) stimulated T production was decreased at 25 µm concentration of Res, while the db-camp (an effector of post-receptor signaling route) stimulated T response diminished even at 12.5 µm of Res. Res had also an additive effect on hcg stimulated T response at 3.12 µm concentration. Our data suggest that Res may influence the testosterone production via direct or indirect modulation of LH-receptor mediated signals (at the receptor or secondary messenger camp level). Another possible mechanism of the effect of resveratol is a cross-talk effect between androgen and estrogen receptors. Introduction Resveratrol (trans-3,5,4'-trihydroxystilbene) is a naturally occuring polyphenol synthesized by a variety of plant species in response to injury, ultraviolet (UV) irradiation and fungal attack. It is present e.g. in grapes, berries, peanuts and in red wine too. Besides the known cardioprotective effects, Res exhibits anticancer properties of different tumor cells (1). This natural compound influence several biological processes. It suppress cell 18

25 proliferation, has a growth inhibitory effect, potentiate apoptotic effects of cytokines (e.g., TRAIL), chemotherapeutic agents and ionizing radiation as recently reviewed by Aggarwal et al, 2004 (1). Res is proved to be influence several known transcription factors, kinases. The chemical structure of Res is very similar to estrogens and it has been shown to function as an estrogen receptor (ER) agonist (2). However, Res has both estrogenic and antiestrogenic properties in different types of cells, when bound to the ER. The data examining tissue selectivity in vivo is limited (1,2). According to the recent in vivo data, Res is a modulator of the balance of different sex hormones, including testosterone (3). It is known that Leydig cells also have estrogen receptors (4). But it is not clear whether Res has agonist or antagonist effect on the ER mediated cellular responses in Leydig cells. Moreover, it is known, that Res inhibits the expression and function of androgen receptor too (5). Leydig cells are responsible for the T production in mammalian testis. The T production depends upon stimulation of these cells by LH (or its analogue hcg) and T concentration is regulated by a negative feedback. LH binds to its receptor on the Leydig cells' plasma membrane, thereby initiates a cascade of events involving the activation of adenylate cyclase, increasing the intracellular c-amp level, translocation of cholesterol into the mitochondria, enhancing the production of pregnenolone from cholesterol in the mitochondria. Translocation of pregnenolone from the mitochondria to the smooth endoplasmic reticulum and conversion of pregnenolone to testosterone via a series of reactions in the smooth endoplasmic reticulum are next steps of T production (6). The main goal of this study was to evaluate the possible effects of resveratol on the basal, hcg or camp stimulated testosterone production of the primary mouse Leydig cell culture. Materials and Methods Interstitial cells were prepared from the testicles of the animals by mechanical dissociation without enzyme treatment (7,8) The interstitial cell suspension was diluted to 10 6 cells/ml in Minimum Essential Medium (MEM; Gibco BRL) supplemented with 10 % Fetal Bovine Serum (FBS; Gibco BRL), 100 IU / ml penicillin and 100 µg / ml streptomycin (Sigma Chemical Co., St.Louis, MO). The cell suspension was plated into sterile plastic 24-well (or for cytotoxicity test 96-well) plates (Nunclon TM, Nunc, Roskilde, Danmark). Leydig cells were identified by the histochemical reaction for 3β-hydroxysteroid dehydrogenase (3β-HSD) enzyme as described earlier (8). The percentage of 3β-HSD positive cells was at least 70 %. To assess viability prior to adding FBS to the culture medium, samples were taken and stained with trypan blue solution (Sigma) and the 19

26 cells were counted in a hemocytometer. The initial viability of cells was at least 90 %. In order to evaluate the concentration-response action of Res on 48-hr Leydig cell culture, Res was added to the cells to achieve a Res concentration of 1.56, 3.12, 6.25, 12.5, 25, 50, 100 or 200 µm. The basal and maximal hcg or db-camp stimulated testosterone production was determined in the presence or absence of 1 IU/ml hcg (Choriogonin, Richter, Budapest, Hungary) or 1 mm db-camp (Sigma) in the culture medium. The cultures were maintained for 48 h at 34 C under a humidified atmosphere of 95% air / 5 % CO 2. Following the incubation the aliquots of the culture medium were centrifuged and the supernatant was collected and frozen at 20 C until T measurement. Determination of T directly from aliquots of the culture media was performed by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) kits purchased from Dialab (Austria). The viability of the Res-treated 48-h cell cultures was measured by MTT [3- (4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] reduction test (8). To eliminate heterogenic of variance among the data of experiments performed at different times, T levels were expressed in percent of 48-hr basal, hcg or db-camp controls. Analysis of variance and Dunnett's test were used for statistical evaluations. The level of significance was set at p < Results and Discussion Fig 1 shows the effect of Res on the viability of 48-h Leydig cell culture. Res cytotoxicity appeared only at 200 µm concentration. According to the literature Leydig cells proved to be more resistant to Res, than some other cell types, like MDA-MB-231 cells which were showed reduced viability even at lower concentration (15µM) (9). The basal testosterone level showed a mild (2,5 times), but significant increase in the presence of µm Res (Fig 2). The db-camp stimulated T production was unaltered at lower concentrations of Res (3-6µM), whereas it was markedly reduced at higher concentration of Res in a dose-dependent manner (Fig 3). Interestingly, Res caused a biphasic effect on the hcg simulated T production. Our results showed that Res has a small additive effect at lower concentrations (3 µm) whereas at higher concentrations (>25 µm) it turned to be an inhibitor of hcg stimulated T production (Fig 4). Similar effects were observed by Juan et al 2005 (3) in in vivo experiments, where Res increased the serum testosterone 20

27 Fig 1 Effect of Res on cell viability Fig 2 Effect of Res on basal T production 21

28 level. Fig 3 Effect of Res on camp stimulated T production Fig 4 Effect of Res on hcg stimulated T production 22

29 To clarify the exact mechanism of the mild stimulatory effect of Res needs further experiments. Based on the literature one possible way is through LH receptor. However there are no data about direct binding of Res to the LH receptor. There are evidences about interplay between androgen and estrogen receptors as well as androgen and estrogen levels (11, 12) in Leydig cells. As reported by Akingbemi et al (2004) (12) phthalate (an estrogen agonist) -induced Leydig cell hyperplasia, associated with multiple endocrine disturbances. Since Res is an estrogen-like molecule, and its effect on estrogen receptor has been proven, it is another possibility that Res modify hcg (LH) response through estrogen receptors (1,2). Our data, that Res had an additive effect (at low concentration) to hcg stimulated T- production suggest that Res has an alternative route to the LH-receptor mediated way, and this can be the mentioned receptor-cross-talking or an LH-receptor independent increasing of camp-level. It is well known, that LH receptor activation as well as the testosterone production associated with the level of camp via activation of adenylate cyclase (AC) enzyme (6). Data exist that Res can activate adenylate cyclase (AC) enzyme and increase camp level in time- and concentration-dependent manner (13) in MCF-7 breast cancer cells. However, Res had no effect on cgmp level, and the stimulatory effects of Res on AC could not be altered by protein synthesis inhibitors or the estrogen-receptor (ER) blockers. It was proposed, that RES can be an agonist of the camp/kinase-a system, too (13). It is interesting, that Res has a marked inhibitory effect on the maximally stimulated T-production above the concentration of 25 µm. The inhibitory effect was independent from the stimulatory agent used. Interpretation of these data needs further examinations, but may somehow correspondent to the feed-back mechanisms of T-production related signaling routes. Acknowledgment Thanks are due to Mrs Mária Szívós for her excellent technical assistance. The study was supported by research grants from the National Scientific Research Fund (OTKA No. T ), the Committee for Health Studies Grant (ETT 160/2003) of the Ministry of Health, and the Széchenyi Project (1/B-047/2004 NKFP) in Hungary. References 1. Aggarwal BB, Bhardwaj A, Aggarwal RS, Seeram NP, Shishodia S, Takada Y. (2004) Role of resveratrol in prevention and therapy of cancer: preclinical and clinical studies. Anticancer Res. 24: Review. 2. Levenson AS, Gehm BD, Pearce ST, Horiguchi J, Simons LA, Ward JE 3rd, Jameson JL, Jordan VC. (2003) Resveratrol acts as an estrogen receptor 23

30 (ER) agonist in breast cancer cells stably transfected with ER alpha. Int J Cancer. 104: Juan ME, Gonzalez-Pons E, Munuera T, Ballester J, Rodriguez-Gil JE, Planas JM. (2005) Trans-resveratrol, a natural antioxidant from grapes, increases sperm output in healthy rats. J Nutr. 135: Benson TA, Renshan Ge, Cheryl SR, Leslie GN, Dianne OH, James FC, Dennis BL, Kenneth SK and Matthew PH. (2003) Estrogen receptor-α gene deficiency enhances androgen biosynthesis in the mouse Leydig cell. Endocrinol 144: Mitchell SH, Zhu W, Young CYF. (1999) Resveratrol inhibits the expression and function of the androgen receptor in LNCaP prostate cancer cells. Cancer Res 59: Zirkin BR, Chen H. (2000) Regulation of Leydig cells steroidogenic function during aging. Biol Reprod. 63: Stoklosowa S (1982) Tissue culture of gonadal cells. Acta Biologica Hungarica 33: Forgács Z, Somosy Z, Kubinyi G, Sinay H, Bakos J, Thuróczy G, Surján A, Hudák A, Olajos F, Lázár P. (2004) Effects of whole-body 50-Hz magnetic field exposure on mouse Leydig cells. ScientificWorldJournal. 4: Suppl 2: Scarlatti F, Sala G, Somenzi G, Signorelli P, Sacchi N, Ghidoni R. Resveratrol induces growth inhibition and apoptosis in metastatic breast cancer cells via de novo ceramide signaling. FASEB J : A Kocsis Zs, Marcsek ZL, Mátyás GJ, Jakab MB, Szende B, Tompa, A (2005) Properties of trans-resveratrol against the cytotoxicity of chloroacetanilide herbicides in vitro. Int J Hyg Environ Health in press 11. El-Mowafy AM and Alkhalaf M 2003 Resveratrol activates adenylylcyclase in human breast cancer cells: a novel, estrogen receptor-independent cytostatic mechanism Carcinogenesis, Vol. 24: , 12. Panet-Raymond V, Gottlieb B, Beitel LK, Pinsky L, Trifiro MA. (2000) Interactions between androgen and estrogen receptors and the effects on their transactivational properties Mol Cell Endocrinol 167: Akingbemi BT, Ge R, Klinefelter GR, Zirkin BR, Hardy MP. Phthalateinduced Leydig cell hyperplasia is associated with multiple endocrine disturbances. Proc Natl Acad Sci U S A Jan 20;101(3):

31 VPLYV KONTINUÁLNEHO OŽAROVANIA, DMBA A MELATONÍNU NA IN VITRO FAGOCYTÁRNU AKTIVITU V KRVI POTKANOV INFLUENCE OF CONTINUOUS IRRADIATION, DMBA AND MELATONINE ON IN VITRO BLOOD PHAGOCYTIC ACTIVITY IN RATS Friedmanová, L., Paulíková, E., Orendáš, P., Ahlersová, E., Ahlers, I. PF UPJŠ, Moyzesova 11, Košice, Katedra fyziológie živočíchov, Ústav biologických a ekologických vied Abstract Continuous low dose irradiation, chemocarcinogenic substance dimethylbenz(a)anthracene ( DMBA) and exogenous melatonin treatment have been used to follow hematological parameters and blood phagocytic activity in female rats (Wistar-Han). Experimental animals were irradiated (96 mgy per day) from 60 Co γ-source for 15 days. Some groups were drinking melatonin solution (20 mg/l water) during exposure. DMBA (10 mg/ml oil) was given 3x within a week after irradiation. Analyses were performed on day 30, 100 and 180.An enhanced total leukocyte count, monocytosis, neutrophilia but the decrease in phagocytic index was found in groups of triple combination treatment on day 180 after irradiation. Úvod Cieľom práce bolo sledovanie vplyvu kombinácie kontinuálneho ožarovania malými dávkami a chemickej karcinogenézy s následnou chemoprevenciou, na hematologické parametre a in vitro fagocytárnu schopnosť v zmiešanej krvi u potkanov. Materiály a metódy V experimente boli použité samice potkanov kmeňa Wistar Han, z chovu Velaz, Praha. Zvieratá na začiatku pokusu boli vo veku 40 dní, s hmotnosťou g. Samice potkanov boli kontinuálne ožarované gama žiarením zo 60 Co zdroja po dobu 15 dní denným dávkovým príkonom 96 mgy (10 R), sumárna dávka bola 1,44 Gy. Po skončení ožarovania bola u zvierat chemicky indukovaná karcinogenéza intragastrickým podaním 7,12 dimetylbenz(a)antracénu (ďalej DMBA), 3 dávky 10 mg/ ml oleja počas 1 týždňa, na deň po narodení samíc potkanov. Chemopreventívna látka melatonín bol aplikovaný kontinuálne počas ožarovania vo forme vodného roztoku, jeho koncentrácia bola 20 25

32 mg/l pitnej vody. Pri jeho aplikácii bol zamedzený prístup svetla k pitným fľašiam ich zabalením do ochrannej vrstvy. Po ožarovaní boli zvieratá prenesené do zverinca so štandardnými chovnými podmienkami (s potravou a vodou ad libitum). Analýzy sa vykonali 30, 100 a 180 dní po ožarovaní. Test fagocytózy prebiehal 1 h inkubáciou 0,1 ml nezrážanlivej krvi so suspenziou Saccharomyces cerevisiae pri 37 C. Potom sme zhotovili nátery, ktoré boli po osušení zafarbené metódou May Grűnwald, Giemsa Romanowsky, podľa Hrubišku (1981). Všetky preparáty boli zhodnotené svetelným mikroskopom. Priemerná hmotnosť ožiarených samíc po 30 dňoch bola 235 g, po 180 dňoch 308 g. V každej skupine bolo vyšetrených 9 10 potkanov. Bolo vytvorených sedem experimentálnych skupín: Kontrolné zvieratá - kontroly zverinec KZ kontroly pole KP kontroly s podaným DMBA KD kontroly s podaným DMBA a melatonínom KDM Ožiarené zvieratá - ožiarené pole O ožiarené s podaným DMBA OD ožiarené s podaným DMBA a melatonínom ODM Výsledky boli štatisticky spracované Peritzovým F testom. Výsledky a diskusia V pokusoch sme sledovali protektívny účinok melatonínu pri kombinácii dvoch karcinogénov, fyzikálneho ionizujúceho žiarenia a chemokarcinogénu DMBA u samíc potkanov Wistar Han. Zaujímalo nás, či kombinácia karcinogénov s ochranným účinkom melatonínu bude mať vplyv na fagocytárnu schopnosť leukocytov u potkanov. Podanie DMBA, resp. kombinácia DMBA s melatonínom sa výrazne prejavili na poklese počtu neutrofilných granulocytov u kontrolných zvierat na 180. deň analýzy. Z našich výsledkov vyplýva, že kontinuálne ožarovanie malými dávkami malo ochranný efekt, pretože počet leukocytov v skupine OD sa udržal v norme aj na 180. deň po ožarovaní. V tom istom časovom období sa však trojkombinácia (ožarovanie, DMBA, melatonín) prejavila leukocytózou, signifikantným vzostupom 26

33 počtu neutrofilných granulocytov, monocytov a fagocytárnej aktivity v porovnaní so skupinou ODM30. Z logického hľadiska by väčší počet fagocytujúcich buniek mal pohlcovať aj viac kvasiniek. Avšak my sme v pokusoch pozorovali opačný efekt, teda signifikantný pokles hodnôt fagocytárneho indexu na 180. deň v skupinách kontrolných aj ožiarených zvierat jednak po samotnom podaní DMBA, ale aj v jeho kombinácii s melatonínom. Z toho vyplýva, že aj napriek vyššiemu počtu profesionálnych fagocytov a vyššej fagocytárnej aktivite bola ich funkčná schopnosť porušená vplyvom kombinácie účinku DMBA a melatonínu v porovnaní s výsledkami na 30. deň analýzy. Pretože tento efekt sme pozorovali nielen u ožiarených, ale aj u kontrolných zvierat predpokladáme, že funkčná porucha bude spôsobená inhibíciou enzýmov vo fagocytoch vplyvom podania chemického karcinogénu. Experimentálne práce týkajúce sa fagocytárnych zmien po kontinuálnom ožarovaní nie sú početné. Paulíková et al. (1995) zistili u kontinuálne ožarovaných potkanov nízkou dennou dávkou (48 mgy) počas 30 dní, celkovo 1,43 Gy gama lúčmi pokles fagocytárnej aktivity a zníženie počtu lymfocytov a monocytov. Naviac zaznamenali aj ochranný účinok melatonínu (20 mg/ml), ktorý sa prejavil v tom, že zabránil poklesu počtu leukocytov v krvi kontinuálne ožarovaných zvierat a stlmil funkčné poškodenie fagocytov na 100. deň. Diferenciálny rozpočet leukocytov t.j. percentuálny počet jednotlivých typov buniek má dôležitý význam pri posúdení obranyschopnosti organizmu. Pri vyhodnocovaní diferenciálneho rozpočtu leukocytov v krvi sme zaznamenali najväčší počet signifikantných rozdielov medzi jednotlivými skupinami zvierat v počte monocytov. Bolo to hlavne po podaní DMBA, ale aj v jeho kombinácii s melatonínom tak u zvierat kontrolných ako aj ožiarených. Postupné zvyšovanie monocytov s časovým priebehom nášho experimentu vyústilo do monocytózy na 180. deň po ožarovaní s najvyššími hodnotami v skupine OD180. Podávanie melatonínu malo tlmivý účinok na nárast monocytov v skupinách ODM100 a ODM180. Po kombinácii podania DMBA a melatonínu v skupinách KD180, KDM180 a ODM180 sme zistili eozinofíliu na 180. deň (dvoj- až trojnásobok kontrolných hodnôt). Aj napriek nárastu počtu eozinofilov na 180. deň sa tieto bunky nepodieľali na fagocytóze. Podľa údajov Fischbacha (1988) možnými príčinami zvýšenia počtu eozinofilných granulocytov by mohli byť hyperimúnne a degeneratívne reakcie, subakútne infekcie, resp. mohli by naznačovať prekancerózne štádium. Chronický zápal je induktorom mutagenézy až v 30% prípadoch. 27

34 V tomto experimente bola incidencia tumorov veľmi nízka. Ahlers a kol. (1998) zistili, že potkany kmeňa Wistar Han sú veľmi málo senzitívne na DMBA indukovanú mamárnu kancerogenézu. Aj napriek tomu, že v tomto pokuse boli zvieratá ožarované len nízkymi dávkami a bola použitá len nižšia dávka chemokarcinogénu, v našich pokusoch sme zistili jednak významné kvantitatívne zmeny v krvi ako aj vo funkcii fagocytov na 180. deň. Záver Samotné ožarovanie nespôsobilo významné zmeny ani vo fagocytárnej aktivite, ani v počte leukocytov. Po podaní DMBA u kontrolných, ale aj u ožiarených zvierat sa signifikantne zvýšil počet leukocytov v krvi významnejší nárast bol u kontrolných zvierat. V dôsledku podávania melatonínu v kombinácii s ožarovaním a aplikáciou DMBA sme pozorovali v skupine ODM180 leukocytózu, čo sa odzrkadlilo v diferenciálnom rozpočte zvýšením počtu všetkých druhov leukocytov. V skupine ODM180 sa väčší počet neutrofilných a eozinofilných granulocytov, a monocytov síce prejavil zvýšením fagocytárnej aktivity, ale klesol ich fagocytárny index, teda množstvo pohltených kvasiniek jednou fagocytujúcou bunkou. Tieto údaje poukazujú na zhoršenie funkčnej schopnosti krvných fagocytov u samíc potkanov kmeňa Wistar Han. Literatúra hlers, I., Solár, P., Burešová, A., Ahlersová, E.: Very low sensitivity of Wistar Han female rats to chemocarcinogens in mammary carcinogenesis induction. Neoplazma 45, , 1998 Fischbach, F., T.: A Manual of Laboratory Diagnostic Tests. J. B. Lippincott Company Philadelphia, 1988 Hrubiško, M.: Hematológia a transfuziológia. Osveta, Martin, 1981 Paulíková, E., Kočiková, A., Sabol, M., Daxnerová, Z.: Hematological and immunological changes in continuously irradiated rats. In: Radiation Biology and Application in Space Research, Eds. Kozubek, S., Horneck, D., (eds.), Kiramo,

35 VPLYV PODMIENOK NA PREŽÍVANIE VYBRANÝCH PROBIOTICKÝCH MIKROORGANIZMOV THE INFLUENCE OF CONDITIONS TO LIVING OF SELECTED PROBIOTIC MICROORGANISMS Golian, J. 2, Sokol, J. 1, Hanzel, S. 1, Rajský, D. 3, 1 Slovenská poľnohospodárska univerzita Nitra, 2 Krajská veterinárna a potravinová správa Trnava, 3 Regionálna veterinárna a potravinová správa Dunajská Streda Abstract Acid resistance of bacterias of milk fermentation in acid medium and in medium of bile acids. were tested. Bacteria Lactobacillus plantarum signified acidoresistant towards ph 2,0 in the acid medium and Lactobacillus helveticus wasn t resistant. The biliary salts with content of 0,03% didn t influence viability of selected bacterias. The bile acids had unfavourable effect to viability of. B. Lactis BB12. Úvod Probiotiká sú živé mikroorganizmy (mono, alebo zmesné kultúry), ktoré majú pozitívne zdravotné účinky. Najnovšie výskumy však ukazujú, že nielen živé mikroorganizmy, ale aj ich neživé formy a určité zložky bunkových stien môžu pravdepodobne ovplyvňovať zdravie. Boli opísané viaceré pozitívne účinky probiotík: syntetizujú vitamíny skupiny B, K, niacín, kyselinu folovú, tvoria tiež mastné kyseliny s krátkym reťazcom, zohrávajú kľúčovú úlohu v cirkulácii estrogénu a znižovaní zvýšenej hladiny pohlavných hormónov u žien. Napomáhajú vylučovaniu karcinogénnych zlúčenín, ako sú amoniak, alifatické amíny, indoly, fenoly a zlúčeniny síry z hrubého čreva. Znižuje sa aktivita beta-glukuronidáz, azoreduktáz a nitroreduktáz, čo sú enzýmy podieľajúce sa na vzniku rakoviny, čím sa znižuje frekvencia vzniku rakoviny hrubého čreva. Sú schopné viazať mutagénne amíny vznikajúce pri príprave jedál bohatých na proteíny a môžu znižovať hladinu cholesterolu v krvi jeho zabudovaním do vlastných plazmatických membrán. Prehľad literatúry Probiotiká môžu mobilizovať špecifické imunitné mechanizmy, (Buts a Bernasconi 1990, Famularo et al. 1997,, Majamaa a Isolauri 1997). L. acidophilus, L. casei a L. rhamnosus GG dokonca inhibujú apoptózu buniek črevného epitelu (Yan a Polk 2002). Zvýšená expresia cytokínov sa však nemusí prejaviť na odpovedi v gastrointestinálnom trakte, pretože 29

36 môže dochádzať k ovplyvňovaniu inými mikroorganizmami prítomnými vo veľkom počte (Seegers 2002). Aby mikroorganizmy dosiahli hrubé črevo v požadovanom množstve, musia sa v pôvodnom výrobku nachádzať v počte zväčša udávanom ako KTJ/cm 3. Približne 30% z nich prejde tráviacim traktom a dosiahne hrubé črevo (Martau et al. 1997,). Prechod tráviacim systémom je jednou z mnohých požiadaviek na probiotické kultúry. Je to základný a nevyhnutný predpoklad ich účinnosti. Musia byť odolné voči enzýmom v ústnej dutine (napr. lyzozýmu), musia byť schopné prežiť pôsobenie žalúdočných kyselín, žlčových solí v tenkom čreve a pankreatických enzýmov a osídliť určitú časť tráviacej sústavy (Collins a Gibbson 1999, Fuller 1992). Materiál a metodika Testovanie acidorezistencie baktérií mliečneho kvasenia v kyslom prostredí sa uskutočňuje po 24 h kultivácii, keď sa kmeň sterilne centrifuguje z kultivačnej pôdy (3000 ot./min). Supernatant sa zleje a ku sedimentu sa pridá selekčný roztok, obsahujúci 8,5 g.dm -3 NaCl upravený 15% HCL na hodnotu ph 2,0. Zmes sa udržiava pri 37 C v biostate a odoberá sa vzorka v definovaných časových intervaloch. Odobratá vzorka v objeme 5cm 3 sa scentrifuguje a doplní sa 5 cm 3 fyziologického roztoku. Počet viabilných buniek sa zistí očkovaním. Testovanie acidorezistencie baktérií mliečneho kvasenia v prostredí žlčových kyselín sa uskutočňuje tak, že do selekčného roztoku s ph 2,0 sa pridá zmes solí žlčových kyselín (DIFCO) v množstve 0,5% a ph roztoku sa upraví hydrogénuhličitanom sodným na ph 8,3. K takto upravenému selekčnému roztoku sa pridá sediment buniek získaný centrifugáciou (3000 ot./min) 24 hodinovej biomasy. Zmes sa udržiava pri 37 C v biostate a odoberá sa vzorka v definovaných časových intervaloch. Odobratá vzorka v objeme 5 cm 3 sa centrifuguje a doplní sa 5 cm 3 fyziologického roztoku. Počet viabilných buniek sa zistí očkovaním. Výsledky a diskusia Žalúdočná šťava má ph 2,0., teda ph v prázdnom žalúdku sa rovná tejto hodnote a mení sa v závislosti od množstva a kvality požívanej potravy do hodnoty 4,0. Baktérie mliečneho kysnutia sa selektovali vo vzťahu ku kyslému prostrediu a testoval sa i vplyv ph 1,0 a ph 4,0. Pri ph 1,0 v selekčnom roztoku uhynuli všetky testované kmene už po 30 minútach, pri ph 4 boli kmene životaschopné v sledovanom časovom intervale 4 h. Selekčný roztok s ph 2 mal rôzny vplyv na skúmané baktérie. Výsledky pôsobenia ph podmienok 2,0 na životaschopnosť skúmaných baktérií sú v tab.1. 30

37 Tab.1. Vplyv selekčného roztoku s ph=2 na životaschopnosť sledovaných baktérií mliečneho kysnutia. Kultivácia: 24 h, staticky pri teplotách 37 C ( Lactobacillus, Lactoccocus, Bifidobacterium) 30 C( L. plantarum ). Počet životaschopných buniek v ph=2,0 (KTJ/cm 3 ) Testovaný kmeň kontrola 30 min 60 min min min min min L. plantarum L.plantarum L.acidophilus V L.acidophilus <1 <1 <1 <1 <1 L.acidophilus L. delbrückei <1 <1 <1 <1 <1 <1 L.helveticus <1 <1 <1 <1 <1 <1 Lactococcus lactis sbp cremoris N B. lactis BB B. longum L. acidophilus La Ako vyplýva z tab.1., baktérie z rodu L. plantarum prejavili v kyslom prostredí acidorezistenciu voči ph 2,0. Kmene L. acidophilus prejavili acidorezistenciu čiastočne, pričom ku poklesu životaschopných buniek došlo najviac v 30-tej minúte a v nasledovnom časovom intervale sa pokles naďalej neprejavoval L. delbrückei a L. helveticus nie sú v skúmanom ph=2,0 rezistentné. Kmeň B. lactis BB12, prejavil v skúmanom prostredí ph 2,0 rezistenciu. Na sledovanie vplyvu solí žlčových kyselín na viabilitu baktérií mliečneho kysnutia sa vybrali kmene L. acidophilus , L. acidophilus La5 a B. lactis BB12. Množstvo žlčových solí v tenkom čreve je individuálne a ph podžalúdočnej šťavy sa pohybuje v rozmedzí ph 8,0 8,5. Zvolila sa koncentrácia žlčových solí 0,03% a 0,5%. Žlčové solí v roztoku s obsahom 0,03% neovplyvňovali životaschopnosť sledovaných baktérií. Vplyv solí žlčových kyselín v množstve 0,5% na životaschopnosť je zosumarizované v tab

38 Tab.3. Vplyv solí žlčových kyselín v množstve 0,5% na životaschopnosť L. acidophilus , L. acidophilus LA-5 a B. lactis BB12 v ph 8,3. Kultivácia: 24 h, staticky pri teplote 37 C (Lactobacillus, Bifidobacterium). Kmeň Počet životaschopných buniek (KTJ/cm 3 ) kontrola 30 min 60 min 120 min 240 min L.acidophilus L.acidophilus LA B. lactis BB Vplyv solí žlčových kyselín sa na životaschopnosť kmeňov L. acidophilus a L. acidophilus La5 neprejavil, ale prídavok solí žlčových kyselín mal nepriaznivý vplyv na životaschopnosť B. lactis BB12 (tab.2). Použitá literatúra BUTS, J.-P., BERNASCONI, P Stimulation of secretory IgA and secretory component of immunoglobulins in small intestine of rats treated with Saccharomyces boulardii. Dig. Dis. Sci. 35: COLLINS,M. D., GIBBSON, G. R Probiotics, prebiotics and synbiotics:approaches for modulating the microbial ecology of the gut. Am. J. Clin. Nutr. 69 (suppl): 1052S-1057S FAMULARO, G., MORETTI, S., MARCELLINI, S., DE SIMONE, C Stimulation of immunity by probiotics. In: Fuller, R., ed. Probiotics: therapeutic and other beneficial effects. Chapman&Hall, London FULLER, R A review: probiotics in man and animals. J. Appl. Bacteriol. 66 (5): MAJAMAA, H., ISOLAURI, E Probiotics: A novel approach in the management of food allergy. J. Allergy Clin. Immunol. 99: MARTAU, P., MINEKUS, M., HAVENAAR, R., HUIS In t VELD, J. H. J Survival of lactic acid bacteria in a dynamic model of the stomach and small intestine: validation and the effects of bile. J. Dairy Sci. 80: SEEGERS, J. F. M. L Lactobacilli as live vaccine delivery vectors: progress and prospects.. Trends in Biotechnol. 20 (12): YAN, F., POLK, D. B Probiotic bacterium prevents cytokineinduced apoptosis in intestinal epithelial cells. J. Biol. Chem. 277 (52):

39 LABORATÓRNA DIAGNOSTIKA GRAVIDITY PRASNÍC LABORATORY PREGNANCY DIAGNOSIS IN SOWS Hajurka, J., Sirotkin, A.*, Hura, V., Makarevič, A.* Klinika pôrodníctva, gynekológie a andrológie, Univerzita veterinárskeho lekárstva, Košice, *Výskumný ústav živočíšnej výroby, Nitra Abstract Early and accurate identification of pregnant and nonpregnant sows and gilts improves reproductive efficiency in commercial swine farms. Serum progesterone and oestrone sulphate concentration was measured by RIA in samples taken from 32 sows during the period 26 to 30 days after mating. Overall accuracy of pregnancy diagnosis based on progesterone was 71.9 % and on oestrone sulphate was 93.8 %. False positive results (based on subsequent farrowing) by estimation of progesterone in this period is so high and in our experiment was 90.0 %. Oestrone sulphate determination is more suitable method than progesterone for pregnancy diagnosis in sow herds, with higher accurrence of embryonic mortality which prolong interoestrus interval above 25 days after mating. Úvod Skorá a presná identifikácia gravidných a negravidných prasníc a prasničiek zlepšuje reprodukčné parametre v komerčných stádach ošípaných. Pre diagnostiku gravidity prasníc sú využívané najmä opakovanie ruje po predchádzajúcej inseminácii, vyšetrenie ultrazvukom, ale aj iné metódy laboratórneho a klinického charakteru. V praxi sa najviac využíva detekcia ruje u inseminovaných prasníc v čase 17 až 24 dní po predchádzajúcom pripustení. Týmto spôsobom je možné určiť graviditu na úrovni 39 % 98 %. Pokiaľ sa k detekcii ruje nepoužije kanec, tak percento úspešnosti sa výrazne redukuje (Almond a Dial, 1987). Vzhľadom na časovú náročnosť so zvýšeným podielom práce tento spôsob detekcie gravidity nenachádza široké uplatnenie. Okrem toho embryonálna mortalita v rozsahu 20 % 40 % redukuje početnosť vrhu a predlžuje interinseminačný resp interrujový interval (Lambert et al., 1991). Cieľom tejto práce bolo posúdiť možnosti diagnostiky gravidity prasníc stanovením progesterónu a estron sulfátu v dobe od 26. do 30 dňa po pripustení. Materiály a metódy Sledovanie bolo vykonané na produkčnej forme prasníc s uzatvoreným obratom. Prasničky boli odchovávané na farme. Pripúšťanie 33

40 bolo vykonávané umelou insemináciou spracovaným ejakulátom od vlastných kancov podľa bežných zásad. Včase medzi dňom po pripustení bola 32 prasniciam odobratá krv z v. cava cranialis. Po spracovaní získané krvné sérum bolo až do stanovenia uskladnené pri 20ºC. Progesterón bol stanovený RIA metódou pomocou kitu Progesterone RIA DSC-3900 (Diagnostic System Laboratories, Inc., Webster, Texas). Minimálny detekčný limit súpravy je 0,1 ng/ml. Estron sulfát bol stanovený RIA metódou súpravou Estrone-Sulphate RIA DSL-5400 (Diagnostic System Laboratories, Inc.,Webster, Texas) Minimálny detekčný limit súpravy je 0,01ng/ml. Výsledky a diskusia Určenie gravidity na základe stanovenia progesterónu (P 4 ) a estron sulfátu (E 1 S ) je uvedené v tab. 1. Citlivosť metódy t.j. schopnosť určiť gravidné zvieratá je vyššia stanovením E 1 S a dosahuje 91,7 %. Rovnako vyššie percento sa dosiahlo touto metodikou čo sa týka špecificity (schopnosť určiť negravidné jedince), presnosti určenia (percento gravidných zvierat z tých, ktoré boli označené testom ako pozitívne) ako aj celkovej presnosti (celkové percento správne označených zvierat). Tab. 1. Špecifické parametre stanovenia gravidity prasníc pomocou P 4 a E 1 S medzi dňom po pripustení (n=32) špecifické parametre určenia gravidity Stanovenie citlivosť, špecificita, presnosť celková, falošne poz., falošne neg. presnosť výsledok výsledok P 4 68,8 % 10,0 % 68,8 % 71,9 % 90,0 % 0 % E 1 S 91,7 % 80,0 % 91,7 % 93,8 % 20,0 % 0 % Vysvetlivky: P 4 progesterón E 1 S estrón sulfát Detegovateľný obsah estron sulfátu u gravidných prasníc v periférnom krvnom obehu je možný približne na 18 deň. Maximálnu koncentráciu je možné zistiť v dňoch po pripustení s jeho náhlym poklesom na hodnotu 0,1 ng/ml na 37. deň. U negravidných prasníc je koncentrácia estron sulfátu takmer nulová (Hattersley et al., 1980). Z tohto hľadiska estron sulfát je vhodným parametrom pre stanovenie gravidity prasníc, pretože iba prítomnosť živých embryí v maternici spôsobuje jeho 34

41 zvýšenie na detegovateľnú úroveň. U prasníc k embryonálnej mortalite dochádza asi v % (Lambert et al., 1991), pričom najväčšie percento sa vyskytuje v raných štádiách gravidity v období materského rozpoznania gravidity. Zlyhanie produkovať estrogény, ktoré sa u prasníc pokladajú za substanciu spôsobujúcu zabráneniu luteálnej regresie, je hlavným činiteľom spôsobujúcim prebiehanie sa prasníc po predchádzajúcom pripustení. V menšom percente sa vyskytujú embryonálne straty, ktoré predlžujú normálnu dĺžku medzirujového intervalu nad 25 dní. Stanovenie estron sulfátu v tomto období odhalí odumretie alebo aj odumieranie embryí v maternici. V tomto období však, pokiaľ nedôjde k luteálnej regresii, žlté telieska produkujú ešte progesterón. Z tohto pohľadu stanovenie P 4 v stádach s vyšším výskytom embryonálnej mortality predlžujúcej interestrálny interval medzi dňami je nevhodný, pretože špecifické parametre určenia gravidity ako citlivosť, špecificita, celková presnosť sú nízke, ale najmä falošne pozitívne stanovenie je na úrovni až 90,0 % (Tab. 1). Záver Stanovenie P 4 v krvnom sére u neprebehnutých prasníc medzi dňom po pripustení je v stádach s vyšším výskytom embryonálnej mortality nevhodné vzhľadom na nízku celkovú presnosť 71,9 % a až 90 % výskyt falošne pozitívnych výsledkov. Z laboratórnych metód diagnostiky je vhodnejšie stanovenie E 1 S, pretože celková presnosť v našom sledovaní bola na úrovni 93,8 %. Laboratórna diagnostika gravidity stanovením E 1 S je vhodnejšou metódou v porovnaní s P 4 avšak jej zavedenie do praxe v súčasnosti naráža na cenu súpravy, vybavenie laboratória a tým aj celkové náklady na jedno stanovenie. Literatúra 1. Lambert, E., Williams, D.H., Lynch, P.B., Hanarahan, T.J., McGeady, T.A., Austin,F.H., Boland, M.P., Roche, J.F.: The extent and timing of prenatal loss in gilts. Theriogenology 36, 1991, Almond, G.W., Dial, G.D.: Pregnancy diagnosis in swine: Principles, applications, and accuracy of available techniques. JAVMA, 191, 1987, Hattersley, J.P., Drane, H.M., Matthews, J.G., Wrathall, A.E., Saba, N.: Estimation of oestrone sulphate in the serum of pregnant sows. J. Reprod. Fertil., 58, 1980,

42 PUERPERÁLNA INFEKCIA MATERNICE KRÁV A CELKOVÁ IMUNITNÁ ODPOVEĎ PUERPERAL INFECTION OF UTERUS IN COW AND IMMUNE RESPONSE Hajurka, J., Revajová, V., Macák, V., Novotný, F. Univerzita veterinárskeho lekárstva, Košice Abstract During the periparturient period cows undergo marked physiological changes that might cause suppression of host defence mechanismus and an increase in susceptibility to uterine infections. An inderect immunoflorescence method for staining and flow cytometric analysis was employed to determine the cell subpopulation of lymfocytes. Indices of cellular imunity were evaluated in postpartum dairy cows (n = 7) suffered with acute endometritis. Antibody mediated and cell mediated immunity were induced after puerperal uterus inflamotion. Úvod Otvorenie maternicového krčka počas pôrodu a raného puerpéria je príčinou preniknutia bakteriálnej infekcie z pošvy a vonkajšieho prostredia do maternice. Riziko bakteriálnej infekcie je väčšie pri dystokiach, asistovanom pôrode, zadržaní placenty po pôrode a infikovanom prostredí v priestoroch pôrodnice. Popôrodná infekcia maternice kráv, ktorá je predovšetkým nešpecifická, redukuje následnú reprodukčnú výkonnosť. Narušená alebo potlačená funkcia neutrofilov a lymfocytov je predispozíciou pre infekciu maternice (Lewis, 1997). U väčšiny kráv však maternica je schopná eliminovať infekciu a zabrániť jej zápalu. Krátkotrvajúce pôsobenie progesterónu exogenného alebo luteálneho pôvodu potláča imunitné funkcie organizmu (Lewis, 2003). Na druhej strane akútna endometritída resp.metritída u kráv sú diagnostikované počas prvých dvoch týždňov po pôrode, kedy koncentrácia progesterónu je v tomto období bazálna. Iba ku koncu druhého týždňa po pôrode dochádza k obnoveniu produkcie gonadoliberínu, ktorý následne v ďalšom období môže stimulovať rast, a neskôr aj dozrievanie folikulov. Táto práca je zameraná na sledovanie parametrov celulárnej imunity kráv s klinicky diagnostikovanou endometritídou v čase dní po pôrode. 36

43 Materiály a metódy Sledovanie sme vykonali na 7-mich kravách plemena Nížiny čiernostrakatý s klinickými príznakmi endometritídy. V čase medzi dňom po pôrode, kravy boli gynekologicky vyšetrené. Na základe posúdenia charakteru lóchii a rektálnej palpácie maternice bolo vybratých sedem kráv, od ktorých sa uskutočnil odber na imunologické vyšetrenie. Druhý odber sme vykonali 14 dní po prvom odbere. Od vybraných kráv sa z v. jugularis odobrala krv do skúmaviek s obsahom 1,5% EDTA. Stanovenie subpopulácie lymfocytov bolo vykonané na prietokovom cytometri Becton Dickinson, SRN. Detaily stanovenia sú uvedené v práci Levkut et al. (2002). Výsledky a diskusia Sledované parametre bielej zložky krvného obrazu až na makrofágy sa v priebehu 14 dní signifikantne zvýšili u kráv so zápalmi maternice (graf 1). Podobný charakter mali aj ostatné sledované parametre subpopulácie lymfocytov (graf 2). Aj napriek tomu, že v tomto sledovaní sme nesledovali kravy s normálnym priebehom puerpéria z našich predchádzajúcich výsledkov (Levkut et al. 2002) je zrejmé, že v tejto skupine kráv dochádza k zvyšovaniu meraných hodnôt do 7.dňa po pôrode, ale v ďalšom období nastáva signifikantný pokles bieleho krvného obrazu a subpopulácie lymfocytov, čo má dočasne opačný trend ako u kráv so zápalmi maternice. Infekcia maternice takého stupňa, ktorá je spojená s klinickými príznakmi zápalu stimuluje obranný mechanizmus eliminácie infekcie s odrazom na hodnotené zložky imunitného systému. Sme si vedomí, že výsledky sú predbežného charakteru a hodnotenie peripartálneho obdobia z pohľadu celkovej a lokálnej obrany- schopnosti si vyžaduje ďalšie detailnejšie štúdium. 37

44 Graf 1 Biela zložka krvného obrazu dojníc s akútnou puerperálnou endometritídou (n=7) l Lc Ly Ne Mf 1.odber 2.odber Graf 2 Subpopulácie lymfocytov ( v absolútnych hodnotách) u doj níc s akútnou puerperálnou endometritídou (n=7) l-1 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0, CD4 CD8 IgM CD3 CD2 Mf 1.odber 2. Odber 38

45 Záver Nepriamu imunoflorescenčnú metódu farbenia a prietokovú cytometrickú analýzu sme použili k sledovaniu bielej zložky krvného obrazu a subpopulácie lymfocytov u 7 kráv s klinicky zjavnou akútnou endometritídou diagnostikovanou dní po pôrode. V dvoch odberoch so 14 dňovým odstupom sa zistilo zvyšovanie väčšiny sledovaných parametrov, čo nasvedčuje o aktivácii imunitného systému na lokálnu infekciu maternice. Výsledky majú predbežný charakter s potrebou ďalšieho detailnejšieho štúdia. Literatúra 1.Lewis, G.S.: Uterine bealth and disorders. J.Dairy Sci:, 80, 1997, Lewis, G.S.: Role of ovarion progesterone and potential role of prostaglandin F 2α in modulating the uterine response to infections bacteria in postpartum ewes, J.Anim.Sci., 81, 2003, Levkut, M., Pistl, J., Revajová, V., Choma, J., Levkutová, M., David, V.: Comparison of immune parameters in cows with normal and prolonged involution time of uterus Vet. Med. Czech, 47, 2002, Táto práca bola financovaná z Grantu VEGA 1/0590/03 39

46 HORMONÁLNA A AKUPUNKTÚRNA SYNCHRONIZÁCIA RUJE U ANESTRICKÝCH BAHNÍC. HORMONAL AND ACUPUNCTURE SYNCHRONISATION IN ANESTROUS EWES. Halagan, J., Maraček, I., Staníková, A. Katedra normálnej anatómie, histológie a fyziológie, Ústav fyziológie, UVL Košice Abstract The simple acupuncture needling has been used for porpose to activate of the ovary in anoestrous ewes. Totaly 15 of 3 years old ewes after regularly lambing and weaning of lambs were used in half of May. First group were as randomnised animals. Second were chlorsuperlurine treated. The third group developed acupuncture treatment. Acupuncture treatment procedures have been consisted of needling of two pares of active points of Blader Meridian (BL 21 and BL 22). Each treatment has been left in action for 15 or 20 minutes time. Stimulation by inserting of needle has been carried out by contra dial rotation of inserting needle. The needling procedure has been repeat three times in 48 intervals. The stimulatory effect of the treatment were evaluated according morphological changes on the ovary on second respective on the 5th days after last procedure by laparotomy. Significantly increase of ovary follicular activity after acupuncture stimulation has been found in anoestrous ewes in comparison to untreated ewes but not the same range as we found in hormonally synchronized ewes. Preliminary results confirm an idea for involving of traditional chinise medicine treatment in sheep reproduction if treatment will be performed and evaluated individually case by case. Two theoretical aproaches to explanation of the needling effect were discussed. Úvod. U dospelých bahníc fyziologicky normálna pohlavná aktivita je pravidelne jedenkrát v roku vystriedaná obdobím pohlavného pokoja anoestrus. V našich klimatických podmienkach obdobie anestru začína v mesiacoch marec a končí augustom. Absencia sexuálnej aktivity, preovulačných antrálnych folikulov rozvíjajúceho sa alebo aktívneho žltého telieska na vaječníkoch a minimálnych hladín periférnych ovariálnych hormónov sú základné ukazovatele subminimálnej aktivity vaječníkov bahníc počas anestrickej periódy. Kľúčom tranzitu estrickej do anestrickej sezónnej periódy je epifýza, ktorá cez svetelný signál a vegetatívnu nervovú sústavu brzdí alebo aktivuje hypotalamus. Z doposiaľ publikovaných 40

47 prameňov vyplýva, že efektívna manipulácia so sezónnosťou bahníc je možná použitím jednej alebo kombináciou metód 1. úpravou výživy, 2. svetelným režimom, 3. použitím hormónov (melatonín, gestagény, gonadotropíny, GnRh a PGF 2 a). V ostatnom desaťročí sa začali objavovať správy o pokusoch využitia priamej alebo nepriamej intervencie CNS cez vegetatívnu nervovú sústavu za účelom štúdia alebo pokusov ovplyvniť aktivitu vaječníkov bahníc (Jaroszewski a Kotwica,1992, Szatkowska a Lakomy, 1987). Otázky biológie, fyziológie a najmä patológie reprodukčných procesov samíc sú celé storočia centrom záujmu aj čínskej tradičnej medicíny aj vo veterinárnej praxi pri kobylách a kravách. Cieľom prezentovanej práce bolo predbežne preskúmať, overiť a v experimentálnych podmienkach potvrdiť alebo vyvrátiť 1. možnosť dosiahnutia a funkčného ovplyvnenia vaječníkov bahníc cez akupunktúrne body povrchu tela, ktoré ovplyvňujú pohlavný trakt, 2. pokúsiť sa indukovať estrus u acyklických oviec v anestre pomocou jednoduchého akupunktúrneho ošetrenia a 3. overiť predpokladaný stimulačný efekt jednoduchej akupunktúry na ovulačnú aktivitu vaječníkov bez hormonálnej stimulácie. Materiál a metódy Pokus sme uskutočnili na 15 bahniciach plemena slovenské merino vo veku 3 rokov. Vybraté a klinicky otestované bahnice sme rozdelili na tri skupiny po 5 v každej. 1.skupína ako kontrolná, 2.skupina synchronizovaná 12 dni pošvovými hubkami s 20 mg chlorsuperlutínu, 3 skupinu sme podrobili 3 akupunktúrnym procedúram špeciálnymi akupunkčnymi ihlami zavedenými do podkožia a svalstva akupunktúrnych bodov BL 21 a BL 22, ktoré predstavujú meridián močového mechúra. Topograficky sme sa riadili podľa údajov atlasu pre prežúvavcov (Kothbauer a Vanengelenburg, 1994). Needling sme robili u každej pokusnej ovce stimuláciou 4 bodov naraz. Dĺžka stimulácie(točenie ihiel v smere hodinových ručičiek prstami holej ruky) u prvej procedúre trvalo 15 minút a u ďalších procedúr 20 minút. Procedúru sme opakovali 3-krát s medzipauzou jedného dňa. Vaječníky pokusných oviec sme excidovali u a 5. deň po ukončení akupunktúrnych procedúr alebo vybratí hubiek. Po laparotómii sme makroskopicky hodnotili veľkosť vaječníkov, počet prominujúcich veľkých preovulačných folikulov a počet čerstvých žltých teliesok resp. počet ovulačných bodov. Mikroskopickou analýzou sme hodnotili kvantitatívne a kvalitatívne zmeny folikulárneho aparátu. 41

48 Výsledky Vaječníky kontrolných bahníc vykazovali všetky príznaky hlbokého anestru s relatívne malými vaječníkmi s hladkým povrchom bez prominujúcich folikulov alebo žltého telieska a bez ovulácii. U hormonálne synchronizovanej skupine bahníc sme zaznamenali priemerne 4,8 preovulačných folikulov s 0,7 podielom ovulácií/vaječník s histologicky plnohodnotnými žltými telieskami. Bahnice po trojnásobnom akupunktúrnom ošetrení vykázali signifikantne nižší počet preovulačných folikulov (3,2/vaječník) ako aj počet ovulácií (0,40/vaječník). Z celkového počtu 4 ovulácií histologickým vyšetrením u týchto bahníc bola zaznamenaná plnohodnotná luteinizácia iba u dvoch ovulácií.. Prevažná časť neovulovaných folikulov nejavila známky povestného a typického intenzívneho prekrvenia folikulárnych štruktúr. Nakoľko v dostupnej odbornej literatúre nie sú doteraz hodnoverné údaje o použití akupunktúrnej techniky u oviec nemôžeme priamo konfrontovať nami dosiahnuté výsledky s inými autormi. Podľa Vangelenburga (1996) stimuláciou aktívnych bodov močového mechúra je možno ovplyvniť ovulačný cyklus kráv. Uvedený autor uvádza pozitívne výsledky po ošetrení aktívnych bodov BL 22 24, BL 26, efekt Xan Chi a BL 30 pri superovulačných pokusoch u kráv. Porovnanie prezentovaných výsledkov stimulácie vaječníkov vyjadrené ovulačným indexom po akupunktúrnom ošetrení s výsledkami synchronizácie a ovariálnej stimulácie referovanými Arendarčíkom a kol. (1985) je možné konštatovať vyrovnanie biologického efektu akupunktúry a použitia GnRH. Dosiahnuté výsledky účinku akupunktúrnej stimulácie je však možno interpretovať a čiastočne vysvetliť priamym účinkom akupunkturného zásahu na vaječníky cez ovplyvnenie endomorfného neuro-endokrinného systému v hypotalanickohypofyzarných štrukturach ( Lin a kol., 1988). Inou možnou cestou účinku by mohla byť aktivovanie centrálneho a periférneho epinefrického a chlinergického autonomného systému sympatikovej a parasympatikovej inervácie a centralného katechol-estrogenného systému (Stener- Victorin a kol, 2000). Problematickou a doposiaľ nevysvetlenou otázkou zostáva frekventovaný počet tzv. neplnohodnotných ovulácií s nedostatočne rozvinutým procesom postovulačnej luteinizácie po akupunktúrnej procedúre. Záver Z nami dosiahnutých výsledkov vyplýva, že v individuálnych prípadoch, keď je zabezpečená optimálna výživa a starostlivosť o bahnice plemena merino je možné za účelom ovplyvnenia funkcie vaječníkov bahníc použiť techniku akupunktúry cez stimuláciu akupunkčných bodov 42

49 BL 21 a 22. Dĺžka trvania stimulácie minút pri troch opakovaniach procedúr, s odstupom jedného dňa je pri prevedení lege artis postačujúca na pozitívne ovplyvnenie funkcií zdravých fyziologicky normálnych funkčných vaječníkoch bahníc v anestrickom období. Literatúra 1. ANTONUCCI, R.(1979): Act. Med. Vet., 25, ARBEITER, K.- HOLLER, W.(1983): Tierarztliche, UMSCHAV, 38, ARENDARČIK, J. a kol (1985): Záverečná správa ved. Úlohy č.vi-6-1/12, JAROSZEWSKI, J.- KOTWICA, J.(1992): Medicina Weterinaryjna, 48, KOTHBAUER, O.(1994): Vanengelenburg (1994): In: Scheon: Veterinary Acupuncture, LIN, J, H a kol. (1988) : A. J. Chin. Medicine, 16, STENER-VICTORIN, E. a kol. (2000) : Biol. Reprod. 63, 5, SZATKOWSKA, C. LAKOMY, A. ( 1987) : Polskie Archiwum Weterinaryjne, ART. Olsztyn, 27,

50 VPLYV VÝŽIVY NA CHEMICKÉ ZLOŽENIE PRSNEJ SVALOVINY BROJLEROVÝCH KURČIAT INFLUENCES ON CHEMICAL COMPOSITION OF BREAST MUSCLE BROILERS Haščík,P., Čuboň, J., Kulíšek, V. Slovenská poľnohospodárska univerzita Nitra Abstract In the experiment chemical composition of breast muscle of hybrid ISA 30 are evaluated. The completes foods diets on the base animal meal and vegetable foods where compared. The significant differences of chemical composition in the breast muscles where only in higher protein contents and higher cholesterol contents in the experimental groups ((P 0,05, P 0,01) The lower sloughter weights and higher cholesterol content in the group feeds with complete food diets based only vegetable components negatively influenced the economic of fattening. The biological influence substance, probiotics, fytobiotics, syntetics aminoacids for increasing growth intensity and slaughter weights are neceseary to add to complete food diets based on vegetable foods. The higher nutrition composition positively affects nutritive value of meat. For consumers of meat if means the lower risk of cardiovascular diseases. Key words: complete diets, meat chemical composition, chickens, breast muscles, Úvod Trendy racionálnej výživy sa v súčasnom období zameriavajú na dietetické vysoko stráviteľné živočíšne produkty. Zo živočíšnych produktov, ktoré sa vyrábajú vo veľkovýrobných prevádzkach sa najlepšie hodnotí hydinové mäso, ako jeden z najbohatších zdrojov bielkovín (Holoubek, 2001). Dôležitým článkom pre zabezpečenie optimálnej jatočnej a nutričnej hodnoty mäsa je výživa. Vo výžive hydiny platí zásada, že hydina musí byť kŕmená len krmivami, pri ktorých nehrozí prenos ochorení na človeka po konzumácii hydinového mäsa. Vzhľadom na to, že v poslednom období sa vo svete rozširuje ochorenie BSE, zvyšuje sa percento kardiovaskulárnych ochorení ako aj rakoviny, čo lekári prisudzujú dlhodobo zvýšenému príjmu tukov v potrave (Chudý et al., 2000). Je dôležité sledovať aj samotné zloženie kompletných kŕmnych zmesí používaných pri výkrme brojlerových kurčiat, čo v poslednom období viedlo k zákazu používania mäsokostných múčok, antibiotických preparátov 44

51 a je tendencia úplného vylúčenia živočíšnych múčok z recepturálneho zloženia kŕmnych zmesí pre hydinu ako aj ostatné monogastrické zvieratá. Pre zvyšovanie zdravotnej stránky u hydiny, zabezpečenie kvalitného jatočného produktu ako aj správne hospodárske využitie krmiva sa v poslednom období využívajú rôzne probiotické, resp. enzymatické preparáty, ktoré by mali byť alikvótnou náhradou za zakázané živočíšne múčky. Touto problematikou sa zaoberal celý rad autorov Nahashon et al. (1992), Kumrecht a Zobač (1998) Haščík et al. (2004). Okrem samotnej produkcie hydiny má hydinové mäso význam aj z hľadiska jeho kvalitatívnej skladby, nakoľko obsahuje vysoký obsah vysokostráviteľných bielkovín a málo lipidov s vysokým zastúpením nenasýtených mastných kyselín na rozdiel od iných živočíchov (Kerekréty, 1998). Podľa Brázdovej (1996) 100 gramov jedlého podielu kurčiat má energetickú hodnotu 1100 kj, kuracích pŕs 370 kj a stehien 620 kj. Podobne aj Horváthová et al (1994) uvádza, energetickú hodnotu požívateľného podielu, ktorá sa pohybovala na úrovni 980 až 1198 kj na 100 g. Uhrín et al. (1993) vyhodnotil nutričnú hodnotu viacerých hybridných kombinácii brojlerových kurčiat v 100 g svaloviny a zistil priemerný obsah bielkovín v stehennej svalovine 21,33-22,01 g a v prsnej svalovine 22,80-23,40 g, obsah tuku 1,10-1,42 g v stehennej svalovine a v prsnej 0,45-1,22 g. Komplexné hodnotenie kurčiat bez a s kožou vo svojich prácach zhodnotili Mojto a Palanská (1997) a Mojto a Zaujec (2001), ktorí uvádzajú priemerný obsah bielkovín na úrovni od 18,67 do 22,20 g, obsah tuku 2,05-12,02 g, cholesterolu mg a energetickú hodnotu v priemere kj na 100 g mäsa. Cieľom nášho experimentu bolo na výkrmových kurčatách hybridnej kombinácie ISA 30, ktoré boli vykrmované kompletnými kŕmnymi zmesami zloženými na báze živočíšnych múčok, antibiotických a rastových doplnkov resp. vylúčne zložených len z rastlinných krmív vyhodnotiť ich vplyv na chemické zloženie najcennejšej t.j. prsnej svaloviny jatočného tela kurčiat. Materiál a metódy V nami sledovanom experimente boli vytvorené 2 skupiny zvierat po 100 ks výkrmových kurčiat hybridnej kombinácie ISA 30. Kurčatá boli kŕmené sypkými kompletnými kŕmnymi zmesami HYD-01 do 21 dní výkrmu a od 22 dňa do skončenia výkrmu kŕmené granulovanými kŕmnymi zmesami HYD-02 systémom ad libidum. Dĺžka výkrmu bola 42 dní. Kŕmne zmesi boli vytvorené len na báze živočíšnych krmív, antibiotických preparátov a stimulátorov rastu (kontrolná skupina) a na báze rastlinných krmív (pokusná skupina). Zloženie kompletných kŕmnych zmesí 45

52 uvádzame v tabuľke 1. Na hodnotenie chemického zloženia mäsa sme po základnej jatočnej rozrábke 30 ks brojlerových kurčiat z každej skupiny odobrali najcennejšiu časť jatočného tela t.j. prsnú svaloviny bez kože. Základné chemické zloženie mäsa bolo spracované pomocou prístroja INFRATEC 1265 (NSR), kde sme vyhodnocovali obsah sušiny, bielkovín a tuku v g.100 g -1. Obsah popola v g. 100 g -1 bol stanovený spaľovaním vzorky v muflovej peci pri 550 o C a obsah cholesterolu v mg.100 g -1 sa zistil spektorfotometricky podľa Horňákovej a kol. (1974). Sledované hodnoty chemického zloženia prsnej svaloviny bez kože sú zobrazené v tabuľkách 2 a3. Výsledky boli štatisticky spracované pomocou štatistického programu STATGRAFICS, kde sme vypočítali základné štatistické charakteristiky (aritmetický priemer, smerodajná odchýlka, minimum, maximum, koeficient variability) a na určenie preukaznosti rozdielov medzi sledovanými skupinami sme použili t-test.. Výsledky a diskusia Náš ako aj európsky spotrebiteľ si vyžaduje podľa Mojta a Palanskej (1997) mäso chudé s minimálnym mramorovaním, t.j. nižším obsahom vnútrosvalového tuku, ale je nutné si zároveň uvedomiť, že znižovaním podielu tuku v jatočnom tele zvierat sa znižuje aj obsah vnútrosvalového tuku, čo môže mať zlý dopad na senzorické vlastnosti mäsa. Variabilita priemerných hodnôt chemického zloženia mäsa je aj v rámci druhu zvierat veľká, pričom jednou z možností ovplyvnenia jeho zloženia je výživa. Mäso hydiny je zo zdravotného hľadiska považované za mäso vysoko dietetické a preto aj snahou nášho experimentu bolo preveriť jeho chemické zloženie v prsnom svale vplyvom nových trendov vo výžive výkrmových kurčiat. 46

53 Tabuľka 1 Zloženie štartérovej a rastovej kompletnej kŕmnej zmesi pre výkrmové kurčatá hybridnej kombinácie ISA 30 do 42 dní výkrmu Sledovaná skupina Kontrolná Pokusná Kontrolná Pokusná Komponenty HYD-01 HYD-02 Pšenica 12,0 15,501 9,5 16,0 Jačmeň 5,0 Kukurica 41,2 45,0 51,0 48,375 Soj.extr.šrot 47 % 31,0 36,0 28,0 32,0 Slnečnic pokrutiny 3,0 Repkové výlisky 3,0 Rybia múčka 72 % 1,25 Rybia múčka 62 % 2,0 Pšeničná múka 0,72 Sójový olej 1,3 2,5 Pšenič. bielkovina 1,25 Vápenec mletý 1,4 1,684 1,3 1,35 Monokalciumfosfát 1,65 1,0 1,0 1,4 Mycosorb Latech 0,02 0,020 Biostrong 0,015 Sel.plex 0,010 Bio - Cox 120 0,055 Betaín HCL 0,015 0,020 0,020 0,015 Kŕmna soľ 0,3 0,4 0,35 0,3 Lyzín 99 % 0, ,18 0,25 Treonín 99 % 0,020 Methionín 99 % 0,21 0,15 0,200 0,20 Avylamicín 0,01 Robenidín 0,05 Blend-05 0,045 0,040 0,045 0,045 MMD 03 0, ,065 0,065 Tabuľka 2 Chemické zloženie prsnej svaloviny hybridnej kombinácie ISA 30 Ukazovateľ Skupina x sx min. max. v % Obsah sušiny Kontrolná 25,70 0,192 24,91 27,10 2,37 g.100g -1 Pokusná 26,07 0, ,52 26,50 1,31 Obsah Kontrolná 23,14 0,132 22,4 23,6 1,80 bielkovín -1 g.100g Pokusná 23,62 0,163 23,0 24,40 0,163 Obsah tuku Kontrolná 1,45 0,263 0,90 3,70 57,26 g.100g -1 Pokusná 1,39 0,170 0,9 2,3 38,73 Obsah Kontrolná 1,107 0,013 1,0 1,15 3,78 popola -1 g.100g Pokusná 1,064 0,017 1,0 1,15 5,11 Obsah Kontrolná 40,95 14,426 34,58 46,48 11,01 cholesterolu -1 mg.100g Pokusná 50,85 2,637 36,5 64,80 2,63 47

54 Na základe nami dosiahnutých výsledkov môžeme konštatovať, že obsah sušiny sa pohyboval v prsnej svalovine od 25,70 g (kontrola) po 26,07 g (pokus) v 100 g mäsa, čo je porovnateľné s výsledkami Uhrína et al. (1993), Chudého (1994), resp. Mojtu a Palanskej (1997), ktorí zistili obsah sušiny na úrovni 25,36 až 26,19 g.100 g -1. S množstvom sušiny v jatočnom tele úzko súvisí aj obsah bielkovín, tuku, resp. popolovín. Obsah bielkovín sa dosiahol v prsnej svalovine v kontrolnej skupine 23,14 g, čo bolo menej o 0,48 g oproti pokusnej skupine, kde hodnota tohto ukazovateľa dosiahla úroveň 23,62 g.100 g -1. Dosiahnuté výsledky pri skrmovaní len rastlinných krmív sú na vysokej úrovni, nakoľko Uhrín (1993) resp. Chudý (1994) dosiahol pri skrmovaní komerčných kŕmnych zmesí so zastúpením živočíšnych múčok hodnotu bielkovín v prsnej svalovine od 22,65 do 23,40 g 100 g -1, čo korešponduje s našimi výsledkami ako aj názormi iných autorov, ktorí pri hydine deklarujú výšku bielkovín v mäse na úrovni 23 %.Dôležitým ukazovateľom z hľadiska kulinárských vlastností mäsa a na druhej strane zo zdravotnej stránky je obsah tuku a cholesterolu. Tuk v prsnej svalovine bol 1,39 g (pokus) a 1,45 g (kontrola). Z hľadiska porovnania skupín, môžeme konštatovať, že rastlinné krmivá tvoriace KKZ v pokusnej skupine vplývali na nižšie zastúpenie obsahu tuku v prsnej svalovine ako komerčne vyrábané KKZ použité na kŕmenie v kontrolnej skupine. Hodnoty obsahu tuku v našom pokuse sú jednoznačne nižšie ako uvádza Chudý (1994) resp. Mojto a Zaujec (2001), ktorí namerali hodnoty v prsnej svalovine a celkovom kurčati bez kože 2,05 až 2,32 g.100 g-1. Obsah cholesterolu sme zistili v prsnej svalovine 40,95 mg (kontrola) až 50,85 mg (pokus). Výsledky obsahu tuku v pokusnej skupine potvrdzujú, že kompletná kŕmna zmes zložená len z rastlinných krmív znižuje obsah tuku, ale nepotvrdili tendenciu znižovania obsahu cholesterolu v najcennejších častiach jatočného tela výkrmových kurčiat, čo je v rozpore s údajmi, ktoré zistili Haščík et al. (2005), a probiotiká tento ukazovateľ taktiež výrazne nezvyšujú. Z hľadiska zdravotného je dôležité pre vlastného konzumenta vedieť, že čistá svalovina obsahuje menej tuku a cholesterolu ako svalovina s kožou a podkožným tukom. Naše výsledky výrazne popierajú názory Benkovej a Šabíka (1997) resp. Holoubeka (2001), ktorí uvádzajú, že hydinové mäso v priemere obsahuje niekoľkonásobne menej cholesterolu ako mäso bravčové, kde bolo namerané podľa Mojta a Zaujeca (2001) 56 mg. 100 g -1. Obsah popola sa pohyboval v priemere 1,10 g v 100 g prsnej svalovine v oboch sledovaných skupinách, čo je v súlade s výsledkami Uhrína et al. (1993), Chudého (1994), Angelovičovej (1997) a iných. Z hľadiska štatistického môžeme konštatovať, že preukazne štatistické rozdiely (P<0,05) u výkrmových kurčiat hybridnej kombinácie 48

55 ISA 30 medzi sledovanými skupinami sa zaznamenali len v oblasti obsahu bielkovín a cholesterolu v prospech pokusnej skupiny. Súhrn V pokuse sme hodnotili chemické zloženie prsnej svaloviny brojlerových kurčiat hybridnej kombinácie ISA 30 vplyvom rozdielneho zloženia KKZ t.j. na báze živočíšnych múčok a len na báze rastlinných krmív. Na základe dosiahnutých výsledkov nášho experimentu sme zistili zásadné rozdiely chemického zloženia v prsnej svalovine, len v zvýšenom obsahu bielkovín a zvýšenom obsahu cholesterolu v prospech pokusnej skupiny (P 0,05, P 0,01). Aj keď bola transformácia bielkovín vyššia do prsnej časti v pokusnej skupine, negatívnym javom je zvýšenie cholesterolu a v konečnom dôsledku KKZ len na báze rastlinných krmív je vysoko nerentabilná pre dosiahnutie nízkej porážkovej hmotnosti, čím je ovplyvnená aj celková ekonomika chovu. Z tohto hľadiska je nutné do KKZ vytvorených len báze rastlinných krmív do budúcnosti pridávať ďalšie účinné látky, ako probiotické preparáty, fytobiotické preparáty resp. syntetické aminokyseliny, ktoré v prvom rade zvýšia úžitkovosť kurčiat pri dodržanej dĺžke výkrmu a negatívne neovplyvnia nutričné zloženie mäsa, čo pre konzumenta v časoch rozmáhajúcich sa kardiovaskulárnych chorôb je nesmierne dôležitým faktorom. Kľúčové slová: kŕmna zmes, chemické zloženie mäsa, brojlerové kurčatá, prsná svalovina, Literatúra ANGELOVIČOVÁ, M Vplyv nízkobielkovinových tukových zmesí na živú hmotnosť a vybrané jatočné ukazovatele jatočnej kvality výkrmových kurčiat. In: Poľnohospodárstvo, 43, 1997, č.10, s BENKOVÁ, J. ŠABÍK, J Hydina nezastúpiteľná súčasť zdravej výživy. In: Slovenský chov, 2, 1997, č. 12, s. 19. BRÁZDOVÁ, Z Maso ve výživě lidí. In: Maso, 1996, č.4, s. 7. HAŠČÍK,P. ČUBOŇ, J. VAGAČ,V Hodnotenie senzorickej kvality hydinového mäsa vplyvom probiotického preparátu IMB 52. In: Maso, XV, 2004, č.1, s HAŠČÍK, P. WEIS, J. ČUBOŇ, J. KULÍŠEK, V. - MAKOVICKÝ,P. KAČÁNIOVÁ, M Vplyv probiotického preparátu v KKZ brojlerových kurčiat ROSS 308 na chemické zloženie mäsa. In: Acta zootechnica, 2005, v tlači. HOLOUBEK, J Dúvody trvalého rozširovaní drúbeže. In: Náš chov, LXI, 2001, č.11, s

56 HORŇÁKOVÁ, M. CHROMÝ, V. HEYROVSKÝ, A Spektrofotometrické stanovení sérového cholesterolu. Biochem.elin. bohem., 1974, 3, s HORVÁTHOVÁ, V. LAGIN,L. BENCZOVÁ,E Jatočná a technologická hodnota kurčiat hybridov Starbro a Hybro. In: Acta Zootechnica, XLIX, 1994, s CHUDÝ, J Vplyv živej hmotnosti a pohlavia na jatočnú kvalitu a nutričnú hodnotu mäsa brojlerových kurčiat. Habilitačná práca, VŠP, Nitra, 1994, s. 73. CHUDÝ, J. ČANIGOVÁ, M. HORVÁTHOVÁ, V. - LAGIN, L. MICHALCOVÁ, A Hodnotenie surovín a potravín živočíšneho pôvodu, VES SPU Nitra, 2000, 206 s., ISBN KUMPRECHT, I. ZOBAČ, P Účinek probiotických preparátú na bázi Sacharomyces cerevisiae a Enterococcus ve směsích s rozdílnou hladinou vitamínú skupiny B na úžitkovost kuřecích brojlerú. In: Czech. J. Anim. Sci., 43, 1998, č.8.,s MOJTO, J. PALANSKÁ, O O nutričnej hodnote mäsa hospodárskych a divých zvierat. In: Výživa a zdravie, 42, 1997, č.1, s MOJTO, J. ZAUJEC, K Aktuálne údaje o chemickom zložení a nutričnej hodnote mäsa hospodárskych a divých zvierat. In: Maso, 2001, č. 4, s NAHASHON, S. N. NAKAUE, H. S. MIROSH, L. W Effect of direct-feed microbials on nutritient retention and production parameters of laying pullets. In: Poultry Science, vol. 71, 1992, no. 1, p UHRÍN, V. HORVÁTHOVÁ, V. HORNIAKOVÁ, E. CHMELNIČNÁ, L. BULLA, J Kvalita hydinového mäsa. In: Acta zootechnica, XLIX, VŠP, Nitra, 111 s., ISBN Kontaktná adresa: Ing. Peter Haščík, PhD. Slovenská poľnohospodárska univerzita v Nitre, Fakulta biotechnológie a potravinárstva, Katedra hodnotenia a spracovania živočíšnych produktov. Tr. A. Hlinku 2, Nitra, [email protected] 50

57 REGULÁCIA PERIFÉRNYCH CIRKADIÁNNYCH OSCILÁTOROV U KURČAŤA POČAS PRENATÁLNEHO A POSTNATÁLNEHO VÝVINU REGULATION OF OSCILLATORS IN PERIPHERAL TISSUES IN CHICKEN DURING PRENATAL AND POSTNATAL LIFE Herichová I. 1, Zeman M. 1,2, Lamošová D. 2 1 Katedra živočíšnej fyziológie a etológie, Univerzita Komenského v Bratislave, Bratislava 2 Ústav biochémie a genetiky živočíchov, SAV, Ivanka pri Dunaji Abstract Many physiological functions express a rhythmic pattern. Daily rhythms persisting without an external input are driven by an autonomous circadian oscillator localised in the brain. The master pacemaker coordinates functions of peripheral oscillators by neural and humoral signals. The aim of our work was to study peripheral clocks in the heart during prenatal and postnatal life of chicken. We measured a daily pattern of clock genes bmal1, per2 and E4BP4 in 19 day old embryos and 4 day old chickens by real time PCR. We conclude that unlikely other circadian features studied till now with use of avian experimental models, peripheral clock in the heart show fully developed pattern of clockwork postnataly. Úvod Mnohé fyziologické funkcie nemajú konštantný priebeh, ale vykazujú v priebehu dňa rytmické zmeny. Rytmy, ktoré pretrvávajú aj v konštantných podmienkach sa nazývaju endogénne biologické rytmy a sú generované cirkadiánnym oscilátorom lokalizovaným v mozgu (Aschoff, 1981). U vtákov predstavuje cirkadiánny systém komplexnú štruktúru pozostávajúcu zo suprachiazmatických jadier hypotalamu, epifýzy a retiny. Relatívna dôležitosť týchto zložiek v regulácii rytmických prejavov, ako sú pohybová aktivita, je u jednotlivých druhov rozličná (Zeman, 1986). Funkčná podstata činnosti biologických hodín zatiaľ bola študovaná najmä u cicavcov. Bolo identifikovaných viacero génov, ktorých delécia spôsobuje disrupciu rytmického profilu aktivity v konštantných podmienkach (Okamura, 2003). V súčasnosti je funkčný model činnosti cirkadiánneho pacemakera založený na predpoklade vytvorenie spätnoväzobnej slučky z tzv. hodinových génov per1, per2, per3, cry1 a cry2 a transkripčných faktorov Clock a Bmal1. Proteínové produkty hodinových génov per1-3 a cry1-2 inhibujú transkripciu svojej vlastnej mrna interferenciou s komplexom stimulačne pôsobiacich transkripčných 51

58 faktorov Clock-Bmal. Transkripčné faktory Clock a Bmal1 naopak indukujú expresiu hodinových génev prostredníctvom väzby na E-box v ich promotori (Shearman et al., 2000). U vtákov je molekulárna podstata biologických hodín menej preštudovaná aj z toho dôvodu, že sa jedná o anatomicky komplexnejšiu štruktúru. Podarilo sa naklonovať viacero homológov hodinových génov identifikovaných v minulých rokoch u cicavcov a zdá sa, že mechanizmus činnosti hodín je v princípe podobný (Fukada a Okano, 2002). Expresia hodinových génov bola dokázana aj v periférnych štruktúrach cicavcov ako sú srdce, sval, pečeň alebo obličky, pričom navodením istých fyziologických, patofyziologických situácií a taktiež počas vývinu je možné pozorovať odpojenie periférnych oscilátorov od centrálneho pacemakera (Balsalobre et al, 2000; Damiola et al., 2000; Sladek et al., 2004, Herichová et al., 2005). Keďže transkripčné faktory regulujúce expresiu hodinových génov sú pod kontrolou hodín a môžu regulovať aj expresiu tzv. output génov, predpokladá sa, že oni sú spojením medzi rytmicky prebiehajúcimi fyziologickými funkciami a biologickými hodinami. Cieľom našej práce bolo charakterizovať expresiu vybraných hodinových génov v srdci kurčaťa počas prenatálneho a postnatálneho vývinu. Materiál a metódy V pokusoch sme použili násadové vajcia brojlerových kurčiat Ross, ktoré boli inkubované v liahniach (Bios Sedlčany, ČR) s automatickým otáčaním. Inkubačná teplota bola udržiavaná v rozsahu 37,5 ± 0,2 ºC a vlhkosť %. Počas inkubácie aj po vyliahnutí boli kurčatá vystavené svetelnému režimu svetlo (L) : tma (D) 12:12, ktorý bol kontrolovaný automaticky a intenzita osvetlenia na úrovni vajec, resp. v chovnej miestnosti bola v rozsahu lux. Odbery vzoriek boli robené pravidelne počas 24h v 4 hodinových intervaloch. V tmavej fáze 24h cyklu sme odbery uskutočnili pri matnom červenom svetle. Vzorky tkanív boli uložené pri 80 o C až do izolácie celkovej RNA. Celková RNA bola izolovaná pomocou Tri-reagentu (MRC, USA) (Chomczynski a Sacchi, 1987). Na extrakciu sme použili g tkaniva, ktoré boli zhomogenizované v 500 µl Tri-reagentu. Na kontrolu integrity RNA sme použili 1 % agarózový gél obsahujúci MOPS a formaldehyd. Gél bol vizualizovaný pomocou systému Gel Doc XR (Bio-Rad, USA) a záznam gélu bol uložený v digitálnej forme. Kvalita RNA bola dobrá a nezistili sme žiadnu kontamináciu genomickou DNA. Syntéza cdna bola urobená pomocou kitu ImProm-II Reverse Transcription System (Promega, USA) s použitím oligo(dt) 15 a 1 µg 52

59 celkovej RNA. RNA s primermi sme denaturovali 5 minút pri 75 C. Reakčná zmes pozostávala z nasledujúcich zložiek: 1 x reakčný pufor, 2 µl 25 mm MgCl 2, 1µl 10 mm dntps, 0,5 µl RNasin ribonukleázový inhibítor, 1 µl reverznej transkriptázy. Po 5 minútovej inkubácii pri 25 o C, prebiehal prepis pri 42 o C 60 minút. Na záver sme reverznú transkriptázu tepelne inaktivovali 15 minútovou inkubáciou vzoriek pri 70 o C. cdna bola uložená do kvantifikácie pri 18 o C. Expresiu jednotlivých génov sme analyzovali pomocou polymerázovej reťazovej reakcie (PCR) s použitím špecifických primerov. Relatívnu kvantifikáciu expresie kuracích homológov bmal1, per2 a E4BP4 sme uskutočnili pomocou real time PCR. Signál sme normalizovali vzhľadom na expresiu konštitutívne exprimovaného génu kódujúceho proteín S17. Na kvantifikáciu sme použili 0,5-2 µl cdna a QuantiTect SYBR Green PCR Kit (QIAGEN, Germany). Intenzita signálu počas amplifikácie v 20 µl reakčnej zmesi sa hodnotila na prístroji ABI PRISM 7900HT Sequence Detection System (Applied Biosystems, USA). Podmienky PCR boli: 95 C, 15 min a následne 50 cyklov pri teplotách 94 C, 15 s; C, 30 s a 72 C, 30 s. Špecifita reakcie a molekulová veľkosť amplifikovaného produktu bola zistená pomocou analýzy teploty topenie, ktorá sa uskutočnila ako posledný krok po ukončení amplifikácii v cykleri a elektroforetickým rozdelením produktu na 2 % agarózovom géli. Na normalizáciu možných nepresnotí v pipetovaní reakčného mixu bola použitá fluorescenčná referenčná farbička ROX, ktorá je súčasťou kitu a slúži ako interný štandard merania. Výsledky a diskusia Cirkadiánny systém je schopný nasynchronizovať sa na vonkajší svetelný aj teplotný režim a diskriminovať medzi dominanciou vonkajších signálov už počas poslednej tretiny embryonálneho vývinu. Je teda pravdepodobné, že regulačné zložky cirkadiánneho systému sú v tomto štádiu už vyvinuté (Okabayashi et al, 2003; Zeman et al., 1999; Zeman et al., 2004). Málo sa však vie o vývine periférnych oscilátorov a vzájomnom prepojení centrálnych a periférnych komponent. Práve na objasnenie týchto faktov bol zameraný náš výskum. Naše výsledky ukázali, že expresia Bmal1, per2 a E4BP4 bola počas prenatálneho a postnatálneho vývinu odlišná. Ani jeden z meraných hodinových génov nevykazoval rytmický profil v 19. dni embryonálneho života. V tkanive srdca 4 dňových kurčiat negatívny element spätnoväzobnej slučky per2 a E4BP4 vykazovali vyššie hladiny počas dňa ako počas noci, zatiaľ čo rytmus v expresii pozitívneho elementu slučky Bmal1 mal opačnú tázu. Tieto výsledky dobre korešpondujú s predpokladaným 53

60 modelom činnosti cirkadiánnych hodín u vtákov. Expresia génov kódujúcich Bmal1 aj MOP4 bola v minulosti popísaná u dospelých kurčiat v retine, epifýze, pečeni a srdci v podmienkach LD 12:12 aj v podmienkach konštantnej tmy (Chong a kol., 2003). Expresia mrna kódujúca Bmal1 bola podobne ako v prípade naších výsledkov najvyššia na prechode svetlej a tmavej fázy 24h cyklu. Rytmus expresie per2 a E4BP4 bol u kurčaťa v tkanive srdca charakterizovaný prvý krát v našej štúdii. Záver Na základe našich výsledkov možno konštatovať, že periférne oscilátory začínajú byť funkčné neskôr ako hlavný pacemaker. Napriek tomu, že na 19. deň embryonálneho vývinu boli sledované hodinové gény detekovateľné v tkanive srdca, ich expresia nevykazovala rytmický profil. To, či je na indukciu rytmicity periférnych oscilátorov potrebné spojenie s hlavným pacemakerom alebo sa periférne oscilátory vyvíjajú oddelenie a rytmus sa indukujú autonómne je predmetom ďalších štúdií. Poďakovanie Táto práca bola podporovaná Agentúrou na podporu vedy a techniky na základe zmluvy č.apvt a grantom VEGA 1/1294/04. Literatúra Aschoff J: Plenum Press, New York, pp , Balsalobre A et al.: Science 289: , Chong NW et al.: J Neurochem., 85: , Damiola F et al.: 14: , Fukada Y, Okano T.: Mol Neurobiol., 25:19-30, Herichova I et al.: Mol. Cell Biochem., 270: , Chomczynski P, Sacchi N: 162: , Okabayashi N et al.: Brain Res., 990: , Okamura H: Novartis Found Symp., 253: , Shearman LP et al.: Science, 288: , Sladek M et al.: Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 101: , Zeman M: Čs. fysiol., 35: , Zeman M et al.: J. Pineal Res., 26:28-34, Zeman M et al.: Avian Poult. Biol. Rerv., 15: ,

61 INOVAČNÉ METÓDY ZISKU EMBRYÍ U OŠÍPANÝCH COLLECTION OF EMBRYOS IN GILTS- INNOVATIONAL METHODS Horňáková Ľ., Pošivák J., Lazar G., Valocký I. Klinika pôrodníctva, gynekológie a andrológie, Univerzita veterinárskeho lekárstva, Košice Abstract The application of embryo-transfer (ET) in multiparous swine is limited compared to the unipara ruminant species. Althought this method can be useful in disease control of population (SPF), propagation of endangered swine breeds or obtaining more offspring from sows with high genetic value. The ET has more steps including selection of donor and recipient gilts/sows, cycle synchronization, embryo recovery, handling of the embryos, transfer into recipients. These applications releated to in vitro technologies are reviewed in this paper. Úvod Už desaťročia si produkcia a spotreba bravčového mäsa u nášho obyvateľstva udržuje popredné miesto. V minulosti produkcia zameraná na zvyšovanie populácie ošípaných naberá trend smerom k intenzifikácii a zvyšovaniu reprodukčných ukazovateľov. Napriek geneticky silnému materiálu, výbornému manažmentu a rozvoju biotechnológií dosahujú reprodukčné straty stále vysoké hodnoty. So zavedením umelej inseminácie sa vylúčila "nenahraditeľnosť" kanca, pričom väčšina biotechnologických postupov je maximálne zameraných na samičie pohlavie. Za účelom dosiahnutia fyziologického priebehu rastu a rozmnožovania, čo je úzko späté s dodržaním zoohygienických a chovateľských noriem, sú mimoriadne významné biotechnické postupy a načasovanie regulácie jednotlivých reprodukčných pochodov. Základná znalosť všetkých fyziologických dejov pohlavnej aktivity a faktorov ovplyvňujúcich ich priebeh je východiskom pri uplatňovaní biotechnického riadenia. Indukcia ruje, ovulácie, luteolýzy a zároveň ich zosúladenie patria medzi podstatné metódy riadenej reprodukcie. Materiál a metodika Výber zvierat Do pokusu sme celkovo zaradili 7 kusov ošípaných plemena Slovenská biela ušľachtilá. 5 kusov ošípaných v troch rôznych kategóriách tvorilo skupinu donoriek a 2 ošípané - pohlavne zrelé prasničky boli vyčlenené ako príjemkyne embryí. Pokusné ošípané pochádzali z 55

62 produkčného chovu ŠPP v Zemplínskej Teplici a zo súkromnej farmy Rogus, s.r.o., v Trsťanoch. Výkon zisku ranných embrií (RE) sa vykonal na Klinike pôrodníctva, gynekológie a andrológie na UVL v Košiciach. Druhá časť pokusu - prenos embryí bola vykonaná na súkromnej farme v podmienkach poľnohospodárskej prvovýroby. Biotechnická príprava donoriek a recipientiek - synchronizácia ruje a superovulačné ošetrenie. Do pokusu boli zaradené 2 prepubertálne, 2 pohlavne dospelé prasničky a 1 dospelá prasnica, po dvoch predchádzajúcich pôrodoch určená na vyradenie. Zvieratá boli klinicky zdravé, primeraného telesného rámca, odpovedajúceho veku, pochádzajúce z vyrovnaného vrhu. Pred vlastným pokusom boli odčervené a ultrasonograficky (Aloka SSD-500, Aloca Corp. Ltd. Tokyo, Japan ) vyšetrené na intaktnosť vnútorných pohlavných orgánov. Anamnestické údaje boli potvrdené z evidenčných kariet a váha bola určená odhadom. Zisk embryí. Získanie a prenos raných embryí (RE) boli vykonané chirurgickým spôsobom, laparotomicky, krátkym rezom v linea alba po uložení zvieraťa do chrbtovej polohy. Zákroky boli vykonávané v celkovej anestézii (STRESNIL inj., dávka 2ml/kg ž.h. + NARKAMON 5% inj., 20 mg/kg ž.h.). Získavanie a následný prenos RE sme vykonali na 4.deň po prvej inseminácii. Po exteriorizácii vnútorného pohlavného aparátu a po zaznamenaní superovulačnej reakcie boli vajcovody a maternicové rohy vyplavované (Hunter a kol., 1955, Tervit a Havik, 1976) - každý maternicový roh dvakrát. Na výplavovanie sme použili dvojcestný katéter (Foley 2, WAY TIEMAN, CH 18, 10 ml), na prepláchnutie vajcovodu (Foley 2 WAY TIEMAN, CH 6, 10ml), na krátkodobú kultiváciu RE sme použili komerčné výplachové médium (ViGro Complete Flush Solution, AB Technology Inc., Pullman, WA USA) v celkovej dávke 40-50ml na 1 maternicový roh. Zisk z oboch maternicových rohov boli získané oddelene do sterilných 100 ml kadiniek. Brušná dutina bola po skončení preplachovania zrevidovaná, brušná stena chirurgicky uzavretá a zvieratá antibioticky ošetrené (penicilin a streptomycin, i.m.). Výsledky Synchronizácia ruje. Z celkovo 7 pokusných zvierat ošetrených ecg a HCG sa synchronizácia a superovulácia navodila u všetkých 5 donoriek, estrálny asynchrónny cyklus (oneskorený o 1 deň), bol navodený aj u 2 recipientiek. Ruja u donoriek a recipientiek bola diagnostikovaná podľa príznakov na vonkajších pohlavných orgánoch, ale hlavne podľa reflexu nehybnosti na 4. respektíve 5.deň od podania gonadotropných hormónov. 56

63 Superovulačná odozva, počet ovulácií. Všetkých 5 donoriek vykazovalo nálezy na vaječníkoch. Počet žltých teliesok na vaječníkoch medzi jednotlivými zvieratami značne kolísal. Priemerný počet CL u donoriek bol 26,8. Najpozitívnejšiu superovulačnú odozvu vykazovala skupina pohlavne dospelých prasničiek, kde priemerný počet CL bol 31,5. Zisk RE bol hodnotený ako pomer počtu vyplavených RE, oocytov, fragmentov, zona pellucida a počtu funkčných žltých teliesok na vaječníku. Superovulačná reakcia, celkový počet získaných RE a počet prenosu schopných RE sú znázornené v prehľadnej tabuľke (Tab.1). Prenos RE sme vykonali do 2 pohlavne dospelých prasničiek. Po 35 dňoch po prenose RE sme diagnostikovali ultrasonograficky (Aloka SSD-500, Aloca Corp. Ltd. Tokyo, Japan ) s použitím 5 MHz lineárnej sondy graviditu u 1 prasničky. Počet zvieratdonorky Predpuber tálna prasnička č.1 Predpuber tálna prasnička č.2 Pohlavne dospelá prasnička č.1 Pohlavne dospelá prasnička č.2 Pravý vaječník Počet CL Ľavý vaječník Celkovo Počet získaných RE Počet prenosusc hopných RE Počet oocytov a fragm. zona pellucida Počet degenero vaných RE Počet neovulov aných folikulov Prasnica Spolu Priemer 13,2 13,6 26,8 19,8 15,6 1,4 2,2 3,4 Tab.1 Celkový počet žltých teliesok, počet získaných embryí a počet prenosuschopných embryí u všetkých kategórií donoriek. Diskusia Všetky zvieratá synchronizované použitím HCG a superovulačne stimulované ecg zareagovali pozitívne - viacpočetnými ovuláciami a tvorbou CL. To dokazuje vhodnosť spolupôsobenia HCG a ecg. Prítomnosť veľkých folikulov na vaječníkoch spolu so žltými telieskami svedčí o pokračujúcom stimulačnom pôsobení exogénnych gonadotropínov 57

64 nepretržite rekrutujúcich folikuly, z ktorých však väčšina nie je schopná ovulovať, čo je pravdepodobne spôsobené dočasným nedostatkom LH receptorov prítomných na granulóznych bunkách folikulov (Baird a Mc.Neilly, 1981 ). Zisk RE v našom pokuse bol 87,31 %. Ošípaná sa považuje za zviera celoročne polyestrické, pohlavná aktivita vyjadrená počtom ovulácií, počtom zdravých plodov je ovplyvnená endogénnymi a exogénnymi faktormi, ktoré sa rozhodujúcou mierou podieľajú na reprodukčných pochodoch. To všetko vytvára enormný potenciál pre využitie v chove ošípaných. Aby sa dosiahli optimálne výsledky, treba tiež preniesť do každej príjemkyne aspoň 12 RE vysokej kvality. Ak je príliš málo RE medzi 12. a 17. dňom, alebo ak sa RE nerozptýlia rovnomerne v rohoch maternice, gravidita nenastane. Pri prasniciach recipientkách, ktoré sa oprasia, asi 30 % RE neprežije do pôrodu. Táto strata, ktorá sa podobá na embryonálnu mortalitu u prirodzene gravidných prasníc, a tiež strata všetkých RE pri príjemkyniach, ktoré sa neoprasia (asi 30 %), predstavuje reálne straty pri prenose. Takisto treba získať dostatok skúseností s chirurgickým odberom RE, aby sa zmenšila možnosť tvorby adhézií v reprodukčných orgánoch darkýň, ktoré môžu zapríčiniť neplodnosť. Prasnice sú viac náchylné na tvorbu adhézií po chirurgickom odbere RE než ovce a kravy. Záver Praktický význam a vlastný prínos biotechnických metód v chove prasiat je v zlepšení nástupu a zvýraznení príznakov ruje, v zjednodušení a zrýchlení práce pri detekcii ruje, spresnenie priebehu ruje a ovulácie s možnosťou vykonávať umelú insemináciu v optimálnej dobe, a tak ju významne zracionalizovať. Okrem lepšieho využívania prirodzeného reprodukčného potenciálu prasníc spolu s vytvorením homogénnych skupín zvierat s rovnakým štádiom pohlavného cyklu vytvára lepšie podmienky pre dôsledné a plánované vykonávanie zoohygienických, chovateľských a veterinárnych zdravotných opatrení. Biotechnické metódy racionalizujú starostlivosť o reprodukciu, spravidelňujú priebeh reprodukčných cyklov a umožňujú presnejšie plánovanie produkcie potomstva, umožňujú plné využitie ustajňovacích objektov, náväznosť pracovných postupov, plánovanie a rovnomerné využívanie maštaľného personáluzáverom je treba zdôrazniť, že všetky uvedené výhody sú limitované podmienkami využívania biotechnických metód. Riadená reprodukcia a využitie biotechnických metód nie sú schopné nahradiť nedostatky a hrubé chyby v organizácii a vedení reprodukcie. Neprinesú úžitok, keď nerešpektujú biologické zákonitosti reprodukčných funkcií a procesu rozmnožovania prasníc. 58

65 Poďakovanie Táto práca bola vytvorená s podporou grantu MŠ SR, VEGA 1/0565/03 Literatúra BRUSSOW, K. P. - TORNER, H. - RATKY, J. - SHNEIDER, F. - KANITZ, W.: Aspects of follicular development and intrafollicular oocyte and maturation in gilts, Reprod. Dom. Anim., 31, 1996, DRIANCOURT, M. A. - LOCATELLI, A. - PRUNIER, A.: Effects of gonadotrophin deprivation on follicular growth in gilts, Reprod. Nutr. Dey., 35, 1995, FOXCROFT, G. R. - COSGROVE, J. R. - DING, J. - HOFACKER, S. - WIESAK, T.: Reproductive function, Principles of pig Science., 1993, QUESNEL, H. - PRUNIER, A. - DRIANCOURT, M. A.: Control of folliculogenesis and mechanisms triggering alterations in ovulation rate in pig, Repr. Dom. Anim., 33, 1998, MARTINAT BOTTE, F. - BARITEAU, F - FORGERIT, Y. - MACAR, C. - POIRIER, P. - TERQUI, M.: Synchronisation of oestrus in gilts with altrenogest efects on ovulation rate and foetal survival, Anim. Reprod. Sci., 39, 1995, MEDURI, G.: Comparison of cellular distribution of LH receptors and steroidogenic enzymes in the porcine ovary, J. E.ndocrinol., 148, 1996, PIVKO, J. - GRAFENAU, P. - SOKOL, J.: Prenos ranných embryí zvierat, NITRA, 2000, RÁTKY, J. - BRUSSOW, K. P.: Ovarian activity in gilts including some characteristics of a native breed, Reprod. Domest. Anim., 33, 1998,

66 SLEDOVANIE VPLYVU LACTOBACILUS CASEI VAR. SUBP. PSEUDOPLANTARUM Č. 294 NA VYBRANÉ UKAZOVATELE U PRASIAT MONITORING OF LACTOBACILLUS CASEI VAR. SUBP. PSEUDOPLANTRUM NO. 294 INFLUENCE TO SELECTED FACTORS IN PIGLETS Húska M., Kováč G., Link R., Novotný J., Popelková M. Univerzita veterinárskeho lekárstva, Komenského 73, Košice, Slovenská Republika Abstract The aim of our study was to obtain more information about the influence of casei subp. pseudoplantarum no. 294 oral on the systemic immunity response in the digestive tract of piglets. In two model experiments, 6 pigs in each group - experimental (E) and control (C) - were used. 6 animals in group E were given 3 ml of L. casei subp. pseudoplantarum no. 294 oral. Blood collection was from eyes, through the venous circulation on the 5., 14., 21., 28., 42., 49., 59. and 73. days of age. To realize the aim, we determined phagocytic activity of neutrophils (FA Ne) and leukocytes (FA Lc), the phagocytic activity index of neutrophiles (IFA Ne) and leukocytes (IFA Lc), reduction of tetrazolium salt (INT Test) and concentration of total immunoglobuline- (Tlg), concentration of erytrocytes (Ec), leukocytes (Lc), Hb, Hk, albumines (ALB), total proteins (TP), MCVand glucose. Úvod Celosvetovým trendom pri zvyšovaní efektivity živočíšnej výroby s dopadom na zlepšený zdravotný stav obyvateľstva je využívať vo výrobnom procese nové perspektívne biotechnologické postupy a metódy, ktoré v mnohých smeroch otvárajú v produkcii potravín živočíšneho pôvodu možnosti ďalšej intenzifikácie bez nárokov rastu na materiálne, pracovné a finančné náklady. Materiál a metódy Experiment bol realizovaný v klinických priestoroch Katedry vnútorných chorôb prežúvavcov a ošípaných s vysokobrezou prasnicou, ktorá porodila 12 klinicky zdravých ciciakov plemena Slovenská biela ušľachtilá 75 x Landras 25. Po pôrode boli ihneď ciciaky odvážené, otetované a vytvorili sa dve skupiny, K kontrolná a E experimentálna s približne rovnakou pôrodnou hmotnosťou, v ktorých boli zastúpené obe 60

67 pohlavia. Priemerná hmotnosť vrhu bola 1,12 kg na ciciaka. Prasiatkam v E skupine bol pred prvým prijatím kolostra perorálne aplikovaný injekčnou striekačkou 3 ml Lactobacillus casei var. subp. pseudoplantarum kmeň č. 294 množený v rogózovom bujóne, pričom v 1 ml bolo 10 8 baktérií. Táto dávka sa aplikovala zvieratám denne do veku 73 dní. Lactobacillus casei var. subp. pseudoplantarum kmeň č. 294 bol izolovaný na Katedre infekčných chorôb a tropickej veterinárnej medicíny (ČÍŽEK, 1993) z rektálneho výteru od teľaťa na druhý deň po narodení. Kmeň bol otypizovaný s použitím MIDIPA testov (LENART, KMEŤ, 1986). Výsledky boli overené za pomoci použitia API testov francúzskej proveniencie. Laktobacilový kmeň bol testovaný na schopnosť tvoriť inhibíciu voči vybraným patogénnym kmeňom studničnou metódou. Kmeň 294/89 bol testovaný na schopnosť adherencie črevnej sliznice metódou podľa KMEŤA (1984). Výživa v prvej fáze pokusu od 5. dňa bola zabezpečená obchodne vyrábanou kompletnou kŕmnou zmesou pre ciciaky (ČOS) a v druhej fáze kompletnou kŕmnou zmesou (A1). Krmivo bolo prasiatkam podávané v suchom stave v adlibitnom množstve. Vodu k napájaniu mali zvieratá trvalo k dispozícii. Pre laboratórne analýzy bola krv odobratá z očného splavu - sinus ophtalmicus (KOVÁČ a kol., 1990) všetkým zvieratám na 5., 14., 21., 28., 42., 49., 59. a 73. deň veku zvierat. V odobratej krvi boli stanovené počty erytrocytov (Ec), koncentrácie hemoglobínu (Hb), Hematokrit (Hk), hodnoty stredný objem erytrocytov (MCV), počty leukocytov (Lc), hodnoty INT, fagocytárnu aktivitu neutrofilov (FANe), index fagocytárnej aktivity neutrofilov (IFANe), fagocytárnu aktivitu leukocytov (FALc), index fagocytárnej aktivity leukocytov (IFALc), koncentrácie CIg, celkových bielkovín (CB), albumínov (ALB), glukózy. V oboch skupinách bol sledovaný rozvoj telesnej hmotnosti, zdravotný stav klinickým vyšetrením (SLANINA, 1993). Na 59. deň bolo odporazených 8 kusov prasiat, z každej skupiny po 4 kusy za účelom sledovania hodnôt ph v žalúdku, dvanástniku, lačníku, bedrovníku, slepom a hrubom čreve, z ktorých boli odobraté vzorky na mikrobiologický rozbor a elektrónovú mikroskopiu. Výsledky a diskusia V práci sú zhrnuté výsledky vplyvu účinku testovaných laktobacilových kmeňov na zdravotný stav ošípaných vo vzťahu k vzniku diarhoického sydrómu so zameraním na vybrané ukazovatele. Pri perorálnej inokulácii neautochtónneho kmeňa Lactobacillus casei varietas subp. Pseudoplantarum č. 294 sa zistilo, že u ošípaných: a) testovaný kmeň neovplyvnil hematologický profil (počet Ec, Lc, koncentrácie Hb, Hk a MCV) 61

68 b) dynamika schopnosti aktivácie oxidačného metabolizmu fagocytov (INT) vykázala významný štatistický efekt (p<0.05) na 28. a 59. deň, (p<0.01) na 42. deň, podobne bol zistený signifikantný rozdiel (p<0.01) pri hodnotách FANe, IFANe, FALc, IFALc na 21., 28. a 42. deň v prospech E skupiny zvierat c) testovaný laktobacilový kmeň neovplyvnil dusíkový (bielkovinový) profil, došlo k poklesu koncentrácie CIg počas celého experimentu bola hypoproteinémia a hypoalbuminémia v oboch skupinách zvierat d) neovplyvnil koncentráciu glukózy v sére e) priaznivo ovplyvnil zdravotný stav, čo sa prejavilo stimuláciou rastu a prírastkov zo signifikantým rozdielom (p<0.01) pri ukončení experimentu na 59. a 73. deň f) znížil hodnoty ph v GIT-e u E zvierat, hoci nebola preukázaná štatisticka významnosť medzi skupinami g) nebola dokázaná adherencia na sliznice tenkého čreva elektónovou mikroskópiu. Tab. č. 1 Výsledky hematologického, imunologického, dusíkového, energetického profilu a hmotnosti Odber Vek v dňoch Skupina E n=6 K n=6 I. 5 E K II. 14 E K III. 21 E K IV. 28 E K V. 42 E K VI. 49 E K VII. 59 E K VIII. 73 E K Ec T.l -1 4,48±1,10 4,62±0,50 6,14±0,42 6,56±0,36 6,82±0,28 6,83±0,31 7,50±0,53 7,92±0,12 6,94±0,38 7,12±0,22 7,33±0,27 7,19±0,20 6,93±0,05 6,32±0,20 7,34±0,55 7,22±0,67 Hb g.dl -1 5,08±0,94 5,20±0,83 8,28±0,45 8,40±0,62 9,20±0,46 9,43±0,40 10,05±1,06 11,00±1,56 8,83±1,01 9,50±0,10 10,60±0,42 10,70±0,70 9,35±0,05 8,60±0,60 9,25±0,15 9,55±0,05 Hk l.l -1 0,21±0,01 0,21±0,03 0,31±0,01 0,33±0,02 0,36±0,02 0,36±0,02 0,41±0,04 0,43±0,02 0,36±0,02 0,37±0,01 0,37±0,01 0,38±0,01 0,36±0,02 0,33±0,04 0,39±0,05 0,39±0,06 MCV f.l -1 49,42±2,92 45,40±2,41 50,80±2,41 50,37±4,10 52,48±2,09 53,43±3,89 54,00±2,45 54,67±3,86 52,10±0,71 51,70±1,20 49,90±0,88 52,25±0,45 51,80±2,90 51,70±4,70 53,30±2,60 53,75±3,05 Lc G.l -1 7,58±2,43 5,30±0,86 14,43±3,38 14,07±1,55 15,28±3,22 14,23±2,16 22,28±1,49 21,80±4,42 15,93±0,97 14,30±2,10 12,90±1,20 14,00±1,80 14,85±2,05 13,25±0,15 16,70±0,90 13,85±1,65 Odber Vek v dňoch Skupina E n=6 K n=6 INT % FA Ne % IFA Ne % FA Lc % IFA Lc % I. 5 E K 1,04±0,22 0,93±0,20 37,95±10,64 46,96±10,46 2,02±0,74 3,56±0,96 22,80±6,73 22,00±3,08 2,68±0,13 2,60±0,18 II. 14 E K 1,34±0,15 1,33±0,06 31,25±5,77 30,35±6,26 2,18±0,65 1,97±0,64 19,25±3,49 19,00±4,55 2,83±0,29 2,67±0,09 III. 21 E K 1,36±0,16 1,20±0,20 49,03±2,08** 33,40±2,22 4,99±0,97** 2,83±0,47 28,00±0,71** 19,33±0,47 5,05±0,17** 2,85±0,02 IV. 28 E K 1,34±0,31* 0,99±0,03 47,13±2,13** 32,18±2,22 5,23±0,50** 2,62±0,20 28,50±1,12** 19,67±0,94 5,14±0,62** 2,89±0,14 V. 42 E K 1,55±0,26** 1,12±0,06 47,81±2,27 47,21±0,09 5,41±0,50** 4,07±0,62 28,33±0,47 25,50±3,50 5,22±0,13** 4,00±0,21 VI. 49 E 1,86±0,56* 47,00±1,15 7,43±1,19** 30,00±0,82 6,20±0,79 62

69 K 1,59±0,02 43,93±3,43 5,11±0,82 27,00±3,00 4,88±0,80 VII. 59 E K 1,85±0,06* 1,61±0,05 47,90±2,10 45,50±1,30 7,05±1,22 5,72±0,61 29,50±1,50 28,00±3,00 6,70±1,12 5,40±0,58 VIII. 73 E K 1,86±0,05 1,83±0,05 42,95±2,05 42,40±2,05 5,85±0,61 5,04±0,33 28,50±0,50 27,50±0,50 5,64±0,61 5,50±0,29 * P<0.05 * *P<0.01 Odber Vek v dňoch Skupina E n=6 CIg u.zst CB g.l -1 ALB g.l -1 Glukóza mmol.l -1 Hmotnosť kg K n=6 I. 5 E K 9,49±3,22 7,44±2,53 57,50±3,73 55,94±3,25 27,52±1,75 26,46±1,59 5,73±0,41 5,57±0,32 1,46±0,80 1,43±0,86 II. 14 E K 7,91±3,01 7,32±1,56 52,78±7,93 51,26±4,47 32,63±1,15 31,73±0,20 5,66±0,19 5,12±0,29 3,28±0,63 2,98±0,96 III. 21 E K 7,87±2,43 7,57±1,12 45,61±4,59 42,62±4,59 32,45±0,85 30,62±1,36 5,87±0,35 5,80±0,41 5,25±1,50 4,95±1,69 IV. 28 E K 7,71±0,79 6,82±3,74 49,68±0,59 49,49±2,88 29,52±2,10 29,29±1,13 3,85±0,09 3,58±0,16 5,78±1,23 5,13±2,13 V. 42 E K 5,31±1,05 4,94±2,11 50,91±0,91 49,89±0,61 23,53±1,01 22,78±0,78 5,40±0,20 5,18±0,35 9,13±2,09 8,36±1,50 VI. 49 E K 5,12±0,57 4,68±1,12 48,07±1,11 46,30±1,30 23,55±0,32 23,28±0,52 4,53±0,30 4,34±0,26 11,27±4,41 10,58±2,30 VII. 59 E K 5,08±0,19 4,63±0,32 58,85±2,55 53,85±1,55 20,80±2,40 20,45±4,15 4,45±0,15 4,42±0,06 15,98±2,10 14,95±2,45 VIII. 73 E K 4,50±0,40 4,27±0,11 60,10±1,39 56,80±0,11 27,50±1,55 24,55±2,45 5,64±0,34 4,68±0,34 18,69±0,50 17,25±2,75 Záver Doterajšie závery o nepresvedčivej efektívnosti používaných probiotík vyústili v potrebu jasnejšieho definovania ich účinku. Musíme si uvedomiť, že dominantný mikrobiálny predstavitelia jednotlivých úsekov črevného traktu spolu nažívajú aj so svojimi plazmidmi, temperovanými a virulentnými bakteriofágmi a občas, keď sú dominantné mikroorganizmy v stresovom stave sa odohrávajú medzi nimi interakčné vzťahy nielen na fenotypovej úrovni (enzýmy, rastové faktory, inhibítory, antibiotiká a bakteriocíny), ale aj na genotypovej úrovni (transformácia, transdukcia a konjugácia, delécia, inzercia DNA segmentov a génov). Až poznanie týchto zákonitosti umožní vedeckú selekciu probiotických mikroorganizmov a vedecký spôsob kontroly zloženia a účinnosti firemných probiotických výrobkov. Pochopením mechanizmov účinku jednotlivých zložiek probiotík bude možné určiť a vybrať selekčné kritéria. Je potrebné charakterizovať interakčné vplyvy rôznych typov probiotík vo vzťahu k nutričným, environmentálnym a zdravotným vplyvom pre rôzne vekové kategórie a rôzne druhy zvierat. Až poznanie týchto zákonitostí umožní vedecké pochopenie symbiózy mikroorganizmov zažívacieho traktu a vedecký spôsob kontroly zloženia krmiva vo vzťahu k metabolickým procesom. Literatúra u autorov 63

70 VPLYV PODÁVANIA LACTOBACILLUS REUTERI NA VNÚTORNÉ PROSTREDIE PRASIAT INFLUENCE OF LACTOBACILLUS. REUTERI ADMINISTRATION TO INTERNAL ENVIROMENT IN PIGS Húska, M., Reichel, P., Novotný J., Link R., Popelková M. Univerzita veterinárskeho lekárstva, II. interná klinika, Košice, Slovenská republika Abstract The aim of our study was to obtain more information about the influence of Lactobacillus reuteri on the systemic immunity response in relationship to bacterial pathogen E. coli in the digestive tract of piglets. In two model experiments, 18 pigs in each group - experimental (E) and control (C) - were used. For 49 days, 10 animals in group E were given 3 ml of L. reuteri oral for 5 days. Each animal was applied with 3 ml E. coli. Blood collection was from eyes, through the venous circulation on the 49, 54 and 59 days of age. To realize the aim, we determined phagocytic activity of neutrophils (FA Ne) and leukocytes (FA Lc), the phagocytic activity index of neutrophiles (IFA Ne) and leukocytes (IFA Lc), reduction of tetrazolium salt (INT Test) and concentration of total immunoglobuline- (Tlg). 24 hours after application of E. coli in group C, first clinical changes, such as increased temperature and, in one case, death, appeared. In group E no death was recorded. Obtained values were highest in group E on 59 day of age. Úvod Ochorenia gastrointestinálneoho traktu (GIT) majú najväčší podiel na morbiditu a mortalitu prasiatok v rannom veku. Veľmi častým pôvodcom hnačkových ochorení prasiatok infekčnej etiológie sú rôzne kmene E. coli (Holoda, Mikula, 1995). Aplikácia probiotík predstavuje jednu z efektívnych metód prevencie ochorení tráviaceho traktu (Révajová, Bomba et al., 1998). Probiotikum ako prirodzený bioregulátor napomáha udržiavať rovnováhu črevnej mikroflóry a bráni kolonizácii GIT-u patogénnymi baktériami (Mikula et al., 1998). Pre probiotické účely sa z mikroorganizmov najčastejšie používajú laktobacily (Vandenbergh, 1993). Materiál a metódy Experiment bol realizovaný na Katedre vnútorných chorôb prežúvavcov a ošípaných na UVL v Košiciach. V dvoch modelových pokusoch bolo použitých 18 ks prasiat, kríženci plemien slovenskej bielej 64

71 ušľachtilej - 75% x Landras - 25% (Buleca et al., 1996) odstavených na 42. deň. Odstavčatá použité v každom pokuse pochádzali z jedného vrhu, rovnakého genetického pôvodu, veku, približne rovnakej hmotnosti. V každom pokuse boli vytvorené dve skupiny - experimentálna (E 5 zvierat) a kontrolná (K 4 zvieratá) oboch pohlaví. Na 49. deň veku prasiat bol 10 zvieratám v experimentálnej skupine aplikovaný perorálne L. reuteri 5 dní v množstve 3 ml na jedno zviera, 1 ml bujónu obsahoval 10 8 L. reuteri. Na 54. deň bol jednorázovo všetkým zvieratám perorálne aplikovaný enteropatogén E. coli 08:K88 v množstve 3 ml na jedno zviera, v 1 ml bolo 10 8 baktérií. Za účelom stanovenia počtu erytrocytov (Ec), leukocytov (Lc), koncentrácie hemoglobínu (Hb), hodnôt hematokritu (Hk), priemerného objemu erytrocytov (MCV), hodnôt FA Ne, IFA Ne, FA Lc, IFA Lc, INT-testu a koncentrácie CIg krv všetkým zvieratám bola odobratá z očného venózneho splavu v deň odstavu, na 49. deň pred aplikáciou L. reuteri, na 54. deň pred aplikáciou E. coli a 59. deň. Pred každým odberom boli zvieratá vážené. Po ukončení experimentu na 59. deň sa 9 zvierat odporazilo za účelom stanovenia ph v žalúdku, duodene, jejune, ileu, coecu a kolóne. Zároveň z nich boli odobraté vzorky k potvrdeniu adherencia elektrónovým mikroskopom. Stanovenie počtu Er, Lc, koncentrácie Hb, hodnôt Hk, MCV bolo vykonané a vyhodnotené analyzátorom krviniek Serono 150 a Dilutor 106 PLUS. Test FA Ne, IFA Ne, FA Lc, IFA Lc bol prevedený pomocou HEMA častí. Kvantitatívne stanovenie tetrazolium reduktázovej aktivity (INTtest) sme previedli modifikovanou metódou so škrobom. Koncentrácia sérových imunoglobulínov (CIg) bola stanovená turbidimetrickou metódou, CB, Alb, Gluk, BIOLA testy (Lachema Brno). Výsledky a diskusia Počty leukocytov vykazovali postupný nárast v E skupine, najvyššie boli na 59. deň veku 18,69±0,70 G.l -1, bez významného štatistického rozdielu medzi skupinami. Počas celého experimentu boli počty Lc v rozmedzí fyziologického optima. Test fagocytárnej aktivity s prítomnosťou HEMA častíc nám potvrdil nárast na 59. deň FANe u E skupiny 37,80±0,44 % oproti K skupine 33,69±1,53 %, IFANe u E skupiny 3,87±0,01 % oproti K skupine 3,56±0,20 %, FALc u E skupiny 34,0±1,00 % ku K skupine 29,50±0,50 %, IFALc 3,87±0,08 % v E skupine ku K skupine 3,03±0,36 %. Všetky tieto ukazovatele boli štatisticky významné (p<0.01). Kvantitatívne stanovenie tetrazolium reduktázovej aktivity (INT test) korelovalo s výsledkami testu fagocytárnej aktivity (HEMA častíc). Nárast metabolickej aktivity fagocytov bol na 59. deň 1,94±0,04% v E skupine ku 1,38±0,11 % v K skupine. Bilancia dusíkového 65

72 (bielkovinového) profilu zastúpená koncentráciami celkových bielkovín a albumínov, vykazovala vzácnu rovnováhu medzi skupinami. Koncentrácie CB a ALB sa pohybovali v rámci udávaných referenčných hodnôt v obidvoch skupinách.v našom experimente došlo v IV. odbere k nárastu koncentrácie CIg u E skupiny 21,79±0,99 u ZST ku K skupine 19,49±0,80 u ZST, čo priaznivo ovplyvnilo zdravotný stav experimentálnych zvierat pri ukončení pokusu a pozitívne ovplyvnilo aj hmotnosť v tejto skupine. Po odporazení zvierat bol negatívny patologickoanatomický nález v tráviacom aparáte. Hodnoty ph v daných úsekoch GITu boli v E skupine nižšie, čo mohlo byť ovplyvnené prítomnosťou probiotika, ale štatisticky významný rozdiel medzi porovnajúcimi úsekmi GITu a skupinami nebol preukázaný. Tabuľka č. 1 Počet leukocytov (Lc), hodnoty tetrazolium reduktázovej aktivity leukocytov (INT), hodnoty fagocytárnej aktivity neutrofilov (FANe), index fagocytárnej aktivity neutrofilov (IFANe), hodnoty fagocytárnej aktivity leukocytov (FALc), index fagocytárnej aktivity leukocytov (IFALc) a koncentrácii celkových imunoglobulínov (CIg) po aplikácii Lactobacillus reuteri a E. coli K-88 u odstavčiat Skupina Lc INT FA Ne Odber Vek v E n=9 G.l -1 % % K n=9 dňoch I. 42 E 15,64±1,04 1,15±0,12 31,30±2,80 K 15,58±1,08 1,16±0,01 31,33±2,89 II. 49 E 16,22±1,19 1,16±0,13 31,39±2,81 K 16,35±1,00 1,16±0,01 31,73±3,20 III. 54 E 18,46±1,32 1,56±0,18 34,59±2,21 K 15,60±1,49 1,33±0,26 33,06±2,57 IV. 59 E 18,69±0,70 1,94±0,04** 37,80±0,44** K 18,65±0,50 1,38±0,11 33,69±1,53 Skupina FA Lc IFA Lc CIG Odber Vek v E n=9 % % u.zst K n=9 dňoch I. 42 E 21,20±2,93 1,73±0,48 13,76±2,40 K 21,25±2,59 1,82±0,38 13,86±2,91 II. 49 E 22,20±2,93 1,79±0,53 14,22±2,40 K 23,00±2,55 1,89±0,41 14,24±3,11 III. 54 E 27,00±1,26 2,65±0,42 15,54±2,51 K 25,25±2,68 2,45±0,26 15,59±3,89 IV. 59 E 34,00±1,00** 3,87±0,08** 21,79±0,99** K 29,50±0,50 3,03±0,36 19,42±0,80 Odbery: I. pri odstave E experimentálna II. pred aplikáciou L. reuteri skupina, podaný L. reuteri III. pred aplikáciou E. coli K-88 K kontrolná skupina IV. pri ukončení experimentu ** - p < 0,01 IFA Ne % 1,72±0,44 1,72±0,40 1,80±0,52 1,78±0,42 3,16±0,75 2,81±0,72 3,87±0,01** 3,56±0,20 66

73 Tabuľka č. 2 Počet erytrocytov (Ec), koncentrácia hemoglobínu (Hb), hematokritu (Hk) a priemerný objem erytrocytov (MCV) po perorálnej aplikácii Lactobacillus reuteri a E. coli K-88 u odstavčiat Odber Vek v dňoch Skupina E n=9 K n=9 I. 42 E K II. 49 E K III. 54 E K IV. 59 E K Ec T.l -1 7,53±0,12 6,75±0,31 7,71±0,13 6,98±0,28 7,54±0,45 7,59±0,36 7,77±0,06 8,01±0,61 Hb g.dl -1 10,72±0,39 10,38±0,31 11,18±0,35 10,03±0,43 10,82±0,58 10,73±0,98 10,65±0,05 10,35±0,05 Hk l.l -1 0,30±0,01 0,39±0,01 0,39±0,01 0,38±0,01 0,38±0,02 0,39±0,01 0,39±0,00 0,39±0,01 MCV f.l -1 50,00±1,44 50,00±1,50 50,40±1,62 50,53±1,55 50,70±1,56 50,03±1,33 53,60±0,20 47,75±0,05 Záver Pri perorálnej aplikácii Lactobacillus Reuteri a E.coli sa u ošípaných zistilo, že: testovaný kmeň neovplyvnil hematologický profil (počet Ec, Lc, koncentráciu Hb, Hk a MCV), štatistický významný efekt (p<0.01) bol zaznamenaný v IV. odbere, pri dynamike schopnosti aktivácie oxidačného metabolizmu fagocytov (INT), hodnotami FANe, IFANe, FALc a IFALc v prospech E skupiny, koncentrácia CIg vykázala v IV. odbere štatistický významný rozdiel (p<0.01), neovplyvnil dusíkový (bielkovinový) profil, koncentrácie CB a ALB boli v oboch skupinách vyrovnané, neovplyvnil koncentráciu glukózy v sére, priaznivo ovplyvnil zdravotný stav zvierat v E skupine, kde nedošlo k úhynom, ani k stratám na hmotnosti, znížil hodnoty ph v GITe u E zvierat, hoci nebola preukázaná štatistická významnosť medzi skupinami, bola dokázaná adherencia na sliznici tenkého čreva elektrónovou mikroskopiou. Literatúra BOMBA, A., NEMCOVÁ, R., KAŠTEĽ, R., HERICH, R., PATAKY, J., ČÍŽEK, M..: Interactions of lactobacillus spp. and enteropathogenic E. coli under in vivo in vitro conditions. Vet.Med 41,1996(5): BOMBA, A., GANCARČÍKOVÁ, S., NEMCOVÁ, R., KAŠTEĽ, R., HERICH, R.: Slov. Vet. Čas. 23, 6; 1998, BULECA, J., STEBNICKÁ, K., MATTOVÁ, J., HÚSKA, M., ONDRAŠOVIČOÁ, O.: Zborník ÚEVM Košice, 1996, 155 RÉVAJOVÁ, V., LEVKUT, M., BARTKO, P., KOLODZIEYSKI, L., HÚSKA, M.: Zborník ÚEVM, 1996,

74 ANALÝZA MLIEKA TRANSGÉNNYCH A NETRANSGÉNNYCH KRÁLIKOV ANALYSIS OF TRANSGENIC AND NON-TRANSGENIC RABBIT MILK Chrenek 1,3, P., S. Dragin 1,2, L. Chrastinova 1, K. Kirchnerova 1, J. Rafay 1, J. Bulla 3 1 Výskumný ústav živočíšnej výroby, Nitra, 2 Agronomická fakulta, UNS, Srbsko a Čierna Hora, 3 Fakulta Biotechnológií a potravinárstva, SPU, Nitra Abstrakt: Cieľom práce bolo porovnať kvalitu a produkciu mlieka transgénnych a netransgénnych králikov laktujúcich na I.-laktácii. Transgénne jedince (F0 generácia) boli získané po prenose mikroinjektovaných králičích embryí s WAP-hFVIII génom do prvojadra oplodneného vajíčka. Následne, F1 generácia bola získaná krížením transgénnych (founder, F0 generácia) a netransgénnych králikov. Transgénne králiky produkovali rekombinantný humánny faktor VIII do mlieka. Možný vplyv na kvalitu a produkciu mlieka transgénnych králikov sme zisťovali a porovnávali s mliekom netransgénnych králikov. Produkciu mlieka sme zisťovali na 10, 15, 20 a 30 deň I.- laktácie metódou váženia mláďat tesne pred a po nacicaní. Kvalitu mlieka sme vyhodnocovali na základe obsahu tuku, bielkovín, laktózy a počtu somatických buniek. Zistili sme, že rozdiel v produkcii mlieka medzi transgénnymi a netrasngénnymi samicami v jednotlivých dňoch merania bol štatisticky nepreukazný. V prípade kvality mlieka sme zistili vyššií obsah bielkovín, tuku a počet somatických buniek v mlieku transgénnych králikov (P<0,05). Abstract: The aim of this preliminary study was to compare milk production and quality of transgenic and non-transgenic rabbit females on the I. - lactation. Transgenic animals (F0 generation) were made by embryotransfer of microinjected rabbit eggs with WAP-hFVIII gene construct into pronucleus of fertilized eggs. The next F1 generation was obtained after breeding of transgenic founder rabbits (F0 generation) with non-transgenic rabbit. Transgenic rabbits produced recombinant human factor VIII (rhfviii) into milk. Possible effect on milk quality and quantity of transgenic females was compare with non-transgenic females. The amount of milk produced by does at 10 th, 15 th, 20 th and 30 th day of the I.- lactation 68

75 by weight-suckle-weight method and milk quality (fat, protein, lactose, and number of somatic cells) of both group were measured. Comparison of milk production showed that there are no differences between transgenic and standard genotype females. Significant differences (P<0,05) in content of proteins, fat and number of somatic cells were received in transgenic rabbit milk comparing with non-transgenic one. Úvod Technológia využitia mliečnej žľazy ako bioreaktor bola prednesená na základe prvotných skúseností a zistení, že farmaceutické proteíny je možné produkovať v mlieku niektorých transgénnych jedincov (Lubon a kol., 1996). Čas, náročnosť získania transgénnych jedincov produkujúcich vysokú hladinu rekombinantnej bielkoviny, v požadovanej forme, s následným prečistením a klinických testovaní sú najväčšie nevýhody využitia hospodárskych zvierat pre tieto účely. V prípade králika, nižšie finančné náklady na získanie transgénneho jedinca, výhodné reprodukčné vlastnosti, ako aj nižšie náklady s udržaním transgénnej generácie predurčujú na uprednostenenie králika pred inými hospodárskymi zvieratami. Zatiaľ čo myš je dobrý model pre počiatočné experimenty, hlavne s cieľom odskúšať nové genové konštrukcie (integrácia a expresia), králiky môžu produkovať až do 50ml mlieka na deň. Produkcia niekoľkých tisíc kg mlieka ročne môže byť získaná kravami, prípadne niekoľkých stoviek kg ovcami a kozami, kde u králika len niekoľko kg ročne. Králičie mlieko však obsahuje 2,5 krát viac bielkovín na rozdiel od ovčieho a 4,8 krát viac na rozdiel od kozieho mlieka (Jennes 1974). Výhodou pre produkciu farmaceutických proteínov použitím transgénnych králikov je, že králiky môžu byť chované v SPF ( specific pathogen free ) podmienkach pri nižšich nákladoch a zároveň je možné využiť tieto podmienky pre výskum humánných chorôb. Napriek tomu, že výskum v tejto oblasti trvá už viac než 20-rokov, je nedostatočný počet publikácií, ktoré porovnávajú mliekovú úžitkovosť (kvalitu a kvantitu mlieka) medzi transgénnymi a netransgénnymi jedincami. Materiál a metódy Biologický materiál Transgénne králiky (F0 generácia) boli získane prenosom mikroinjektovaných (WAP-hFVIII génom) embryí (Chrenek a kol., 2004). Krížením F0 generácie s netransgénnymi králikmi sme získali F1 generáciu. Zvieratá boli ustajnené v individuálnych typizovaných klietkach v hale s upraveným svetelnym a teplotným režimom. Krmivo (kompletná kŕmna zmes) a voda im bolo podávané ad libitum. 69

76 Mlieková úžitkovosť Produkciu mlieka laktujúcich samíc na I. laktácii sme zisťovali na 10, 15, 20 a 30 deň laktácie na základe rozdielu hmotnosti mláďat pred a po nacicaní. Kvalitu mlieka vyhodnocovaná na základe obsahu tuku, bielkovín, laktózy a počtu somatických buniek sme analyzovali prístrojom Instrument Milko-Scan, FT 120 Foss. Počet somatických buniek sme zisťovali fluorescenčnou metódou, prístrojom Fossomatic 90 Foss. Štatistika T-test bol použitý na vyhodnotenie rozdileu medzi jednotliymi ukazovateľmi transgénnych a netransgénnych králikov. Výsledky a diskusia Detekcia integrácie hfviii génu PCR metóda bola použitá na detekciu integrácie WAP-hFVIII génu zo vzoriek DNA izolovaných z ucha živonarodených králikov F0 a F1 generácie (Chrenek a kol., 2004). Mlieková úžitkovosť Na základe výsledkov produkcie mlieka transgénnych a netransgénnych králikov na I. laktácii, prezentovaných v tabuľke 1, sme nezistili rozdiel medzi sledovanými skupinami. Tabuľka 1. Produkcia mlieka transgénnymi a netransgénnymi králikmi na I.- laktácii (kg). samice deň laktácie transgénne 0,24±0,02 0,28±0,02 0,31±0,03 0,15±0,02 netransgénne 0,19±0,01 0,25±0,02 0,30±0,03 0,13±0,01 štatisticky nepreukazny rozdiel Tieto výsledky zodpovedajú aj zisteniam pri porovnaní mliekovej úžitkovosti transgénnych králikov s inou génovou konštrukciou - hpc génom (Dragin a kol., 2004). Podobné hodnoty produkcie mlieka u králikov ako aj vzostupnosť produkcie mlieka do 20 dňa laktácie boli publikované u viacerých autorov, ktorí sledovali mliekovú úžitkovosť netransgénnych jedincov (Schranner 1993, Chrastinová a kol., 1997, Šramková, 2002). Kvalitu mlieka transgénnych a netransgénnych králikov vyhodnotenú na základe obsahu bielkovín, tuku, laktózy a počtu somatických buniek prezentujeme v tabuľke 2. Zistili sme štatisticky preukazný rozdiel v obsahu bielkovín, tuku a počte somatických buniek medzi sledovanými skupinami (P<0,05). 70

77 Tabuľka 2. Zloženia mlieka transgénnych a netransgénnych králikov na I.- laktácii ukazovateľ bielkoviny tuk laktóza somaticke bunky g/100g g/100g g/100g 10 3 /ml transgénne 9,90±0,12 a 5,25±0,17 c 2,03±0,02 258±5,50 e netransgénne 8,70±0,09 b 13,42±0,15 d 2,16±0,01 109±2,02 f a vs b., c vs d, e vs f significant differences (P<0,05) Obsah jednotlivých ukazovateľov v mlieku (bielkoviny, tuk a laktóza) králikov, napriek tomu, že sme zistili štatisticky preukázny rozdiel medzi nami sledovanými skupinami je v rámci variability, najmä čo sa týka obsahu tuku (10-17%) ako uvádzajú Marounek a kol. (1999). Vyšší obsah bielkovín u transgénnych králikov môže byť ovplyvnení produkciou rekombinantného hfviii, ktorý bol detegovaný v F0 a F1 generácii transgénnych králikov (Chrenek a kol., 2005). Počet somatických buniek môže byť oplyvnený aj technikou odberu mlieka od laktujúcich samíc v súvislosti s temperamentom jednotlivých samíc. Záver Naše výsledky poukazujú na fakt, že kvalita a produkcia mlieka transgénnych králikov nie je negatívne oplyvnená transgenézou. Transgénne jedince sú schopné produkcie rekombinantného humánneho faktora VIII (rhfviii) bez negatívneho vplyvu na produkciu mlieka. Literatúra Dragin S., Božić A., Chrenek P.: Effects of transgenesis on F2 and F3 rabbit offspring generation development. 5. vedecká konferencia doktorandov a mladých vedeckých pracovníkov, FPV UKF Nitra, Marec 2004, Chrastinová Ľ., Sommer A., Rafay J., Svetlanská M. : Využitie AVOTANU vo výžive králikov. II. Stráviteľnosť živín a mliekovosť samíc. J. Farm Anm Sci.XXX, 1997, Chrenek, P., Vasicek D., Makarevich A, Jurcik R., Suvegová K., Bauer M., Rafay J., Bulla J., Hetenyi L., Erickson J. and Paleyanda R.K.: Stability of transgene transmission in three generations of transgenic rabbits after single or double pronuclear microinjection. 8th World Rabbit Congress, Mexico, September 2004, Chrenek P., Kaufmann V., Makarevich AV., Bauer M., Ryban L., Uhrin P., Paleyanda RK. and Binder BR.: Production of recombinant human clotting Factor VIII in mammary gland of two transgenic rabbit lines. 49 th GTH meeting in Mannheim, February 2005, P

78 Jennes R.: The composition of milk. In: Lactation: A Comprehensive Treatise. Academic Press, New York, 1974, Lubon H., Paleyanda R. K., Velander W. H., Drohan W. N. : Blood proteins from transgenic animal bioreactors. Transfusion Medecine Reviews 2, 1996, Marounek M., Skřivanová V., Savka O. G.: Fyziologie výživy králikú. In. Sborník referátú V. celostátního semináře. Nové směry v chovu brojlerových králikú, Praha: VÚŽV Uhříněves, 1999, Šramková A.: Vplyv výživy na postantálny vývoj brojlerových králikov. Diplomová práca. SPU Nitra, 2002, 40 strán. Schranner S..: Untersuchungen zum maschinellen Milchentzug beim Kaninchen als Grandlage zur Bestimmung von Laktationsleistungen und Milchinhaltsstoffen. Inaugural-Dissertation, Ludwig-Maximilians- Universität München, Poďakovanie Táto práca bola realizovaná za finančnej podpory: grant č SP51/ / , koordinovanáho SAV. 72

79 ÚČINOK FYTOBIOTIK A EXOGÉNNYCH TRÁVIACICH ENZÝMOV NA ZDRAVIE A UŽITKOVOSŤ HOSPODÁRSKYCH ZVIERAT THE INFLUENCE OF PHYTOBIOTICS AND EXOGENOUS DIGESTIVE ENZYMES ON HEALTH AND PRODUCTION EFFICIENCY OF FARM ANIMALS Ivanko, Š., Dinda, Š., Mařeček, E.,*Chalupa,M **. Falat, M.*** Cymedica Zvolen, [email protected],*ukzuz Praha, Motol** Cymedica CZ, *** Dona.s.r.o., Veľké Revištia Abstract: The results of our experiments approved,that exclusion of antibiotic growth promotor (avilamycin) and the use of phytobiotic product XTRACT TM in combination with RONOZYME P and ROXAZYME G2 is provable improving the health of animals and production efficiency of complete feed mixes, especially by balancing requirement of calcium and phosphorus. Complete feed mixes with a reduced level of Ca and closer relation between Ca and P total resulted in a statistically very significant higher average of body weight gain together with a significant better feed conversion rate. Keywords: Phytobiotics,phytase, glycosidases, animals, health,production, efficiacy. Úvod Nové trendy vo výžive zvierat sa sústreďujú na hlbšie pochopenie vzťahov medzi diétou, produkčným zdravím, chorobami, stresom a životným prostredím. Pomaly končí éra antibiotických rastových stimulátorov a stále viacej sa používajú prirodzené kŕmne aditíva ako sú prebiotika, probiotika, fytobiotika a exogénne tráviace enzýmy.za posledné štyri desaťročia zohrali antibiotické rastové promotory (AGP) spolu s výrazným progresom v kvalite diét významnú úlohu najmä vo veľkochovoch hydiny a ošípaných. Konštatuje sa /Engberg a Pederso, 2002., Joness, 2002., Moreland, 2002., Collet a Dawson, 2002., Perdok at all., 2003., Mellor,2003/, že bez používania AGP by sa boli nedosiahli také výrazné zlepšenia v úžitkovosti monogastrických zvierat, akých sme boli svedkami pri vysokej koncentrácií zvierat vo veľkochovoch. Zásah kŕmnych antibiotik do fyziologických a biochemických procesov trávenia cez ovplyvňovanie mikroflóry zažívacieho traktu je veľmi rozsiahly. Collet a Dawson (2002) uvádzajú širokú škálu fyziologických,nutričných a metabolických konzekvencií ovplyvnenia mikroflóry zažívacieho traktu AGP. Ako je dnes už všeobecne známe, pozitívne dopady AGP na 73

80 úžitkovosť zvierat sú doprevádzané selekciou mikroorganizmov v prospech prevahy kmeňov s antibiotickou rezistenciou. Mnohonásobná antibiotická rezistencia sa pozoruje u viacerých patogénnych baktérií a mnohé choroby, o ktorých sa zdalo, že sa zlikvidovali,sa znovu objavujú a sú ťažšie kontrolované tradičnými antibiotikami (WHO Report,1998). Obavy o zdravotné riziká pre ľudí, spojeného s plošnou aplikáciou kŕmnych antibiotik, stimulovali hľadanie možnosti ich postupného vylúčenia z kŕmneho raciónu a od bude používanie všetkých kŕmnych antibiotík v EU zákonne zakázané. Ako je známe, po vylúčení AGP z diety zhoršujú sa traviace procesy. Dochádza k intenzivnému rozvoju intestinálnej mikroflóry, ktorá spotrebuje okolo 10 % ME krmiva, čo sa negatívne odráža na užitkovosti.z toho dôvodu sa intenzivne hľadajú účinné prirodzené kŕmne aditíva podporujúce stravitelnosť všetkých živín a navodzujúce fylogeneticky vytvorenú rovnováhu intestinálnej mikroflóry. Dôležitým je poznanie vzájomnej interakcie fytobiotik,ktoré v prvom rade stimulujú vylučovanie endogénnych traviacich enzýmov, s aplikovanými exogénnými enzýmami, ktoré hydrolyzujú endogénnymi enzýmami nestravitelné látky akými sú: fytát,neškrobové polysacharidy (NSP) a na nich viazaná časť proteínov a lipidov. Cieľom uvádzanej série pokusov bolo overiť produkčnú účinnosť kompletných kŕmnych zmesi bez kŕmnyhc antibiotik, mäsokostnej múčky pre výkrm broilérov so zaradením namiesto avilamycínu pripravku XTRACT TM firmy Pancosma, RONOZYME P a ROXAZYME G2 firmy La Roche.Podobné pokusy boli urobené aj na ošipaných a králikoch o čom budeme podrobnejšie referovať v prednáške. Material a metodika Overovacím materialom boli kompletné kŕmne zmesi, bez mäsokostnej múčky, pre výkrm broilerov.v prvej fáze do 14. dňa sa skrmovala KZ BR 1 a v druhej fáze BR 2 od 14. do 35. dňa veku kurčiat. Zmesi odpovedali požiadavkám Prílohy vyhlášky č.451/2000sb,čr.biologická testácia bola uskutočnená formou siedmých opakovaných porovnavácich pokusov na kurčiatach mäsového typu hybridu ROSS 308.Ustajnenie bolo v súlade s požiadavkami veľkovýrobných technológii. Kurčiatá boli ustajnené na hlbokej podstielke. Tolerancia hmotnosti jednodňových kurčiat v jednotlivých skupinách bola 2g.. Priemerná živá hmotnosť pri naskladnení bola v jednotlivých pokusoch následovná: pokus 1 a 2 40g, 3 a 4 44g, 5 39g, 6 37 g,7 36g. Schema testovania: Skupina1 kompletná KZ BR 1 a BR 2 v základnom zložení s Avilamycínom (10 mg na kg KZ) pozitívna kontrola. Skupina 2- kompletná KZ BR 1 a BR 2 bez Avilamycínu negatívna kontrola. Skupina 74

81 3 kompletná KZ BR 1 a BR 2 bez Avilamycínu, s fytobiotikom XTRACT v dávke 150 g/t KZ BR 1 a 100 g/t KZ BR 2. Skupina 4 kompletná KZ BR1 bez Avilamycínu, s fytobiotikom XTRACT v dávke 150g/t KZ a RONOZYME P v dávke 300g/t KZ, kompletná KZ BR 2 bez Avilamycínu,s fytobiotikom XTRACT v dávke 100g/t KZ a RONOZYME P v dávke 300g/t KZ. Skupina 5 ako skupina 4 len bol naviac pridaný k KZ BR 1 a BR 2 ROXAZYME G 2 v dávke 100g/t KZ. Skupina 6-ako skupina 5 len v tejto skupine bol znížený obsah Ca z 10g/kg na 7,.9g/kg KZ a pomer Ca:Pcelkový bol zúžený z 1,75 na 1,36. Tabuľka 1. Zloženie pokusných kŕmnych zmesi BR 1 a BR 2 v % BR 11,2,3,4,5 BR 16 BR 21,2,3,4.5 BR 26 pšenica 37,04 37,64 35,595 36,87 kukurica 23,00 23,00 20,675 20,00 sojový extr.šrot 43 % 28,60 28,60 31,50 31,50 dikalciumfosfát 0,60 0,60 0,70 0,80 repkový olej 2,50 2,50 4,0 4,00 kŕmna soľ 0,26 0,26 0,33 0,33 vápenec mletý 1,50 0,90 1,80 1,10 rybia múčka 5,0 5,0 - - kvasnice Vitex - - 3,0 3,0 premix Treonín 0,5 0,5 0,70 0,7 premix Lyzín - - 0,5 0,5 premix Metionín - - 0,20 0,20 Aminovitan BR 1 super 1,00 1, Skrmovanie pokusných KZ: Kŕmne zmesi boli skrmované v suchom granulovanom stave ad libitum. Čerstvá napájacia voda bola stále k dispozicií..pokusné KZ boli vyrobené vo výrobní KZ Lysa nad Labem z vopred homogenizovaných a analyticky overených surovín. Výkrm ošipaných. Overovaným materialom boli kompletné kŕmne zmesi pre výkrm ošipaných bez živočíšnych múčiek podľa nasledujúcej schemy: Skupina 1 - /pozitívna kontrola s avilamycínom/ kompletné kŕmne zmesi A1,A2, a CDP.AVILAMYCÍN: 25g/t krmnej zmesi A1,16.5g/t zmesi A2 a 15g/t zmesi CDP. Skupina 2 - /negatívna kontrola bez avilamycínu/ kompletné kŕmne zmesi so zaradením pripravkov ROXAZYME G2 100g/t RONOZYME P 300g/t. Skupina 3 - kompletné kŕmne zmesi A1,A2 a CDP so zaradenim ROXAZYME G2 100g/t,RONOZYME P 300g/t a XTRACT 100g/t. Overovanie bolo uskutočnené biologickou testaciou na ošipaných v šiestích trojskupinových pokusoch uskutočnených podľa jednotnej metodiky. Hlávnymi sledovanými ukazovateľmi boli prírastky živej hmotnosti,spotreba krmiva a hlávných živín na kg prirastku a zdravotný stav.všetky výsledky dielčích pokusov boli súhrnne spracované 75

82 a štatistický vyhodnotené.bol vypočitaný koeficient produkčnej hodnoty krmiva podľa Brugemanna. Výsledky a diskusia: Získané experimentálne výsledky z výkŕmu broilerov sú uvedené v súhrnej výslednej tabuľke č.2. Ziskané výsledky (Tab.2) ukazujú, že po vylúčení avilamycvínu /skupina 2./ sa preukazne znížil prírastok živej hmotnosti o 2,.9 % a spotreba krmiva na 1kg prírastku sa zvýšila o 4%. Po zaradení fytobiotika XTRACTu /obsahuje esenciálne oleje carvacrol, cinnamaldehyd a capsaicín/ a vylučení avilamycínu /skupina 3./ sa ziskali výsledky,ktoré sú štatisicky nepreukazne rozdielne od skupiny 1.Pridanie 750 FYT/t KZ 6 fytázy/ronozyme P /k XTRACTu /skupina 4/ zvýšilo vyskopreukazne prírastok ž.h. voči negatívnej kontrole a nepreukazne voči pozitívnej kontrole. Dá sa preto konštatovať, že oba tieto varianty sú určitým riešením náhrady avilamycínu z hľadiska biologického.ekonomická bilancia nákladov a príjmov ukázala,že zaostávajú za variantom s avilamycínom o cca 0.5 KČ na jedno kurča. Tab.2. Výsledky testovania za obdobie 0-35 dní. skupiny Priemerný prírastok ž.h. Počet zvierat kŕmne dní Priemerná konečná ž.h.g Indexy 100,0 97,1 98,4 101,2 100,9 105,4 100,0 101,4 104,2 103,9 108,5 100,0 102,8 102,5 107,1 100,0 99,7 104,2 100,0 104,4 Priemerná spotreba krmiva na 1 kg prírastku živej hmotnosti BR 1 kg 0,34 0,35 0,34 0,34 0,34 0,33 BR 2 kg 1,41 1,42 1,46 1,46 1,42 1,37 Celkom kg 1,75 1,82 1,80 1,80 1,76 1,70 Indexy 100,0 104,0 102,9 102,9 100,6 97,1 100,0 98,9 98, ,4 100,0 100,0 97,8 94,4 100,0 97,8 94,4 100,0 96,6 Priemerna spotreba živín na 1 kg prírastku živej hmotnosti sušina kg 1,543 1,608 1,600 1,593 1,564 1,505 NL kg 0,404 0,421 0,400 0,417 0,408 0,396 ME MJ 22,51 22,47 22,19 22,41 21,77 21,11 Koeficient produkčnej hodnoty krmiva 100,0 96,6 97,8 99,2 100,2 104,2 76

83 Tabuľka 3. Štatistické overenie rozdielov prírastku živej hmotnosti. Kategórie * ** ** +69** +150** 3 +50* +45* +126** ,2** 5 +81** MSD 0, 05 =44,0 g MSD 0, 01 =51,0 g.pridanie ďalšej súpravy enzýmov glykozidáz /ROXAZYME G 2/ obsahujúcej endo 1,4 beta xylanázu,endo 1,3 ( 4 ) beta D glukanázu a endo 1,4 beta glukanázu /celulázu /neprinieslo v tejto kompozicií KZ /skupina 5 / lepší doplnkový efekt.tento sa výrazne dostavil len po znížení obsahu Ca z 10g/kg KZ na 7,9g/kg KZ,čím sa zúžil pomer Ca : Pcelkový z 1.75 na 1,36.V dôsledku tejto úpravy, ktorá znižuje chelatizačný účinok prebytku vápnika na fytát a NSP sa efektivnejšie využila pridaná enzymatická hydrolytická aktivita fytázy a glykozidáz.v dôsledku toho sa zvýšil prírastok ž.h. vysoko preukazne tak ku pozitívnej kontrole ako aj k ostatným skupinam.doplnkový zisk na 1 kurča sa zvýšil o 2.56 KČ a bol o 1,5 KČ vyšší ako v skupine s avilamycínom.uvedené výsledky sú v súlade s výsledkami dosiahnutými inými autormi / Kamel 1999, Engberg a Peterson 2002,Collet Dawson 2002,Applegate at all.2003 a iní / i s našimi predchadzajúcimi /Ivanko 2004/. Záver Biologická testacia produkčnej účinností kompletných kŕmnych zmesi BR 1 a BR 2 pre výkrm broilérov bez mäsokostnej múčky a stimulatora rastu avilamycínu ukázala, že- vylúčením rastového stimulátora avilamicínu a zaradením testovaných pípravkov je možné zabezpečiť dobrý zdravotný stav a užitkovosť monogastrických zvierat a tým znížiť podporu produkcie na antibiotika rezistentných kmeňov baktérií bez úpravy obsahu Ca a zúženia pomeru Ca : Pcelkový zaradenie do KZ fytobiotika XTRACT TM a exogénnych enzýmov v pripravkoch RONOZYME P a ROXAZYME G 2 poskytuje len nepreukazné zvýšenie prírastkov ž.h. a je ekonomicky nevyhodné. Pri znížení pôvodného obsahu Ca a zúžení pomeru Ca : Pcelkový došlo po zaradení testovaných prípravkov k štatisticky vysokovýznamnému zvýšeniu prírastku živej hmotnosti a súčasne k výraznému zlepšeniu konverzie krmiva,čím sa znížuje vylúčovanie dusíka a fosforu do životného prostredia. Aplikácia testovaných prípravkov prináša doplnkový ekonomický efekt najmenej 1,50 KČ na 1 kurča v porovnaní s aplikáciou rastového stimulátora avilamycínu. 77

84 Výsledky pokusov na ošipaných. Tab.4. Overenie produkčnej účinnosti kŕmnych zmesi obsahujúcich Ronozyme P a Roxazyme G2 pre výkrm ošipaných po vylúčení avilamycínu a zaradení Xtraktu. Skupina Počet zvierat ks Priem.počiatočná.ž.h. kg Priem.konečná.ž.h. kg Priem.prirastok.ž.h. kg Priem.počet KD deň Priem.denný prir.ž.h. kg Idexy Primerna spotreba kŕmnych zmesi na 1kg prírastku ž.h. A1 kg A2 kg CDP kg Celkom kg Indexy Analýza variancii Scheffého testom nepotvrdila preukázne rozdiely medzi skupinami.je možné preto konštatovať,že vylúčenie rastového antbiotického stimulátora pri suplementácii KZ Xtractom a exogennými traviacimi enzýmami zabezpečuje dobrý zdravotný stav i užitkovosť výkrmových ošipaných. Prevádzkový pokus s aplikáciou pripravku XCTRACT TM do kŕmnych zmesi pre prasnice, ciciakov, odstav a až do konca výkrmu. Zaradenie XTRACTu do KZ pre prasnice znížuje infekčný tlak od prasníc na ciciaky. Kŕmne antibiotika napomáhali aj ľahšiemu zvladnutiu fázy odstavu prasiat,kedy často dochádza k alimentárnym a infekčným hnačkam.zaradili sme preto XTRACT aj do KZ pre ciciakov ČOS UNI TEKRO /Ivanko 2004/ a postupne v roku 2002 do všetkých KZ..Prevádzkový pokus sa uskutočnňuje vo veľkovýkrmni ošipaných VOŠ Pláne patriacej podniku DONA Veľke Revištia, okr. Michalovce.Výsledky sa úspešne overujú aj na ďalších podnikoch,kde sa taktiež dosahuje vysoká úspora v nákladoch na antibiotika. Tab.5.Niektoré dôležité ukazovatele chovu ošipaných na VOŠ Pláne po započatí aplikacií XTRCTu. Rok CELOŽIVOTNÝ priemerny denný prírastok kg Spotreba KZ Spotreba antibiotik v terapií.náklady r.2001=100% kg/kg odstav, PV, V , , 50, , , 5, , , 5, Celková výroba jat.oš. ton Záver Vylúčením avilamycínu a zaradením fytobiotika XTRCT TM a prípravkov exogénných enzýmov Ronozyme P a Roxazyme G2 je môžné 78

85 zabezpečiť dobrý zdravotný stav monogastrických zvierat, tým znížiť spotrebu antibiotik a na antibiotika rezistentných kmeňov baktérii a zaroveň znížiť exkreciu dusíka a fosforu do životného prostrediav dôsledku zvýšenia využitia Ca je nutné upraviť pomer Ca :Pc na : 1. Literatúra: Applagate T. J.,Angel R.,Clasen H.L.,2003.Effect of dietary calcium,25 hydroxy-cholecalciferol,or bird strain on small intestinal fytase activity in broiler chickens.poultry Science,82, Collet S.R. and K.H.Dawson How effective are the alternaives to AGP? Feed Mix 10,2, Engberg R.M., and J.S. Peterson Designing poultry diets without doubts.feed Mix 10,1,8-10. Ivanko S Fytobiotika,exogenní trávicí enzymy,intestinální mikroflóra a užitkovost zviřat.náš chov 4, Kamel C Use of plant extracts in european pig diets. Feed compounder. 19, Moreland S Futher benefits of botanicals. Feed Mix 10, Perdok H.,Langhout P.,and P.van Vught Stimulation apetite for AGP free success.feed Mix 11, 3, WHO Report.1998The medical impact of the use of antimicrobials in food animals.who/emc/ Z oo

86 APPLICATION PCR BASED POLYMORPHISM OF LEPTIN GENE AS QTL FOR MILK PRODUCTION TRAITS IN DAIRY CATTLE IN SLOVAKIA. Jakabová, D. 1, Trandžík, J. 1, Haško, M. 1, Massányi, P. 2, Kozlík, P. 1, Chrastina J. 1, Jakab, F. 3, Turčan, J. 3, Kukurová L. 4, Bulla J. 2 1 State Breeding Institute, Slovak Republic, 2 Slovak Agricultural University, Slovak Republic, 3 State Breeding Inspection, Slovak Republic, 4 Constantine the Philosopher University, Slovak Republic Abstract Leptin is a hormone synthesized by adipose tissue, with important effects in regulating body weight, metabolism and reproductive function. The protein is approximately 16 kda in mass and encoded by the obese (ob) gene. We investigated DNA polymorphism in ob locus, what is associated with higher milk production (AB genotype in RFLP1). Introduction The ob gene product, leptin, is synthesized in adipose tissue and presumably acts on the hypothalamus to regulate appetite and stored body fat. This 16 k Da protein is involved in regulation of feed intake, energy balance, fertility and immune functions, too. The obese gene has been assigned to Chromosome (Chr) 6 in mice (Friedman and Leibel, 1992) and 7q31.3 in humans (Isse et al., 1995). Genetic differences in the leptin gene were first observed in mice. ob/ob mice lack functional leptin and hyperphagic, obese, and infertile (Hamann and Matthaei, 1996). Polymorphisms in the human leptin gene were associated with low circulating leptin levels (Hager et al., 1998), obesity (Ohshiro et al., 2000), and birthweight (Orbak et al., 2001). Recently the ob gene has mapped to Chr. 4 in cattle (Stone et al., 1996) and Chr. 18 in swine (Neuenschwander et al., 1996, Sasaki et al., 1996). The polymorphisms in cattle leptin gene have been described by Pomp et al., 1997, Fitzimmons et al., 1998 and Haegman et al., There are several reports about QTLs with effects on milk production traits in the literature. We report of a QTL with effects on milk production on RFLP polymorphism in ob gene in cattle in Slovakia. This RFLP polymorphism is located in the intron (at 2049 or 2261 bp) between two exons of leptin. The PCR reaction as describes by Pomp et al., 1997 turned out to be problematic because of PCR artefacts bands. Therefore, Liefers et al., 2002 were modified PCR primers, closer to the polymorphic side, which resulted in a PCR product of 400 bp. 80

87 Materials and methods: Blood samples for the present survey were collected from 73 animals from the Holstein cattle. DNA was isolated from 300 l of whole blood using the Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega). The primers specific for this RFLP were synthesized by a commercial oligonucleotide synthesizing service. The primer sequences used for the PCR amplification are shown in Table 1. PCR was performed in a total volume of 30 l of the following mixture: 0,4 M each of primers, 1x PCR standard reaction buffer (Perkin Elmer), 200 M dntps, 1U of AmpliTaq Platinnum polymerase (Gibco) and 100 ng of genomic DNA. The PCR reactions were carried out on a thermal cycler MJ Research (PTC 200). Thermal cycling conditions included an initial denaturation at 95 0 C for 4 min, followed by 35 cycles of 94 0 C 0.5 min, 61 0 C 0.5 min and 72 0 C 1.5 min and ending with a final extension for 10 min. Digestion of the PCR product with 5U of Sau 3AI (Promega) for 2 hours at 37 0 C revealed products of 100 and 300 bp. Table 1 Primer sequences used in RFLP analysis forward 5 TGGAGTGGCTTGTTATTTTCTTCT 3 primer reverse 5 GTCCCCGCTTCTGGCTACCTAACT 3 primer Results and Discussion: Livestock breeding schemes based on quantitative genetics have facilitated an enormous improvement of production traits such as milk production in cattle. The RFLP1 AB genotype is associated with 1.23 kg per day higher milk yield and 0.31 kg/d higher dry matter intake (DMI) (Liefers et al., 2002). In our study, 73 Holstein cattle were genotyped for RFLP1. Allele A in RFLP studies was the allele not digested by the restriction enzyme, allele B was the restriction enzyme-digested PCR product. The genotype frequencies were for RFLP 1 AA (0,829), AB (0,162), BB (0). There was any animal with BB-genotype, 13 were with AB genotype and 60 with AA genotype in Holstein cattle. The allele frequencies were calculated, where frequency of allele A was and B was (Table 2). Future breeding programs could be to favour the RFLP1 B-allele, what can yield a higher milk production without affecting the energy balance and fertility. 81

88 Table 2 Allele frequencies and genotypes frequencies in RFLP1 allele frequencies genotype frequencies A AA B AB BB References: Fitzsimmons C.J et al. (1998): A potential association between the BM 1500 microsatellite and fat deposition in beef cattle. Mamm. Genome 9, Friedman J.M. et al. (1992): Tackling a weighty problem. Cell 69, Haegman A.A. et al. (2000): New mutation in exon 2 of the bovine leptin gene. Anim. Genet. 31, 79 Hager J.K. et al. (1998): A polymorphism in the 5 untranslated region of the human ob gene is associated with low leptin levels. Int. J. Obes. Relat. Metab. Disord. 22, Hamann A., Matthaei S. (1996): Regulation of energy balance by leptin. Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes 104, Isse N. et al. (1995): Structural organization and chromosomal assignment of the human obese gene. J. Biol. Chem. 270, Liefers S.C. et al. (2002): Associations between leptin gene polymorphisms and production, live weight, energy balance, feed intake and fertility in Holstein heifers. J. Diary Sci. 85, Neuenschwander S. et al. (1996): Partial characterisation of porcine obesity gene (OSB) and its localisation to chromosome 18 by somatic cell hybrids. Anim. Genet. 27, Ohshiro Y.K. et al. (2000): A polymorphic marker in the leptin gene associated with Japanese morbid obesity. J. Mol. Med. 78, Orbak Z.M. et al. (2001): Association between serum leptin and anthropometric parameters at birth and 15 th day in infants born asymmetrically small for gestational age. J. Pediatr. Endocrinol. Metab. 14, Pomp D.J. et al. (1997): Rapid communication: mapping of leptin to bovine chromosome 4 by linkage analysis of a PCR based polymorphism. J. Anim. Sci. 75, 1427 Sasaki S. et al. (1996): Assignment of the porcine obese (leptin) gene to Chromosome 18 by linkage analysis of a new PCR based polymorphism. Mamm Genome 7, Stone R.T. et al (1996): The bovine homolog of the obese gene maps to Chromosome 4, Mamm. Genome 7,

89 MAMÁRNA KARCINOGENÉZA A JEJ OVPLYVNENIE PODÁVANÍM MELATONÍNU U OPAKOVANE STRESOVANÝCH POTKANOV MAMMARY CARCINOGENESIS AND THE INFLUENCE OF MELATONIN ADMINISTRATION IN REPEATEDLY STRESSED RATS Kassayová, M., Adámeková, E., Bojková, B., Marková M., Kubatka, P., Ahlers, I., Ahlersová, E. Katedra fyziológie živočíchov, Ústav biologických a ekologických vied, Prírodovedecká fakulta UPJŠ, Košice Abstract The aim of this study was to evaluate the effect of exogenous melatonin (MEL) on N-nitroso-N-metylurea (NMU)-induced mammary carcinogenesis in repeatedly immobilized female Sprague-Dawley rats. Melatonin solution was given at low doses, 4 µg/ml of tap water, discontinuously - from 3.00 p.m. to 8.00 a.m., with the administration onset from 5 th day before carcinogen administration to 63 th day of animal age (during 15 days the promotion phase) or untill the end of experiment (20 weeks). Animals were immobilized in special boxes for 7 x 120 minutes. Long-term MEL administration reduced the number and the size of mammary tumors more markedly in comparison to its short-term administration. Úvod Schopnosť melatonínu (MEL) potláčať neoplastický rast bola dokázaná u experimentálnych zvierat i u ľudí u rôznych typov nádorov, najmä tých, ktoré sú hormón-závislé, t.j. citlivé na estrogén a prolaktín, napr. nádory mliečnej žľazy. Melatonín tlmí bunkovú proliferáciu, rast tumorov a znižuje incidenciu metastáz. Priamo ovplyvňuje bunkový cyklus predlžuje G 1 fázu a odďaľuje vstup buniek do S-fázy, má imunostimulačné a výrazné antioxidačné účinky, inhibuje hladiny estrogénu a prolaktínu v cirkulácii, čím blokuje mitogénny účinok týchto hormónov, má proapoptotický efekt, sprostredkovaný MEL-receptormi v nádorových bunkách (1, 2, 3). Úloha stresu pri vzniku a vývoji tohto ochorenia nie je v súčasnosti dostatočne popísaná. Cieľom našej štúdie bolo analyzovať vplyv krátkodobého a dlhodobého podávania melatonínu na vznik a vývoj nádorov mliečnej žľazy u samíc potkanov, opakovane vystavených psychoemočnému stresu.

90 Materiál a metódy V experimente sme použili samice potkanov kmeňa Sprague- Dawley, ktoré boli vo veku dní adaptované na štandardné podmienky zverinca a umelý svetelný režim 12 h svetlo 12 h tma (svetlo od 7.00 do h). Počas celého experimentu boli zvieratá kŕmené štandardnou laboratórnou diétou a napájané vodovodnou vodou ad libitum. Medzi postnatálnym dňom bol všetkým zvieratám intraperitoneálne podaný chemokarcinogén N-metyl-N-nitrozourea v dvoch dávkach po 50 mg/kg hmotnosti. Ako model psychoemočného stresu bola použitá imobilizácia, na tretí deň od aplikácie 2. dávky karcinogénu boli zvieratá znehybnené v špeciálne upravených boxoch po dobu 2 hodín denne počas 7 po sebe nasledujúcich dní. Melatonín (MEL) bol aplikovaný v pitnej vode v koncentrácii 4 µg/ml diskontinuálne - od do hod. nasledujúceho dňa (od 8.00 do zvieratá pili vodu), so začiatkom podávania od 5. dňa pred prvou dávkou NMU. Zvieratá sme rozdelili do štyroch experimentálnych skupín: NMU kontrolná neimobilizovaná skupina, NMU + 7IMS skupina imobilizovaná 7-krát (počas siedmich po sebe nasledujúcich dní), NMU + 7IMS + MEL(P) skupina 7-krát imobilizovaná a pijúca melatonín krátkodobo, len 15 dní po podaní 2. dávky NMU v promočnej fáze, NMU + 7IMS + MEL skupina imobilizovaná 7-krát a pijúca melatonín dlhodobo až do ukončenia experimentu (20. týždeň). Počas experimentu sme zvieratá každý týždeň vážili a palpovali, rozmery a lokalizáciu nádorov sme zaznamenali. Zo získaných údajov sme vyhodnotili incidenciu, latenciu, frekvenciu nádorov na skupinu a na zviera, priemerný prírastok objemov tumorov a kumulatívny objem nádorov. Výsledky a diskusia Incidencia, latencia, frekvencia na skupinu a na zviera, priemerný prírastok objemov tumorov a ich kumulatívny objem v poslednom týždni experimentu sú uvedené v Tab. 1. Krátkodobé podávanie MEL v skupine NMU + 7IMS + MEL(P) spôsobilo oproti skupine NMU + 7IMS 22-percentné zvýšenie incidencie nádorov a pokles frekvencie na zviera o 26 %. U zvierat pijúcich MEL až do ukončenia pokusu (skupina NMU + 7IMS + MEL) sme zaznamenali zníženie frekvencie na zviera o 28 %. Najvýraznejšími zmenami v porovnaní so skupinou NMU + 7IMS bolo zníženie prírastku objemu tumorov o 21 % po krátkodobom podávaní MEL a pokles prírastku objemov nádorov o 45 % a ich kumulatívneho objemu o 42 % u zvierat, ktorým bol MEL podávaný dlhodobo, až do ukončenia pokusu.

91 Rast nádorového tkaniva je stimulovaný vychytávaním mastných kyselín z cirkulácie, čo bolo dokázané v nádoroch pečene potkana in vivo (4). Chronické podávanie MEL vo fyziologických koncentráciách signifikantne znižuje rast nádorov pečene prostredníctvom inhibície vychytávania mastných kyselín (5), čo by mohlo byť jedným z mechanizmov tumor-supresívneho účinku MEL aj v iných typoch nádorov. V našom experimente sme zaznamenali výraznejšiu redukciu počtu a veľkosti mamárnych tumorov po dlhodobom podávaní fyziologických dávok MEL v porovnaní s krátkodobým. Efekt stresu na tumorigenézu sa v tejto našej štúdii výraznejšie neprejavil, i keď v predchádzajúcich pokusoch sme zaznamenali jeho výrazný stimulujúci účinok na chemicky indukovanú mamárnu karcinogenézu u samíc potkanov (6, 7). SKUPINA NMU NMU+7IMS Počet zvierat na konci experimentu NMU+7IMS + MEL(P) NMU+7IMS + MEL Incidencia (%) 50, 00 38,89 Latencia (dni) 74,00 ± 8,76 Frekvencia na skupinu 85,43 ± 12,65 1,36 ± 0,50 1,00 ± 0,42 47,37 (+ 22%) 84,22 ± 8,49 (- 1 %) 0,89 ± 0,30 (- 11%) 43,75 (+ 13%) 94,14 ± 10,53 (+ 10%) 0,81 ± 0,28 (- 19%) Frekvencia na zviera 2,71 ± 0,68 2,57 ± 0,78 1,89 ± 0,34 (- 26%) 1,86 ± 0,34 (- 28%) Prírastok objemov nádorov (cm 3 ) Kumulatívny objem nádorov (cm 3 ) 6,43 ± 1,74 3,86 ± 0,93 74,14 36,63 3,04 ± 0,77 (- 21%) 36,14 (- 1%) 2,14 ± 0,45 (- 45%) 21,16 (- 42%) Hodnoty sú uvedené ako aritmetické priemery ± SEM, hodnoty sú uvedené ako sumy objemov nádorov, hodnoty vyjadrujú priemerný prírastok objemov nádorov za posledných 8 týždňov experimentu (brali sme do úvahy iba tie palpovateľné nádory, ktoré vznikli do 12. týždňa experimentu, počet nádorov v tomto týždni bol v skupine NMU - 10, NMU + 7IMS - 7, NMU + 7IMS + MEL(P) - 6, NMU + 7IMS + MEL - 3),

92 hodnoty v zátvorkách vyjadrujú percentuálnu odchýlku voči skupine NMU + 7IMS (predstavuje 100%), IMS imobilizačný stres. Záver Účinok exogénneho MEL na NMU-indukovanú mamárnu karcinogenézu u samíc potkanov, ktoré boli opakovane vystavené psychoemočnému stresu, sa v našom experimente prejavil inhibíciou vzniku a rastu nádorov, ktorá bola výraznejšia u zvierat dlhodobo pijúcich MEL. Podávanie MEL len v promočnej fáze vývoja mamárnych tumorov malo menej výrazný vplyv ako dlhodobá aplikácia. Literatúra 1. REITER, R.J.: Melatonin: clinical relevance. Clin. Endocrinol. Metab., 17, 2003, s PANZER A., VILJOEN M.: The validity of melatonin as on oncostatic agent. J. Pineal Res., 22, 1997, s VIJAYALAXMI, THOMAS, C.R., REITER, R.J., HERMAN T.S.: Melatonin: from basic research to cancer treatment clinics. J. Clin. Oncol. 20, 2002, s BLASK, D.E., SAUER L.A., DAUCHY R.T., HOLOWACHUK E.W., RUHOFF M.S., KOPFF, H.S.: Melatonin inhibition of cancer growth in vivo involves supression of tumor fatty acid metabolism via melatonin receptor-mediated signal transduction events Cancer Res., 1999, s BLASK, D.E., DAUCHY, R.T., SAUER, L.A., KRAUSE, J.A.: Melatonin uptake and growth prevention in rat hepatoma 7288CTC in reponse to dietary melatonin: melatonin receptor-mediated inhibition of tumor linoleic acid metabolism to the growth signalling molecule 13- hydroxyoctadecadienoic acid and the potential role of phytomelatonin. Carcinogenesis, 25, 2004, s ADÁMEKOVÁ, E., MARKOVÁ, M., KUBATKA, P., BOJKOVÁ, B., AHLERS, I., AHLERSOVÁ E.: NMU-induced mammary carcinogenesis in female rats is influenced by repeated psychoemotional stress. Neoplasma, 50, 2003, s ADÁMEKOVÁ E., MARKOVÁ M., BOJKOVÁ B., KUBATKA, P., AHLERS, I., AHLERSOVÁ E.: The effect of psychoemotional stress on chemically induced mammary carcinogenesis in female rats. Biologia, 58, 2003, s Práca vznikla s podporou grantu VEGA MŠ SR č. 1/1286/04.

93 ÚLOHA PROGESTERÓNU, IGF-I A IGFBP-3 V REGULÁCII POHLAVNÉHO DOSPIEVANIA PRASNIČIEK THE ROLE OF PROGESTERONE, IGF-I AND IGFBP-3 IN REGULATION OF PORCINE SEXUAL MATURATION Kolesárová A. 1, Sirotkin A. 2, Kramárová M. 1, Massányi, P. Kováčik J. 1 1 Katedra fyziológie živočíchov, Slovenská poľnohospodárska univerzita v Nitre, 2 Ústav genetiky a reprodukcie HZ, Výskumný ústav živočíšnej výroby v Nitre, [email protected] Abstract The aim of our experiments was to study the influence of level of progesterone (P 4 ), insulin-like growth factor I (IGF-I), IGF-binding protein-3 (IGFBP-3) in blood plasma and the release of these substances by porcine ovarian granulosa cells cultured in vitro on sexual maturation. Gilts were divided in two groups according to the sexual maturation (sexually immature gilts and sexually mature gilts). By radioimmunoassay and immunocytochemistry we determined, that sexual maturation of gilts is associated with an increase content of P 4, IGF-I, IGFBP-3 in blood plasma and granulosa cells. These data demonstrate the ability of P 4, IGF-I and IGFBP-3 to regulation of porcine sexual maturation. Úvod Procesy pohlavného dospievania a ovariálnej folikulogenézy ošípaných sú charakteristické proliferáciou, diferenciáciou a apoptózou rôznych tkanivových štruktúr. Ich regulácia zahrňuje systém zložitých vzájomných vzťahov medzi rôznymi biologicky aktívnymi látkami. Hlavným ovariálnym hormónom, ktorý je popisovaný v granulóznych bunkách vaječníkov prasničiek (Sanislo et al., 2001) je progesterón (P4). Podobne aj inzulínu podobný rastový faktor I (IGF-I) je prítomný v granulóznych bunkách vaječníkov (Sirotkin et al., 2001) a je dôležitý z hľadiska reprodukčných procesov (Monno et al., 2000). Úlohu transportného proteínu pre IGF plnia jeho väzbové proteíny (IGFBP) (Coverley et al., 2000), ktorých prítomnosť bola popisovaná tiež v granulóznych bunkách vaječníkov prasničiek (Sirotkin et al., 2001). Zmeny v produkcii spomínaných biologicky aktívnych látok počas pohlavného dospievania sú preskúmané nedokonale. Cieľom experimentálnej práce bolo preskúmať účasť a úlohu progesterónu (P4), inzulínu podobného rastového faktoru typu I (IGF-I) a jeho väzbového 1,

94 proteínu (IGFBP-3) v regulácii pohlavného dospievania prasničiek. Pre splnenie uvedeného cieľa sme sa v našej práci zamerali na: porovnanie produkcie P4, IGF-I, IGFBP-3 medzi pohlavne nedospelými a pohlavne dospelými prasničkami v podmienkach in vivo a in vitro. Materiál a metódy 50 prasničiek sme testovali v podmienkach in vivo (analýza krvnej plazmy) a in vitro (analýza granulóznych buniek). Krv sme odoberali v deň zabitia prasničky v množstve 10 cm3, z ktorej sme následne získali krvnú plazmu. P4 a IGFBP-3 boli analyzované použitím komerčných súprav RIA firmy DSL (Webster, USA) podľa návodu výrobcu a IGF-I sme analyzovali vlastnou metódou podľa Makarevicha a Sirotkina (1999). Na základe klinických prejavov ruje a podľa vizuálnej charakteristiky stavu vaječníkov získaných pri zabití zvierat sme prasničky rozdelili na dve skupiny - pohlavne nedospelé (26) a pohlavne dospelé prasničky (24). Ovariálne granulózne bunky sme izolovali metódou aspirácie zo stredne veľkých folikulov (2 5 mm). Suspenziu granulóznych buniek sme odstreďovali (1500 ot/min, 10 minút) a premývali pomocou sterilného kultivačného média TCM-199 doplneného 10% fetálnym teľacím sérom a antibiotikom - antibiotic antimycotic solution (Sigma, St. Louis, MO, USA). Bunkovú suspenziu riedenú kultivačným médiom sme kultivovali (37 oc, 5 % CO2). Približne po 7-10 dňoch kultivácie sme médium nahradili čerstvým s rovnakými doplnkami ako bolo pôvodné, ale bez prítomnosti fetálneho teľacieho séra a kultivovali 96-hodín. Monovrstvu buniek sme fixovali 4% paraformaldehydom v PBS (Phosphate Buffer Saline) 10 minút. Podobne ako pri identifikácii P 4 a IGF-I v podmienkach in vivo, aj v inkubačnom médiu s granulóznymi bunkami sme použili už spomínané metódy. IGFBP- 3 sme stanovili imunocytochemickou metódou (Osborn a Isenberg, 1994) pomocou protilátok od firmy Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, USA). Výsledky a diskusia V krvnej plazme a v granulóznych bunkách pohlavne nedospelých a pohlavne dospelých ošípaných sme zaznamenali prítomnosť P4, IGF-I a IGFBP-3. Na základe literárneho prehľadu vieme, že už v predchádzajúcich výskumoch bola dokázaná lokalizácia P4, IGF-I a IGFBP-3 v krvi a/alebo v granulóznych bunkách vaječníkov ošípaných. Vizuálny stav vaječníkov bol evidentne odlišný medzi skupinami prasničiek. Vaječníky pohlavne nedospelých zvierat boli pomerne malé

95 a produkovali malé množstvo biologicky aktívnych látok. Pohlavné dospievanie sa prejavovalo v raste folikulov a zvýšenou produkciou látok. Koncentrácie P4, IGF-I a IGFBP-3 v krvnej plazme pohlavne dospelých prasničiek boli signifikantne (p<0,05) vyššie ako pri pohlavne nedospelých ošípaných (Graf 1). Výsledky in vivo boli potvrdené aj výsledkami in vitro (Graf 2). Zistili sme, že produkcia P 4 ovariálnymi granulóznymi bunkami bola preukazne (p<0,05) vyššia pri pohlavne dospelých prasničkách ako pri pohlavne nedospelých ošípaných (Graf 2). Podobné zistenie sme zaznamenali aj v prípade IGF-I (Graf 2). Signifikantný rozdiel (p<0,05) medzi skupinami zvierat sme evidovali aj v prípade IGFBP-3. Percentuálne zastúpenie ovariálnych granulóznych buniek obsahujúcich IGFBP-3 bolo nižšie pri pohlavne nedospelých prasničkách (36,53%±2,29) ako pri pohlavne dospelých ošípaných (50,13%±0,41). Uvoľnenie látok (ng/ml plazmy) 10 * Graf 1 Graf 2 Koncentrácia P 4, IGF-I a IGFBP-3 Produkcia P 4 a IGF-I granulóznymi v krvnej plazme prasničiek bunkami vaječníkov prasničiek * * Uvoľnenie látok (ng/3x10 6 buniek/deň) * * 0 P 4 IGF-I IGFBP-3 0 P 4 IGF-I pohlavne nedospelé prasničky pohlavne dospelé prasničky * signifikantné rozdiely (p<0,05) medzi skupinami prasničiek pohlavne nedospelé prasničky pohlavne dospelé prasničky * signifikantné rozdiely (p<0,05) medzi skupinami prasničiek Naše pozorovania sa stotožňovali so zisteniami iných autorov, ktorí zaznamenali súvislosti pohlavného dospievania s produkciou steroidných hormónov (Loche et al., 1996) pri ošípaných (Sirotkin et al., 1998). Vyššie koncentrácie P 4 v období puberty zvierat svedčia o nezastupiteľnej úlohe daného steroidného hormónu v procese pohlavného dospievania. S pohlavným dospievaním prasničiek sme pozorovali aj vyššiu prítomnosť

96 IGF-I. Výsledky našej práce sú totožné s údajmi autorov o korelácii IGF-I s pohlavným dospievaním (Loche et al., 1996). Na základe literárnych a našich údajov predpokladáme priame zapájanie sa IGF-I do regulácie pohlavného dospievania zvierat, ktoré je závislé od folikulogenézy. Ďalšie výsledky svedčia o zapájaní sa väzbových proteínov pre IGF-I do regulácie pohlavného dospievania prasničiek, ktoré spolu s IGF-I sa podieľajú na regulácii folikulogenézy (Liu et al., 2000). Podľa autorov proces folikulogenézy je usmerňovaný rastovými faktormi ako je IGF-I, ale nami získané údaje dokazujú, že rast a zrenie folikulárnych buniek môžu byť ovplyvnené aj IGFBP-3. Záver Výsledky našej práce potvrdzujú a rozširujú súčasne existujúce poznatky o regulácii pohlavného dospievania ošípaných, čo by mohlo mať prínos nielen pre teóriu, ale aj pre prax. Predpokladáme praktické využitie progesterónového testu pre určenie, či sú zvieratá pohlavne dospelé alebo pohlavne nedospelé. Ďalšie pozorovania nepriamo svedčia o tom, že podobne ako IGF-I, aj jeho väzbové proteíny je možné použiť pre reguláciu folikulogenézy. Od priebehu folikulogenézy závisí pohlavné dospievanie prasničiek, a preto konštatujeme, že tieto procesy úzko medzi sebou súvisia. Literatúra Coverley, J. A. et al.: The Effect of phosphorylation by casein kinase 2 in the activity of insulin-like growth factor-binding protein-3. In: Endocrinology, roč. 141, 2000, č. 2, s Liu, J. et al.: Growth and the initiation of steroidogenesis in porcine follicles are associated with unique patterns of gene expression for individual componentsof the ovarian insulin-like growth factor system. In: Biology of Reproduction, roč. 63, 2000, č. 3, s Loche, S. et al.: The GH/IGF-I axis in puberty. In: British Journal of Clinical Practice Supplement, roč. 85, 1996, s Makarevich, A. - Sirotkin, A.: Development of sensitive radioimmunoassay for IGF-I determination in samples from blood plasma and cell-conditioned medium. In: Veterinárna Medicína, roč. 44, 1999, č. 3, s Monno, S. et al.: Insulin-like growth factor 1 activates c-jun N-terminal kinase in MCF-7 breast cancer cells. In: Endocrinology, roč. 141, 2000, č. 2, s Osborn, M. - Isenberg, S.: Immunocytochemistry of frozen and of paraffin tissue sections. In: Cell Biology : A Laboratory Hanbook. New York/London : Academic Press, roč. 2, s

97 Sanislo, P. et al.: Úloha thrombopoietinu a rozličných proteínkináz v regulácii proliferácie, apoptózy a steroidogenézy ovariálnych buniek ošípaných in vitro. In: Acta fytotechnica et zootechnica, roč. 4, 2001, č. 2, s Sirotkin, A. V. et al.: Isolated porcine ovarian follicles as a model for the study of hormone and growth factor action on ovarian secretory activity. In: Journal of Endocrinology, 159, 1998, s Sirotkin, A. et al.: The transfection-induced overexpression of IGF-binding protein 4 affects the secretory activity of porcine ovarian granulosa cells and their response to hormones and IGF-I. In: Journal of Molecular Endocrinology, roč. 26, 2001, č. 3, s

98 EXPRESIA PROTEÍNKINÁZY G, MAP KINÁZY ERK1,2, TYROZÍNKINÁZY PHT A ODOZVA OVARIÁLNYCH GRANULÓZNYCH BUNIEK PRASNIČIEK NA DBCAMP, IGF-I A OXYTOCÍN THE EXPRESSION OF PROTEIN KINASE G, MAP KINASE ERK1,2, PHOSPHOTYROSINE PHT AND RESPONSE OF PORCINE OVARIAN GRANULOSA CELLS ON DBCAMP, IGF-I AND OXYTOCIN Kolesárová A. 1, Sirotkin A. 2, Kramárová M. 1, Massányi, P. Kováčik J. 1 1 Katedra fyziológie živočíchov, Slovenská poľnohospodárska univerzita v Nitre, 2 Ústav genetiky a reprodukcie HZ, Výskumný ústav živočíšnej výroby v Nitre, [email protected] 1, Abstract The aim of our experiments was to study the regulation of the expression of protein kinase G (PKG), MAP kinase (ERK1,2) and phosphotyrosine (PhT) in porcine ovarian granulosa cells cultured in vitro. Gilts were divided in two groups according to the sexual maturation (sexually immature gilts and sexually mature gilts). By immunocytochemistry we determined, that sexual maturation of gilts is associated with the expression of PKG, ERK1,2 and PhT. It was observed that dbcamp (analog camp), insulin-like growth factor I (IGF-I) and oxytocin (OT) influenced the expression these kinases during sexual maturation in gilts. These data demonstrate that in pigs PKG, ERK1,2, PhT, camp, IGF-I and OT control gonadal functions and sexual maturation. Úvod Z biologického a ekonomického hľadiska je dôležité predbežné ohodnotenie biologickej aktivity hormonálnych látok a ich vnútrobunkových sprostredkovateľov pred ich praktickou aplikáciou na zvieratách a ľuďoch. Poznávanie a skúmanie regulátorov intraovariálnych procesov hospodárskych zvierat, ich vzájomné vzťahy a mechanizmy účinku je dôležité ako z teoretického, tak aj z praktického hľadiska. Cieľom našej práce bolo: 1. porovnať úroveň expresie proteínkinázy PKG, MAP kinázy ERK1,2 a tyrozínkinázy (TK) PhT medzi pohlavne nedospelými a pohlavne dospelými prasničkami v podmienkach in vitro, 2. skúmať úlohu analóga camp (dbcamp), inzulínu podobného rastového faktoru (IGF-I) a oxytocínu (OT) v regulácii expresie PKG, ERK1,2 a PhT v granulóznych bunkách vaječníkov pohlavne nedospelých a pohlavne dospelých prasničiek.

99 Materiál a metódy Vaječníky získané pri zabití zvierat sme individuálne uskladnili v termoske s fyziologickým roztokom pri izbovej teplote a spracovali maximálne do 6 hodín od zabitia zvierat. Na základe klinických prejavov ruje a podľa vizuálnej charakteristiky stavu vaječníkov sme prasničky rozdelili na dve skupiny - pohlavne nedospelé (26 prasničiek) a pohlavne dospelé prasničky (24 prasničiek). Ovariálne granulózne bunky sme izolovali metódou aspirácie zo stredne veľkých folikulov (2 5 mm) a suspenziu granulóznych buniek sme odstreďovali (1500 ot/min, 10 minút) za účelom oddelenia od folikulárnej tekutiny s následným premývaním pomocou sterilného kultivačného média TCM-199 doplneného 10% fetálnym teľacím sérom a antibiotikom - antibiotic antimycotic solution (Sigma, St. Louis, MO, USA). Pomocou hemocytometra sme počítali bunky a upravili koncentráciu buniek 3 x 106 buniek/ml média. Bunkovú suspenziu riedenú kultivačným médiom sme kultivovali (37 oc, 5 % CO2). Približne po 7-10 dňoch kultivácie, keď bunky vytvorili na 75 % súvislú monovrstvu, sme médium nahradili čerstvým s rovnakými doplnkami ako bolo pôvodné bez prídavkov (kontrola) alebo s prídavkami IGF-I (10 ng/ml), OT (100 ng/ml) a dbcamp (10 µg/ml) (Sigma), ale bez prítomnosti fetálneho teľacieho séra. Monovrstvu buniek sme fixovali 4% paraformaldehydom v PBS (Phosphate Buffer Saline) 10 minút a uskladnili pri +4 oc až do doby imunocytochemickej analýzy (Osborn a Isenberg, 1994; Sirotkin a Makarevich, 1999; Makarevich et al., 2000; Sirotkin et al., 2000a) pomocou protilátok od firmy Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, USA). Výsledky a diskusia Pohlavné dospievanie prasničiek bolo charakteristické zmenou podielu ovariálnych granulóznych buniek obsahujúcich PKG, MAP kinázu ERK1,2 a tyrozínkinázu PhT. Množstvo ovariálnych buniek s prítomnými proteínkinázami PKG a ERK1,2 bolo vyššie pri pohlavne nedospelých prasničkách (PKG: 61,33%±2,10 a ERK1: 46,23%±1,79) ako pri pohlavne dospelých ošípaných (PKG: 16,68%±2,23 a ERK1,2: 35,33%±1,60). Percentuálne zastúpenie buniek vaječníkov obsahujúcich tyrozínkinázu PhT pri pohlavne nedospelých zvieratách bolo nižšie (32,40%±3,32) v porovnaní s pohlavne dospelými prasničkami (41,43%±1,06). V expresii všetkých troch sledovaných biologicky aktívnych látkach sme evidovali signifikantné rozdiely (p<0,05) medzi skupinami zvierat. Nadobudli sme dôkazy, že pohlavné dospievanie prasničiek je spojené so zmenou MAP kinázy ERK1,2. Predpokladáme zapájanie sa aj PKG a PhT do regulačných mechanizmov pohlavného dospievania prasničiek. Protikladné zmeny v TK

100 a MAPK počas pohlavného dospievania zvierat nepotvrdzujú funkčné prepojenie týchto dvoch kináz. Expresia PKG, ERK1,2 a PhT v granulóznych bunkách vaječníkov prasničiek bola ovplyvnená prídavkami dbcamp, IGF-I a OT. Zaznamenali sme stimulačný efekt dbcamp na aktivitu ERK1,2 a PKG pri oboch skupinách ošípaných. Účinok dbcamp bol výraznejší pri pohlavne dospelých zvieratách (ERK1,2: +133,67%±1,84, PKG: +94,84%±1,91) ako pri pohlavne nedospelých (ERK1,2: +33%+0,72, PKG: +33,53%±0,20). Vplyv dbcamp na expresiu PhT v bunkách granulózy bol odlišný v závislosti od skupiny ošípaných. Pri pohlavne nedospelých zvieratách dbcamp eliminoval PhT (-68,31%±3,85) na rozdiel od pohlavne dospelých prasničiek, kde sme pozorovali stimuláciu (+35,66%±1,12). Diferencie medzi skupinami zvierat boli signifikantné (p<0,05). Podľa SIROTKINA et al. (2000b) camp-závislá PKA sa môže zapájať do regulácie MAP-kinázy (ERK) v ovariálnych bunkách prasničiek. CAMERON et al. (1996) pozorovali zvýšenú aktivitu ERK1 a ERK2 kináz vplyvom camp v cytoplazme a v jadre granulóznych buniek ošípaných. MAKAREVICH et al. (2000) demonštrovali vplyv IGF-I/cAMP/PKA systému na MAPK aktivitu (ERK) v ovariálnych granulóznych bunkách králikov. Naše zistenia sú v súlade so zisteniami spomínaných autorov. Potvrdili sme existujúce údaje o prepojení camp/pka- a MAPK-závislých signálnych dráh a že camp môže aktivovať MAPK. Dokázali sme účasť camp v regulácii PKG a TK. Odlišný charakter vplyvu dbcamp na PhT a ERK naznačuje, že camp môže regulovať MAPK nie cez TK, ale cez iné vnútrobunkové signálne dráhy. Eliminácia PKG a ERK1,2 vplyvom IGF-I bola pozorovaná v granulóznych bunkách pohlavne nedospelých prasničiek (PKG: 6,73%±0,39, ERK1,2: 43,61%±2,62). V prípade pohlavne dospelých zvierat sme zaznamenali opačný efekt: expresia PKG sa zvýšila o 94,84%±2,14 a ERK1,2 o 20,12%±1,02 v porovnaní s bunkami kultivovanými bez prídavku IGF-I. Sledovali sme inhibičný účinok IGF-I aj na expresiu PhT pri oboch skupinách zvierat. Výraznejšiu redukciu (- 65,14%±10,60) sme evidovali pri pohlavne dospelých jedincoch na rozdiel od pohlavne nedospelých (-10%±3,87). V sledovaných látkach sme zaznamenali signifikantné diferencie (p<0,05) medzi skupinami prasničiek. Naše zistenia korešpondujú s údajmi autorov o úlohe rastových faktorov v regulácii expresie MAP-kinázy v granulóznych bunkách ošípaných (CAMERON et al., 1996) a králikov (MAKAREVICH et al., 2000). Výsledky práce svedčia o možnej úlohe PKG, TK a MAPK v sprostredkovaní účinku IGF-I na vaječníky a o zapájaní sa týchto látok do regulácie pohlavného dospievania.

101 OT variabilne ovplyvňoval expresiu proteínkináz v ovariálnych granulóznych bunkách v závislosti od skupiny prasničiek. Pri pohlavne nedospelých ošípaných OT stimuloval PKG (+8,92%±0,17), ale eliminoval ju pri pohlavne dospelých zvieratách (-22,42%±4,52). Inhibičný efekt OT na aktivitu MAP kinázy a tyrozínkinázy PhT sme sledovali aj pri pohlavne nedospelých, aj pri pohlavne dospelých prasničkách. V prípade pohlavne nedospelých ošípaných OT redukoval ERK1,2 o 20,22%±0,24, PhT o 44,95%±1,02 a pri pohlavne dospelých zvieratách ERK1,2 o 33,98%±7,45 a PhT o 31,80%±0,55. Medzi pohlavne nedospelými a pohlavne dospelými prasničkami sme sledovali preukazné diferencie (p<0,05) v účinku OT na expresiu vybraných biologicky aktívnych látok. Podobnosť biologických efektov OT na PhT a ERK1,2 potvrdzujú funkčnú prepojenosť TK a MAPK-závislých mechanizmov. Záver Výsledky našej práce prispeli k rozšíreniu teoretických poznatkov v oblasti regulačných mechanizmov pohlavného dospievania ošípaných. Expresia PKG, ERK1,2 a PhT v bunkách granulózy pohlavne nedospelých a pohlavne dospelých prasničiek poukazuje na zapájanie sa už spomínaných kináz do regulácie pohlavného dospievania. Odozva ovariálnych granulóznych buniek na dbcamp, IGF-I a OT počas pohlavného dospievania naznačuje, že aplikáciou regulátorov kináz by bolo možné ovplyvniť funkcie buniek vaječníkov, a tým usmerniť pohlavné dospievanie hospodárskych zvierat. Literatúra Cameron, M. R. et al.: Activation of mitogen-activated protein kinase by gonadotropins and cyclic adenosine 5-monophosphates in porcine granulosa cells. In: Biology of Reproduction, roč. 55, 1996, s Makarevich, A. et al.: The role IGF-I, camp/protein kinase A and MAPkinase in the control of steroid secretion, cyclic nucleotide production, granulosa cell proliferation and preimplantion embryo development in rabbits. In: Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology, roč. 73, 2000, s Osborn, M. - Isenberg, S.: Immunocytochemistry of frozen and of paraffin tissue sections. In: Cell Biology : A Laboratory Hanbook. New York/London : Academic Press, roč. 2, s Sirotkin, A. - Makarevich, A.: GH regulates activity and apoptosis in cultured bovine granulosa cells trough the activation of the camp/protein kinase A system. In: Journal of Endocrinology, roč. 163, 1999, s

102 Sirotkin, A. V. et al.: Effect of cgmp analogues and protein kinase G blocker on secretory activity apoptosis and the camp/protein kinase A system in porcine ovarian granulosa cells in vitro. In: Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology, roč. 74, 2000a, č.1/2, s Sirotkin, A. et al.: Úloha oxytocínu, camp- a cgmp-závislých mechanizmov pri regulácii funkcií ovariálnych folikulov ošípaných. In: Journal of Farm Animal Science, roč. 33, 2000b, s

103 HODNOTENIE NUTRIČNÉHO STAVU DOSPELÝCH OSÔB S VYUŽITÍM ANTROPOMETRICKÝCH PARAMETROV A STANOVENIA TELESNÉHO TUKU EVALUATION OF NUTRTITIONAL STATUS IN ADULTS BY ANTHROPOMETRIC PARAMETERS AND BODY FAT MEASUREMENT Kopčeková, J., Šramková, K., Daniška, J. Katedra výživy ľudí FAPZ SPU Nitra Abstract The objective of the study was to evaluate somatometric parameters in 119 adult humans aged years (average age 46,69 years). Body composition, particularly body fat content was estimated using bioelectrical impedance analysis. According to body fat content was overweight classificated by 34,4 % of persons (34,8 % of females and 33,4 % of men) and obesity by 30,3 % of persons (28,3 % of females and 37,0 % of men). The body composition classification according to body mass index was by 38,9 % probands different compared with evaluation overweight or obesity according to body fat content. Úvod Telesná výška, hmotnosť, obvod pásu a obvod bokov patria k antropometrickému vyšetreniu, ktoré je súčasťou metód fyziologickoklinického sledovania na určenie stavu výživy. Indexy proporcionality (napr. body mass index a iné) neumožňujú štrukturálny pohľad na telesné zloženie (podiel aktívnej telesnej hmoty a tuku v organizme) (Kajaba, Kaláč, Krátky et al., 2003), naviac aj u dospelých sú zaťažené určitými chybami, nediferencujú pohlavie a vek (Kajaba et al., 2002). Cieľom štúdie bolo zhodnotiť vybrané antropometrické parametre ako ukazovatele stavu výživy: telesnú hmotnosť vo vzťahu k telesnej výške - body mass index (BMI), podiel telesného tuku a porovnať hodnotenie podľa obsahu telesného tuku a podľa BMI. Materiál a metódy V súbore 119 náhodne vybratých dospelých osôb vo veku rokov (s priemerným vekom 46,69 ± 9,16 rokov) sme merali a hodnotili ukazovatele nutričného stavu: telesnú hmotnosť a telesnú výšku, celkový telesný tuk, index telesnej hmotnosti (BMI) vypočítaný ako podiel telesnej hmotnosti v kilogramoch a druhej mocniny telesnej výšky v metroch.

104 Podiel celkového telesného tuku (percentuálne a celkové množstvo telesného tuku v kg) sme merali metódou bioelektrickej impedančnej analýzy (BIA) prístrojom Omron BF 300. Podľa podielu celkového telesného tuku sme ženy rozdelili do štyroch skupín podľa hodnotenia: štíhla postava (19,9 % a menej), normálna postava (od 20 % do 29,9 %), nadhmotnosť (od 30 % do 34,9 %), obezita (35 % a viac). U mužov sme podiel telesného tuku hodnotili podľa nasledovných kritérií: štíhla postava (9,9 % a menej), normálna postava (od 10 % do 19,9 %), nadhmotnosť (od 20 % do 24,9 %), obezita (25 % a viac). Na základe BMI sme hodnotili normálnu telesnú hmotnosť (u žien BMI 24 a menej, u mužov 25 a menej), zvýšenú hmotnosť (u žien 24,1-28,9, u mužov 25,1-29,9) a obezitu (u žien 29 a viac, u mužov 30 a viac) (Avdičová et al., 2000). Výsledky a diskusia Priemerný vek súboru žien bol nižší ako mužov (rozdiel 2,08 rokov), ženy mali aj nižšiu priemernú hmotnosť (o 19,5 kg), telesnú výšku (o 13,6 cm) a teda aj BMI (o 2,66 kg/m 2 ) (tab. 1). Podiel celkového telesného tuku bol u žien nižší o 7,79 % a 0,32 kg (tab. 2). Tab. 1 Telesná hmotnosť, výška a BMI vyšetrovaných osôb ženy muži spolu n % 77,3 22,7 100,0 vek [roky] telesná hmotn. [kg] telesná výška [cm] BMI [kg.m -2 ] 46,22 ± 8,73 68,43 ± 4,73 164,36 ± 4,73 25,29 ± 3,85 48,30 ± 10,49 87,93 ± 14,95 177,96 ± 7,63 27,95 ± 5,56 46,69 ± 9,16 72,86 ± 14,82 167,45 ± 7,93 25,89 ± 4,41 Podľa nameraného podielu telesného tuku (tab. 3) mal najväčší podiel žien nadhmotnosť (34,8 %), najviac mužov malo obezitu (37,0 %) a z celého súboru osôb bolo najviac s nadhmotnosťou (34,4 %). Štíhlu alebo normálnu telesnú hmotnosť malo 34 žien (36,9 %), 8 mužov (29,6 %) a 42 zo všetkých sledovaných osôb (35,3 %). Nadhmotnosť alebo obezitu malo 58 žien (63,1 %), 19 mužov (70,4 %) a 77 zo všetkých sledovaných osôb (64,7 %).

105 Tab. 2 Podiel telesného tuku ženy muži spolu n % 77,3 22,7 100,0 telesný tuk [%] priemer ± SD minimum maximum telesný tuk [kg] priemer ± SD minimum maximum 31,54 ± 6,12 15,50 43,00 22,06 ± 7,61 8,80 43,50 23,75 ± 6,68 12,10 36,10 21,74 ± 9,61 7,70 43,70 29,77 ± 7,03 12,10 43,00 21,99 ± 8,07 7,70 43,70 Tab. 3 Vyhodnotenie telesného tuku (%) ženy muži spolu n % n % n % štíhla 4 4, ,4 normálna 30 32,6 8 29, ,9 nadhmot ,8 9 33, ,4 obezita 26 28, , ,3 Na základe hodnotenia BMI (tab. 4) mal najvyšší podiel žien zvýšenú hmotnosť (42,4 %), najviac mužov normálnu hmotnosť (37,0 %) a z celého súboru osôb bolo najviac s normálnou hmotnosťou (40,3 %). Zvýšenú hmotnosť alebo obezitu malo 54 žien (58,7 %), 17 mužov (63,0 %) a 71 zo všetkých sledovaných osôb (59,7 %). Tab. 4 Vyhodnotenie indexu telesnej hmotnosti BMI (kg/m 2 ) ženy muži spolu hmotnosť n % n % n % normálna 38 41, , ,3 zvýšená 39 42,4 8 29, ,5 obezita 15 16,3 9 33, ,2 Zisťovali sme prítomnosť rizikových hodnôt sledovaných parametrov telesnej konštitúcie telesného tuku a súčasne i rizikovej hodnoty BMI (tab. 5). Nadhmotnosť alebo obezitu klasifikovanú súčasne podľa parametra podiel telesného tuku i parametra BMI sme zistili u 33 (56,9 %) z 58 žien, u 14 (73,7 %) z 19 mužov a celkovo u 47 (61,1 %) zo 77 všetkých osôb. Klasifikácia nadhmotnosti a obezity podľa podielu telesného tuku sa nezhodovala s klasifikáciou podľa hodnoty BMI u 43,1 % žien a 26,3 % mužov (u 38,9 % osôb), u ktorých bola nadhmotnosť alebo obezita klasifikovaná podľa podielu tuku v organizme.

106 Tab. 5: Zhoda hodnotenia nadhmotnosti a obezity podľa telesného tuku a podľa BMI ženy muži spolu n % n % n % nadhmotnosť/ 20 34,5 6 31, ,8 zvýšená hmotn. obezita 13 22,4 8 42, ,3 Spolu * 33 56, , ,1 Spolu ** , , ,0 * počet osôb so súčasnou rizikovou hodnotou telesného tuku i BMI ** celkový počet osôb so zvýšenou hodnotou telesného tuku Hodnotenie nadhmotnosti alebo obezity len podľa BMI je menej spoľahlivé. Jednou z príčin nezhodného hodnotenia s hodnotením podľa obsahu telesného tuku môže byť nezohľadňovanie pohlavia, veku, prípadne ďalších faktorov pri výpočte BMI. Záver Podľa nameraného podielu telesného tuku sme v súbore 119 náhodne vybratých osôb zistili nadhmotnosť u 34,4 % osôb a obezitu u 30,3 % osôb. Podľa body mass indexu bolo hodnotenie zvýšenej hmotnosti a obezity rozdielne, nakoľko index telesnej hmotnosti nezohľadňuje pohlavie, vek ani ďalšie faktory vyšetrovaných osôb. Literatúra: 1. AVDIČOVÁ, M. et al Metodická príručka pre prácu v poradniach zdravia. Bratislava : Ministerstvo zdravotníctva, s. ISBN KAJABA, I., BZDÚCH, V., BEHÚLOVÁ, D., KRÁTKY, A Komplexná metóda výskumu stavu výživy vybraných populačných skupín SR. In: Výživa a zdraví Celostátní konference s medzinárodní účastí. Teplice 17. až 19. září Teplice : Okresní hygienická stanice, 2002, s KAJABA, I., KALÁČ, J., KRÁTKY, A. et al Komplexná metóda výskumu výživovej situácie obyvateľstva Slovenska. In: Poľnohospodárstvo, roč. 49, 2003, č. 7, s

107 APOPTÓZA AKO MARKER KVALITY A ŽIVOTASCHOPNOSTI KRÁLIČÍCH EMBRYÍ PO MIKROMANIPULÁCIÁCH APOPTOSIS AS A QUALITY AND VIABILITY MARKER OF RABBIT EMBRYOS AFTER MICROMANIPULATION Kordovánová, D. 1, Makarevič, A. 2, Chrenek, P. 2 1 Univerzita Konštanína Filozofa Nitra, Fakulta prírodných vied 2 Výskumný ústav živočíšnej výroby, Hlohovecká 2, Nitra Abstract This study was designed to examine the effects of microinjection on quality and viability of rabbit embryos. The aim of it was to determinate if programmed cell death apoptosis (using two parameters: TUNELpositive cells per embryo and TUNEL index) should by a good marker to evaluate embryos for selecion and transfer to uterus. Microinjection of foreign gene resulted in decreased developmental rate and increased frequency of apoptotic cells to compare with control group. Therefore, we concluded, that TUNEL index can be a suitable parameter. Úvod Pri produkcii transgénnych zvierat sa používajú mikromanipulácie na vajíčkach in vitro a každá in vitro manipulácia znižuje životaschopnosť a prežívateľnosť následne vytvoreného embrya. Hlavným dôvodom je, že materiál in vitro sa výrazne líši svojou kvalitou i životaschopnosťou od materiálu in vivo. Obzvlášť, mikroinjekcia DNA do cytoplazmy alebo do prvojadra králičích vajíčok spôsobuje zastavenie ich vývoja, znižuje pomer podelených embryí ako aj pomer embryí vyšších vývojových štádií (moruly a blastocysty) (Voss a kol., 1996; Chrenek a kol., 1998), ako aj zvýšený výskyt apoptotických buniek v embryu. Apoptóza alebo programovaná smrť bunky je aktívny fyziologický proces spôsobujúci elimináciu nadbytočných, poškodených alebo nebezpečných buniek na základe špecifických, geneticky kontrolovaných programov (Hardy, 1999). Prejavuje sa v bunkách na úrovni membrány, genómovej DNA alebo organel. V tejto súvislosti existujú rôzne metódy detekcie apoptóz, pričom my sme v našej práci použili detekcia fragmentácie DNA použitím metódy TUNEL. Náš výskum bol zameraný na testovanie vývojového potenciálu vo vzťahu k výskytu apoptóz u embryí králikov oplodnených in vivo po mikromanipuláciách uskutočnených in vitro.

108 Materiál a metódy V experimentoch sme používali králiky brojlerových línií novozélandského plemena hodín po pripárení sme donorky zabili a vypreparovali vaječník s vajcovodom. Vajíčka sme vyplavili médiom PBS (Gibco BRL), doplneným o 10% BSA. Mikroinjekciu cudzieho génu sme robili pomocou manuálnych mikromanipulačných jednotiek (Alcatel a Narishige) umiestnených na mikroskope Olympus (IMT-2) s Nomarského optikou. Vyselektované vajíčka sme náhodne rozdelili na dve skupiny: 1. určená na mikroinjekciu génovou konštrukciou WAP-hFVIII (Chrenek a kol., 2004), 2. nemikroinjektovaná skupina. Následne sme embryá kultivovali v kultivačnom médiu k-dmem (Gibco) s 10% FCS pri 5% CO2 a 39 C po dobu 96 h.p.c. Získané embryá v štádiu blastocysty boli ďalej fixované použitím analýzy TUNEL, ako popísané (Makarevič a Markkula 2002). Embryá sme analyzovali pomocou laserového konfokálneho skenovacieho mikroskopu Olympus IX 70 vybaveného skenovacou jednotkou Fluoview 300 a laserom so zmesou plynov argón/kryptón. Použili sme objektív UplanApo x 40 s 2 apertúrou. Výsledky sme spracovali použitím Fluoview verzia 1,2 software. TUNEL - index sme určili ako pomer TUNEL pozitívnych jadier k celkovému počtu jadier (zafarbených PI) spočítaním z obrázkov Z-optických rezov, ktoré predstavovali 1,0 µm. Výsledky a diskusia Sledovali výskyt apoptóz pri embryách na základe stanovenia počtu buniek s fragmentovanou DNA (TUNEL Vplyv mikroinjekcie na počet TUNELpozitívnych buniek na blastocystu bunky pri pozorovaní na -pozitívne bunky). Tieto fluorescenčnom alebo konfokálnom mikroskope preukazovali b zelené zafarbenie vďaka 10 a,b a fluoresceinu FITC. 8 Jadrá všetkých embryonálnych blastomér 6 4 preukazovali červené 2 zafarbenie vďaka jadrovému farbivu propidium 0 Intaktné Mi-gén Mi-PBS jodidu. Najviac TUNEL -pozitívných buniek Obr. č. 1 Vplyv mikroinjekcie na TUNEL-pozitivitu TUNEL-pozitívne bunky na embryo

109 na embryo sa vyskytovalo pri génom mikroinjektovaných embryách a ich počet sa signifikantne odlišoval od kontrolnej skupiny, ale výrazne sa neodlišoval od embryí mikroinjektovaných PBS. PBS mikroinjektovaná skupina sa signifikantne neodlišovala od kontrolnej skupiny (Obr. č. 1). Okrem priemerného počtu TUNEL - pozitívnych buniek na embryo sme hodnotili TUNEL - index Vplyv mikroinjekcie na TUNEL - blastocýst, ktorý vyjadruje index králičích blastocýst percentuálny pomer apoptotických 20 buniek k celkovému 18 počtu buniek blastocysty. 16 b b Signifikantne vyšší TUNEL a index mali mikroinjektované embryá či už s génom alebo s PBS, pričom tento rozdiel bol viac ako dvojnásobný (Obr. č. 2). Neboli zistené preukazné 4 rozdiely medzi obidvoma 2 mikroinjektovanými 0 skupinami. TUNEL index, % Intaktné Mi-gén Mi-PBS Obr. č. 2 Vplyv mikroinjekcie na TUNEL-index Výsledky predchádzajúcich štúdií ukazujú, že manipulácia in vitro znižuje preživateľnosť výsledného embrya mechanickým poškodením počas mikroinjekcie (Canseco a kol., 1994). Jedným z funkčných kritérií preživateľnosti embryí môže byť determinácia apoptóz. Najviac sa odlišoval apoptotický index, čo poukazuje na to, že tento ukazovateľ najlepšie charakterizuje zmeny v kvalite mikroinjektovaných embryí a môže byť jedným z markerov kvality a prežívateľnosti. V našej práci apoptotický index v intaktnej skupine dosahoval hodnotu 6%, zatiaľ čo po mikroinjekcii sa táto hodnota preukazne zvyšovala viac ako dvojnásobne. Pričom apoptotický index bol približne rovnaký či už pri embryách mikroinjektovaných génom alebo PBS. Pri počte apoptotických buniek na jednu blastocystu mikroinjekcia génom preukazne ovplyvňovala počet mŕtvych buniek na jedno embryo, zatiaľ čo pri mikroinjekcií s PBS bola pozorovaná len tendencia k zvyšovaniu počtu. Nakoľko embryá v rôznych skupinách majú variabilitu v počte buniek, TUNEL-index je presnejším parametrom v porovnaní s počtom mŕtvych buniek na embryo.

110 Záver Analýza embryí potvrdzuje, že apoptóza hrá dôležitú úlohu vo vývoji embryí, hoci presná podstata zostáva neznáma. Dôležitá je však regulácia apoptózy, ktorá vyžaduje rovnováhu vonkajších faktorov ako aj endogénnych génových produktov. Apoptózu - programovanú smrť buniek, ako prirodzený proces úplne eliminovať nemôžeme. Tiež nám môže poslúžiť ako vhodný selekčný marker pre správny výber embryí na prenos. Avšak zníženú kvalitu embryí po mikroinjekcií spôsobenú zvýšeným výskytom apoptotických buniek je možné potlačiť. Jedným zo spôsobov je aj prídavok rôznych antiapoptotických faktorov, ako sú rastové faktory, ktoré by mohli túto skutočnosť pozitívne pozmeniť. Literatúra Canseco, R.S., Sparks, A.E.T., Page, R.L., Russel, C.G., Johnson, J.L. Velander, W.H., Pearson, R.E., Drohan, W.N., Gwazdauskas, F.C. (1994): Transgenic Res.,3: Hardy, K. (1999): Apoptosis in the human embryo. Reviews of Reproduction, 4: Chrenek, P., Makarevich, A., Vašíček, D., Laurinčík, J., Bulla, J., Gajarská, T., Rafay, J. (1998): Effect of superovulation, culture and microinjection on development of rabbit embryos in vitro. Theriogenology, 50: Chrenek P., Vašíček D., Makarevich A., Jurčík R., Suvegová K., Bauer M., Rafay J., Bulla J., Hetényi L., Erickson J., Paleyanda R.K. (2004): Stability of transgene transmission in three generations of transgenic rabbits after single or double pronuclear microinjection. 8th WRC, Mexico,, Makarevich, A.V., Markkula, M. (2002): Apoptosis and cell proliferation potencial of bovine embryos stimulated with Insulin-like growth factor I during in vitro maturation and culture. Biology of Reproduction, 66: Voss, A.K., Sandmoller, J.J., Suske, G., Strojek, R.M., Beato, M., Hahn, J. (1996): A comparison of mouse and rabbit embryos for the production of transgenic animals by pronuclear microinjection. Theriogenology, 34:

111 ZMENY AKTIVITY CHYMOTRYPSÍNU A TRYPSÍNU V TRUSE JAPONSKÝCH PREPELÍC PO APLIKÁCII CD A CR CHANGE OF ACTIVITIES CHYMOTRYPSIN AND TRYPSIN IN DROPPINGS OF JAPANESE QUAILS AFTER CD AND CR APPLICATION Korének, M., Koréneková, B., Skalická M., Naď, P. Universita veterinárskeho lekárstva, Košice Abstract The effect of Cd on the activity of chymotrypsin (ACHT) and trypsin (AT) in droppings of Japanese quail was observed. The group 1 was control. In the 2. group, Cd was added daily in dose 0.12 mg Cd/day and animal and in group 3, Cd+Cr (0.12 mg Cd and 0.12 mg Cr) was added. ACHT and AT were photometric determined on 35. and 58 day of experiment. In group 2, Cd decreased ACHT and AT in the middle of the study (135.3; 116 U/g) as well as in the end of experiment (132.1;201.3 U/g) in comparison to control. In group 3, Cd+Cr increased ACHT and AT in the middle of the study (213.9;147.9 U/g) as well as in the end of experiment (270.5;210.7 U/g). Úvod Kadmium je vysoko toxický a nebezpečný kontaminant životného prostredia Patrí do skupiny abiogénnych chemických prvkov, ktorý je v stopových množstvách prítomný v živočíšnych a rastlinných druhoch (Kottferová, 1996). Kumuluje najprv v pečeni a neskôr v obličkách. Spôsobuje Cd indukované poškodenie s následnými zmenami v hladinách enzýmov. Inhibuje aktivitu mnohých enzýmov ako sú kataláza, mitochondriálna ATP-áza, alkalická fosfatáza, niektoré proteázy, dehydrogenázy a chymotrypsín v truse hydiny (El Sabai a kol., 1994). Chróm je pre zvieratá esenciálny prvok, známy ako glukózo toleranný faktor (Baselt, 2000). Spôsobuje zníženie hladín cholesterolu v svalovine, v srdci, v krvnej plazme a vo vaječnom žĺtku (Debski et al., 2000). Japonská prepelica sa používa pre skúmanie fyziologických procesov v tele kurovitých, a ako vhodný experimentálny objekt na sledovanie interakčných vzťahov esenciálnych chemických prvkov a xenobiotík v podmienkach in vivo (Koréneková a kol., 2004). Cieľom práce bolo sledovanie zmien aktivity chymotrypsínu a trypsínu v truse Japonských prepelíc po prídavku kadmia a chrómu.

112 Materiál a Metódy Do pokusu boli zaradené Japonské prepelice vo veku 3 týždňov, ktoré boli rozdelené do 3 skupín: Kontrolná skupina a dve experimentálne skupiny. V 2. skupine bolo v roztoku aplikované kadmium v dávke 0,12 mg Cd/kus a deň. V 3.skupine bolo aplikované spolu Cd (CdCl 2.2H 2 O) a Cr (CrCl 3.6H 2 O) v dávke 0,12 mg Cd a 0.12 mg Cr/kus a deň. Prepelice boli ustajnené v klietkach, pričom mali optimálne, mikroklimatické podmienky pre rast. Kŕmené boli zmesou HYD 10. Krmivo a voda boli podávané ad libitum. Priemerná hmotnosť prepelíc počas experimentu bola 170 g. Aktivita chymotrypsínu (ACHT) a trypsínu (AT) v truse hydiny bola stanovená na 35. deň a 58. deň aplikácie prvkov spektrofotometricky (Šulík a kol., 1992) na syntetický chromogénny substrát L-TAPA (Tosyl-Arg- pna pre trypsín) a (Suc-(Gly) 2 -Phe-pNa pre chymotrypsín). Výsledky a diskusia V truse 2. pokusnej skupine s prídavkom Cd sme pozorovali po 35. dni pokusu (tab.1) štatisticky významné (p 0,001)zníženie aktivity trypsínu (116,0 U.g -1 ) v porovnaní s kontrolou (132,1 U.g -1 ). Po 58 dňoch aplikácie Cd sme pozorovali štatisticky významné (p 0,001) zníženie AT (201,3 U.g -1 ) porovnaní s kontrolou (220,2U.g -1 )pričom bolo r=0,920. Po prídavku Cd sme pozorovali po 58.dni významné (p 0,001) zvýšenie AT (201,3 U.g -1 ), v porovnaní so začiatkom pokusu (98,3U.g -1 ), pričom bolo r=0,870. Tabuľka 1 Aktivita trypsínu v truse prepelíc (U.g -1 ) v skupine bez a s prídavkom Cd No 1. deň 35. deň 58. deň Kontrola Cd Kontrola Cd Kontrola X 125,2 98,3*** 132,1 116*** 220,2 201,3*** Sd 5,2 7,4 8,0 6,0 9,3 7,8 Min 118,5 201,3 122,9 217,1 286,1 171,6 Max 131,9 250,2 141,3 231,2 312,4 192,6 Medián 125,2 224,6 132,1 224,5 303,6 180,5 *** štatistická významnosť na hladine p 0,001 Cd

113 Tabuľka 2 ACHT v truse prepelíc (U.g -1 ) v skupine bez prídavku a s prídavkom Cd No 1. deň 35. deň 58. deň Kontrola Cd Kontrola Cd Kontrola X 152,8 120,5*** 160,4 135,3*** 195,9 132,1*** Sd 6,2 6,1 6,1 6,0 9,3 7,8 Min 145,3 201,3 152,1 217,1 286,1 171,6 Max 160,3 250,2 168,7 231,2 312,4 192,6 152,8 224,6 160,4 224,5 303,6 180,5 Medián V kontrolnej aj 2.skupine sme zistili (tab. 2) stúpanie chymotrypsínu v závislosti od veku prepelíc. Prídavok Cd spôsobil po 35 dni významné (p 0,001) zníženie ACHT(135,3 U.g -1 ) v porovnaní s kontrolou (160,4 U.g -1 ) pričom bolo r=0,878. Po 58.dňoch Cd spôsobil významné (p 0,001) zníženie ACHT (132,1U.g -1 ) oproti kontrole. Pričom r=0,835 sme pozorovali v Cd skupine na 58.deň v porovnaní k 35.dňu. Prídavok Cd spôsobil po 58.dni významné (p 0,001) zvýšenie ACHT (132,1U.g -1 ) v porovnaní so začiatkom pokusu (120,5 U.g -1 ), pričom bol r=0,550. V 3.skupine sme po prídavku Cd+Cr pozorovali na 35.dni pokusu (tab.3) štatisticky významné (p 0,001) zvýšenie aktivity trypsínu (141,5U.g -1 ), v porovnaní s kontrolou (116,4 U.g -1 ). Po 58. dňoch aplikácie Cd+Cr sme pozorovali významné (p 0,001) zvýšenie AT (210,7U.g -1 )oproti kontrole, pričom bolo r=0,998. V 3. skupine sme pozorovali po 58.dni významné (p 0,001) zvýšenie AT (210,7 U.g -1 ) v porovnaní so začiatkom. Tabuľka 3 Aktivita trypsínu (U.g -1 ) v skupine bez prídavku a s prídavkom Cd+Cr No 1. deň 35. deň 58. deň Kontro la CD + CR Kontrola Cd +Cr Kontrola Cd Cd + Cr X 102,8 112,9*** 116,4 141,5*** 147,8 210,7*** Sd 6,5 5,5 6,9 6,1 8,0 9,7 Min 93,9 106,0 110,2 133,6 138,0 202,8 Max 111,7 119,8 124,3 149,4 157,6 222,8 Medián 102,8 112,9 116,4 141,5 147,8 210,7

114 Tabuľka 4 Aktivita chymotrypsínu (U.g -1 ) v skupine bez a s prídavkom Cd+Cr No 1. deň 35. deň 58. deň Kontrola Cd +Cr Kontrola Cd +Cr Kontrola Cd +Cr X 114,2 150,8*** 160,4 213,9*** 177,1 270,5*** Sd 7,7 6,4 7,6 8,7 7,7 9,8 Min 105,2 143,0 153,5 204,1 167,2 262,2 Max 123,2 158,6 169,6 223,7 187,0 281,6 Mediá n 114,2 150,8 160,4 213,9 177,1 270,5 V kontrolnej aj v 3.skupine sme zistili v porovnaní so začiatkom pokusu (tab.4) stúpanie ACHT v závislosti od veku prepelíc. Prídavok Cd+Cr spôsobil štatisticky významné (p 0,001) zvýšenie ACHT po 35. aj 58. dni aplikácie oproti kontrole. Korelačnú významnosť r=0,999 sme pozorovali v 3.skupine na 58.deň v porovnaní k 35.dňu. V 3. skupine bolo po 58. dni významné zvýšenie ACHT v porovnaní so začiatkom pokusu. Záver Z výsledkov pokusu vyplýva, že dlhodobé podávanie Cd malo inhibičný vplyv na ACHT a AT. Prídavok Cr malo pozitívny vplyv na inhibičný účinok Cd a na zvýšenú aktivitu ACHT a AT. Literatúra 1. BASELT, R.C. 2000, Disposition of toxic drugs and chemicals in man. Chem.Toxicol Inst,Forster CityCalifornia, USA,ISBN , DEBSKI, B., ZALEWSKI, W., KRYNSKI, A.: Influence of Cr yeast supplementation on cholesterol concentration in broilers tissues and egg yolk composition, Proceedings of lectures and posters, Hygiena Alimentorum 21,2000, EL - SEBAI, A.; ABAZA,M.; SZILAGYI,M.; SZALAY,I; SANKARI, M.; PAIS, I.; ANKE,M.; MEISSNER,D.: Physiological and biochemical parameters in chicken exposed to cadmium, Mengen and Spurenelementen. 14. Arbeitsstagung, Jena, (1994), KOTTFEROVÁ, J.: Dissertation work, ŠULÍK,E., KORÉNEK,M.; BLAHOVEC,J., ROSIVAL,I., ŠLESÁROVÁ,L..: Photometric determination of ACHT activity in feces. Materialy IX. Kongresu, Olsztyn, , 496 VEGA 1/0564/03, 1/1336/04

115 SLEDOVANIE ÚČINKU SELÉNU U VAJEC JAPONSKÝCH PREPELÍC PO APLIKÁCII KADMIA OBSERVATION EFFECT OF SELENIUM AFTER CADMIUM APPLICATION IN JAPANESE QUAIL EGGS Koréneková, B., Šály, J., Skalická, M. Naď, P., Buleca, V., *Soták, M. Katedra výživy, dietetiky a chovu zvierat, Univerzita veterinárskeho lekárstva, Košice, *Prešovská univerzita, Prešov Abstract The influence of Se and Cd was observed on quality of Japanese quail eggs. Quails (n=80) were divided into 4 groups with 20 animals per group. Group 1 was the control group. In the group G2, Se was administered daily in dose 0.78 mg of Se for one quail. In the group G3, combination of Se and Cd, in dose 0.12 mg of Cd and 0.78 mg of Se, and G4, 0.12 mg of Cd was added. The weight of eggs, solidity and thickness of eggshell were determined. Se (G2) increased weight of eggs, strength as well as thickness of eggshells in the end of experiment. After addition of Se+Cd in group G3 were found lower values in comparison to G2. Cd treatment (G4) markedly decreased weight of eggs strength of eggshell and thickness of eggshell. Úvod Kadmium je toxický prvok, ktorý v dôsledku priemyselnej expozície ako aj poľnohospodárskou činnosťou je v stopových množstvách prítomný v životnom prostredí (Satarug a kol., 2000). Se je pre zvieratá esenciálny prvok. Nedostatok Se predstavuje významný problém vo väčšine oblastí sveta, kým naopak nadbytok daného prvku môže spôsobovať toxické účinky (Bobček, 2002). Doplnok Se sa používa u zvierat pri jeho nedostatočnom príjme krmivom (Nolan, 2000; Skalická a kol., 2002). Japonská prepelica je veľmi zaujímavý druh zvieraťa jednak pre produkciu vajec a mäsa pre komerčné účely. Prepeličie vajcia sú veľmi významné z hľadiska výživového, nakoľko predstavujú bohatý zdroj vysoko kvalitných proteínov a minerálnych prvkov, napr. selénu (Matek a kol., 2000). Cieľom experimentu bolo stanovenie účinku Se a Cd na váhu vajec Japonských prepelíc ako aj na pevnosť a hrúbku škrupiny. Materiály a metódy V experimente boli použité Japonské prepelice vo veku 40 dní v počte 80ks, rozdelené do 4 skupín po 20ks. Skupina G1 bola kontrolná. V

116 skupine G2, selén (Na 2 SeO 3 ) bol denne podávaný vo forme vodného roztoku v dávke 0,78 mg Se na 1 kus. V skupine G3 bola podávaná kombinácia Se+Cd, (0.78 mg Se a 0.12 Cd), v skupine G4, bolo podané Cd (0.12 mg Cd). Prepelice boli kŕmené kompletnou kŕmnou zmesou HYD 10. Kŕmna zmes a voda boli podávané ad libitum. Podmienky experimentu boli v súlade s etickými požiadavkami. Biologický pokus trval 58 dní. Váha vajec, pevnosť a hrúbka škrupiny boli stanovené na 35 a 58 deň experimentu. Pevnosť škrupiny bola stanovená metódou, ktorú uvádza Marcinka a Gažo (1964). Výsledky boli štatisticky spracované (ANOVA). Výsledky a diskusia Prídavok Se výrazne zvýšil váhu vajec v priebehu experimentu. Na konci experimentu boli vyššie hodnoty v skupine G2 (10.58g) v porovnaní s kontrolou (10.00g). Na druhej strane, Cd+Se výrazne znížil váhu vajec (9.378 g) na konci experimentu. Po 35. dňovej aplikácii sme pozorovali nižšiu váhu vajec v skupine G4 (9.707g) než v kontrolnej skupine (10.79g). Cd expozícia Japanských prepelíc v skupine G4 (9.741g) spôsobila zníženie váhy vajec v porovnaní s kontrolou G1 (10.00g). Porovnanie skupiny G2 (11.18; N)s kontrolou (12.09;3.05 N) odhalilo zníženie pevnosti škrupiny po prídavku Se. Výsledky bol nižšie v skupine G2 (Se) v porovnaní s G3 (Cd+Se). V skupinách (G2, G3, G4) bola zaznamenaná nižšia pevnosť škrupiny v porovnaní s kontrolou G1. Pozorovali sme zníženie hrúbky škrupiny v skupine G2 (Se) a G3 (Cd+Se) v porovnaní s kontrolou G1, pričom zníženie bolo výraznejšie v skupine G3 (Tab.1). Priemerná hrúbka škrupiny v skupine G4 bola nižšia ako v kontrole (0.245 mm). Výsledky štúdie poukazujú, že Cd (G4) významne znižuje pevnosť škrupiny Japonských prepelíc. Tento jav môže byť spôsobený redukciou obsahu Ca v škrupine. Podobný jav bol zaznamenaný u vajec nosníc po dlhodobom príjme kadmia Kottferová (1996). Prídavok Se v skupine (G3), mal pozitívny účinok na pevnosť škrupiny v porovnaní s skupinou G4 (Cd). Se má výraznú schopnosť tvoriť komplexy s ťažkými kovmi, čo môže byť príčinou ochranného účinku Se voči Cd. Nakano a kol.,(2001) sledoval minerálne zloženie dekalcifikovanej škrupiny vajec kurčiat. Hladiny toxického Cd, Hg boli veľmi nízke. Hladiny Se v škrupine môžu kolísať signifikantne a indikujú silný vplyv kŕmenia ako aj životného prostredia. Surai, (2000a,b,c) zistil, že Se v diétach kurčiat mohol čiastočne zvýšiť kumuláciu stopových prvkov vo

117 vajciach. Ak suplementácia Se v diéte v dávke 0.4 mg/kg mohla obsahovať priemerne 30g Se, čo je okolo 50% požiadaviek na deň. Table 1. Účinok Se a Cd na parametre kvality vajec Japonských prepelíc Kontrolná skupina Experimentálne skupiny 35 deň 58 deň 35 deň 58 deň G1 G1 G2 G3 G4 G2 G3 G4 Váha vajec (g) x SD Max V (%) Pevnosť škrupiny (N) x SD Max V (%) Hrúbka škrupiny (mm ) x SD Max V (%) n = 20; G1= kontrolná skupina; experimentálna skupina G2= Se; experimentálna skupina G3=Se+Cd; experimentálna skupina G4=Cd Doplnok Se(G2) spôsobilo zvýšenie váhy a pevnosti a hrúbky škrupiny v skupine G4 and G3. Ferit Gursu a kol., (2003) pozorovali, že vitamin E and Se majú synergický účinky, a doplnok kombinácie vitamínu E (250mg) a Se (0.2)mg mali pozitívny vplyv na prepelice voči stresu. Záver V našej štúdii prídavok Se mal preventívny účinok voči Cd Kvalita vajec po dlhodobom účinku Cd bola nižšia. Získanie nových informácii o interakciách medzi Se a Cd viedlo k lepšiemu pochopeniu v chove prepelíc a znáške vajec.

118 Literatúra 1. BOBČEK, R.: Úloha selénu vo výžive hydiny, Slovenský chov, 2002, s FERIT GURSU, M., SAHIN, N., KUCUK, O.: Effects of vitamin E and selenium on thyroid status adrenocorticotropin hormone, and blood serum metabolite and mineral concentrations of Japanese quals reared under heat stress, The Journal of trace elements in experimental medicine, 16, 2003, KOTTFEROVÁ, J.: Dissertation work, MARCINKA, GAŽO, Pevnosť škrupiny vajec z klietkového chovu nosníc, II. Príspevok k stanoveniu pevnosti vaječnej škrupiny, Vedecké práce VUCHH v Ivanke pri Dunaji, 1964,2, MATEK, M., BLANUSA, M., GRGIC, J: Determination of the daily dietary selenium intake in Croatia, Eur Food Res Technol., 2000, 210, SATARUG, S., BAKER, J.R., REILLZ, P.E., ESUMI, H.,MOORE, M., Evidence for a synergistic interaction between cadmium and endotoxin toxicity and for nitric oxide and cadmium displacement of metals in the kidney, Biology and chemistry, Nitric oxide, 4, 4, 2000, SKALICKÁ, M., KORÉNEKOVÁ, B., SKALICKÝ, J.: Význam selénu pre organizmus zvierat, Infovet, 3,9, 2002, SURAI PF. Organic Selenium and the Egg: Lessons from Nature. Feeds Compounder 20, 2000a, SURAI PF.: Organic selenium: Benefits to animal and humans, a biochemist s view. In: Bitechnology in the Feed. Lyons TP and Jacques KA (eds). 2000b. Nottingham University Press, Nottingham, UK SURAI PF.: Effect of selenuium and vitamin E content of the maternal diet on the antioxidant system of the yolk and the developing chick. British Poultry Science 41, 2000c, VEGA 1/0564/03, 1/1336/04

119 PROTEÍNY AKÚTNEJ FÁZY U ZVIERAT ACUTE PHASE PROTEINS IN ANIMALS Kováč G., Vargová M., Popelková M. II.Interná klinika, Univerzita veterinárskeho lekárstva, Komenského 73, Košice Abstract The objective determination of animal health is important among other things due to the increasing focus of farmers, consumers and politicians on the welfare of animals. As non-specific markers of inflammation, Acute phase proteins testing is a tool for studing pathogenesis, the spread of infectious diseases or the efficancy of pharmaceuticals and vaccines. The measurement of acute phase proteins might also prove useful in defining the objective health status of an animal or a herd. The present definition of health as the freedom of certain specified disease agents does not guarantee healthy animals. Zdravie zvierat môže byť definované aj ako absencia chorôb stanovená klinickým vyšetrením a diagnostickými testami. Subklinicky prebiehajúce ochorenia (podieľajúce sa na narušení homeostázy) majú za následok poruchy v raste, reprodukcii, produkcii a pod. Ich diagnostika si vyžaduje detailnejšie biochemické,mikrobiologické, parazitologické, epizootologické, imunologické a patologickomorfologické vyšetrenia. Je známe po viac ako storočie, že rýchlosť sedimentácie erytrocytov sa zvyšuje v stabilizovanej krvi, ktorá pochádza od pacientov s infekčnými chorobami. Rýchla sedimentácia je odrazom zvýšenej koncentrácie viacerých plazmatických proteínov, najmä proteínu akútnej fázy zápalu (APP) fibrinogénu. Termín akútna fáza bol po prvýkrát použitý v roku 1941, na popísanie séra, v ktorom bol prítomný ďalší proteín akútnej fázy, C-reaktívny proteín. Odpoveď akútnej fázy zápalu je považovaná za dynamický homeostatický proces, v ktorom sa angažujú všetky hlavné systémy organizmu. Je charakterizovaná zápalovými znakmi ako sú horúčka, nechutenstvo a depresia, ako aj endokrinologickými, metabolickými, hematologickými a neurologickými zmenami. Zabezpečuje včasný nešpecifický obranný mechanizmus proti inzultu predtým ako je dosiahnutá špecifická imunita. SPUSTENIE A PRIEBEH AKÚTNEJ FÁZY 1. Poškodenie tkaniva: poranenia, infekcia, nekróza, neoplazma

120 2. Spracovanie alarmujúcich molekúl: proteázy, voľné radikály, lipidové deriváty, vazoaktívne amíny, produkty komplementu a koagulácie 3. Aktivácia odpovedajúcich buniek: makrofágy, fibroblasty, endotelové bunky, iné bunky 4. Syntéza a uvoľnenie prozápalových cytokínov: interleukín-1, -6, tumor nekrosis faktor-α, interferóny 5. Produkcia proteínov akútnej fázy: CRP, SAA, Hp, AGP a pod. REAKCIE PROTEÍNOV AKÚTNEJ FÁZY U RÔZNYCH DRUHOV ŽIVOČÍCHOV Ošípaná HD Pes Mačka Človek Myš Potkan Králik Albumín NEG NEG NEG NEG? NEG NEG NEG NEG Haptoglobín III III II I/II II III II III AGP 0 II II II II II III II Fibrinogén I I II? II II II II CRP II 0 III 0 III I II II SAA III II III II III III 0 0 SAP? 0?? 0 0 I-III 0 HPAF III II???? II? Normálne hladiny ako aj zmeny v koncentrácii akútnej fázy SAP (sérový amyloid P) sa výrazne líšia u rozdielnych kmeňov myší.?: Nič nebolo uvedené o reakcii proteínu označeného v literatúre. NEG: Pokles v koncentrácii (10 30 %); 0: Žiadne zmeny; I: 50 % až 100 % zvýšenie; II: Medzi 100 % a 10 násobným zvýšením; III: Viac než 10 násobné zvýšenie. BIOLOGICKÉ AKTIVITY VYBRANÝCH PROTEÍNOV AF Haptoglobín (Hp): Viaže hemoglobín, bakteriostatický efekt, stimulácia angiogenézy, úloha v lipidovom metabolizme vývoj stučnenia pečene u HD, imunomodulačný účinok inhibícia vzplanutia aktivity neutrofilov respiračného aparátu C-reaktívny proteín (CRP): Aktivácia komplementu a opsonizácia, modulácia monocytov a makrofágov, produkcia cytokínov, väzba chromatínu, prevencia migrácie neutrofilov v tkanive Sérový amyloid A (SAA): transport cholesterolu z odumierajúcich buniek do hepatocytov, inhibičný účinok na horúčku, na oxidačné vzplanutie neutrofilných granulocytov, na imunitnú odozvu in vitro, chemotaxický účinok na monocyty polymorfonukleárne leukocyty a T bunky, indukcia mobilizácie kalcia monocytmi, inhibícia aktivácie trombocytov

121 PORADIE VÝZNAMNOSTI PAF U JEDNOTLIVÝCH DRUHOV ZVIERAT HD: Haptoglobín (Hp), Sérový amyloid A (SAA), α 1 -kyslý glykoproteín (AGP), α 1 -proteináza inhibítor (α 1 -PI), Fibrinogén (Fb), Ceruloplazmín, α 2 -makroglobulín (α 2 -M), Komplement C3, LPS-viažucí proteín Kone: Sérový amyloid A, Haptoglobín, Fibrinogé (Fb) Ošípané: Haptoglobín (Hp), Hlavný proteín akútnej fázy, Sérový amyloid A (SAA), C-reaktívny proteín (CRP), Fibrinogén (Fb) Psy: C-reaktívny proteín(crp),sérový amyloid A (SAA), Haptoglobín(Hp) α 1 -kyslý glykoproteín (AGP) Fibrinogén (Fb), Ceruloplazmín Mačky: α 1 -kyslý glykoproteín (AGP), Sérový amyloid A (SAA), Haptoglobín (Hp) Myši: Sérový amyloid A (SAA), Haptoglobín (Hp), α 1 -kyslý glykoproteín (AGP), Fibrinogén (Fb), C-reaktívny proteín (CRP), Sérový amyloid P (SAP) DOTERAJŠIE POZNATKY O PRÍČINÁCH VEDÚCICH K ZVÝŠENIU KONCENTRÁCIE HAPTOGLOBÍNU Ošípané: Experimentálny lokálny aseptický zápal, i.m. aplikácia lipopolysacharidu (E. coli sérotyp O.55:B5), chirurgické zákroky, infekcia Actinobacillus pleuropneumoniae (sérotyp 1, 2 a 5),Mycoplasma hyorhinis, Toxoplasma gondii, PRRS vírusom, intranazálna inokulácia Bordetella bronchoseptica a toxigénna Pasteurella multocida typ D Hovädzí dobytok: Experimentálny lokálny aseptický zápal, infekcia BVD vírusom a Pasteurella haemolytica, experimentálna infekcia P. multocida, P. haemolytica, infekcia bovinným herpes vírusom1 a P. haemolytica A1 experimentálna infekcia bovinným respiračným syncyciálnym vírusom prirodzené infekcie SLAK vírusom, mastitída, rôzne akútne infekcie v praktických chovateľských podmienkach, klinicky zjavné choroby respiračného traktu, rôzne zápalové ochorenia, akútne zápaly, kastrácia, rumenotómia, metritída, ťažká popôrodná bakteriálna kontaminácia maternice, stukovatená pečeň (hepatická lipidóza), nekŕmenie po dobu 3 dní, hladovanie po dobu 2 dní kombinované s podaním dexametazónu, transport po dobu 2 dní, vážnejšie poranenia pri odporážaní / brakovaní. Kone: Experimentálne vyvolaná aseptická artritída, vyvolaný lokálny aseptický zápal, vyvolaná neinfekčná laminitída, inhalácia vírusu influenzy koní, kmeňa 2, trávová choroba (dysautonómia koní), kastrácia

122 DOTERAJŠIE POZNATKY O PRÍČINÁCH VEDÚCICH K ZVÝŠENIU KONCENTRÁCIE SÉROVÉHO AMYLOIDU A Ošípané: Chirurgické zákroky, infekcia Actinobacillus pleuropneumoniae sérotyp 5 Hovädzí dobytok: Dlhotrvajúce injekcie nízkych dávok lipopolysacharidov (E.coli O111:B4), zápal, subklinický zápal, mastitída, infekcia Pasteurella haemolytica sérotyp 1, experimentálna infekcia BVD vírusom a/alebo Mannheima haemolytica, experimentálna infekcia bovinným respiračným syncyciálnym vírusom, nekŕmenie po dobu 3 dní Kone: Experimentálna aseptická artritída, chirurgická trauma, lokálny aseptický zápal, setikémia a fokálne infekcie u žriebät, rôzne infekcie u žriebät, enteritída, pneumónia, hnačka a horúčka, experimentálna infekcia herpes vírusom koní sérotypom l, Infekcia vírusom influenzy koní sérotypu A2 Súhrn 1. Objektívne stanovenie zdravia zvierat je dôležité aj v dôsledku zvýšenej pozornosti konzumentov, politikov a farmárov na prosperitu zvierat (welfare). 2. Ako nešpecifické biomarkery zápalu, PAF testovanie je pomôckou na štúdium patogenézy, rozšírenia infekčných chorôb alebo účinnosti liekov a vakcín. 3. Stanovenie proteínov akútnej fázy môže byť využiteľné pri definícii objektívneho zdravotného stavu zvierat alebo stáda. 4. Súčasná definícia zdravia, ako zviera bez určitých špecifických chorobných agensov, negarantuje zdravé zvieratá. 5. Farmár bude profitovať keď subklinicky prebiehajúce zápalové infekcie budú odhalené a liečené. 6. Proteíny akútnej fázy, tak ako rektálna teplota, nedávajú informácie o etiológii chorôb a preto musia byť doplnené diagnostickými testami. 7. Ďalšie poznatky o polymorfizme PAF alebo genetických rozdieloch v schopnosti odpovede PAF na infekciu úzko súvisia s rezistenciou na choroby a mohli by byť využité v plemenárskych programoch, ktoré smerujú k produkcii zdravších a výkonnejších zvierat. Literatúra u autorov.

123 PROBIOTIKÁ: ICH FUNKCIE A VLASTNOSTI PROBIOTICS: THEIR FUNCTION AND CHARACTERS Kramárová, M., Kolesárová, A., Kováčik, J., Massányi, P., Lukáč, N. Katedra fyziológie živočíchov, Slovenská poľnohospodárska univerzita v Nitre Abstract The use of probiotics presents a new, more ecological way. The aim of this work was to provide information about influence and using probiotics preparations. Probiotics are being increasingly studied for their ability to enhance host resistance and recovery from infection. Probiotics are defined as the microbial food supplements, which beneficially affect the host by improving its intestinal microbial balance. Probiotics are the health enhancing functional food ingredients used therapeutically to prevent diarrhoea, improve lactose tolerance and modulate immunity. They may also have potential to prevent cancer and lower serum cholesterol levels Bacterial species that have traditionally been regarded as safe are used in probiotics, the main strains used include lactic acid bacteria and bifidobacteria that inhabit the intestinal tracts of human and animals. Probiotics can be used as innovative tools to alleviate intestinal inflammation, normalize gut mucosal dysfunction, and down-regulate hypersensitivity reactions. Probiotics open new therapeutic modalities in a number of diseases and it may be expected that their importance will increase with growing knowledge and experience. The use of probiotic can help fortify natural resistance. Úvod Použitie probiotík predstavuje novú, ekologickejšiu cestu k udržaniu ekonomiky výkrmu v oblasti maximálneho využitia krmiva zvieratami aj napriek zákazu uplatnenia kŕmnych antibiotík. Cieľom práce bolo poskytnúť informácie o vplyve a využití probiotických prípravkov. Označenie probiotiká, ako viacerí autori uvádzajú, pochádza z dvoch slov gréckeho pôvodu- pro a bios - pre život. Je to teda opačný význam výrazu antibiotiká- anti a bios -proti životu. Probiotiká sú prípravky, ktoré majú kladný vplyv na zdravie konzumenta (GOLIAN, 2000) a ako uviedli BOMBA et al. (1997), nie sú spojené so žiadnymi vedľajšími účinkami ani rizikami pre životné prostredie. BROWN et al. (2005) popisujú probiotiká ako určité fermentované mliečne produkty. Sú to živé mikroorganizmy, ktoré ak sú podané v adekvátnom množstve, majú prospešný vplyv na hostiteľa. Ale aby sa dostavil pozitívny účinok potrebná

124 dávka, ako zistila SCHNEIDEROVÁ (1993), je jednotiek kolónie na kus a deň. Probiotiká sú intenzívne študované kvôli ich schopnosti zvyšovať rezistenciu hostiteľa a zotavenie sa z infekcie (TURCHET et al., 2003). Probiotiká a prebiotiká Jednou z ciest zvyšovania účinnosti probiotík, ako uvádzajú GANCARČÍKOVÁ a KOŠČOVÁ (2003), je ich kombinácia s vhodným prebiotickým substrátom. Preto sa mylne považujú za synonymá, no pritom sa veľmi líšia. Prebiotiká ako nestráviteľné oligosacharidy majú priaznivý efekt na mikroflóru čreva tým, že selektívne stimulujú rast laktacidoprodukčných baktérií v čreve (BURNS a ROWLAND, 2000; ROBERFROID, 2000), čo následne vedie k zlepšeniu zdravia hostiteľa (YOUNG, 1998). Prebiotiká môžu byť využívané aj na zmenu bakteriálnej komunity a metabolizmu v hrubom čreve (HOPKINS a MACFARLANE, 2003). Cieľom prebiotík je rast jednej alebo limitujúcej skupiny mikroorganizmov, ktoré majú pozitívne účinky, čím modulujú kompozíciu prirodzeného ekosystému (KAUR et al., 2002; CASHMAN, 2003). Kombinácia probiotík a prebiotík (synbiotiká) priaznivo pôsobí na hostiteľa zlepšením prežívania a implantáciou živých mikrobiálnych dietetických doplnkov v zažívacom aparáte, selektívnou stimuláciou rastu, resp. aktiváciou metabolizmu jedného druhu alebo limitovaného počtu baktérií podporujúcich rast a zlepšujúcich welfare zvierat. Pre budúcnosť prichádza do úvahy aj kombinácia prebiotík, probiotík a organických kyselín (HUYGHEBAERT, 2003). Účinky probiotík MONTALTO et al. (2002) uvádzajú špeciálne vlastnosti, ktoré zvyšujú využívanie probiotických preparátov. A sú to: stimulácia imunitných reakcií v črevách a stabilizácia mukózovej bariéry, ochrana pred črevnými patogénmi, rezistencia voči kyslému ph prostrediu, sú schopné kolonizovať celý epitel a produkovať baktériocíny. Vďaka týmto pozitívam sa hlavne využívajú pri cestovnej horúčke sprevádzanej črevnými katarmi, pri liečbe infekcie žalúdka spôsobenej Helicobacter pylori a pri tzv. črevnej chrípke. Dokonca je pravdepodobné, že probiotiká majú preventívny a ochranný účinok aj v karcinogenéze tráviacej sústavy. Použitie probiotických mikroorganizmov je ďaleko širšie. Každý kmeň alebo kombináciu kmeňov (STEER et al., 2000) treba hodnotiť osobitne kvôli odlišným vlastnostiam. Príkladom je priľnavosť pozorovaná in vitro. Niektoré probiotiká sú priľnavé k enterocytom, iné nie. Klinický význam tejto vlastnosti nebol objasnený. DE VUYST (2000) tvrdí,

125 že priaznivé vplyvy probiotík sa týkajú len niektorých typov baktérií. V skutočnosti sa nedá predpovedať, či všetky probiotické kmene alebo dokonca konkrétne druhy budú mať rovnaké, alebo vôbec nejaké priaznivé účinky. Využitie probiotík Dôležitým ohniskom záujmu európskej komisie v rámci rámcového programu sa stal výskum funkčných potravín v súčasnosti a budúcnosti (LUCAS, 2002). Funkčné potraviny môžu byť prirodzené alebo aj priemyselne spracované a do tejto kategórie sú zaradené probiotiká, živé mikrobiálne potravové doplnky reprezentované hlavne kvasnými mliečnymi produktmi. Funkčné potraviny uplatňujú svoje účinky na rôzne systémy, hlavne tráviaci, kardiovaskulárny a imunologický (RODRIGUEZ et al., 2003). Funkčné potraviny, medzi ktoré zaraďujeme probiotické prípravky, patria dnes na celom svete i u nás k najdiskutovanejším témam v oblasti výživy. Sú dôležité a užitočné pre zdravie, preto ich európski vedci skúmajú v rámci výskumných programov sponzorovaných európskou komisiou už 10 rokov. Probiotiká sa dostávajú do popredia v dôsledku redukcie používania kŕmnych antibiotík, pretože legislatíva Európskej únie od 1. júla 1999 povolila používať iba 4 kŕmne antibiotiká: avilamycín, flavofosfopolipol, monenzinát sodný a salinomycinát (BÍROŠ, 1999). Ale už od sa zakázalo podávať kŕmne antibiotikum avilamycín a uvažuje sa o zákaze aj ostatných troch (SCHNEIDEROVÁ a NEHASILOVÁ, 2000). Okrem toho je v Slovenskej republike registrovaných 230 veterinárnych liekov s prídavkom antibiotík. Všetky sú však len na lekársky predpis (BÍROŠ, 1999). Pre hromadenie cudzorodých látok a reziduí v živočíšnych produktoch sa museli zakázať aj niektoré stimulátory rastu (ZEDNÍK, 1999). LEE a SALMINEN (1995), VAUGHAN a MOLLET (1999) dokonca predpovedali príchod veku probiotík. Použitie probiotík je najefektívnejšie u mláďat (s vyvíjajúcou sa mikroflórou) alebo po narušení stability mikroflóry (STAVRIC a KORNEGAY, 1995). Na ojedinelej práci sa podieľali EDENS et al. (1997), ktorí aplikovali Lactobacillus reuteri in ovo pred vyliahnutím hydiny. Neznížilo to liahnivosť, naopak pôsobilo to ako prevencia proti množstvu črevných patogénov. Následne bol účinok zvýšený aplikáciou toho istého prípravku do pitnej vody. Podávanie probiotík a vitamínov zvyčajne postačuje na potlačenie prípadnej slabej infekcie enterobaktériami. Slabé a infikované jedince rýchlejšie uhynú, čím sa odstráni aj zdroj nákazy (POSPIŠILOVÁ, 2003).

126 Probiotiká boli experimentálne využité aj v chove včiel. Podanie probiotika obsahujúceho baktérie potrebné k obnoveniu zloženia i funkcie normálnej mikroflóry, by znižovalo riziko vedľajších účinkov včelárskych liečiv (MÁCHOVÁ, 1996). Nemenej úspešné je aj použitie probiotík u ľudí. SANDERS (1993) skúmal probiotiká z oblasti potravinovej intolerancie a alergie: obzvlášť zahŕňa intoleranciu na proteín kravského mlieka a laktózu a schopnosť probiotík napomáhať tráveniu týchto zložiek. Probiotiká ako zdravie zlepšujúce funkčné potraviny sú využívané terapeuticky ako prevencia hnačiek, na zlepšenie laktózovej intolerancie a imunitného systému. Potencionálne sa môžu v niektorých prípadoch využiť aj ako prevencia rakoviny a na znižovanie sérového cholesterolu (ROBERFROID, 2000; ROOS a KATAN, 2000; KAUR et al., 2002). Potencionálny benefičný vplyv na zdravie majú probiotiká aj v redukcii infekcií tenkého čreva, kardiovaskulárnych ochorení, cukrovke, obezite a osteoporóze (ROBERFROID, 2000; ROOS a KATAN, 2000). Ako zistili SAAVEDRA et al. (2004), dlhodobá konzumácia živých probiotikých baktérií u ľudí bola tolerovaná a bezpečná, o čom svedčí aj nižšia frekvencia potreby antibiotík. Posledné štúdie orálnej probiotickej bioterapie dokonca predpokladajú zlepšenie atopických exzémov (ROSENFELDT et al., 2003). DANIELSEN a WINDOVÁ (2003) upozorňujú na jedno veľké nebezpečenstvo, ktoré môže vzniknúť pri systematickom konzumovaní probiotík. Zaujíma ich, či sa môžu gény rezistencie na antibiotiká, ktoré majú preniesť do patogénnych mikroorganizmov, ak sa skontaktujú v tráviacej sústave. Na základe výskumu nevyslovili jednoznačný záver a v pokuse pokračujú. Domnievajú sa však, že citlivosť na antibiotiká závisí na druhu mikroorganizmov. Záver Začiatkom roku 1999 Európska komisia vypracovala a uviedla piaty rámcový program pre výskum, technologický rozvoj a vedecký dôraz ( ), ktorý slúžil ako pomoc na vyriešenie problémov a ako reakcia na hlavné sociálno-ekonomické výzvy v súvislosti s európskou úniou. V rámci programu Kvalita života a manažment žijúcich zdrojov zaujal pozornosť vedcov aj tematický celok: Potrava, výživa a zdravie, pričom kľúčové postavenie mali otázky potreby konzumenta, konkurencie schopnosť európskeho potravového priemyslu, úloha výživy v zdraví a pohode a bezpečnosť potravových zásob. Dôležitým ohniskom záujmu európskej komisie v rámci rámcového programu sa stal výskum funkčných potravín v súčasnosti a budúcnosti. Ako je zaznamenané v materiáloch Európskej únie, funkčné potraviny môžu byť prirodzené alebo aj

127 priemyselne spracované a do tejto kategórie sú zaradené probiotiká, živé mikrobiálne potravové doplnky reprezentované hlavne kvasnými mliečnymi produktmi. Funkčné potraviny uplatňujú svoje účinky na rôzne systémy, hlavne tráviaci, kardiovaskulárny a imunologický Literatúra: 1. BÍROŠ, V Poznatky o používaní antibiotík v poľnohospodárstve v SR. In: Materiál na rokovanie porady ministra, MPSR, Sekcia poľnohospodárstva a potravinárstva, číslo:2249/99-520, 1999, s BOMBA, A. et al Probiotiká vo výžive, prevencii a liečbe chorôb mláďat HZ. In: Súčasné a perspektívne možnosti využitia biotechnológií v pôdohospodárstve. Košice: UVM, 1997, s BROWN,A.C. et al. 2005: A non-dairy probiotic s (poi) influence on chaaging the gastrointestinal tract s microflora environment. In: Altern Ther Health Med., roč.11, 2005, č.1, s BURNS, A. J., ROWLAND, I. R Anti-Carcinogenicity of Probiotics and Prebiotics. Curr. Issues Intestinal. In: Microbiol., roč.1, 2000, č.1, s CASHMAN, K Prebiotics and Calcium Bioavailability. Curr. Issues Intestinal. In: Microbiol., roč.4, 2003, č.1, s DANIELSEN, A.-WINDOVÁ, A Susceptibility of Lactobacilus sp. to antimicrobial agents. In: International Journal of Food Microbiology, roč. 82, 2003, č.1, s DE VUYST,L Technology aspects related to the application of functional starter cultures. In: Food technol.biotechnol.,roč.38, 2000, č.2, s EDENS,G.N. et al Principles of ex ovo competitive exclusion and in ovo administration of Lactobacillus reuteri. In: Poultry Sci., 1997, č. 76, s GANCARČÍKOVÁ, S., KOŠČOVÁ, J Alternatívne postupy náhrady antibiotík v prevencií a terapii chorôb mláďat. In: Slov. chov [online] Dostupné na internete: IO= GOLIAN,J Probiotiká do potravín. In: Poľnohospodár, roč.44, 2000, č.12, s HOPKINS, M. J., MACFARLANE, G. T Nondigestible Oligosaccharides Enhance Bacterial Colonization Resistance against Clostridium difficile In Vitro. Appl. Environ. Microbiol., roč. 69, 2003, č.4, s HUYGHEBAERT, Súčasné trendy vo výžive hydiny. In: Demeterová, M.- Slovenský veterinársky časopis, 2004, č. 5, s KAUR, I. P et al Probiotics: potential pharmaceutical applications.in: Eur. J. Pharm. Sci., roč. 15, 2002, č.1, s LEE, Z.-SALMINEN, S.,1995. The coming ofage probiotic. In: Trends in Food Sci. Technology, roč. 6, 1995, s

128 15. LUCAS, J European Union-funded research on probiotics, prebiotics and new foods. In: Dig Liver Dis., roč. 34, 2002, č. 2, s MÁCHOVÁ, M Uplatnění probiotik ve včelařství. In: Včelařství, roč. 8, 1996, s MONTALTO, M. et al Probiotics: history, definition, requirements and possible therapeutic applications. In: Ann. Ital. Med. Int., roč.17, 2002, č.7-9, s ISSN POSPIŠILOVÁ, D Používanie antibiotík, prevencia bakteriálnych a vírusových nákaz v chove brojlerov. In: Slovenský chov, 2003, č. 7, s ROBERFROID, M. B Prebiotics and probiotics: are they functional foods? In: American Journal of Clinical Nutrition, roč. 71, 2000, č.6, s RODRIGUEZ, M. B. et al Functional nutrition and optimal nutrition. Near or fast? In: Rev Esp Salud Publica, roč. 77, 2003, č. 3, s ROOS, N. M., KATAN, M. B Effects of probiotic bacteria on diarrhea, lipid metabolism, and carcinogenesis: a review of papers published between 1988 and In: American J Clinic. Nutr., roč. 71, 2000, č.2, s ROSENFELDT, V., at al Effect of probiotic Lactobacillus strains in children with atopic dermatitis. J Allergy Clin. In: Immunol., roč. 111, 2003, č.2, s SAAVEDRA, J. et al Long-term consumption of infant formulas containing live probiotic bacteria: tolerance and safety. In: American Journal of Clinical Nutrition, roč.79, 2004, č.2, s SCHNEIDEROVÁ,A Využití probiotik ve výživě zvířat. In: Zemědelské aktuality- príloha, 1993, č. 12, s SCHNEIDEROVÁ, P. - NEHASILOVÁ, D Zákaz avilamycínu. In: Náš chov, roč. LX, 2000, č.2, s STAVRIC, S.- KORNEGAY, E.T Microbial probiotic for pigs and poultry. In: Wallace, R.J.-Chesson, A.: Biotechnology in Animal Feeds and Animal Feeding. Weinheim: VCH Verlagsgesellschaft mbh,1995, s STEER, T. et al G Perspectives on the role of the human gut microflora and its modulation by pro- and pre- biotics. s TURCHET, P. et al. Effect of fermented milk containing the probiotic Lactobacillus casei DN on winter infections in free-living elderly subjects: a randomised, controlled pilot study. In: J Nutr. Health Aging, roč.7, 2003, č.2, s VAUGHAN, E. E.-MOLLET,B., Probiotics in the new millenium. In: Nahrung, roč. 43, 1999, č.3, s YOUNG, J European market developments in prebiotic- and probiotic-containing foodstuffs. In: Br. J. Nutr., roč.80, 1998, č.4, s ZEDNÍK, J Zákaz antibiotických stimulátorů růstu. In: Náš chov, 1999, č.2, s.46.

129 VPLYV MATERNÁLNEHO TESTOSTERÓNU NA SOCIÁLNE A EXPLORAČNÉ SPRÁVANIE MLÁĎAT LABORATÓRNEHO POTKANA INFLUENCE OF MATERNAL TESTOSTERONE ON SOCIAL AND EXPLORATION BEHAVIOUR OF LABORATORY RAT PUPS Kršková, L., Talarovičová, A. Univerzita Komenského v Bratislave, Prírodovedecká fakulta, Katedra živočíšnej fyziológie a etológie, Mlynská dolina B-2, Bratislava [email protected] Abstract The purpose of the present study was to characterize the influence of maternal testosterone (pregnant Wistar rat females administered 2.5 mg of testosteroni isobutyras on gestation day 14) on offsprings (1-23 days old pups) postnatal social and exploration behaviour. Social behaviour was studied with direct observation method, exploration with open field test. Behavioural events were compared between control and testosterone group. Increased maternal testosterone influenced: character of vocalization, decreased stay underneath mother, increased competition and crawling in the nest; stimulated especially male postnatal exploration behaviour how is ambulation, sniffing, sniffing the air, urination, but reduced vocalization. Úvod Testosterón patrí svojimi skorými organizačnými účinkami medzi dôležité faktory ovplyvňujúce vývin CNS (Kimura, 1992; Dörner a kol., 2001; Cohen-Bendahan a kol. 2004). Ovplyvňuje kognitívnuje schopnosti (Kimura, 2002; Baron-Cohen, 2002) ako aj rôzne formy a prejavy správania (vom Saal, 1979; Simpson, 2001). Sociálne správanie sa u mláďat laboratórneho potkana vyvíja paralelne s dozrievaním senzorických a motorických funkcií (Albert, 1978; Mitchel a Moorová, 1999, Hanson, 2005). Exploračné správanie patrí medzi vrodené formy správania. Podľa niektorých autorov (Lambadjeva, 1999) má však testostosterón stimulačné účinky na exploračnú motiváciu. Cieľom našej práce bolo zistiť, či má zvýšená hladina testosterónu v prenatálnom období vplyv na postnatálne sociálne a exploračné správanie mláďat laboratórneho potkana. Materiál a metódy V pokuse sme použili dva vrhy (pod matkou ponechaných 7 mláďat) tých istých troch samíc laboratórneho potkana kmeňa Wistar. Prvý vrh tvoril kontrolu (K). Druhý vrh (T) bol prenatálne ovplyvnený zvýšenou

130 hladinou testosterónu (14. deň gravidity- 2,5 mg testosteroni isobutyras). Jednotlivé vrhy boli chované v plastových klietkach (57x37x19cm), pri regulovanom svetelnom režime (L:D, 12:12), teplote 21±2 C s prístupom k vode a potrave ad libitum, na substráte z drevených hoblín. Sociálne správanie mláďat (K: n=21, T: n=21) v prostredí domácej klietky v čase od narodenia až do odstavu (23. deň) sme sledovali prostredníctvom deskriptívnej metódy priameho pozorovania. Každý deň sme v priebehu 30 min. (8:00-12:00 hod.) zaznamenávali frekvenciu výskytu a charakter akustických prejavov v počuteľnej oblasti, vzájomného preliezania v hniezde, čistenia mláďat samostatne a navzájom, súťaženia, hravého a agresívneho správania, ako aj frekvenciu aktívneho vyhľadávania kontaktu mláďat s matkou. Takisto sme zaznamenávali (%) počet mláďat pod matkou a mimo matky. Exploračné správanie sme sledovali vo veku 23 dní. V čase medzi 14:00 a 17:00 hod. sme mláďatá (K: samice n=8, samce n=12; T: samice n=9, samce n=9) podrobili 20 min. open field testu. Testovacia komora (72x34x39 cm) mala podlahu rozdelenú na 32 štvorcov. Metódou priameho pozorovania sme zaznamenávali: horizontálnu a vertikálnu motorickú aktivitu, plíženie, očuchávanie, vetrenie, čistenie, defekáciu, urináciu a hlasové prejavy. Horizontálnu aktivitu sme zaznamenávali ako počet prejdených štvorcov, vertikálnu motorickú aktivitu, defekáciu, urináciu a hlasové prejavy ako frekvenciu výskytu danej aktivity za zvolený časový interval. Pri plížení, očuchávaní, vetrení sme zaznamenávali prítomnosť sledovanej aktivity v danom časovom intervale (v danej minúte). Pri čistení sme zaznamenávali dĺžku trvania (v sec.). Na štatistické zhodnotenie rozdielov medzi K a T sme v oboch prípadoch použili neparametrický Mann-Whitneyov test. Všetky pokusy sa uskutočnili v súlade s etickými normami a boli schválené etickou komisiou. Výsledky a diskusia Medzi K a T skupinou mláďat sme zaznamenali nasledujúce štatisticky preukazné rozdiely v sociálnom správaní (Tab.1). T mláďatá vydávali signifikantne viac pípavých (P<0,01) zvukov a zvukov s charakterom cvrlikania (P<0,01), ktoré sa podľa Hanson (2005) objavujú počas agonistických stretnutí, alebo ako forma silného protestu. Podľa nás to môže súvisieť s diskomfortom v dôsledku zvýšenej aktivity mláďat v hniezde. Nižšie % mláďat pod matkou sme zaznamenali u T skupiny (P<0,01), čo podľa nás, hlavne vo fáze osamostatňovania sa mláďat, súvisí so zvýšenou aktivitou v dôsledku stimulačného účinku testosterónu (Simpson, 2001). Signifikantné rozdiely v prospech T skupiny sa nám potvrdili aj vo frekvencii súťaženia a preliezania (P<0,01). Zvýšená frekvencia preliezania môže súvisieť so snahou mláďat o väčšiu

131 samostatnosť. Čoraz viac času trávili bez matky a boli nútené samostatne si regulovať telesnú teplotu (Albert, 1978; Mitchel a Moorová, 1999). Pri výskume exploračného správania (Tab. 2) sme zistili, že T zvieratá vykazovali štatisticky preukazné vyššie hodnoty horizontálnej motorickej aktivity (P<0,05), očuchávania (P<0,01), vetrenia (P<0,05), urinácie (P<0,05) a signifikantne nižšie hodnoty frekvencie výskytu zvukových prejavov (P<0,05). Vyššie hodnoty sledovaných aktivít si vysvetľujeme na základe redukcie strachu a aktívnejšej explorácie neznámeho prostredia spojenej s teritoriálnym správaním (urinácia). Tieto zistenia sú v súlade so zisteniami Lambadjievy (1999) ktorá tvrdí, že testosterón stimuluje exploračnú motiváciu u potkanov. Štatisticky preukazné rozdiely medzi K a T samicami sa nám podarilo nájsť iba vo vetrení (P<0.05), čo si takisto vysvetľujeme nárastom exploračnej motivácie. Naše výsledky tiež môžu podporovať teóriu extrémne mužského mozgu (Baron-Cohen, 2002), podľa ktorej je práve v dôsledku maternálneho testosterónu samčí mozog viac kognitívny, čomu by nasvädčovalo intenzívnejšie explorovanie. Tab. 1: Sociálne správanie mláďat laboratórneho potkana ( deň). behaviorálny prejav K (n=21) T (n=21) pípanie 170,0 ± 13,9 275,6 ± 11,6** kvíkanie 262,0 ± 21,1 230,8 ± 6,2 zvuky s charakterom cvrlikania 63,8 ± 5,8 142,8 ± 2,1** mladé mimo matku 10,2 ± 0,2 12,9 ± 0,3 mladé pod matkou 12,8 ± 0,2 10,1 ± 0,3** preliezanie 49,2 ± 0,9 112,9 ± 4,6** interakcia mladých s matkou 40,3 ± 3,0 60,3 ± 2,8 čistenie 28,7 ± 2,7 43,2 ± 2,7 vzájomné čistenie 6,6 ± 0,6 8,0 ± 0,8 súťaženie 1,0 ± 0,2 18,0 ± 0,8** hra 59,0 ± 9,6 70,3 ± 10,4 agresivita 1,0 ± 0,6 8,7 ± 1,3 Hodnoty sú udávané ako priemer ± S.E.M. Hviezdička označuje signifikantné rozdiely medzi kontrolnou (K) a testosterónovou (T) skupinou zvierat (* P<0,05; **P<0,01).

132 Tab. 2: Exploračné správanie mláďat laboratórneho potkana (samce). behaviorálny prejav K (n=12) T (n=9) horizontálna motorická aktivita 340,8 ± 22,1 452,3 ± 35,5* vertikálna motorická aktivita 78,2 ± 6,7 77,1 ± 6,7 plíženie 2,0 ± 0,4 2,7 ± 0,8 očuchávanie 17,9 ± 0,3 19,4 ± 0,2** vetrenie 16,3 ± 0,8 19,0 ± 0,5* čistenie 160,2 ± 17,2 142,8 ± 15,8 defekácia 3,3 ± 0,8 4,9 ± 0,4 urinácia 1,3 ± 0,3 2,9 ± 0,5* zvukové prejavy 5,8 ± 2,2 1,7 ± 1,7* Hodnoty sú udávané ako priemer ± S.E.M. Hviezdička označuje signifikantné rozdiely medzi kontrolnou (K) a testosterónovou (T) skupinou zvierat (* P<0,05; **P<0,01). Záver Zvýšená hladina maternálneho testosterónu spôsobuje zmeny v sociálnom, ale aj exploračnom správaní mláďat laboratórneho potkana. Rozdiely v sledovaných indikátoroch oboch foriem správania naznačujú, že testosterónové mláďatá sú v porovnaní s kontolou aktívnejšie. Poďakovanie Práca bola podporená grantom VEGA 1/1294/04. Literatúra Alberts JR. Huddling by rat pups: group behavioral mechanisms of temperature regulation and energy conservation. J Comp Physiol Psychol Apr;92: Baron-Cohen S. The extreme male brain theory of autism. Trends Cogn Sci. 2002; 6: Cohen-Bendahan CC, Buitelaar JK, Van Goozen SH, Cohen-Kettenis PT. Prenatal exposure to testosterone and functional cerebral lateralization: a study in same-sex and opposite-sex twin girls. Psychoneuroendocrinol. 2004; 29: Dörner G, Gotz F, Rohde W, Plagemann A, Lindner R, Peters H, Ghanaati Z. Genetic and epigenetic effects on sexual brain organization mediated by sex hormones. Neuro Endocrinol Lett Dec; 22: Review. Gorski RA. Sexual differentiation of the brain. Hosp Pract Oct;13: Hanson AF. Norway rat behavior repertoire. ( )

133 Kimura D. Sex differences in the brain. Sci Am Sep; 267: Kimura D. Sex Hormones Influence Human Cognitive Pattern. Neuro Endocrinol Lett. 2002; 23: Lambadjieva ND. Influence of testosterone on some behavioural reactions of male immature rats exposed to continual light. Methods Find Exp Clin Pharmacol. 1999; 21: Mitchel GF, Mooreová CL. Psychobiologie: biologické základy vývoje chování. Portál, Praha, 1999; s. Simpson K. The Role of Testosterone in Aggression. McGill J Med. 2001; 6: vom Saal FS. Prenatal exposure to androgen influences morphology and aggressive behaviour of male and female mice. Horm Behav. 1979; 12:1-11.

134 VPLYV VÍRUSOV (BHV-1 A BVDV) NA VITALITU VČASNÝCH BOVINNÝCH EMBRYÍ IN VITRO INFLUENCE OF VIRUSES (BHV-1 AND BVDV) ON THE VITALITY OF EARLY BOVINE EMBRYOS IN VITRO Kubovičová, E., Pivko, J., Makarevič, A., Grafenau, P., Ríha, Ľ., Parkányi, V. Ústav genetiky a reprodukcie hospodárskych zvierat, VÚŽV Nitra, Slovensko Abstract Bovine embryos collected embryos from seronegative cows and heiferes were exposed in vitro to herpesvirus 1 (BHV 1) and bovine viral diarrhea virus (BVDV) for 60 minute. The results showed, that early bovine embryos can be infected with herpesvirus 1 and such infection is rapidly embryocidal. Within 24 hours of exposure embryos collapsed and became grossly degenerated. Direct immunofluorescent method by the use of polyspecific anti IBR/IPV FITC conjugate detected an adherence and penetration of virus through the zona pellucida and its accumulation mainly in the cells of trophoblast. Titration of infectivity associated with embryos immediately after exposure and 24 h later indicated a mean increase in virus titer between fold. Bovine embryos (with or without zona pellucida) exposed to BVDV showed positive signal on the fluorescent conjugate BVDV. Úvod Bovinný herpesvírus-1 (BHV-1) patrí medzi najstaršie známe vírusy, často rozšírené v prírode medzi cicavcami a býva tiež izolovaný aj od kráv s rôznou manifestáciou ochorenia, vrátane primárneho ovplyvnenia reprodukčného aparátu (Kahrs, 1977). Taxonomicky patrí tento vírus do čeľade Herpesviridae, čo je skupina obalených vírusov s deoxyribonukleovou kyselinou (DNA). Virión (kompletná vírusová častica) je sférického tvaru, má priemer nm a tvoria ho štyri štrukturálne komponenty. Vysoký výskyt seropozitívnych kráv na bovine viral diarrhea vírus (BVDV) nájdených po celom svete je dôkazom toho, že podobne ako pri BHV-1, aj infekcia týmto patogénom je medzi kravami bežná (Meyling a kol., 1998) a preto je veľká pravdepodobnosť, že materiály bovinného pôvodu použité pri in vitro produkcii embryí môžu pochádzať od kráv, ktoré boli vystavené BVDV. Čo sa týka efektu vplyvu BVDV na úspešnosť delenia a vývoj embryí, existujú v súčasnej literatúre rozporné údaje.

135 Vanroose a kol. (1998) poukázali na skutočnosť, že aj keď sa jednoznačne nepotvrdila prítomnosť vírusu, úspešnosť delenia embryí do viac ako 5 bunkového štádia a vývoj do štádií moruly a blastocysty boli nižšie pre BVDV vystavené skupiny embryí v porovnaní s neovplyvnenými skupinami. Zistili tiež, že replikácia cytopatického BVDV v morulách a blastocystách inhibovala embryonálny vývoj a nakoniec viedla k úplnej degenerácii embryí. Materiál a metódy Infekcia embryí s vírusom BHV-1 V experimentoch sme použili bovinný herpesvírus-1, kmeň Cooper o koncentrácii 10 6,16 TCDI 50 /ml. In vivo bovinné embryá, získané od séronegatívnych kráv-dárkyň, boli exponované vírusom po dobu 60 minút v atmosfére s 5% CO 2 vo vzduchu. Po perióde expozície sme embryá premyli podľa manuálu IETS (Stringfellow a Seidel, 1998) a následne kultivovali ďalších 24 hodín. Prítomnosť vírusu sme vyhodnotili metódou priameho imunofluorescenčného farbenia pod mikroskopom OLYMPUS BX 51. Niektoré embryá sme po expozícii s BHV-1 jednotlivo zmrazili v TCM-199 hneď po premytí. Vzorky boli následne rozmrazené, vortexované a titrované. Infekčnosť titrov sme determinovali hodnotením plakov zmrazených a rozmrazených embryí na kultúrach Madin Darly Bovine Kidney (MDBK) buniek. Infekcia embryí vírusom BVDV In vivo získané bovinné embryá sme rozdelili na dve skupiny: embryá s intaktnou zona pellucida a embryá, u ktorých bola zona pellucida odstránená enzymaticky (0,125% enzým pronáza). Následne sme skupiny embryí inkubovali s vírusom BVDV (kmeň VDV-OREG Ph F.TL 2; cytopatický kmeň s jasne rozpozateľným cytopatickým efektom, ktorý sa pomonožuje v primárnych kultúrach teľacích obličkových buniek a v primárnych kultúrach teľacích semenníkových buniek, kmeň Oregon bol pre prípravu vakcíny pomnožený do titra minimálne 10 5 TCID50/ml) po dobu 60 minút v atmosfére s 5% CO 2 vo vzduchu. Po uplynutí doby inkubácie sme embryá 10x premyli (podľa metodiky IETS; 5x v médiu PBS, 2x 0,25% trypsín, 5x médium PBS; Stringfellow a Seidel, 1990) a následne kultivovali po dobu 24 hodín v médiu TCM s GLUTAMAX-I s dodatkami. Po uplynutí 24h kultivácie sme embryá po infekcii cytopatickým vírusom BVDV spracovali na hodnotenie pod fluorescenčným mikroskopom. Rané embryá sme po 3-násobnom premytí v PBS-PVP 30 minút fixovali v 4% paraformaldehyde pri izbovej teplote, následne sme ich premyli 3 x 2

136 minúty v PBS-PVP Následne boli embryá 15 minút inkubované v 0,5% Tritone, premyté v PBS-PVP a 20 minút v PBS +20% séra. Nasledovala inkubácia s FITC-BVDV konjugátom po dobu 30 minút, premytie 3 x 2 minúty v PBS. Výsledky a diskusia Zistili sme, že rané embryá kráv a jalovíc môžu byť infikované in vitro herpesvírusom-1 a infekcia má výrazný embryocídny priebeh. 24 hodín po expozícii vírusom BHV-1 embryá kolabovali a výrazne degenerovali. Na základe priamej imunofluorescenčnej metódy použitím polyšpecifického antiibr/ipv FITC konjugátu sme zistili, že vírus adheruje na zona pellucida, preniká ňou a lokalizuje sa v jadrách blastomér, hlavne v bunkách trofoblastu. Titrácia infekčnosti asociovaná s embryami ihneď po expozícii a po 24 hodinách neskôr naznačila priemerný násobný nárast titru vírusu, čo je v súlade so závermi Bowena a kol. (1985). Toto zvýšenie titru bolo však nižšie ako pri infekcii in vivo, čo naznačuje nižšiu in vitro produkciu vírusových partikúl. Hodnotenie bovinných embryí infikovaných s BVDV pod fluorescenčným mikroskopom ukázalo, že bovinné embryá kultivované s vírusom s intaktnou zona pellucida vykazovali pozitívny signál na fluorescenčný konjugát BVDV. V embryách kultivovaných s vírusom bez intaktnej zona pellucida sa ukázal slabý fluorescenčný signál na úrovni pozadia. Záver Na základe našich získaných výsledkov môžeme konštatovať, že vírus BHV-1 adheruje na zona pellucida bovinných embryí, preniká ňou a lokalizuje sa hlavne v bunkách trofoblastu. Produkcia vírusových partikúl je všk v podmienkach in vitro nižšia v porovnaní s in vivo infekciou. Čo sa týka infekcie bovinných embryí vírusom BVDV, zatiaľ nemôžeme jednoznačne povedať, či preniká, resp. nepreniká do embryí cez zona pellucida. Pre konečnú odpoveď je potrebné uskutočniť ďalšiu sériu pokusov, kde budú embryá po inkubácii s vírusom rozdelené na skupinu, ktorá bude premývaná s trypsínom a skupinu bez premývania v trypsíne. Literatúra Bowen, R.A., ELSDEN, R.P., SEIDEL, G.E.: Infection of early bovine embryos with bovine herpesvirus-1. In: Am. J. Vet. Res., 46 (5), 1985, Kahrs,R.F.: Infectious bovine rhinotracheitis: A review and update. In: J. Am. Vet. Med. Assoc., 171, 1997,

137 Meyling, A.,Jensen, A.M.:Transmission of bovine viral diarrhoea virus (BVDV) by artificial insemination (AI) with ssemen from persistently infected bull. IN: Vet. Microbl., 17, 1990, Stringfellow, D.A., Seidel, S.M. (eds.): Manual of the International Embryo Transfer Society. Champaign, IL: In: IETS, 1990, Táto práca bola podporovaná Agentúrou na podporu vedy a techniky prostredníctvom finančnej podpory č. APVT

138 SPOROTVORNÉ BAKTÉRIE AKO POTENCIÁLNE RIZIKO KONTAMINÁCIE POTRAVÍN SPOREFORMING BACTERIA AS POTENTIAL RISK FOR CONTAMINATION OF FOOD Link, R., Kováč, G., Novotný, J. Univerzita veterinárskeho lekárstva, II. Interná klinika, Komenského 73, Košice Abstract Some species of genus Bacillus are known as agents of food poisoning, among them especially Bacillus cereus. It produce one emetic toxin and three different enterotoxins, one of them is haemolysin. But also other species can produce toxins, e.g. Bacillus mojavensis, fusiformis, pumilus, subtilis, megaterium. As bacteria of genus Bacillus produce endospores, they are resistant to hostile physical and chemical conditions. In addition they have a wide range of physiological adaptations and so they are able to survive process of preparation of food. Úvod Rod Bacillus zahrňuje Gram pozitívne, tyčinkovité baktérie, aeróbne alebo fakultatívne anaeróbne baktérie vytvárajúce endospóry. Endospóry Bacillus sú rezistentné voči fyzikálnym a chemickým vplyvom a majú široké fyziologické adaptačné schopnosti, ktoré im umožňujú prežiť v nepriaznivých podmienkach a preto sa vyskytujú aj v piesku púšte a horúcich prameňoch aj v Arktíde a morskom sedimente. Spóry sú vegetatívnou formou baktérií, predstavujú tvrdý obal z keratínu a sú vysoko odolné voči teplote a chemikáliám. Pri farbení spór sa využíva malachitová zeleň a teplota. Najčastejšie druhy znehodnocujúce potraviny Druhy rodu Bacillus sú dobre známe v potravinárskom priemysle ako baktérie znehodnocujúce potraviny. Mezofylné kmene Bacillus cereus rastú v rozpätí od 10 C do 50 C, s optimom okolo 28 C 35 C. Psychrofilné kmene sú schopné rastu a produkcie toxínov aj pri teplote pod 4 C. V praktických podmienkach je potrebné uchovávať uvarené jedlo pri teplotách pod 5 C alebo tesne pred podávaním v jedálňach a reštauráciách nad 60 C. V niekoľkých prípadoch sa ako príčina gastrointestinálnych problémov (vomitus a hnačka) vyskytol aj Bacillus licheniformis a Bacillus subtilis, pričom priebeh intoxikácii spôsobených spomínanými druhmi bol miernejší. Intoxikácia Bacillus licheniformis sa najčastejšie vyskytuje pri

139 pečenom mäse, hydine a zeleninových jedlách obzvlášť pri dusených a korenených, podávaných s ryžou. Bacillus cereus sa po prvýkrát spomína ako príčina gastrointestinálnych porúch v roku V súčasnosti rozoznávame dva typy porúch GIT spôsobených Bacillus cereus. Prvý typ emetická forma intoxikácie je charakterizovaný nauzeou a zvracaním, žalúdočnými kŕčmi, pričom inkubačná perióda od požitia potravy do nástupu symptómov je od 1 do 6 hodín. Vysytuje sa po požití vopred uvarenej a opätovne zohriatej ryže. Priebeh a príznaky tejto intoxikácie sa podobajú otrave spôsobenej Staphylococcus aureus. Emetická forma je spôsobená termostabilným enterotoxínom molekulovej hmotnosti do 5,000 daltonov. Druhý typ diarrhoická forma je charakteristická abdominálnymi kŕčmi a hnačkou rôzneho stupňa, od miernej až po profúznu a vodnatú. Diarhoická forma je spôsobená termolabilným enteroxínom, molekulová hmotnosť nad 50,000 daltonov, ktorý aktivuje intestinálnu adenylát cyklázu a tým spôsobuje zvýšenie sekrécie do tráviaceho traktu. Inkubačná doba pri tejto intoxikácii je od 8 do 16 hodín vyskytuje sa po požití mäsa, mliečnych výrobkov, omáčok. Svojím priebehom pripomína intoxikáciu Clostridium perfringens. Pri obidvoch typoch príznaky intoxikácie zvyčajne netrvajú dlhšie ako 24 hodín. Produkcia enterotoxínov: Bacillus cereus produkuje jeden emetický a tri iné enterotoxíny. Emetický toxín má kruhovú štruktúru z troch opakovaní štyroch aminokyselín a je chemicky podobná draselnému jonofóru valinomycínu. Dva z ďalších troch enterotoxínov spôsobujú intoxikáciu po požití kontaminovanej potravy. Obidva enterotoxíny pozostávajú z troch rozdielnych proteínov, ktoré účinkujú spoločne. Jeden z týchto enterotoxínov je hemolyzín. Tretí pozostáva z jednoduchého proteínu a nebol zatiaľ diagnostikovaný pri intoxikácii potravinami (Granum, Lund, 1997). Pri diagnostikovaní emetickej formy sa kultivuje Bacillus cereus z inkriminovanej potravy. Pri diarhoickej forme sa stanovuje prítomnosť Bacillus cereus aj z potravy a zo stolice, izolácia len zo stolice nie je dostatočne presná nakoľko približne 14 % zdravej dospelej populácie má gastrointestinálny trakt kolonizovaný aj Bacillus cereus. Diagnóza je potvrdená v prípade, ak počet baktérií Bacillus cereus v grame potravy je vyšší ako Laboratórna diagnostika Bacillus cereus sa potvrdzuje hemolýzou na krvnom agare, pohyblivosťou baktérií, hydrolýzou želatíny, fermentáciou glukózy, maltózy a salicínu, kataláza je pozitívna. From et al. (2005) zisťovali produkciu enterotoxínov a emetických toxínov u 333 druhov Bacillus, ktoré izolovali z potravín, vody a rastlín. osem kmeňov produkovalo detekovateľné množstvá toxínov, z toho šeť

140 cytotoxických, tri kmene produkovali emeticlé toxíny (odlišné od cereulidu), jeden kmeň produkoval aj cytotoxický aj emetický toxín. Kmene, ktoré produkovali toxíny boli priradené na základe biochemických a DNA analýz k druhom Bacillus subtilis, B. mojavensis, B. pumilus a B. fusiformis. Najvyššiu cytotoxickú aktivitu vykazovali kmene Bacillus mojavensis, jeden kmeň produkoval cytotoxíny pri teplote 25 C 42 C, pričom nebolo zistené žiadne zníženie aktivity ani po 24 hodinách rastu pri 42 C. Žiaden z kmeňov neprodukoval cytotoxíny podobné enterotoxínom produkovaných Bacillus cereus, čo bolo zistené pomocou imunologických alebo PCR metód. Emetické toxíny boli produkované rýchlejšie pri teplote 30 C ako pri 22 C. Rovnako aj Taylor et al. (2005) zistil produkciu termostabilného enterotoxínu od kmeňov z druhov B. megaterium, B. firmus, B. simplex. Čiastočná purifikácia týchto toxínov ukázala, že majú podobnú fyzikálnu charakteristiku ako emetický toxín od B. cereus cereulid. Záver Na druhej strane sa v súčasnosti začínajú používať kmene rodu Bacillus ako probiotiká pre ľudí a zvieratá. Barbosa et al. (2005) popísali 237 kmeňov rodu Bacillus, ktoré izolovali z tráviaceho traktu zdravých brojlerov. Pomocou morfologických, biochemických fyziologických a genových analýz časť z nich bola priradená k rodom B. subtilis, B. licheniformis, B. pumilus, B. clausii, B. megaterium, B. firmus a niektorým druhom skupiny B. cereus. Niektoré z týchto kmeňov mali dobrú antimikrobiálnu aktivitu proti širokému spektru baktérií, zahŕňajúce patogény a potraviny znehodnocujúce baktérie z rodov Bacillus, Clostridium a druhy Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes. Na základe doterajších poznatkov je zrejmé, že pri posudzovaní konkrétneho kmeňa z rodu Bacillus treba prihliadnuť predovšetkým na príslušnosť k určitej skupine v rámci rodu a zistiť eventuálnu produkciu enterotoxínov a množstvo plazmidov v cytoplazme. Druhy v rámci skupiny Baciluus cereus produkujú najviac enterotoxínov, obsahujú plazmidy a preto sú potenciálne najnebezpečnejší znehodnocovatelia potravín. Literatúra 1. Barbosa, T.M., Serra, C.R., La Ragione, R.M., Woodward, M.J., Henriques, A.O.: Screening for bacillus isolates in the broiler gastrointestinal tract. Appl. Environ.Microbiol., 2005, 71(2), From, C., Pukall, R., Schumann, P., Hormazabal, V., Granum, P.E.: Toxin-producing ability among Bacillus spp. outside the Bacillus cereus group. APPL. Environ. Microbiol., 2005, 71(3),

141 3. Granum, P.E., Lund, T.: Bacillus cereus and its food poisoning toxins. FEMS Microbiol. Lett., 1997, Dec 15, 157(2), Taylor, J.M., Sutherland, A.D., Aidoo, K.E., Logan, N.A.: Heat-stable toxin production by strains of Bacillus cereus, Bacillus firmus, Bacillus megaterium, Bacillus simplex and Bacillus licheniformis. FEMS Microbiol. Lett., 2005, 242(2),

142 VPLYV BACILLUS LICHENIFORMIS NA FYZIOLÓGIU TELIAT PRI DIARHOICKOM SYNDRÓME EFFECT OF BACILLUS LICHENIFORMIS ON PHYSIOLOGY OF CALVES WITH DIARRHOEA Link, R., Kováč, G. II. Interná klinika, Univerzita veterinárskeho lekárstva, Košice, Komenského 73 Abstract Bacillus licheniformis was added to milk replacer fed to calves with early diarrhoeic syndrome. The calves were fed culture of Bacillus licheniformis at the dose of for ten days, with daily check of health status. Blood was collected before (0) and then on day seven and fourteen. We evaluated following indices during experiment : serum levels of Na, K and parameters of immune profil (phagocytic activity of leukocytes, reduction of tetrasolium, serum levels of total immunoglobulins), blood ph, base excess-be, standard bicarbonate- SB, packed cell volume-pcv, white blood cells. In the present study Bacillus licheniformis had positive effect on the occurrence of diarhoe in treated calves. Úvod Hnačkové ochorenia novorodených mláďat predstavujú hlavný ekonomický problém v poľnohospodárstve a zapríčiňujú väčšinu úmrtí teliat. V súčasnosti sa v živočíšnej výrobe prejavuje snaha znižovať množstvo doteraz používaných látok antibiotiká, chemoterapeutiká, stimulátory rastu a namiesto nich používať probiotiká. Tento trend je vedený snahou o produkciu zdravotne neškodných potravín pre ľudský konzum, bez nežiadúcich reziduí a snahou o prevenciu vzniku rezistencie na doteraz používané látky. Účinné probiotikum by sa malo vyznačovať stabilitou a životaschopnosťou počas dlhej doby uskladnenia, schopnosťou prežívať v črevách hostiteľa a pozitívnymi účinkami na hostiteľa. (Mikula,1998) Tieto mikroorganizmy produkujú biologicky aktívne látky, ktoré ovplyvňujú životne dôležité funkcie hostiteľov, ako sú ochranná bariéra slizníc črevného traktu, morfogenéza jeho epitelu a resorbcia živín, ontogenéza imunity ( Fuller, 1992). Materiál a metodiky V experimente bola použitá lyofilizovaná kultúra Bacillus licheniformis (kmeň CCM 7/79, Československá zbierka

143 mikroorganizmov). Konečná mliečna kultúra, ktorou boli napájané teľatá, obsahovala baktérií/ml mlieka. Táto kultúra bola pridávaná do mlieka pokusných teliat tesne pred napojením, v dávke 200 ml/ks dvakrát denne po dobu 10 dní. V experimente bolo zaradených 15 teliat s ľahkým stupňom diahoického syndrómu. Krv na laboratórne vyšetrenia sme odoberali z veny jugularis na 0., 7., 14. deň. Výsledky Na druhý deň pokusu sme zistili respiračný syndróm u troch teliat (bronchopneumónia acuta). Pretože tieto zvieratá museli byť liečené antibiotikami z ďalšieho sledovania boli vyradené. Klinická manifestácia sa postupne upravovala u desiatich teliat až do úplného uzdravenia na 10. deň. U zostávajúcich dvoch teliat došlo na 4. deň k výraznému zhoršeniu diarhoického syndrómu a bolo pozorované uľahnutie, vymiznutie cicacieho reflexu a výrazná dehydratácia. Napriek intenzívnej rehydratačnej terapii obidve teľatá uhynuli v priebehu 48 hodín. Výsledky vyšetrenia krvi pred začiatkom pokusu ukázali u pokusných teliat mierny pokles hodnôt acidobázického profilu - BE, ph, SB. Na siedmy deň pokusu sa hodnoty BE a SB čiastočne upravili. Počas pokusu sme nezistili signifikantné zmeny hodnôt Na a K (Tab.1). Tabuľka 1. Hodnoty ph, BE, SB, Na, K Parameter 0. deň 7. deň 14. deň ph 7,33±0,09 7,35±0,08 7,34±0,06 BE (mmol/l) -3,3±4,71-1,0±5,29-2,8±4,87 SB (mmol/l) 21,1±3,74 23,1±4,94 21,9±4,68 Na (mmolo/l) 137,6±4,7 138,8±3,8 141,6±2,6 K (mmol/l) 5,18±0,72 5,31±0,62 5,47±0,45 Iba mierny charakter diarhoického syndrómu sa odrazil v relatívne nízkych hodnotách hematokritu. Z ukazovateľov imunitného profilu sme stúpajúcu tendenciu zaznamenali len pri hodnotách IFA (Tab. 2). Tabuľka 2. Leukocytov, INT, IFA, CIg Parameter 0. deň 7. deň 14. deň Le (G/l) 11,22±5,52 10,76±5,97 11,49±5,64 INT 1,06 ±0,16 1,00 ±0,34 0,93 ±0,16 IFA 3,77 ±1,92 3,37 ±2,10 4,29 ±3,57 CIg (UZST) 10,91±4,01 11,82±5,66 12,72±4,42

144 Diskusia Kmene Bacillus licheniformis sú značne rozšírené v prírode. Bacillus licheniformis je tiež častý v prírodných poľnohospodárskych plodinách, ktoré pravdepodobne kontaminujú čiastočky pôdy a prach naviaty vetrom. V rámci rodu je geneticky najbližšie Bacillus subtilis a Bacillus pumilis, s ktorými tvorí skupinu. Sietske de Boer (1994) píše, že kmene Bacillus licheniformis má približne len na 10% homológne DNA v rámci tejto skupiny, napríklad s Bacillus pumilis len asi 8% homológne DNA. Od ostatných druhov v rámci rodu je ľahko odlíšiteľný API diagnostickými setmi. Bacillus licheniformis sa používa ako probiotikum v rôznych prípravkoch pre hospodárske zvieratá, pričom sa vyznačuje nízkou patogenitou. V ojedinelých prípadoch patogenity niektorých kmeňov sa neskôr zistilo, že zvieratá boli oslabené silnou vyčerpanosťou alebo infekcia bola zapríčinená traumatickým prekonaním ochranných bariér organizmu. Žiadny prípad nepoukazuje na invazívne vlastnosti tejto baktérie. Literatúra 1. Fuller, R. : The effect of probiotics on the gut microbiology of farm animals. In : Wood, B.J. (ed) : The Lactic Acid Bacteria, 1992, AS 3108, Mikula, I., Sokol, A., Tkačiková, Ľ. : Kedy sú probiotiká užitočné a kedy zbytočné. Infovet, 5, 1998, Sietske de Boer, A., Priest, F., Diderichsen, B. : On the industrial use of Bacillus licheniformis: a review. Appl. Microbiol. Biotechnol., 1994, 40,

145 ZLEPŠENIE UTILIZÁCIE KRMIVA V CHOVE OŠÍPANÝCH POMOCOU PROBIOTICKÝCH PREPARÁTOV IMPROVEMENT OF FEED UTILIZATION IN PIGS BY PROBIOTIC PREPARATION Link, R., Kováč, G., Húska, M. II. Interná klinika, UVL Košice, Komenského 73, Abstract The aim of our work was to evaluate the efficacy of probiotic preparation BioPlus 2B, which contain Bacillus licheniformis and Bacillus subtilis, on value of some indices of protein and energetic profile in blood of piglets. In the experiment were used 18 weaned pigs of the age 42 days diveded into two groups, The first group was the experimental group and the second served as a control group. BioPlus 2B had not significant effect on value of parameters of protein profile but we found out significant differences in levels of cholesterol and total lipids between groups on day 14 of the experiment Úvod V poslednom čase sa okrem tradičných probiotík na báze rodov Lactobacillus a Bifidobacterium začínajú využívať aj probiotiká založené na zástupcoch rodu Bacillus. V súčasnosti poznáme 77 druhov v rode Bacillus, z ktorých sa ako probiotiká najčastejšie používajú : coagulans, subtilis, clausii, cereus, toyoi (Sanders, 2003). V poľnohospodárstve sa využíva aj Bacillus licheniformis na zlepšenie zdravotného stavu a zvyšovanie prírastkov ošípaných. Účelnosť spór ako probiotika potvrdili nedávno aj La Ragione et al. (2001), keď dokázali po orálnej aplikácii Bacillus subtilis jednodňovým kurčatám, v dávke 2,5 x 10 8, potlačiť všetky príznaky infekcie po predchádzajúcej inokulácii E. coli 078:K80. Po aplikácii 10 8 baktérií Bacillus subtilis myšiam zistil Hoa (2001), že Bacillus subtilis nediseminuje cez membrány gastrointestinálneho aparátu, a tým je bezpečný. Na druhej strane vyšší počet vylúčených baktérií Bacillus subtilis ako podané inokulum poukazuje na germináciu a pomnoženie probiotických spór. V našom experimente sme sledovali vplyv prípravku BioPlus 2B na vybrané metabolické ukazovatele. Materiál a metodika Do experimentu bolo zaradených 18 odstavčiat vo veku 42 dní, krížencov Landrace x Biela ušľachtilá. Experiment trval osem týždňov do veku troch mesiacov. Pokusná skupina (n=9) dostávala prípravok BioPlus

146 2B (Christian Hansen s bio systems, Hørsholm, Denmark) zamiešaný v pomere 1:1000 v kŕmnej dávke, takže počet spór Bacillus licheniformis a Bacillus subtilis bol 10 9 /kg krmiva. Kontrolná skupina (n=9) nedostávala prípravok BioPlus 2B v kŕmnej dávke. Odstavčatá boli kŕmené štartérovou kŕmnou zmesou OŠ-02 (Tajba a.s., Čaňa) do 56. dňa veku a následne kompletnou kŕmnou zmesou pre predvýkrm A1 (Tajba a.s., Čaňa) do konca experimentu. Krv na vybrané parametre proteínového a energetického profilu sme odoberali v dvojtýždňových intervaloch. Krv sme odoberali z očného splavu (Kováč a kol., 1990). Proteínový a energetický profil v krvnom sére sme stanovovali na multiparametrickom spektrofotometrickom analyzátore Alizé, firma Lisabio. Testy na stanovovanie sme používali od firmy Bio Merieux. Štatistické údaje sa spracovali Studentovým T- testom. Výsledky Celkové bielkoviny sa postupne zvyšovali počas experimentu v obidvoch skupinách. Močovina v krvnom sére sa postupne zvyšovala pri jednotlivých odberoch, ale bola v rámci normy pre ošípané. Medzi skupinami sme pri jednotlivých odberoch nezaznamenali signifikantné rozdiely (Tab.1.). V hladine cholesterolu sme zistili v 2. odbere signifikantný rozdiel medzi skupinami. V nasledujúcom odbere signifikantný rozdiel vymizol. Počas experimentu boli hladiny cholesterolu v oboch skupinách v rámci referenčnej normy. Pri celkových lipidoch sme tiež zaznamenali signifikantný rozdiel v 2. odbere (Tab. 2.). Diskusia Ahrens et al. (1992) zistili v pokuse na odstavčatách po podávaní BioPlus 2B, v dávke 1,2 x 10 6 /g krmiva, o 10% vyššie hmotnostné prírastky a konverziu krmiva v prvých troch týždňoch pokusu, v nasledujúcich dvoch týždňoch zaznamenal dokonca signifikantne vyššie prírastky v pokusnej skupine (679 g/deň) oproti kontrolnej skupine (570 g/deň). Bacillus licheniformis a Bacillus subtilis produkujú proteázy, amylázu, katalázy. Až polovica všetkých priemyselne vyrobených proteáz, amyláz pochádza od baktérií rodu Bacillus. Tieto enzýmy napomáhajú tráveniu krmiva čo je dôležité hlavne pri prechode krmiva u mláďat hospodárskych zvierat. Je naviac dokázané, že proteázy produkované rodom Bacillus stimulujú rast laktobacilov (Hosoi, 2000). V našej práci sa potvrdilo potencionálne znižovanie cholesterolu po aplikácii probiotík. Pri znižovaní hladiny cholesterolu v krvi sa

147 predpokladajú tri mechanizmy účinku probiotík. Jednou z ciest je konverzia cholesterolu v tráviacom trakte na koprostanol, ktorý sa potom neabsorbuje. Zatiaľ je známy len Eubacterium spp., ktoré majú spomínaný účinok, ale predpokladá sa, že viac druhov mikroorganizmov je schopných previesť túto konverziu. U germ-free myší je hladina cholesterolu vyššia ako u konvenčných (Cardoba, 2002). Druhou cestou znižovania cholesterolu je dekonjugácia žlčových kyselín, ktoré vznikajú z cholesterolu, ich sťažená reabsorbcia a tým vynútená ich ďalšia syntéza v pečeni. Dekonjugácia žlčových kyselín v čreve sa uskutočňuje len cez bakteriálne enzýmy. Dekonjugáciu žlčových kyselín dokážu baktérie Lactobacillus a Bifidobacterium (Cardoba, 2002), pričom Gedek (1992) zistila zvyšovanie počtu laktobacilov po aplikácii BioPlus 2B. Tretím mechanizmom na znižovanie cholesterolu je priame zabudovanie cholesterolu do stien Lactobacillus. Literatúra 1. Ahrens F, Schmitz M, Warlies B, 1992, Mikrobieller Zusatzstoff in der Ferkelfűtterung. Kraftfutter, 75, Cardona, ME, 2002, PhD Thesis, Karolinska University Press, Stockholm, Sweden, pp Gedek B, 1992, Mikroorganismen als Leistungsfőrderer beim Ferkeln. Kraftfutter, 75, Hoa TT, Duc LH, Isticato R, Baccigalupi L, Ricca E, Van PH, Cutting SM, 2001, Fate and dissemination of Bacillus subtilis spores in a murine model. Appl. Environ. Microbiology, 67, Hosoi T, Ametani A, Kiuchi K, Kaminogawa S, 2000, Improved Growth and viability of lactobacilli in the presence of Bacillus subtilis (natto), catalase, or subtilisin. Can. J. Microbiol., 45, Kováč G, Martinček M, Mudroň P, Cilík D, Demovič T, Paštek J, Stanislavský V, Ružička S, 1990, Collection of blood samples from pigs. Comparison all used methods and description of recent method. Veterinářství, 40, La Ragione RM, Casua G, Cutting SM, Woodward MJ, 2001, Bacillus subtilis spores competitively exclude E. coli 078:K80 in poultry. Veterinery Microbiology, 79, Sanders ME, Morelli L, Tompkins TA, 2003, Sporeformers as human probitics: Bacillus, Sporolactobacillus, and Brevibacillus. Comprehensive reviews in food science and food safety, 2,

148 VI. Celoslovenský seminárz fyziológi Tab.1. Hodnoty v krvnom sére 0. odber 1. odb CB Pokus (g/l) 55,8±2,8 8 55,8± 4 CB Kontr. (g/l) 58,6±3,3 3 58,1± 8 Urea - Pokus 3,7±0,54 4,7±0 (mmol/l) Urea - Kontr. 4,1±0,63 5,0±0 (mmol/l) CB celkové bielkoviny Tab. 2. Hod 0. odber Chol P (mmol/l) 2,37±0,2 3 Chol - K (mmol/l) 2,35±0,4 1 TL Pokus (g/l) 2,83±0,8 1 TL Kontrola (g/l) 2,84±0,6 6 Chol cholesterol, TL to

149 VZŤAH MEDZI SÉROVÝMI HLADINAMI ANTIOXIDAČNÝCH VITAMÍNOV A IMUNOGLOBULÍNOV NEONATÁLNYCH TELIAT RELATIONSHIP BETWEEN ANTIOXIDANTS VITAMINS AND IMMUNOGLOBULINS IN THE NEONATAL CALVES BLOOD Lukáč, N 1., Bárdos, L 2., Massányi, P 1., Brezina, B 1., Kramárová, M 1. 1 Slovak Agriculture University, Tr. A. Hlinku 2, Nitra, Slovak Republic, [email protected] 2 Szent Istvan University, 2103 Gödöllő, Hungary, [email protected]. Abstrakt Stanovila sa hladina antioxidačných vitamínov (retinol - ROL, retinyl palmitátu - RP, β-karoténu - BC, α-tokoferolu - AT) ako aj imunoglobulínov (IgG1, IgG2, IgM, IgA) u neonatálnych teliat (n = 15) holštajnskofrízskeho plemena. Z teliat prvá skupina (A, n = 5) ihneď po narodení pred príjmom kolostra bola odobratá krv, ostatné teľatá rozdelené do dvoch skupín (B, n=5; C, n=5) boli napojené do 1 hodiny života 1 litrom kolostra a následne po 4 a 10 hodinách života odobratá krv. Medzi koncentráciou redinoidov a E-vitamínov v krvi teliat sme nezistil signifikantný rozdiel. Bol zistený preukazný rozdiel (P 0,001) v sérovej koncentrácii BC a retinoidmi v jednotlivých časových intervaloch. Zistili sme vysokú signifikanciu medzi hladinami RP pred podaním kolostra a imunoglobulínmy všetkých tried v tom istom období (P 0,001). Zistili sme koreláciu medzi hladinami Rol a IgG1 (r=0,91), RP a IgG2 (r=0,92) ako aj medzi RP a IgA (r=0,77). Klúčové slová: teľatá, vitamíny, imunoglobulíny Abstract Determinate of antioxidants vitamins (retinol - ROL, retinyl palmitát - RP, β-carotene - BC, α-tocopherol - AT) level and immunoglobulins (IgG1, IgG2, IgM, IgA) in calves (n = 15) Holstein-Friesan breed. Calves from first group (A=5) after born ago suckling of colostrum been was taken blood, other calf separation by by two group (B, n=5; C, n=5) by after colostrum suckling by 1 hour of live with one litre colostrum and followinge after 4 and 10 hour of living was taken blood. Between concentracion of retinoid and vitamin - E in claves blood and cows blood no significant difference. The plasma BC levels and retinoids of differed significantly (p=0.001) from each other. Determinate high demonstrativeness between RP before colostrums suckling and immunoglobulins in the all classes it the same time (p=0.001). Detected

150 high correlation between of Rol and IgG1 level (r=0,91), RP and IgG2 level (r=0,92) and also RP and IgA level ((r=0,77). Key words: calves, vitamins, immunoglobulins, Úvod Na vývoj maternálnej imunity teliat majú vplyv nielen faktory spomenuté na úvode ale aj stav plodových zárodočných listov (obalov) ako aj celkový intrauterinný vývoj teľaťa. Hlavne vývoj špecifickej a nešpecifickej imunity teliat. Retinoidy zohrávajú významnú úlohu pri diferenciácii obalov (zárodočných listov) a regulujú látkový metabolizmus. Jednotlivé karotenoidy (hlavne β-karotény) nielen ako pro-retinoid, ale ako reštrikčný faktor pre mikrofágy a makrofágy,(gergely a Erdei, 1998) pričom ho možno označiť ako faktor ovplyvňujúci diferenciáciu lymfocytov.(sklan, et al., 1989) Je známa vlastnosť tokoferolov a β- karoténu v rôznych peroxidatívnych procesoch.(bárdos, 2000) Tieto látky sa môžu dostať do plodu už počas intrauterinného obdobia a v tomto období zasahovať do metabolizmu. Po narodení môže nastať v neonatálnom organizme vplyvom drastických vonkajších faktorov zvýšený nárok na príjem vitamínových antioxidantov. Je známe, že vývoj obranyschopnosti teliat je v prvých dňoch života závislý od kolostra čiže maternálnej imunity. Schopnosť absorpcie intaktných kolostrálnych imunoglobulínov (IgG, IgA, IgM) je zabezpečený len v prvých dňoch života. Prudký pokles imunoglobulínov je zreteľný po pôrode v kolostre ako aj tenké črevo teliat po narodení stráca schopnosť absorbovať globulárne makromolekuly (Blum, et al., 1997). Reddy et al., (1986) zistili vo svojej štúdii, že nie sú významné zmeny v koncentráciách imunoglobulínov IgG1 a IgG2 počas orálneho podávania vitamínového doplnku E vitamínu. Zaznamenali významne vyššie koncentrácie imunoglobulínu IgM v 6. týždni veku teliat po podaní vitamínového doplnku E vitamínu v porovnaní s ostatnými teľatami (bez podania vitamínového doplnku). Aj predkladané výsledky sledujú spomínané parametre v krvnom sére ako β-karoténu, retinoidov, E-vitamínu, ďalej sme sledovali jednodňových teľatách. Zistené hodnoty sme sme navzájom štatisticky vyhodnotili. Materiál a metodika Vlastné stanovenia V predkladanej práci boli zistené sérové hladiny retinoidov (retinol - ROL; retinil-palmitátu - RP), β-karoténu (BC), a E-vitamín (α-tokoferol -

151 AT). Z tých istých vzoriek sa stanovila hladina imunoglobulínov (IgG1, IgG2, IgM, IgA ). Zvieratá a odber biologického materiálu Po spontánnom pôrode sme odobrali krv od teliat pred podaním kolostra (A skupina; n=5) Ostatné teľatá boli napojené 1 litrom kolostra a po 4. (B skupina; n=5) a 10. hod.(c skupina; n=5) im bola odobratá krv. Z krvi sme odstredením získali krvné sérum, ktoré sa použilo pre ďalšie analýzy. Analytické metodiky Retinoidy (ROL, RP), β-karotény v krvnom sére sme merali pomocou HPLC (Kerti a Bárdos, 1999). Obdobné HPLC techniky boli využité pri stanovení tokoferolov. (Biesalski, et al., 1986). Stanovenie imunoglobulínov sa robilo metódou jednoduchej radiálnej imunodifúzie (Inglid et al., 1983) (VMRD Pulman, WA.). Štatistické metódy Zo získaných údajov sme stanovili základné štatistické údaje, závislosti medzi skupinami sme otestovali Fisherovým F-testom pri uvádzaní významnosti od P 0,05, na sledovanie vzájomných vzťahov sme využili korelácie. Výsledky Hodnoty hladín jednotlivých sledovaných vitamínov v krvi teliat sa nachádzajú v tabuľke 1. Hladiny jednotlivých tried a podtried imunoglobulínov v krvnom sére neonatálnych teliat znázorňuje tabuľka 2. Hodnoty vitamínov v krvi teliat (x ± s) Vitamin levels in the blood of calves (x ± s) Tabuľka 1 ROL (µg.l -1 ) RP (µg.l -1 ) BC (µg.l -1 ) AT (mg.l -1 ) A 263,53±159,8 3644± ,16±25,6 2,1±0,8 B 430,25±223, ± ,48±39,9 1,4±0,4 C 308,29±65, ± ,46±32,6 2,0±0,5 Hodnoty imunoglobulínov (mg.100.ml -1 ) v krvi neonatálnychteliat (x ± s) Immunoglobulins levels (mg.100.ml -1 ) in the blood of neonatal calves (x ± s). Tabuľka 2 IgG1 IgG2 IgM IgA A 97,6±96,1 99,26±92,81 177,6±154 0±0 B 552± ,4± ±203 57,8±33,84 C 1160± ± ±81,7 89±23,83

152 Sérová hladina ROL mala klesajúci trend v čase od 0 hod. do 10 hod. pričom obdobný trend sme zaznamenali aj v hladine retinyl palmitátu v tých istých časových intervaloch. Z retinoidov len pri hladinách ROL sa zistil vzrast no BC a AT obsah bol zistený na minimálnej hranici dokázateľnosti. Zistili sme vysokú signifikanciu medzi hladinami RP pred podaním kolostra a imunoglobulínmy všetkých tried v tom istom období (P 0,001). Po stanovení korelačných závislosti sme zistili vysokú pozitívnu koreláciu (0,667 až 0,999) v krvi teliat: medzi hladinami BC/B a IgG1/A (r=0,76) medzi hladinami AT/C a IgG1/B (r=0,73) medzi hladinami Rol/C a IgG1/C (r=0,91) medzi hladinami RP/C a IgG2/B (r=0,92) medzi hladinami RP/B a IgM/B (r=0,87) medzi hladinami RP/A a IgM/B (r=0,71) medzi hladinami AT/A a IgM/B (r=0,77) medzi hladinami RP/C a IgA/B (r=0,71) medzi hladinami RP/A a IgA/C (r=0,77) medzi hladinami AT/A a IgA/C (r=0,79) Taktiež sme zistili signifikantné korelácie medzi hladinami vitamínov ako aj imunoglobulínov v jednotlivých časových obdobiach. Diskusia Priemerný obsah BC v kravskom mlieku je 370 µg.l -1 ( v rozmedzí µg.l -1 ), A - vitamínu 270 µg.l -1 ( v rozmedzí µg.l -1 ) a obsah AT 0,6 µg.l -1 ( v rozmedzí 0,2-1,19 µg.l -1 ) (Lentner, 1981). Oproti tomu v kolostre je obsah vitamínov rozpustných v tukoch väčší. Pri skrmovaní čerstvého zeleného krmiva alebo dodaním minimálne 500 mg BC na jednu dojnicu sa v kolostre a neskôr v mlieku hladina BC pohybuje od 250 µg.l -1 (Kolb, 1997). Hladina A-vitamínu v prvom kolostre môže byť až 4,3 µg.l -1 (19). Dnes je už známy transport vysokomolekulárnych imunoglobulínov pri zvieratách s epitelchoriálnym typom placenty. Z našich výsledkov je viditeľný nárast hladín TP a albumínov v krvi teliat prvých 4 hodinách života čo je zhodné s výsledkami prace autorov Bárdos, L., et al. (1989). Z týchto istých výsledkov je známy nárast karotenoidov, ale hladina retinoidov v krvi teliat bola o polovicu nižšia ako v krvi kráv. Skôr bolo dokázané, že mierny stav acidózy kráv v peripartálnom období naovplyvňuje hladiny vyššie uvedených vitamínov. Vysoká hladina esterifikovateľných retinoidov (napr: RP) v krvi, ktoré sú transportované špecifickými lipoproteínmi (LDL) môžu mať za následok vznik subklinickej formy hypervitaminózy (Smith a Goodman, 1976). V krvi

153 hovädzieho dobytka sa BC vyskytuje v každej lipoproteínovej frakcii (Chew, et al., 1993). Pri skrmovaní krmiva bez obsahu karoténov teľatami bol obsah A- vitamínov v pečeni týchto zvierat NE.100 kg -1. Ani v takomto prípade sérová hladina retinoidov neodzrkadľuje množstvo v pečeni (Flachowsky, et al., 1990), čo sa dokázalo u jednotlivých druhov zvierat (kôň, ošípaná, pes, sliepka) (Bárdos, 1991). Sekrécia BC a AT z krvi do mlieka je vykonávaná aktívnym transportom pomocou Michelisovou-Mentenovou kinetikou. pričom hodnota Vmax - 32,4 mg pre AT a 2,5 mg pre BC. Čiže je to prestup, ktorý nie je ovplyvňovaný dennou produkciou mlieka ani obsahu tuku v mlieku (Jensen, et al., 1999). Z našich pozorovaní je zrejmá zvýšená resorbcia kolostrálneho RP, kedže sa zvyšovala hladina všetkých A vitamínov (tabuľka 3). Určitý antagonizmus sa spozoroval medzi retinoidmi a hladinou tokoferolov v krvi, keďže teľatám bolo skrmované mlieko s obsahom NE A vitamínov pričom sa plazmatická hladina ROL nezvyšovala, ale znižovala hladina AT (Franklin, 1998). Z našich výsledkov mapujúcich stav uvádzaných vitamínov sa stotožňuje s predchádzajúcim tvrdením. V 4. hodinách života teliat bola sérová hladina ROL najvyššia a v tomto období hladina AT bola najnižšia ( tabuľka 1, B skupina). tento stav môžeme vysvetliť tým, že transport AT je menej špecifický ako transport ROL prostredníctvo TTR-RBP - transportných proteínov. V krvi kráv (Frieseke, 1978) namerali kritické hladiny BC pod 1 mg.l -1 čo charakterizuje stav hypovitaminózy. Takže aj kolostrum nedosahovalo požadované kvantitatívne zloženie provitamínu BC, čo malo za následok zníženie hladiny v krvi novonarodených teliat. Po narodení dochádza k miernemu zvyšovaniu hladiny BC v krvi pozorovaných teliat. Keďže sa hladiny BC v krvi teliat čiastočne stotožňujú s množstvom BC v pečeni môžeme usúdiť, že transport BC na úrovni maternice prebieha v minimálnom množstve. Hodnotenie našich vzoriek in vitro podmienkach jednoznačne poukazujú na tú skutočnosť, že prebiehajúce procesy premeny retinoidov prebiehajú antioxidačnými procesmi (Keys a Zimmerman, 1999). Hodnoty hladín imunoglobulínov v sére teliat predkolostrového a postkolostrového obdobia korešpondujú s výsledkami autorov Banksa a McGuira, (1989), pred napojením mledzivom menej ako 100 mg. 100 ml - 1 v triedach IgG1, IgG2 ako aj nulová hladina IgA. Ako aj Tizarda (1995), ktorý udáva možnosť tvorby imunoglobulínov už počas intrauterinného vývoja teľaťa.

154 Literatúra 1. Banks, K. L. McGuire, T. C.: Neonatal immunology. In: Halliwell, R. E. W. Gorman, N. T.: Veterinary Clinical Immunology. London, 1989, s Bárdos L.: Level of vitamin a in horse, bulls, pig, dog, rabbit and poultry liver. Hungarian Veterinary J.,1991, 46, Bárdos, L.: A vitaminok anyagcseréje. In: Husvéth F.: A gazdasági állatok élettana az anatómia alapjaival. Mezőgazda Kiadó. Budapest, 2000, Biesalski, H., - Greiff, H. et al.: Rapid determination of vitamin (retinol) and vitamin E (alpha-tocopherol) in human serum by isocratic adsorption HPLC. Internat. J. Vit. Nutr. Res Blum, J. - Hadorn, U. et al.: Delaying colostrum intake by one day impairs plasma lipid, essential fatty acid, carotene, retinol and alphatocopherol status in neonatal calves. J. Nutr., Chew, B. P. - Wong, T. S. - Michal, J. J.: Uptake of orally administered beta-carotene by blood plasma, leukocytes, and lipoprotein in calves. J. Anim. Sci., Fisher, A.: A szérumfehérjek vizsgálata In.: Sós J.: Laboratórium diagnostika Medicína. Budapest, 1974, Flachowsky, G. - Wilk, H, et al.:the vitamin A requirement and the vitamin A status of growing cattle. 1. Studies of calves. Arch Tierernahr., Franklin, S. T. - Sorenson, C. E. - Hammell, D. C.: Influence of vitamin A supplementation in milk on growth, health, concentrations of vitamins in plasma, and immune parameters of calves. J. Dairy Sci., Frieseke, H.: The significance of beta-carotene in ruminant nutrition: field results - Europe. In: Lotthammer - Cooke - Frieseke: Importance of beta-carotene for bovine fertility Animal Nutrition Events. Roche Symposium, London, Gergely, J. - Erdei, A.: Immunobiológia. Medicina. Budapest, Ingilid, G.: Single radial immunodiffusion. Scand. J. Immuunol., 1983, 17, 10, s Jensen, S. K. - Johannsen, A. K. - Hermansen, J. E.: Quantitative secretion and maximal secretion capacity of retinol, beta-carotene and alpha-tocopherol into cows milk. J. Dairy res., Kaneko, K.: Clinical biochemistry of domestic animals. Academic Press. new York, Kerti, A. - Bárdos, L.: Storage of retinoids and betacarotene in genital organs of Japanese quail. Acta Vet. Hung.,

155 16. Keys, S. a. - Zimmerman, W. F.: Antioxidant activity of retinol, glutathione, and taurine in bovine photoreceptor cell membranes. Exp. Eye Res., Kolb, E.: Die Bedeutung der Vitamine fur die Fortplanzung. Hoffmann-La Roche. Grenzach-Wyhlen, Sklan, D. - Yosefov, T. - Friedman, A: The effect of vitamin A, β- carotene and cantaxantin on vitamin A metabolism and immune response in the chick. Internat. J. Vitam. Nutr. Res., Smith, F. r: - Goodman, D. S.: Vitamin A transport in human vitamin A toxicity N. Engl. J. Med., Tizard, I. R.: Immunology. San Diego, New York, London, Tokyo, Saunders Coll. Publ., 1995, 544 s. 21. Reddz, P. G. Morril, J. L. Minocha, H. C.,.: Effect of supplemental vitamin E on the immune system of calves. In: J. Dairy Science, roč. 69, 1986, č. 1, s

156 ÚČINOK KOBALTU NA ŠTRUKTÚRU A FUNKCIU SEMENNÍKA U CHRČKA THE EFFECT OF COBALT ON HAMSTER TESTICULAR STRUCTURE AND FUCTION Lukáč, N., Massányi, P., Kramárová, M., Toman, R., Kolesárová, A. Katedra fyziológie živočíchov, FBP, SPU v Nitre Abstract In this study the effect of cobalt on the structure and function of hamster testis was studied. The highest relative volume of germinal epithelium was detected in control group (72.48 ± 2.91%). In experimental groups (administration of 5, 10 and 20 mg of CoCl 2 per kg body weight) decrease of germinal epithelium was detected with significant difference in group B and C in comparison with control. Relative volume of interstitium and lumen was significantly higher in groups after cobalt administration. In the evaluation of the diameter of seminiferous tubules significant increase of this parameter in experimental groups was found. The lumen of the tubule was significantly increased in group B, but in all lead exposed testes the tendency of increased luminization was detected. In all experimental groups also the number of nuclei was decreased. All data suggest that cobalt doses administered in this study have negative effect on germinal epithelium main function and structural part of testis. Úvod Medzi najvýznamnejšie biologické procesy živočíchov patrí plodnosť a reprodukcia, lebo zabezpečuje kontinuitu živej hmoty. Preto sa im už oddávna venovala veľká pozornosť v oblasti praktickej, ako aj teoretickej. Najmä výskumy riadenia pohlavných procesov v posledných desaťročiach odhalili množstvo predtým neznámych procesov, mechanizmov a ich vzájomných interakcií. Kobalt patrí k dôležitej skupine biologicky aktívnych látok vitamínov. Sú to vzťahy priame, ako napr. úloha kobaltu ako štrukturálnej zložky vitamínu B 12, alebo nepriame, kde kobalt vystupuje spolu s inými organickými zlúčeninami ako prekurzor vitamínu B 12, prípadne má takýto kobaltnatý komplex zníženú aktivitu podobnú aktivite B 12. Prostredníctvom tohto vitamínu zasahuje kobalt do rôznych životne dôležitých procesov. Kobalt aktivuje črevnú a kostnú fosfatázu. Aminokyseliny brzdia jeho aktivačnú úlohu. Predpokladá sa, že stabilita väzieb kobaltu s aminokyselinami je vyššia ako je afinita k fosfatázam. Kobalt patrí medzi aj medzi inhibítory

157 enzymatickej aktivity niektorých enzýmov. Inaktivuje ureázu a inhibuje účinok pepsínu. Význam kobaltu vo fyziológii zvierat a človeka nemožno však redukovať len na úlohy kobalamínov. Samotný kobalt sa zúčastňuje biochemických premien aj v iných účinných formách. Kobalt sa zúčastňuje aj na premene glycidov. Hoci kobalt patrí do skupiny minerálnych krvotvorných faktorov, jeho účinok na zmenu krvného obrazu, najmä pri liečení anémií, závisí od prítomnosti ďalších mikroelementov, a to najmä železa a medi. Pri štúdiu mechanizmu účinku kobaltu na tvorbu krvi a spoluúčasti ostatných mikroelementov, najmä medi a železa, sa zistilo, že kobalt sa zúčastňuje na stimulácii resorpcie železa v tom prípade, ak došlo k jej poruche. Za normálnych podmienok sa tento účinok kobaltu nezistil. Biologické funkcie kobaltu v živočíšnom organizme možno zhrnúť do dvoch skupín, a to na funkcie v krvotvorných procesoch a na funkcie v látkovej premene a v procesoch rastu. Pre poznávanie základných biochemických funkcií mikroelementov sú v porovnaní s predchádzajúcimi viacbunkovými organizmami jednobunkové mikroorganizmy pomerne najvýhodnejšie. Kobalt patrí medzi mikroelementy, ktoré stimulujú rast niektorých mikroorganizmov a súčasne inhibujú rast iných mikroorganizmov. Je súčasne jedným z mikroelementov, ktoré zasahujú do premeny látok v bunkách mikroorganizmov. Materiál a metodika V pokusoch sme použili pohlavne dospelých samcov (n=21) chrčka sýrskeho, vo veku minimálne 6 mesiacov. Chrčky sa chovali v štandardných podmienkach výskumného laboratória na pôde SPU v Nitre. Zvieratá prijímali krmivo a vodu ad libitum. Krmivo tvorila kompletná kŕmna zmes pre králikov (KKD 0/10), zrno kukurice, seno, jadrové krmivo (pšenica a jačmeň), ovocie, zelenina a čerstvá zelená tráva. Zvieratá sa rozdelili do štyroch skupín. Skupine A (n=5) sme aplikovali intraperitoneálne (i.p.) kobalt (20 mg.kg -1 živej hmotnosti) vo forme chloridu kobaltnatého (CoCl 2 ), skupine B (n=5) sme i.p. aplikovali 10 mg CoCl 2.kg -1 živej hmotnosti, a v skupine C sme 5 chrčkom aplikovali i.p. kobaltu v koncentrácii 5 mg CoCl 2.kg -1 živej hmotnosti a posledná skupina K (n=6) nám slúžila jako kontrola bez podania kobaltu. Kobalt sme riedili do požadovanej koncentrácie fyziologickým roztokom. Po 48 hodinách sme chrčkov usmrtili, urobili anatomickú pitvu a odobrali sme vzorky semenníkov na histologické a morfometrické analýzy. Hneď po zabití sme makroskopicky zhodnotili stav vnútorných orgánov. Vzorky na histologické analýzy sme odoberali od každého zvieraťa so semenníkov o veľkosti asi 1 cm 3. Potom sa vzorky fixovali v 10% formalíne, odvodnili vo vzostupnom rade alkoholu a zaliali do parafínu. Sériové rezy o hrúbke

158 približne 10 µm sme ukladali na odmastené a označené podložné sklíčka Po narezaní sa rezy farbili prehľadným farbením hematoxylín eozínom podľa platných metodík (Vacek, 1972). Po zafarbení sa vzorky zamontovali do solarkrytu a výsledkom sú trvalé histologické preparáty vhodné na hodnotenie svetelným mikroskopom. Na histologických preparátoch sme subjektívne zhodnotili mikroskopickú stavbu semenníka, semenotvorných kanálikov, intersticiálneho tkaniva, Leydigových buniek, výskyt krvných kapilár v interstíciu, množstvo epitelu kanálikov a priebeh spermatogenézy. Na základe morfometrických kritérií (Weibel et al., 1966; Toman a Massányi, 1997) sme v semenníku sledovali a kvantifikovali nasledujúce parametre: relatívny objem (%) semenotvorného epitelu, interstícia a lomenu; priemer (µm) semenotvorného kanáliku; výšku (µm) semenotvorného epitelu; priemer (µm) lúmenu semenotvorného kanálka; počet jadier na konštantnú plochu (10000 µm 2 ). Dosiahnuté výsledky sme štatisticky zhodnotili použitím PC programu Excel. Zo zistených hodnôt sme vypočítali priemer, smerodajnú odchýlku, variačný koeficient, median, minimálne a maximálne hodnoty podľa jednotlivých kategórií (skupín). Ďalej sme vypočítali rozdiely medzi skupinami F testom. Preukaznosť rozdielov sme hodnotili na hladine P<0,05. Výsledky Semenník sledovaných chrčkov bol úplne uzavretý v belavej blane (tunica albuginea), ktorá odstupuje do semenníka vo forme priehradiek a v centre vytvára väzivový stred (mediastinum testis). V tejto oblasti sme sledovali krvné a lymfatické cievy. Semenotvorné kanáliky mali typický ovoidný tvar. Každý semenotvorný kanálik pozostával zo semenotvorného epitelu ležiaceho na bazálnej membráne pozostávajúceho z podporných bazálne uložených Sertoliho buniek a jednotlivých vývojových štádií spermatogenézy. V centre kanálikov sa nachádza lúmen. Medzi semenotvornými kanálikmi sme sledovali interstícium s krvnými cievami a Leydigovými bunkami. Najvyšší objem semenotvorného epitelu (72,48 ± 2,91%) sme pozorovali v kontrolnej skupine. V oboch pokusných skupinách bol zreteľný pokles relatívneho objemu semenotvorného epitelu, ale preukazný v skupine B a C v porovnaní s kontrolnou skupinou. V kontrolnej skupine bol relatívny objem cez 70%, ale po podaní kobaltu išlo o pokles o 4 13,9%. Relatívny objem interstícia bol preukazne vyšší vo všetkých skupinách po podaní kobaltu. Tento nárast bol o 9,69 12,61%. Signifikantný pokles relatívneho objemu lúmenu sme zistili v skupine B a C v porovnaní s kontrolou. Tieto

159 výsledky poukazujú na edematizáciu interstícia, ktorá je spôsobená dilatáciou krvných ciev a prestupom krvných zložiek. Kvalitatívne pozorovania zaznamenali dilatáciu krvných ciev v interstíciu, unduláciu bazálnej membrány a objavenie sa prázdnych miest v niektorých oblastiach semenotvorného epitelu. Tieto zistenia naznačujú, že kobalt v sledovaných koncentráciách má negatívny účinok na semenotvorný epitel funkčnú a dynamicky sa meniacu zložku semenotvorného kanálika. Pri hodnotení priemeru semenotvorného kanálika sme zistili tendenciu zvyšovania hodnoty priemeru kanálika vo všetkých skupinách po podaní kobaltu v porovnaní s kontrolnou skupinou. Ani jeden rozdiel však nebol štatisticky preukazný. Výška semenotvorného epitelu bola pomerne konštantná a vo všetkých skupinách sa pohybovala od 41,12 do 46,51 v skupine A. Rozdiel medzi skupinou K a A bol štatisticky preukazný. Pri hodnotení priemeru lúmenu semenotvorného kanálika sme zistili, že po podaní kobaltu dochádza k preukaznému zvýšeniu tohto parametru v skupine B, ale vo všetkých skupinách po aplikácii kobaltu sme sledovali tendenciu zvýšenej luminizácie semenotvorného kanálika, aj keď relatívny objem lúmenu klesal. Pri hodnotení počtu viditeľných jadier na sledovanú konštantnú plochu sme zistili, že v kontrolnej skupine je ich 106,56 na µm 2, ale vo všetkých pokusných skupinách je počet jadier vyšší. Diskusia V tejto práci sme popísali účinok kobaltu na štruktúru a funkciu semenníka u chrčka sýrskeho. Môžeme konštatovať, že dochádza k poklesu relatívneho objemu semenotvorného epitelu, ako dynamickej časti semenníku a naopak k nárastu interstícia s dilatovanými krvnými cievami čo naznačuje edematizáciu orgánu. Kobalt spôsobuje cytotoxickú odpoveď a dostáva sa do germinálnych buniek v semenníku (Edel et al., 1994). Kobalt výrazne zvyšuje mitochondriálnu aktivitu produkciu laktátu ako aj aktivitu mitochondriálnej dehydrogenázy v semenníku a tak sa zdá, že je elementom, ktorý je charakterizovaný ako možný faktor spôsobujúci poruchy plodnosti u cicavcov (Cordier et al., 1986; Pedigo a Vernon, 1993; Monsees et al., 1998). V semenníku sa dokázal degeneratívny efekt kobaltu po podaní kobaltu aj v prípade podania zinku pred podaním kobaltu, hoci vtedy je toxický účinok miernejší (Anderson et al., 1993). V reprodukcii zvierat má kobalt veľký význam. Pôsobí na oxidačné katalyzátory. Je potrebný na syntézu vitamínu B 12. Kobalt pôsobí na spermatogenézu plemenníkov, keď jeho karencia sa prejavuje znížením motility a prežívateľnosti spermií a znížením pohlavnej aktivity. Z tohoto pohľadu môžeme jednoznačne zaraďiť aj kobalt v sledovaných dávkach medzi toxikologicky významné dvojmocné prvky.

160 This study was supported by State program Food Quality and Safety (18b/02-Biological Aspects of Increasing Quality of Animal Origin Foodstuff) and VEGA Scientific Grant 1/2417/05 from the Ministry of Education of Slovak Republic. Literatúra ANDERSON, M.B. LEPAK, K. FARINAS, V. GEORGE, W.J.: Protection action of zinc against cobalt induced testicular damage in the mouse. Reprod. Toxicol., 7, 1993, s CIGÁNKOVÁ, V. MESÁROŠ, P BÍREŠ, J. TOMAJKOVÁ, E. ČERNOTA, S.: Vplyv zinku na mikroskopickú a submikroskopickú štruktúru semenníkov býkov. In: XXXV. Zjazd Českej a Slovenskej anatomickej spoločnosti a sekcie bunkovej biológie Čs. biologickej spoločnosti. Nitra, VŠP 1993, s. 34. CORDIER, D.E. ROWE,L.D. CLARK, D.E. HARE, M.F.. Tolerance and effect of chronic dietary cobalt on sheep. Vet. Hum. Toxicol., 28, 1986, s EDEL, J. POZZI, G. SABBIONI, E. PIETRA, R. DEVOS, S.: Metabolic and toxicological studies on cobalt. Sci. Total Environ., 150, 1994, s MONSEES, T.K. WINTERSTEIN, U. HAYATPOUR, J. SCHILL, W.B. MISKA, W.: Effect of heavy metals on the secretory function of testicular cells in culture. J. Trace Microprobe Tech., 16, 1998, s PEDIGO, N.G. VERNON, M.W.: Embryonic losses after 10-week administration of cobalt to male mice. Reprod. Toxicol., 7, 1993, s

161 SLEDOVANIE A POROVNÁVANIE TRANSPORTU NIEKTORÝCH MASTNÝCH KYSELÍN CEZ ČREVNÝ EPITEL OVIEC INVESTIGATION AND COMPARISON OF TRANSPORT OF SOME FATTY ACIDS ACROSS CAECUM EPITHELIUM IN SHEEP Maková, Z. Ústav patologickej fyziológie, Univerzita veterinárskeho lekárstva, Komenského 73, Košice Abstract The influence of oestradiol on propionate (15 and 30 mmol.l -1 of Thyrode solution) transport across isolated sheep caecum epithelium in vitro from mucosal to serosal side was investigated. The equipment constructed in our laboratory for studing fluxies of acids was used. Propionate absorption in 30 mmol level was higher than in 15 mmol level. Adition of oestradiol to propionate (30 mmol level) increased its absorption when propionate was combined with acetate in the solution. Oestradiol might have effected the morphological properties of the epithelium could well have been the reason for our finding. Úvod Unikavé mastné kyseliny (UMK) predstavujú hlavný energetický zdroj najmä pre prežúvavce a ich fermentačná aktivita sa vyskytuje okrem bachora aj v slepom a hrubom čreve. Ich koncentrácia v čreve je u väčšiny druhov zvierat podobná ako v predžalúdkoch (Engelhardt a kol. 1992). V posledných rokoch sa veľká pozornosť venuje transepiteliálnemu prestupu UMK aj v týchto spomínaných častiach tráviaceho traktu. Oestradiol patrí medzi pohlavné steroidné hormóny, odvodzuje sa od acetátu a má vzťah aj k niektorým vyšším mastným kyselinám. Cieľom experimentu bolo sledovať vplyv oestradiolu na prestup čistého propionátu a vplyv oestradiolu na prestup propionátu za prítomnosti acetátu (A+P). Materiál a metódy V experimente sme použili slepé črevá získané z 8 dospelých utratených oviec plemena Merino. Z jedného slepého čreva sme získali 6 plátkov, ktoré po prepláchnutí, oddelení svalovej vrstvy od samotnej sliznice boli vložené do fyziologického roztoku. Prestupy mastných kyselín boli uskutočňované na laboratórne zhotovenej aparatúre, ktorá pozostávala z veľkej okrúhlej sklenenej nádoby s priemerom 45cm. Na dne nádoby sa nachádzal podstavec s viacerými

162 okrúhlymi otvormi, cez ktoré prestupovala voda s následným vytvorením požadovanej vodnej hladiny (vodného kúpeľa). Podstavec slúžil pre štyri rovnaké opäť sklenené nádobky s priemerom 10cm, ktoré sa naplnili 150ml Thyrodeho roztoku s ph 7,4 (serózna strana). Thyrodeho roztok tu predstavuje krvné riečište, t.j. prostredie, do ktorého prestupujú mastné kyseliny z čreva v mukózno seróznom smere. Do spomínaných nádobiek smerovali na laboratórnych stojanoch uchytené Janettove striekačky, ktoré boli cielene upravené. To znamená, po vybratí piestu vznikol otvor s plochou 13,2 cm 2, ktorý sa prekryl plátkom črevnej steny. Jednotlivé plátky slizníc sa uviazali hodvábnou chirurgickou niťou s tým, že mukózna strana smerovala do striekačky a serózna do nádobky. Na druhom konci Janettovej striekačky pôvodný malý otvor slúžil na vsunutie skleneného lievika, cez ktorý sa striekačka naplnila 50ml Thyrodeho roztoku s kyselinami ph 6,9 (mukózna strana) a do 150 ml nádob s Thyrodeho roztokom sa pridával oestradiol (syntetický 17- β oestradiol) v množstve 150pg (serózna strana). Thyrodeho roztok obsahoval: P15 = 15mmol.l -1 TR P30 = 30mmol.l -1 TR P15+E = ng.150ml -1 TR P30+E = ng.150ml -1 TR P15+A = 15+50mmol.l -1 TR P30+A = 30+50mmol.l -1 TR P15+A+E = 15+50mmol.l -1 TR+150ng.150ml -1 TR P30+A+E = 30+50mmol.l -1 TR+150ng.150ml -1 TR P - propionát, E - estrogén, A acetát, TR- Thyrodeho roztok Výška hladín vo všetkých spomínaných nádobách (vo veľkej, v štyroch malých a v striekačkách) bola rovnaká. Do roztokov v nádobkách aj striekačkách smerovali tenké na konci mierne zahnuté miešadielka, ktoré boli napojené na 1,5V motorčeky, upevnené na laboratórnych stojanoch. Voda do akvária bola vháňaná od začiatku do konca experimentu, t.j. jednu hodinu, cez termostat, ktorý ju temperoval na 39 o C. Po uplynutí jednej hodiny sa do skúmaviek s uzávermi odobrali vzorky z jednotlivých nádobiek a striekačiek v množstve 5ml a po pridaní 1ml štandardného roztoku sa mastné kyseliny stanovovali na plynovom chromatografe. Na štatistickú analýzu rozdielov medzi jednotlivými parametrami bola použitá jednocestná ANOVA s použitím Tukeyovho post testu na porovnanie všetkých párov v stĺpci (Graph Pad Instat, GraphPad Sofware, Inc. San Diego, USA).

163 Výsledky a diskusia Prestup propionátu cez črevný epitel bol vyšší pri hladine 30 mmol než pri 15 mmol hladine. Aplikácia estradiolu k 15 mmol hladine samostatného propionátu (P15+E) mala za následok mierne nesignifikantné zvýšenie prestupu propionátu. Pri aplikácii estradiolu ku kombinovanému roztoku (P15+A+E) bola zaznamenaná tendencia mierneho poklesu prestupu propionátu. Pri 30mmol hladine samostatného propionátu (P30+E) aplikácia estradiolu neviedla k zmene jeho prestupu, pričom aplikácia estradiolu ku kumbinovanému roztoku (P30+A+E) mala za následok signifikantné zvýšenie jeho prestupu. Prestupy propionátu boli vyššie pri 30 mmol, než pri 15 mmol hladine, čo môže súvisieť so skutočnosťou, podľa ktorej sa so zvyšujúcou koncentráciou jednotlivých kyselín ich prestup úmerne zvyšuje (Titus a Ahearn 1992). Čo sa týka estradiolu, mohla byť 15 mmol hladina príliš nízka na to, aby sa vplyv estradiolu prejavil. Ako príčina našich výsledkov prichádza do úvahy aj možnosť, že estradiol mohol ovplyvniť morfologické vlastnosti epitelu. Prestup propionátu cez črevný epitel oviec po aplikácii oestradiolu ddd 1 - ḥ 2 m.c m ol µ 0.50 aa bb ccc a a aa, b P bb P<0,01; P c ccc, P d ddd P<0,001 P P propionát; A acetát; E - estradiol b E 30 + E P 15 + A P 30 + A P15+A+E P30+A+E Záver Sledovanie prestupu UMK cez črevný epitel v in vitro podmienkach má predovšetkým teoretický význam. Získané výsledky prispievajú k rozšíreniu doterajších poznatkov o prestupe mastných kyselín s krátkym uhlíkovým reťazcom, predovšetkým acetátu a propionátu. Nálezy c d

164 svedčia o vysokej citlivosti prestupových mechanizmov sledovaných UMK cez membrány tráviaceho traktu oviec. Literatúra Engelhardt W. von a kol.: Segmental differences of short chain acids transport across guinea pig large intestine. Exp. Physiol., 77, 1992: Titus E. and Ahearn G.A.: Vertebrate gastrointestinal fermentation:transport mechanisms for volatile fatty acids. American J. Physiol., 262, 1992:

165 KVALITATÍVNE A KVANTITATÍVNE HODNOTENIE TERCIÁRNYCH FOLIKULOV VAJEČNÍKOV MODERNÝMI ZOBRAZOVACÍMI METÓDAMI A HORMONÁLNYMI PARAMETRAMI QUALITATIVE AND QUANTITATIVE EVALUATION OF TERTIARY FOLLICLES IN OVARIES BY MODERN PICTURAL METHODS AND HORMONAL PARAMETERS Maraček, I., Halagan, J., Danko, J. Katedra normálnej anatómie, histológie a fyziológie, Univerzita veterinárskeho lekárstva, Košice. Abstract his paper is focused on evaluation and monitoring of surface tertiary follicles based on simultaneous use of laparotomy with digital photo documentary evidence, ultrasound investigation and determination of the oestradiol-17β and progesterone in the follicular fluid of the largest follicles from the ovaries of Slovak white goats. It can be concluded from performed observations that the results point to the development of folliculogenesis after lambing in lamb-suckling period also after lamb-weaning and oestrus induction during galactopoesis in milking period of the improved Wallachian breed ewes and after superovulation treatment of the white goats. Úvod Folikulogenéza terciárnych (antrálnych) folikulov smerujúca k diferenciácii dominantného ovulácie schopného terciárneho (Graafovho) folikulu je dvojstupňový proces predstavovaný náborom a výberom vyvíjajúcich sa folikulov na trajektórii rastových vĺn (2,4,5 ). Pri experimentoch zameraných na výskumné analýzy a hodnotenie kvality a počtu jednotlivých kategórií terciárnych folikulov malých prežúvavcov sa používali invázne metódy laparatómie v kombinácii s elektrokauterizáciou folikulov, ich značením čínskym tušom (2) a sledovaním spôsobu a možnosti rastúcich a vyvíjajúcich sa folikulov. Neskôr sa využívali laparoskopické techniky s fotografovaním (7,8) a novšie sa rozširujú neinvázne metodické postupy na hodnotenie a monitorovanie rastových vĺn terciárnych folikulov vaječníkov pomocou ultrasonografie (1, 3, 8). Tieto metódy sú simultánne uplatňované hodnotením histologických nálezov (2, 4) a stanovením koncentrácií hormónov v sére systémového obehu a v tekutine folikulov (6 ). Príspevok sme zamerali na simultánne hodnotenie terciárnych folikulov hlavne na povrchu vaječníkov oviec a kôz pomocou laparatómie,

166 digitálnych fotografií, ultrasonogramov, histologických nálezov a hormonálnych koncentrácií vo folikulárnej tekutine. Cieľom bolo overiť možnosti optimálneho výberu vhodných metód hodnotenia procesu dominancie vo výbere preovulačného folikulu(ov) v estre z funkčno-morfologického aspektu. Materiál a metódy Práce sme vykonali na vaječníkoch 27 oviec plemena merino (SM), 7 bahníc plemena cigája (SC), 6 bahníc zošľachtenej valašky (ZV) a 15 bielych krátkosrstých kôz. Zvieratá boli držané v štandardných chovateľských podmienkach. Sledované parametre boli hodnotené v experimentoch: (a) Superovulačné ošetrenie prípravkom na báze ecg a FSH donoriek pre embryotransfer; (b) v puerpériu 25 a 35 dní po pôrode; (c) po odstavení jahniat u dojných bahníc; (d) po ošetrení na indukciu estru a ovulačného pomeru počas laktácie. Vaječníky po laparotómii sa fotografovali digitálnym fotoaparátom Olympus C50-50ZOOM. Ultrasonogramy sa získali USG prístrojom Sono ACE 600-V (fy. Medison Co.), 5 MHz, lineárnou sondou PB- 06LV50/65AD (fy. Medison Co.). Indukcia ruje a stimulácia OR sa vykonala pošvovými tampónmi s fluórogestonacetátom 40 mg v tampóne na 12 dní. V čase vysadenia tampónov sme ovce i.m. ošetrili 1000 M.J. ecg bezprostredne po vybratí tampónov a po h sa vykonala laparotómia a USG vyšetrenie ovárií. Získané fotografické obrázky a obrázky ultrasonogramov sme hodnotili kvalitatívne i kvantitatívne. Postupovali sme podľa metód uvádzaných v literatúre (1, 3). Koncentráciu 17ß-estradiolu (E 2 ) a progesterónu (P 4 ) v tekutine folikulov sme stanovili postupom ako to uvádzame inde (6). Výsledky sme štatisticky analyzovali. Uvádzame aritmetický priemer i smerodajnú odchýlku. Rozdiely sme hodnotili t-testom a χ 2 - testom. Výsledky a diskusia Výsledky pozorovaní a hodnotení sme zhrnuli podľa vyššie uvedených experimentov do tabuliek. Tabuľka 1 Priemerný počet povrchových terciárnych folikulov vaječníkov oviec a kôz po superovulácii Ošetrenie Zvier (n) Povrchové folikuly Σ Preovulačné DOF Atretické Ovce - ecg 27 8,9 ± 2,7 5,5 ± 2,8 3,4 ± 2,1 Kozy - FSH 7 12,8 ± 1,5 8,1 ±1,6 4,6 ± 0,8 Kozy - ecg 8 9,6 ± 1,7 3,4 ± 1,2 6,2 ± 1,7 AF

167 Po superovulačnom ošetrení koncentrácia 17β-estradiolu v tekutine dominantných ovulácie schopných folikulov sa signifikantne zvýšila v porovnaní s veľkými atretickými folikulmi (P<0,001). Tabuľka 2 Koncentrácia 17β- estradiolu a progesterónu v tekutine folikulov Kategória folikulov Počet folikulov 17β-estradiol nmol / l Progesterón nmol / l DOF ,8 ± 2615,8 a 163,5 ± 113,0 AF 5 114,3 ± 77,3 a 207,8 ± 100,1 a P<0,001 Preukazne sa zvýšil počet folikulov súhrnne na obidvoch vaječníkoch po odstavení jahniat (P<0,01) ako aj po indukcii estru (P<0,001) v porovnaní s 25 dňom po pôrode. Najväčší povrchový terciárny folikul bol štatisticky preukazne väčší po odstavení jahniat aj po ošetrení na indukciu estru (P<0,001) v porovnaní s 25 dňom po pôrode. Tabuľka 3 Terciárne folikuly vaječníkov bahníc 25 a 35 dní po pôrode, po odstavení jahniat a po indukcii estru počas laktácie Skupina Laparotómia digitálna fotografia USG Folikuly Σ F 3mm F>3mm Maxim. F Σ (mm) 25 dní pp 5,5 ± 0,9 4,9 ± 1,1 0,6 ± 0,5 ab 3,1±0,5 c d 5,7 ± 1,5 35 dní pp 6,7 ± 1,9 5,3 ± 1,6 I,3 ± 0,5 4,0 ±0,6 cd 6,7 ± 1,6 Po odstav 7,3 ± 2,6 5,0 ± 2,4 2,3 ±1,7 a 5,1 ± 1,0 c 3,1 ± 0,8 FGA+eCG 5,3 ± 1,5 3,8 ± 1,5 1,5 ± 1,1 b 4,5±1,0 d f 5,5 ± 0,7 a b e P<0,01; c d P<0,001 ; f P<0,05 Záver Z výsledkov vyplýva možnosť využitia overovaných metód pri hodnotení povrchových terciárnych folikulov na vaječníkoch oviec a kôz. Poukazuje sa na možnosť monitoringu folikulogenézy po pôrode v období dojčenia jahniat, po odstavení jahniat a počas galaktopoézy v období dojenia bahníc, ako i v experimentálnych podmienkach aj u kôz. Po použití dvojfrekvenčnej USG sondy s možnosťou prepnutia na 7,5 8 MHz a viac bude možné v budúcnosti uplatniť hodnotenie terciárnych folikulov v štádiu výberu aj klinicky pri vyšetrovaní zvierat ultrasonografom. Literatúra 1. Bartlewski, P.M., Beard, A.P., Rawlings, N.C, 2000.: An ultrasoun-aided study of temporal relationships between the patterns of LH/FSH secretion,

168 development of ovulatory sized antral follicles and formation of corpora lutea in ewes. Theriogenology, 54, Cahill, L.P., Mariana, J.C., Mauléon, F. 1979: Total follicular populations in ewes of high and low ovulation rates. J. Reprod. Fert., 55, Dickie, A.M., Paterson, C., Anderson, J.L.M., Boyd,J.S. 1999: Determination of corpora lutea numbers in booroola texel ewes using transrectal ultrasound, Theriogenology, 51, Driancourt, M.A., Gibson, W.R., Cahill, L.P. 1985: Follicular dynamics throughout the oestrus cycle in sheep. Reprod. Nutr. Dev., 25, Driancourt, M.A. 1994,: Lack of between-follicle interactions in the sheep ovary Reprod. Nutr. Dev., 34, Maraček, I., Krajničáková, M., Kostecký, M., Gréserová, G., Valocký, I. 2002: Tertiary follicular growth wave dynamics after oestrus synchronization and superovulation. Acta Vet. Brno, 71, Mc Natty, K.P., Gibb, M., Dobson, C., Ball, K., Coster, J.,Heath, D., Thurley, D.C. 1982: Preovulatory follicular development in sheep treated with PMSG and/or prostaglandin. J. Reprod. Fert., 65, Vlčková, R., Lacková, Z., Antal, J., Maraček, I. 2005: Povrchové terciárne folikuly ovárií bahníc po odstave jahniat a ich zmeny počas indukovaného estru v riadenej reprodukcii. In: Zborník prác a abstraktov prezentovaných na 81. Fyziologických dňoch konaných februára 2005 v Košiciach, Ed,. P Švorc, Vydal: ZZ design studio Ing, Zvonimír Záviš, Páca bola vytvorená pri riešení grantu VEGA 1/0612/03.

169 DAPA AKO MARKER PRE HODNOTENIE SYNTETICKEJ KAPACITY BACHOROVEJ MIKROFLÓRY DAPA AS MARKER FOR QUANTIFYING MICROBIAL SYNTETIC CAPACITY OF THE RUMEN Maskaľová I., Vajda V., Univerzita veterinárskeho lekárstva, Košice Abstract: In two groups of dairy cows during the puerperal period we have analyzed the level of VFA and ph marker of the rumen fermentation of carbohydrates, NH 3 marker of rumen degradation of protein and values of DAPA amino acids of the cell walls - marker of the microbial protein synthesis in the rumen content. The results of the examination confirmed the direct linear regression (r 0.772) between the values of VFA and DAPA and limiting influences of fermentable energy for the formation of bacterial biomass. The deficit value of NH 3 (x ± 2.28 mg/100ml) confirmed the highest correlation between NH 3 and DAPA (r = 0.837) the influence of the deficit of nitrogen to synthesis the microbial protein in the rumen. Cieľom adaptácie metabolizmu bachora v peripartálnej fáze je maximalizovať tak príjmu sušiny, ako aj produkcie UMK a syntézu bakteriálnej biomasy. Pre zabezpečenie týchto funkcií energia prijímaná vo forme štrukturálnych a neštrukturálnych sacharidov vystupuje ako limitujúci faktor. Mikrobiálna fermentácia sacharidov a produkcia UMK zabezpečuje úhradu až 70 % energetických potrieb prežúvavcov. Rozsah mikrobiálnej proteosyntézy v rozsahu nad 60% absorbovateľných aminokyselín je limitovaný využiteľnosťou sacharidov, dostupnosťou amoniaku a vhodným ph bachorového prostredia pre degradačné a syntetické funkcie. Diaminopimelová kyselina (DAPA) bola identifikovaná ako aminokyselina, ktorá sa vyskytuje v stenách mikrobiálnych buniek. Vzhľadom k proporcionálnemu zastúpeniu DAPA v ruminálnej mikroflóre je používaná ako marker mikrobiálnej proteínovej syntézy (Czerkavski 1974) v priamom vzťahu so zastúpením fermentovateľnej energie v KD (Nelson a kol. 1982). Variabilita pomeru DAPA k bielkovinám je závislá od druhu a veľkosti mikroorganizmov (Broderick a Merchen 1992), z tohto dôvodu hodnoty DAPA je vhodné uplatňovať ako marker na úrovni farmy, ale menej medzi geograficky vzdialenými populáciami. Cieľom práce bolo v kŕmnom pokuse u dojníc analyzovať parametre ruminálnej fermentácie sacharidov, degradácie a syntézy bielkovín v období státia na sucho a 2 týždne pred pôrodom.

170 Materiál a metodika: V chove dojníc dojníc bol hodnotený vzťah ruminálnej fermentácie sacharidov (UMK, kys. octová, kys. propionová, kys. maslová a ph), rozkladu bielkovín (NH 3 ), ako aj rozsah syntézy mikrobiálnych bielkovín pri optimálnom resp. limitovanom prívode NL. Výsledky a hodnotenie: Výsledky vyšetrení v priemerných hodnotách u sledovaných skupín dojníc sú zhrnuté v tabuľke 1. Tab 1. Úroveň bachorového metabolizmu dojníc podľa skupín. DOJNICE DAPA ph NH 3 UMK K. octová K. prop. K. masl. nmol/l mg/100ml mmol/l mmol/l mmol/l mmo/l Pred otelením 128±86 6,8±0,3 15,6±3,9 99,7±21,4 64,1±13,6 18,3±5,7 12,8±3,0 Po otelení 169±46 6,3±0,1 16,8±2,8 112,6±14,0 71,3±8,9 26,2±3,9 15,2±1,7 Dojnice pred pôrodom odrážajú úroveň bachorovej fermentácie, ktorá odpovedá zloženiu KD suchostojacich dojníc. Analyzované hodnoty pre UMK 99,7 mmol/ a NH 3 18 mg/100ml na dolnej hranici referenčného rozpätia priamo korelujú s charakterom KD, čomu zodpovedá aj zastúpenie ph 6,8 a pomer kyseliny octovej a propionovej 3,5. Dojníce po pôrode analyzované hodnoty potvrdzujú vysoký stupeň bachorovej fermentácie pri optimálnej adaptácii na koncentrovaný typ kŕmnej dávky. Zastúpenie celkových UMK 112,6 pri vyrovnanom vzájomnom pomere kys. octovej : kys. propiónovej 2,7:1 a kompenzovaných hladinách bachorovej acidity s hodnotami ph 6,3 v dolnej tretine referenčného rozpätia potvrdzuje optimálny priebeh bachorovej fermentácie sacharidov. Sledované parametre bachorového profilu a ich nesignifikatný vzostup úmerný zmene koncentrácie živín v KD v čase prípravy na pôrod, ako aj po otelení odráža stupeň adaptácie ruminálnej fermentácie. Úmerne so zvýšením hladín UMK koreluje vzostup hodnôt DAPA, ktoré z priemerných hodnôt 127,7 nmol/l nesignifikatne vzrástli na 168,9 nmol/l v období do 14 dní po pôrode. Hodnotením vzájomného vzťahu DAPA a UMK (graf 1) potvrdená priama regresná závislosť s koeficientom r 0,772 signalizuje priamy vzťah medzi fermentačnou aktivitou produkcia UMK a syntetickou aktivitou rozvoj bachorovej mikroflóry, ktorého DAPA je priamy celulárny marker. Individuálne hodnoty DAPA kolísali s úmerným rozdelením od 82 do 281 nmol/l bachorového obsahu.

171 Graf 1. Vzťah obsahu UMK a DAPA v bachorovom obsahu dojníc. UMK mmol/l y = -1E-04x 2 + 0,2615x + 69,55 r = 0, DAPA nmol/l Vzťah medzi hodnotou NH 3 a hladinami DAPA (graf 2) vykazuje najnižšiu regresnú hodnotu (r 0,627) zo všetkých analyzovaných závislosti v období peripartálneho obdobia pri vybilancovanom prívode živín v KD. Graf 2. Vzťah hodnôt NH 3 a DAPA v bachorovom obsahu dojníc. NH3 mg/100ml y = 0,0004x 2-0,0951x + 20,449 r = 0, DAPA nmol/l Pri deficitných hladinách NH 3 regresný vzťah ukazovateľov bachorovej fermentácie dojníc potvrdzuje priamu závislosť medzi hodnotami dusíkatej saturácie a rozvojom bachorovej mikroflóry (NH 3 a DAPA) na najvyššej úrovni korelačnej závislosti r 0,827 (graf 4). Limitujúci vplyv dusíka v bachorovom prostredí na úroveň ruminálnej proteosyntézy a rozmnožovanie mikroflóry potvrdil aj regresný vzťah úrovne fermentácie sacharidov s rozvojom bachorovej mikroflóry (UMK a DAPA, graf 3), ktorý je na najnižšej úrovni závislosti r 0,590, čo potvrdzuje limitujúci vplyv deficitu dusíka v bachorovom prostredí.

172 Tab 2. Parametre ruminálnej fermentácie dojníc pri deficitnom a normovanom prívode NL DOJNICE DAPA ph NH 3 UMK K. octová K. prop. K. masl. nmol/l mg/100ml mmol/l mmol/l mmol/l mmo/l Deficitný 157,9±77 6,7±0,2 10,1±3,9 94,8±15,6 64,8±11,3 16,9±2,3 13,3±2,8 Normovaný 226,3±72,4 6,6±0,2 16,6±2,8 101,4±17,4 66,2±9,5 22,1±7,5 13,1±1,6 Graf 3. Regresný vzťah hodnôt UMK a DAPA v bachorovom obsahu dojníc pri deficite NL v KD UMK mmol/l y = 0,1131x + 74,919 r = 0, DAPA nmol/l Graf 4. Regresný vzťah hodnôt NH 3 a DAPA v bachorovom obsahu dojníc pri deficite NL v KD 19 NH3 mg/100 ml y = -0,0002x 2 + 0,1005x + 0,7613 r = 0, DAPA nmol/l

173 Záver: U dvoch skupín dojníc v peripartálnom období analýzy potvrdili priamu závislosť lineárnej regresie (r = 0,772) medzi hodnotami UMK a DAPA, a limitujúci vplyv sacharidov KD na rozvoj a pomnoženie bachorovej mikroflóry a tvorbu bakteriálnej biomasy. Deficitný príjem bielkovín v KD limituje mikrobiálnu syntézu NH 3 a DAPA (r = 0,837). Literatúra u autorov.

174 ALTERÁCIE ŠTRUKTÚRY OBLIČIEK MYŠÍ PO EXPERIMENTÁLNOM PODANÍ OLOVA STRUCTURAL ALTERATIONS OF MICE KIDNEYS AFTER A LEAD ADMINISTRATION Massányi, P., Lukáč, N., Kováčik, J., Toman, R., Kramárová, M., Kolesárová, A. Slovenská poľnohospodárska univerzita v Nitre Abstract In this study analysis and potential changes in the mice kidney are reported. Animal we intraperitoneally injected with experimental dose of lead (PbCl 2 ) and after 48 hours were killed. We determined that experimental dose of lead markedly influenced the relative volume of kidney corpuscles and relative volume kidney of tubules (P<.01). The diameter of kidney corpuscles was in group A (experimental dose 5 mg PbCl 2 per 1 kg on body weight) µm. Height of tubules epithelium was lower in experimental groups in comparison with control group. Number of glomeruli evaluated per constant area was significant higher (P<.01) in group A and B (experimental dose PbCl 2 10 mg per kg of body weight) that in control group. Results of this experiment suggest that the lead administrated caused expressive effect on the kidney structure. Lead mainly affected the structure of nephritic system which can cause eventual nephritic dysfunction and failure in urea secretion. Úvod Podľa Piskača et al., (1985), najčastejšou príčinou otráv domácich zvierat býva spásanie rastlín s vysokým obsahom olova (napr. v okolí hút), alebo požranie toxických zlúčenín olova, najmä farbív alebo látok na ich prípravu. Podľa Sola et al. (1998), že určité množstvo olova môže preniknúť aj do mäsových výrobkov z plechoviek na uchovávanie potravín. Gábriš et al. (1998) uvádzajú, že olovo je prítomné aj v normálnom organizme z ktorého sa vylučuje napr. močom. Kritická hranica olova je koncentrácia mg.l -1 krvi. Jeho účinky sa prejavujú v klinickom obraze postihnutého (koliky, hnačky, hypertenzia), postihnutie nervovej sústavy (bolesti hlavy, poruchy vedomia, bezvedomie) tak isto je veľmi známy karcinogénny účinok olova ale samozrejme dochádza aj k zlyhaniu vnútorných orgánov. Na vyššie dávky olova reagujú hlavne parenchymatózne orgány. Zvlášť je citlivý na krvotvorný systém, centrálny nervový systém, ale aj tráviaca sústava. Olovo súčasne vyvoláva rozpad červených krviniek a brzdí metabolizmus železa. Poškodenie niektorých enzýmov sa dá do súvislosti

175 s blokovaním SH skupín. Olovo tiež nepriaznivo pôsobí na mitochondrie. Massányi et al. (2001) uvádzajú, že v inseminačných dávkach býkov bola priemerná koncentrácia olova 0,320-0,274 mg/kg. Podľa Rajzáka et al. (2001) olovo preniká do živého organizmu vdychovaním a v pľúcach sa viaže na červené krvinky, ktoré ho zanášajú ďalej, predovšetkým do pečene, obličiek a predovšetkým sa kumuluje v kostnom tkanive. Ako uvádza Bencko et al. (1995) olovo ľahko preniká placentou, v krvi plodu bola nájdená skoro taká istá koncentrácia olova ako v krvi matky. Bíreš et al.. (1995) zistili pri štúdiu distribúcie rizikových kovov v organizme oviec po skrmovaní priemyselnej emisie, že orgánom s najvyšším obsahom boli vaječníky, obličky a pečeň. Ako zvádzajú Jančová et al. (2001) pri zisťovaní ťažkých kovov v parenchymatóznych orgánoch, pri použití dospelých jedincov Apodemus flavicollis a Clethrionomys glareolus najvyšší obsah Pb zistili v obličkách. V pečeni a v semenníkoch boli tieto hodnoty niekoľkokrát nižšie (Massányi, et al.,1995). Materiál a metodika V práci sme analyzovali obličky 12 jedincov pohlavne dospelých myší laboratórnych (Mus musculus ab. alba). Súbor týchto zvierat bol rozdelený do 3 skupín. Prvú skupinu tvorili kontrolné jedince (K- skupina), druhú skupinu (A) predstavovali jedince, ktorým bolo intraperitoneálne podané olovo vo forme roztoku PbCl 2, v množstve 5 mg na kg živej hmotnosti. Tretiu skupinu (B) tvorili zvieratá, kde bolo podané olovo (PbCl 2 ) v množstve 10 mg na kg živej hmotnosti. 48 hodín po podaní olova sa vykonala eutanázia zvierat a ihneď sa vykonala exenterácia obličiek. Obličku sme následne spracovali pre histologické štúdie podľa štandartného postup. Sériové rezy hrubé 7-10 µm boli farbené hematoxylínom a eozínom podľa vypracovanej metodiky (Vacek et al.1974). Na optickom mikroskope s fotozariadením (Olympus Provis AX) sme zhotovili mikrofotografie pri konštatnom zväčšení, niektoré preparáty sme hodnotili priamo pomocou softvéru na analýzu obrazu a kvantitatívne sme zhodnotili pomocou mikromorfometrických metód (Wiebel et al., 1966; Uhrín, 1992). Na získaných histologických preparátoch sme sledovali volumetrické ukazovatele jednotlivých štruktúr obličky: obličkové telieska, tubuly, glomeruly, jadrá Získané hodnoty morfometrických analýz sme štatisticky vyhodnotili. Vypočítali sme údaje základnej popisovej štatistiky ako aj rozdiely sme testovali Studentovým t-testom. Tieto výpočty sme zrealizovali pomocou programov MS Excel 97 a SAS. Výsledky

176 Morfometrická analýza obličky preukázala, že relatívny objem v % obličkových teliesok experimentálnych myší (skupina A, B) bol preukazne (P<0,01) nižší ako v kontrolnej skupine. Zistili sme, že priemerný relatívny objem obličkových teliesok v kontrolnej skupine bol 5,54 ± 1,8 %. V skupine A sme vyhodnotili priemerný objem obličkových teliesok ako najnižší (4,30%). Priemerný relatívny objem obličkových teliesok v skupine B bol 4,39%, čo v porovnaní zo skupinou A bol nepreukazný rozdiel. Obraz relatívneho objemu tubulov, myší v skupine A, B bol preukazne (P<0,01) vyšší ako v kontrolnej skupiny. Priemerný relatívny objem tubulov bol najvyšší v skupine A, čo činilo 95,70%. V skupine B sme zistili priemerný relatívny objem 95,61%, pričom smerodajná odchýlka bola 0,72%. Pri hodnotení priemerov obličkových teliesok sme zistili, že v skupine A bol najväčší priemer 76,39 ± 10,92 µm, potom nasledoval priemer kontrolnej skupiny 74,64 µm a nakoniec skupina B s najnižším priemerom 72,78 ± 12,14 µm. Štatistická analýza nepreukázala preukazné rozdiely v sledovanom znaku. Najväčší priemer glomerulov sme zistili v skupine A 53,73 µm a najnižší v kontrolnej skupine 50,58 ± 9,45 µm. V skupine B bol priemer glomeulov 51,80 µm. Aj v tomto prípade sa nezistil štatisticky významný rozdiel. Pri hodnotení priemerov tubulov sme zistili, že priemer tubulov sa pohybuje v rozmedzí od 61,34 do 61,775 µm. Najnižší priemer sme zaznamenali v skupine A, pričom smerodajná odchýlka bola 6,612 µm. Pri meraní priemeru tubulov sme sa zameriavali na proximálny segment tubulov, ktorý sa nachádza čo najbližšie ku glomerulu. Tak ako v predchádzajúcom prípade pri štatistickej analýze nebol preukázaný rozdiel. Ani štatistická analýza nepotvrdila preukazný rozdiel medzi kontrolnou a pokusnými vzorkami na základe vyhodnotenia výšky epitelu tubulov. Hodnoty namerané v jednotlivých skupínách boli nasledovné: skupina A 13,47 µm; skupina B 14,39 µm a kontrolná skupina 13,86 ± 2,34µm. Maximálnu hodnotu sme namerali v skupine A a B, kde výška epitelu dosiahla hodnotu až 20,77 µm. A naopak najnižšiu hodnotu 9,23 µm sme získali v skupinách K a A. Počet glomerulov na konštantnú plochu µm² renálneho tkaniva myší bol v preukazne vyšší (P<0,01) v skupine A a B ako v kontrolnej skupiny. Priemerná hodnota počtu glomerulov skupiny A a B bola 1,48 µm² a v kontrolnej skupiny sme zistili hodnotu 1,33 ± 0,30 µm². Priemerný počet jadier na konštantnú plochu sa pohyboval od 35,73 do 38,23 na µm². Ani v tomto prípade pri vyhodnotení počtu jadier na konštantnú plochu sme výsledky získané morfometrickou analýzou, štatisticky nepotvrdili preukaznosť medzi kontrolnou a pokusnou skupinou. Najnižšia priemerná hodnota počtu jadier 35,73 ± 4,84 bola nameraná v skupine B, kde sme podali najvyššiu dávku olova. V opačnom prípade, najväčšie množstvo jadier 38,23 ± 6,51 bolo zaznamenané v kontrolnej

177 skupiny, bez podania olova. Maximálny počet jadier 50,82 na µm² sa nachádza v kontrolnej skupine a najnižší je v skupine B kde počet dosiahol 27,29. Diskusia Olovo sa môže dostať do organizmu najmä cez gastrointestinálny aparát a respiračný aparát, no popísané sú prípady intoxikácie aj perkutánnou cestou (Cibulka et al., 1991). V našich pozorovaniach sme zistili obdobný obraz ako Uhrín et al., (2000). Zistili sme veľmi široká škála mikroskopických zmien na renálnom tkanive. Postihnuté sú najmä bunky proximálnych tubulov. Objavuje sa vakôlizácia cytoplazmy a pyknózy jadier. V lumene kanálikov sa vyskytujú odlúpané epitelové bunky a bunkový dentristu. V našich vzorkách experimentálneho podania olova sme pozorovali zvýšené zastúpenie jadier na konštantnú plochu v pokusných skupinách oproti kontrolnej. Uhrín et al., (2000) zistili zmeny na obličkovom tkanive kráv a býkov, ktoré pochádzali z lokalít zvýšeným výskytom polutantov ťažkých kovov. Spozorovali chronické glomerulonefritídy sprevádzané hrubnutím membrán Bowmanových púzdier. Bunky tubulov nasadajú širokou základňou na bazálnu membránu. V cytoplazme sa vyskytuje množstvo sekundárnych lyzozómov, multivezikulárnych teliesok a ojedinele kvapky lipidov. V bunkách obličkových kanálikov, najmä zo silnejšie postihnutých oblastí emisiami spozorovali v cytoplazme pri bazálnach membránach rôzne vláknité útvary, ktoré pripomínali zosieťovanie cytoplazmy. čiastočne boli na niektorých bunkách deštruované aj mikroklky. Nami spozorované zmeny na histologických vzorkách sú evidentné v relatívnom objeme obličkových teliesok a tubulov. Z výsledkov usudzujeme, že olovo podané vo väčších dávkach má preukazný vplyv na relatívny objem obličkových teliesok. Je zaujímavé zistenie, že zastúpenie glomerulov na konštantnú plochu raste v pokusných skupinách oproti kontrolnej skupine. Podľa Gálovej et al. (2001) pri morfologickom obraze glomerulov a obličkových kanálikov pozorovali veľmi širokú škálu zmien vo vzorkách s vyšším zastúpením olova. Zmeny boli zapríčinené porušením krvných vlásočníc a vystúpením krvných buniek medzi kanáliky. Jesenská et al., (2001) porovnávali koncentrácie olova vo vzorkách pečene, svalov, obličiek, sleziny a maternice z jatočných zvierat východoslovenského regiónu pričom zistili najnižšie koncentrácie olova v maternici a najvyššia koncentrácia bola pečeni a v obličkách. This study was supported by State program Food Quality and Safety (18b/02-Biological Aspects of Increasing Quality of Animal Origin Foodstuff) and VEGA Scientific Grant 1/2417/05 from the Ministry of Education of Slovak Republic.

178 Literatúra BENCKO, V.- CIKRT,M.- LENER,J.: Toxické kovy v životnom a pracovnom prostredí človeka. Praha: Grada Publishing, s. BÍREŠ, J.- VRZGULA,L.- JUHÁSOVÁ, Z.: Tierärtztl. Umschau, roč.50,1995, s CIBULKA, J. - DOMAŽLICKÁ, E. - MAŇKOVSKÁ, B. et al.: Pohyb olova, kadmia a rtuti v biosféře. Academia, Praha, 1991, s GÁBRIŠ, Ľ.: Ochrana a tvorba životného prostredia v poľnohospodárstve. Nitra: SPU, s. ISBN GÁLOVÁ, J.- UHRÍN, V.- PIVKO, J.-PAVLÍK, V.-GALLO, M.: Rizikové faktory potravinového reťazca. Nitra: SPU, 2001, s GÁLOVÁ, J.- UHRÍN, V.- PIVKO, J.-PAVLÍK, V.-GALLO, M.: Rizikové faktory potravinového reťazca., Nitra: SPU,2001, s JANČOVÁ, A.- MASSANYI, P.- GÁLOVÁ, J.: In: Rizikové faktory potravinového reťazca. Nitra: SPU, 2001b, s JESENSKÁ, M. - HIŠČÁKOVÁ, M. - KOVÁČ, G. et al.: Rizikové faktory potravového reťazca. Nitra, SPU, 2001, s , ISBN MASSÁNYI, P., TOMAN, R., UHRÍN, V.:1995: In: Ital. J. Food Sci., roč.3, s MASSANYI, P.-TRANDŽIK, J.-LUKÁČ, N.- TOMAN, R.:. In :Rizikové faktory potravinového reťazca. Nitra: SPU, 2001, s PÍSKAČ, A. - KAĆMÁR, P. - BARTÍK, M. et al.: Veterinární toxikologie. SZN Praha, NP Bratislava, 1985, 254 s. RAJZÁK, M.- MAGIC, P.- BREYL, I. et.al.: Slov. vet. časopis, roč. 26, 2001, č. 5, s SOLA,S.- BARIO,T.- MARTIN, A.: Food Addit. Contam., roč.15, 1998, č.5. s UHRÍN, V.- GÁLOVÁ, J.- PAVLÍK, V.- PIVKO, J.-GALLO, M.: In : Kováčik, J.,(Ed.), 2000 Rizikové faktory potravinového reťazca človeka. SPU Nitre, s UHRÍN, V.: Funkčná morfológia epitelov vajcovodu a maternice kravy. Slovak academic press, Bratislava, 1992, 85 s. VACEK, Z.: Histológia a histologická technika. Martin: Osveta, 1974, s.388. WIEBEL, E. R. et al.: Practical stereological methods for morphometric cytology. J.Cell Biol, 30, 1966, s

179 CADMIUM INDUCED OVARIAN ULTRASTRUCTURE ALTERATIONS IN VIVO AND IN VITO Peter Massányi(1), Vladimír Uhrin(1), Jaroslav Kovacik(1), Róbert Toman(1), Juraj Pivko(1,2), Alexander V. Sirotkin(2), Norbert Lukac(1), Zsolt Forgacs(3), Zoltan Somosy(3), and Jan Danko(4) (1)Slovak University of Agriculture, Nitra, Slovak Republic, (2)Research Institute of Animal Production, Nitra, Slovak Republic, (3)Fodor József National Center of Public Health, Budapest, Hungary, (4)University of Veterinary Medicine, Košice, Slovak Republic. Cadmium is an environmental risk factor having various toxic effects both in animals and in humans. Some cadmium has been found in all natural materials that have been analyzed. In the past, chronic effects due to long-term inhalation of cadmium containing dust were frequently observed. The type and intensity of symptoms depend on individual disposition as well as on intensity and duration of exposure. Cadmium also affects reproductive organs [1 3]. Its action may be either direct, affecting the gonads and accessory organs, or indirect via interference with the hypothalamus pituitary gonadal axis [4]. The aim of this study was to determine effects of cadmium on the ultrastructure of various ovarian cells after an experimental administration. The structure of ovarian cells (granulosa, thecal, stromal, endothelial cells) was analyzed by transmission electron microscopy (TEM). In vivo animals (24) were divided into three groups (K, A, C). In group A (n=8) rabbits received cadmium i.p. (1.5 mg/kg body weight) and subsequently were killed 48 h after administration of cadmium. In group C (n=8) cadmium was administered at a dose of 1.0 mg/kg b.w. for 5 month in pelletized food. The last group (K) was the control, receiving no cadmium. In vitro ultrastructure of granulosa cells was studied after 48 h of culture with (0.2, 10 and 20 ng CdCl 2 /ml) or without cadmium. In vivo study: The qualitative analysis of granulosa cells showed undulation of nuclear membrane, dilatation of perinuclear cistern and endoplasmic reticulum. In theca cells dilatation of endoplasmic reticulum was the most characteristic alteration. Also dilatation of perinuclear cistern was evident. In stromal ovarian cells very intensive dilatation of perinuclear cistern and structures with smooth membranes were detected. In endothelial cells dilated mitochondria with altered inner structure, mainly missing cristae were found. Quantitative analysis of granulosa cells found significant (p<0.05) decrease of relative volume of mitochondria in group C in

180 comparison with group A. In ovarian thecal cells a significant (p<0.001) increase of the relative volume of endoplasmic reticulum in group A in comparison with control group was detected. In ovarian stromal cells a significant increase of the relative volume of smooth membranes in comparison with control animals was found. In endothelial cells we have observed significantly higher amount of mitochondria and cytoplasma in group A in comparison with control group. In vitro study: After cadmium administration cell membranes were disintegrated. It was manifested by occurrence of vacuoles in cytoplasm. The vacuoles contained fibrillar or membranous material. The Golgi complex rarely remained intact. Increased number of lysosomes was detected. With increasing cadmium concentrations the number of lipid droplets increased. In some cells the changes were less evident and dense mitochondria with distinct membranes were found. In other cell types the amount of mitochondrial matrix increased and that of membranes decreased. Some mitochondria fused with lysosomes. The endoplasmic reticulum rarely remained intact, and its dilatation was well visible on transverse sections. Nuclei with distinct heterochromatin at the nuclear membrane were often observed. Less frequently nuclei with condensed chromatin reminiscent of pyknosis were observed. Some nuclei had dispersed fine granular chromatin. In other cells changes were less evident, and comprised condensed chromatin in the central part of nuclei. These structural changes of granulosa cells exposed to cadmium were related to premature luteinization of these cells. Results of our study prove negative effects of cadmium on the ovarian structure also on the ultrastructural level. In previous study [1] we have reported that on microspic level (in the same animals) with regard to the number of follicles, the lowest number of primary follicles was found after i.p. administration of cadmium. Percentual content of growing follicles was significantly higher and of stroma significantly lower in the control group in comparison with all experimental groups receiving an administration of cadmium. The stimulatory and inhibitory effects of cadmium on progesterone synthesis were recently investigated using the steroidogenically stable JC-410 porcine granulosa cells line, which was genetically modified with gene constructs containing the promoter region of the cytochrome P450 side chain cleavage gene linked to a luciferase reporter gene [5]. Generally there are few data describing the effect of cadmium on granulosa cells [6] with mainly monitoring and biochemical aspects of toxicity. Our results describe fine structural alterations of ovarian cells after an administration of cadmium. The negative effect of this common

181 environmental toxicant was detected in all studied cell types and we can conclude that it is cell-depended. This study was supported with The State Program Life Quality-Health, Nutrition, Eductation (Program 18b/02) and VEGA grant No. 1/2417/05 of the Slovak Ministry of Education. [1] P, Massányi, V, Uhrin. Reprod Dom Anim (1996) 31, 629. [2] P, Massányi, V, Uhrin. J Environ Sci Health (2005) A40, in press. [3] P, Massányi et al. Acta Vet Brno (2000) 69, 101. [4] K, Paksy et al. J Appl Toxicol (1997) 17, 321. [5] MC, Henson, PJ Chendrese. Exp Biol Med (2004) 229, 383. [6] AD, Smida et al. Biol Reprod (2004) 70, 25.

182 VPLYV VYBRANÝCH IMPLEMENTOROV NA ULTRAŠTRUKTURÁLNU KATEGORIZÁCIU SPERMIÍ BARANA EFFECTS OF CHOSEN IMPLEMENTORS ON THE ULTRASTRUCTURAL CATEGORIZATION OF RAM SPERM Matejašáková, E., Pivko, J., Makarevič, A.V., Kubovičová, E., Sirotkin, A.V., Riha, Ľ. Katedra zoológie a antropológie, Univerzita Konštantína Filozofa v Nitre Ústav genetiky a reprodukcie hospodárskych zvierat, VÚŽV Nitra Abstract In our study we tested effects of chosen implementors on the ultrastructural state of sperm s heads: its membranes and acrosomes. Fresh ram sperm diluted in Biladyl was divided into five groups according to added implementor (IGF-I, EGF, Caffeine and Glutathione). Sperm sample without implementor was served as a control. Totally 300 sperm s heads were classified as belonging to four categories according to state of capacitation. We found out that growth factors (IGF-I and EGF)and Glutathione increased membrane s stability and fertilizing capacityof ram sperm. Caffeine although significantly increased sperm activity,but caused swelling of acrosomes and vesiculization of sperm s membranes. Úvod Membrány spermií barana sú bohaté na obsah nesaturovaných mastných kyselín a sú citlivé na poškodenia indukované kyslíkom cestou peroxidácie lipidov. Antioxidanti seminálnej plazmy, ktoré chránia spermie pred ich oxidatívnym poškodením indukovaným reaktívnymi kyslíkovými radikálmi (ROS) sú oslabené riedením semena pri príprave inseminačných dávok. Poškodenie cytoplazmatickej a akrozómovej membrány za vzniku vezikúl, alebo formou zmeny jej permeability spôsobuje uvoľnenie a únik akrozomálnych enzýmov, a tým aj zníženie oplodňovacej schopnosti embryí (Zibrín a kol., 1995). Potvrdilo sa, že pridanie glutatiónu, ako antioxidantu zvyšuje produkciu blastocýst ak je pridaný počas spracovania spermií pred oplodnením (Earl a kol., 1997). Neskôr sa preukázalo, že aj IGF-I (Vickers a kol., 1999; Champion a kol., 2002) a kofeín (Tathan a kol., 2003) zvyšujú pohyblivosť spermií, čo rezultuje do vyššieho fertilizačného stupňa oocytov. Naším cieľom bolo otestovať vplyv vybraných rastových faktorov (IGF-I a EGF), kofeínu a glutatiónu ako potencionálnych implementorov semena baranov na ultraštrukturálnu konfiguráciu membrán a akrozómu hlavičky spermie.

183 Materiál a metódy Čerstvé baranie semeno nariedené riedidlom Biladyl, sme rozdelili do piatich skupín: 1. skupina: nariedené baranie semeno s pridaním implementora IGF-I; 2. skupina: nariedené baranie semeno s pridaním implementora EGF; 3. skupina: nariedené baranie semeno s pridaním implementora kofeín; 4. skupina: nariedené baranie semeno s pridaním implementora glutatión; 5. skupina: kontrolná vzorka bez pridania implementora. Rastové faktory IGF-I a EGF (Sigma) sme dávkovali v množstve 10 ng/ml a kofeín a glutatión v množstve 1 mg/ml suspenzie nariedeného semena. Takto upravené vzorky sme inkubovali po dobu piatich dní v chladničke pri teplote 5 ºC.V 1. a 5. deň sme z jednotlivých skupín odobrali vzorku, ktorú sme inkubovali v termostate vytemperovanom na teplotu 39 ºC. Následne sme v 1. a v 5. deň pre každý sledovaný implementor elektrón-mikroskopicky klasifikovali hlavičky spermií v jednotlivých skupinách do štyroch kategórií. Bolo analyzovaných 300 spermií. Všetky parametre boli štatisticky vyhodnotené Scheffeho testom. Agarové pelety čerstvého baranieho semena boli fixované v 2,5 % glutaraldehyde a 2 % paraformaldehyde v 0.15M kakodylátovom pufri (ph 7,1-7,3) 1 hodinu a premývané v kakodylátovom pufri. Post fixované boli v 1 % OsO 4 v kakodylátovom pufri, premývané v destilovanej vode, odvodnené v acetóne a zaliate do Durcupan ACM (Fluka). Bločky semena boli rezané na polotenké (1-2µm) rezy a farbené toluidínovou modrou. Tenké rezy (strieborné) boli rezané ultramikrotómom LKB (Nova, Švédsko), kontrastované uranylacetátom a citrátom olova a analyzované elektrónovým mikroskopom JEM 100 CX II (Jeol, Japan pri urýchľovacom napätí 80 kv. Hlavičky spermií boli klasifikované do štyroch kategórií (1-4). Kategória 1 obsahuje spermie s intaktnou cytoplazmatickou membránou hlavičky a intaktným akrozómom. Spermie kategórie 2 majú cytoplazmatickú membránu zvlnenú, prasknutú, alebo im úplne chýba. Spermie kategórie 3 majú napučaný a porušený akrozóm. Kategória 4 predstavuje spermie s akrozómovou reakciou, vytvorenými vezikulami a stratou akrozómovej hmoty. Výsledky a diskusia Test kapacitácie spermií inkubovaných v prítomnosti rozličných implementorov ukázal, že vplyvom pôsobenia rastových faktorov (IGF-I a EGF) bol zvýšený výskyt spermií v kategórii 1 (Graf 1), zatiaľ čo IGF-I preukazne znížil percento spermií kategórie 3 (Graf 3). Rastové faktory znižovali výskyt spermií kategórie 2 (Graf 2) v posledný deň testovania

184 a preukázali len mierny vplyv na percentuálny výskyt kategórie 4 (Graf 4). Glutatión neovplyvňoval výskyt spermií v kategórii 1 a kategórii 2. Preukazne však znižoval percento spermií kategórie 3. Kofeín neovplyvňoval výskyt spermií v kategórii 1 a znižoval výskyt spermií kategórie 2, ako na začiatku, tak i na konci testovania. Naopak, kofeín zvyšoval percentuálny výskyt spermií kategórie 3 a jeho pridaním bolo zaznamenané najväčšie zvýšenie percentuálneho výskytu v kategórii 4. Inkubácia spermií v štandardných podmienkach (kontrolná skupina) mierne znižovala výskyt spermií kategórie 2, a naopak zvyšovala výskyt spermií kategórie 3, zatiaľ čo ostatné kategórie neboli významne ovplyvnené. Spermie zaradené do prvých dvoch kategórií by mali mať vyššiu oplodňovaciu schopnosť v porovnaní so spermiami kategórií 3 a 4, v ktorých už došlo k poškodeniu cytoplazmatickej a akrozómovej membrány. Naše výsledky ukázali, že pridané implementory (IGF-I a EGF) do semena baranov, najviac zvyšovali výskyt spermií kategórie 1a udržiavali membrány spermií nepoškodené, čo môže rezultovať vyššou fertilizačnou kapacitou, ako zistili Vickers a kol. (1999), Champion a kol. (2002) a Matejašáková a kol. (2005). Naopak, kofeín bol implementorom, ktorý neovplyvňoval výskyt spermií kategórie 1, ale zvyšoval výskyt spermií v dvoch vyšších kategóriách (3 a 4), v ktorých indukoval akrozómovú reakciu. Implementor glutatión preukázal len mierny vplyv na kapacitáciu spermií. % * * 1. kategória - intaktná plazm atická m em brána a intaktný 25 akrozóm 20 CAF - kofeín GLU - glutatión k - kontrola 15 S - štartová hodnota 10 (1.d e ň ) E - koncová 5 hodnota (5.d e ň ) 0 IG F -I S IG F -I E E G F S E G F E C A F S C A F E G L U S G L U E k S k E * P < 0, 05 Graf 1: Test kapacitácie porovnanie vplyvu implementorov v rámci kategórie 1

185 % * * * * IGF-I S IGF-I E EGF S EGF E CAF S CAF E GLU S GLU E k S k E 2.kategória - plaz matic ká membrána hlavičk y je z v lnená, prasknutá alebo chýba CAF - kofeín GLU - glutatión k - kontrola S - štartová hodnota (1.deň) E - koncová hodnota (5. deň) * P<0,05 Graf 2: Test kapacitácie porovnanie vplyvu implementorov v rámci kategórie % * * * 3.kategória - porušený akrozóm, napučiavanie, strata hmoty CAF-kofeín GLU - glutatión k - kontrola S - štartová hodnota (1.deň) E - koncová hodnota (5. deň) * P<0, IGF-I S IGF-I E EGF S EGF E CAF S CAF E GLUS GLUE k S k E Graf 3: Test kapacitácie - porovnanie vplyvu implementorov v rámci kategórie 3 40 % 35 * 4.kategória - akrozómová reakcia - vezikuly * CAF- kofeín GLU - glutatión k - kontrola S - štartová hodnota (1.deň) E - koncová hodnota (5. deň) * P<0, * * * IGF-I S IGF-I E EGF S EGF E CAF S CAF E GLU S GLU E k S k E Graf 4: Test kapacitácie - porovnanie vplyvu implementorov v rámci kategórie 4

186 Záver Rastové faktory IGF-I, EGF a glutatión pridávané ako implementory do inseminačnej dávky, môžu zvyšovať stabilitu membrán spermií a udržiavať ich funkčný stav i oplodňovaciu schopnosť. Kofeín zvyšuje pohyblivosť spermií, ale vo zvýšenej miere spôsobuje napučiavanie akrozómu a vezikuláciu membrán. Literatúra Earl, C.R., Kellay, J., Rower, J., and Armstrong, D.T.: Glutathione tre atment of bovine sperm enhances in vitro blastocyst production rates. Theriogenology 47:255 abstract, Champion, Z.J., Vickers, M.H., Gravance, C.G., Breier, B.H., Casay, P.J.. Growth hormone or insulin-like growth factor I extends longevity of equine spermatozoa in vitro. Theriogenology 15:57 (7), , Tatham, B.G., Feehan, T., Pashen, R.: Buffalo and cattle hybrid embryo development is decreased by caffeine treatment during in vitro fertilization. Theriogenology 59, 2003, Vickers, M.H., Casey, P.J., Champion, Z.J., Gravance, C.G., Breier, B.H.: IGF-I treatment increases mobility and improves morphology of immature spermatozoa in the GH deficient dwarf (dw/dw) rat. Growth & IGF Research 9, 1999, Matejašáková, E., Pivko, J., Riha, Ľ.,Makarevič, A.V., Sirotkin, A.V.: Vplyv vybraných rastových faktorov na aktivitu semena baranov. Košice, Zibrín, M., Tomajková, E., Černajová, M.: Bunková membrána spermií teória a praktické dôsledky. Zborník referátov 1995.

187 KORTIZOL, MALONDIALDEHYD (TBARS) A ANTIOXIDAČNÁ KAPACITA PLAZMY U DOJNÍC VYSTAVENÝCH OPERAČNÉMU STRESU THE INFLUENCE OF SURGICAL STRESS ON THE CORTISOL, MALONDIALDEHYDE, AND PLASMA ANTIOXIDATIVE CAPACITY IN DAIRY COWS 1 Mudroň P., 2 Rehage J. 1 2 nd Clinical Department of Internal Diseases, The University of Veterinary Medicine, Kosice, The Slovak Republic 2 Clinic for Cattle, School of Veterinary Medicine, Hanover, Germany Abstract The present investigation was undertaken to study the effects of surgical stress on thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) and ferric reducing ability of plasma (FRAP) in dairy cows. Ten Holstein- Frisian dairy cows, mean age 5.26 years, admitted for treatment of left abomasal displacement (omentopexy), were used in our study. Blood samples were drawn from the jugular vein prior to surgery, immediately and then 15, 30, 60, 90 minutes, and 2, 5, 10, and 24 hours after reposition of abomasum. Surgical stress resulted in a significant increase in plasma cortisol concentrations within five hours of surgery (p<0.05). Similarly, surgery transiently enhanced the plasma levels of TBARS (p<0.05). In contrast, antioxidative capacity (FRAP) showed a tendency for slight decline during surgery, followed by steady rise to the pre-surgical values. In conclusion, these data extend existing knowledge by indicating that stress reaction caused by surgical correction of left displacement of abomasum is associated with a transient increase in lipid peroxidation. Úvod Adaptačné reakcie alebo stresové reakcie predstavujú modifikáciu prebiehajúcich fyziologických mechanizmov, ktoré umožňujú zvieraťu odpovedať na stresové stimuly s minimálnym narušením ich homeostázy. Aj keď stresové reakcie sú spúšťané za účelom ochrany homeostázy, obsahujú prvky, ktoré môžu buď zvýšiť alebo znížiť náchylnosť na patologický proces; v mnohých prípadoch však samotná stresová reakcia môže navodiť patologickú zmenu (Breazile, 1988). Stresová odpoveď môže zahŕňať zmeny v príjme krmiva, hypertenziu, narušenie reprodukčných funkcií, narušenú konvrziu živín, tvorbu žalúdočných a duodenálnych vredov, elektrolytovú dysbalanciu a útlm imunity (Alams and Dobson,

188 1986). Hlavné zmeny počas stresovej reakcie súvisia so zvýšenou sekréciou glukokortikoidov a zvýšenou aktivitou sympatikového nervového systému. Vo viacerých štúdiách sa ukázalo, že stresová reakcia má stimulačný účinok na tvorbu voľných radikálov, čím môže navodiť zvýšenú lipoperoxidáciu u zvierat (Kreinhoff et al., 1990), čo je možné monitorovať pomocou stanovenia produktov lipoperoxidácie a antioxidačného stavu organizmu. Biologické systémy obsahujú účinné enzymatické (glutatiónperoxidáza, kataláza, superoxiddismutáza) a neenzymatické (tokoferoly, β-karotén, k. askorbová a glutatión) antioxidačné systémy, ktoré ochraňujú organické zlúčeniny proti škodlivým účinkom voľných radikálov. Nedostatok antioxidantov môže vyústiť do rôznych patologických procesov, ako sú myopatia, kardiomyopatia, embryonálna degenerácia, pečňová nekróza a encefalomalácia (Machlin, 1991). Zvýšná hladina kortizolu a tým aj streová reakcia boli potvrdené u dojníc pri takých zákrokoch a manipuláciách, ako sú transport (Locatelli et al., 1989), odopieranie krmiva (Fürll et al., 1993), terapeutické zásahy (Nakao et al., 1994) a operácie (Fisher et al., 2001; Sylvester et al., 1998). Predkladá práca bola uskutočnená za účelom štúdia účinku operačného stresu na hladiny malondialdehydu a úroveň antioxidačnej kapacity u dojníc. Materiály a metódy Ako pokusné zvieratá boli použité dojnice (n=10), nemeckého čiernostrakatého plemena, postihnuté ľavostrannou dislokáciou slezu. Chirurgická repozícia bola robená metódou omentopexie z pravej strany (laparotómia). Prípravný čas na operáciu, vrátane lokálnej anestézie, trval v priemere minút a operačný zákrok spravidla nepresiahol 40 minút. Krv pre laboratórne analýzy bola odoberaná desaťkrát z vena jugularis v nasledovných intervaloch: pred prípravou na operáciu, bezprostredne po operácii, 15, 30, 60, 90 minút, 2, 5, 10 a 24 hodín po repozícii. Hladiny kortizolu boli stanovené rádioimunologicky (Coat - A - Count [125I]; Diagnostic Products Cooperation, L.A., USA). Intenzita lipoperoxidácie bola meraná v plazme fluorometricky testom na reaktívne substancie kyseliny tiobarbiturovej (Uchiyama and Mihara, 1978). Celková antioxidačná kapacita plazmy bola stanovená modifilovanou FRAP metódou (Benzie and Strain, 1996). Štatistické vyhodnotenie bolo vykonané pomocou jednorozmernej analýzy rozptylu (ANOVA). Výsledky a diskusia Chirurgický stres mal za následok významné zmeny v hladinách plazmatického kortizolu dojníc (p<0.05). Njavyššie hodnoty boli

189 zaznamenané v priebehu prvej hodiny po repozícii slezu a boli približne 5x vyššie ako pred zákrokom. Návrat k hodnotám pod východzími nastal už 10 hodín po repozícii (Tab.). Podobná dynamika kortizolu bola u hovädzieho dobytka zaznamená pri cisárskom reze ((Janowski et al., 1983) a pri amputačnom odrohovaní (Sylvester et al., 1998). Hladiny pred a po 10 hodinách po operáciii zodpovedali bazálnym hodnotám nameraným u dojníc a inými autormi (Madej, 1992, Hopster et al. 1999). Tabuľka. Palzmatické hladiny kortizolu, malondialdehydu a antioxidačnej kapacity plazmy (FRAP) u dojníc (n=10) vystavených operačnému stresu (mean±sd). KORTIZ OL (µg/l) Malondialdehyd (µmol/l) FRAP (µmol/l) 6.21± ± ±57 Pred operáciou Bezprostredne po AR 14.0± ± ±54 15 min. po AR 32.4± ± ±56 30 min. po AR 30.8± ± ±51 60 min. po AR 25.1± ± ±45 90 min. po AR 17.3± ± ±42 2 hodiny po AR 16.8± ± ±52 5 hodín po AR 8.79± ± ±51 10 hodín po AR 4.18± ± ±66 24 hodín po AR 3.92± ± ±58 ANOVA P<0.05 P<0.05 p>0.05 AR abomazálna repozícia Ukázalo sa, že operačný zákrok mal signifikantný účinok na plazmatické hladiny malondialdehydu, ktorý dosiahol maximálnu hodnotu medzi 1. a 2. hodinou po repozícii. Štyri hodiny po repozícii sa hladiny vrátili na predoperačnú úroveň. Podobné zmeny malondialdehydu bolo možné pozorovať bezprostredne po tréningovej záťaži u testovaných mužov (Ramel et al., 2004). Úroveň lipoperoxidácie nezávisí len od zvýšenej tvorby voľných radikálov, ale ju môže výrazne ovplyvniť aj kapacita antioxidačnej ochrany. Je známe, že vyššie hladiny nutričných antioxidantov, vrátane tokoferolov, β-karoténu a k. askorbovej môžu účinne znižovať intenzitu lipoperoxidácie (Sokol et al., 1993). Karsai and Gaál

190 (1987) referovali o postpartálnom poklese malondialdehydu u dojníc, čo dávali do súvislosti so zvýšenou hladinou vitamínu E v plazme. V experimente sme nezistili žiadne signifikantné zmeny v antioxidačnej kapacite plazmy. Metóda FRAP je z hľadiska realizácie rýchla a jednoduchá a môže poskytnúť základné informácie o antioxidačnom stave zvieraťa. Na celkovej redukčnej kapacite plazmy sa sa jednotlivé zložky podieľajú nasledovne: k. askorbová 15%, α-tokoferol 5%, k. močová 60%, bilirubín 5%, albumín 5%, bielkoviny 10% a iné 5% (Benzie and Strain, 1996). Záver Výsledky práce poukazujú na zvýšenú lipoperoxidačnú záťaž dojníc vystavených operačnému stresu. Nakoľko však ide o krátkodobý jav, otázka možných preventivných opatrení ostáva otvorená. Literatúra Alams, M. G. S. and Dobson, H. (1986): Vet. Rec. 118, Benzie I. F. F., Strain J. J. (1996): Anal Biochemistry, 239, Breazile, J. E. (1988): Veter. Clin. N. Amer. Fd. Anim. Pract. 4, Fisher, A. D., Knight, T. W., Cosgrove, G. P., Death, A. F., Anderson, C.B., Duganzich, D. M., Matthews, L. R. (2001): Aust. Vet. J. 79, Fürll, M., Kirbach, H., Knobloch, B. (1993): Tier rztl. Prax., 21, Hopster, H., Van der Werf, J. T. N., Erkens, J. H. F. and Blokhuis, H. J. (1999): J. Anim. Sci. 77, Janowski, T., Grunert, E., Zaremba, W. (1983): Zuchthygiene (BERL.)18, Karsai F., Gaál T. (1987): Deutsch. tieräztl. Wochenschr., 94, Kreinhoff, U., Elmadfa, I., Salomon, F., Weidler, B. (1990): Infusionstherapie 17, Locatelli, A., Sartorelli, P., Agnes, F., Bondiolotti, G. P., Picotti, G. B. (1989): Br. Vet. J., 145, Madej, A., Oyedipe, E. O., Edqvist, L.-E., Kindahl, H. (1992): Acta Vet. Scand., 33, Machlin L. J. (1991): Marcel Dekker, Inc., New York and Basel Nakao, T., Sato, T., Moriyoshi, M., Kawata, K. (1994): J. Vet. Med. A 41, Ramel, A., Wagner, K. H., Elmadfa, I. (2004): Eur. J. Nutr., 43, 2 6. Sokol R. J., Deveroux M., Khandwala R., O'Brien K. (1993): Hepatology, 17, Sylvester, S. P., Stafford, K. J., Mellor, D. J., Bruce, R. A., Ward, R. N. (1998): Aust. Vet. J. 76, Uchiyama M., Mihara M. (1978): Anal. Biochem., 86,

191 ÚČINOK KADMIA NA VYBRANÉ PARAMETRE BUNKOVEJ IMUNITY U HYDINY EFFECT OF CADMIUM ON SELECTED PARAMETERS OF CELL IMMUNITY OF POULTRY Naď P., Pistl J.*, Skalická M., Koréneková, B. Katedra výživy, dietetiky a chovu zvierat, Ustav mikrobiológie a imunológie*, Univerzita veterinárskeho lekárstva, Košice Abstract The individual influence of Cd and in interaction with Zn and Se was observed on cell immunity of Japanese quail. Quails (n=70) were divided into 7 groups with 10 animals per group. Group K was the control group. In the group Cd1 cadmium was administered in dose 0,12 mg/day/animal. Group Cd2 - cadmium was administered in dose 0,24 mg/day/animal. In Se group selenium was administered daily in dose mg for one quail. In Zn group zinc was administered in dose 4,0 mg/day/quail. The group Cd+Zn combination of zinc and cadmium and the group Cd+Se combination of selenium and cadmium were added. In conclusion, we recorded important immuno-depresive effect of Cd as well as protective effect of Zn against negative influence of Cd. In our work we observed protective effect of increased dose of Se, however in lower level in comparison to protective effect of Zn. Úvod Medzi najvýznamnejšie anorganické polutanty životného prostredia patria olovo, kadmium, ortuť a arzén. K ich vstupu do potravinového reťazca prispieva celý rad antropogenných i naturálnych zdrojov. Prienik kadmia do potravinového reťazca vo veľkej miere závisí od jeho koncentrácie v pôde a dostupnosti rastlinám. Pravidelný, aj keď nie vysoký, príjem kadmia potravou je považovaný za rizikový, pre jeho kumuláciu v cieľových orgánoch a tkanivách. Z tohto pohľadu je nevyhnutné hľadať spôsoby a postupy pre obmedzovanie migrácie kadmia v prostredí a metódy eliminácie neho negatívneho účinku na živý organizmus. Jedným z významných antagonistov kadmia je zinok. Zinok je súčasťou mnohých metalo enzýmov a ovplyvňuje viaceré systémy organizmu, obzvlášť reprodukčný aparát a imunitný systém. Prvkom, ktorý výrazne ovplyvňuje odolnosť a zdravie ľudí i zvierat, je selén. Významne sa podieľa na znižovaní výskytu kardiovaskulárnych a nádorových ochorení odbúravaním voľných radikálov. V rámci Slovenska je výskyt selénu pomerne nízky v pôdach a tým následne aj v rastlinách, obilí, zvieratách a ďalších článkoch

192 potravového reťazca. Príjem selénu v našej populácií sa pohybuje v rozmedzí ug/deň, čo je nízke v porovnaní s odporúčaným príjmom 1 ug/deň na kilogram hmotnosti u ľudí (Maďarič, 1997). Cieľom riešenia bolo sledovanie vplyvu kadmia na zdravie a jednotlivé systémy organizmu u hydiny, s dôrazom na imunitný systém, a eliminovanie jeho negatívneho účinku interakciou s vybranými esenciálnymi prvkami - zinkom a selénom. Materiály a metódy V experimente boli použité japonské prepelice vo veku 3 týždňov. Po týždňovej aklimatizácií v experimentálnych priestoroch boli rozdelené do skupín. Kontrolná skupina (K) kŕmená klasickou kŕmnou zmesou bez prídavkov, skupina (Cd 1) s prídavkom kadmia v dávke predstavujúcej 6 násobok prípustného limitu v kŕmnej zmesi (KZ), skupina (Cd2) s prídavkom kadmia v dávke predstavujúcej 12 násobok limitu Cd v KZ, skupina (Zn) s prídavkom zinku v dávke rovnajúcej sa 2 násobku doporučeného obsahu v KZ, skupina (Se) s prídavkom selénu v dávke rovnajúcej sa 2 násobku doporučeného obsahu v KZ a skupiny s prídavkom kadmium + zinok (Cd+Zn) a kadmium + selén (Cd+Se). Prepelice boli kŕmené kŕmnou zmesou HYD 06 a od začiatku znášky kŕmnou zmesou HYD 10. Kadmium vo forme chloridu kademnatého, zinok ako síran zinočnatý a selén ako seleničitán sodný, boli vo vodnom roztoku podávané pri rannom napájaní v malom objeme vody. Odber vzoriek krvi bol vykonaný na 37., 58. a 118. deň od začiatku podávania prípravkov. Pre analýzu imunologických parametrov boli zvolené testy hodnotiace funkčnú aktivitu fagocytárnych buniek (metabolická aktivita fagocytov) a lymfocytov (polyklónová aktivácia lymfocytov). Metabolická aktivita fagocytov bola hodnotená na základe tetrazolium reduktázovej aktivity buniek počas fagocytózy(goldová a kol., 2001). Suspenzia leukocytov ( ml -1 ) bola rozdelená na 2 časti a inkubovaná pri 40 o C 45 min. Jedna časť suspenzie heterofilov bola inkubovaná so škrobom (1% suspenzia Amylum oryzae vo fosfátovom pufri) a druhá časť bunkovej suspenzie bola inkubovaná za rovnakých podmienok, ale bez škrobu. Všetky suspenzie buniek obsahovali 0,1 % INT (3/4 iodofenyl 2- /4-nitrofenyl/-5-fenyl/-tetrazolium chlorid, Lachema, Brno). Po inkubácii a lýze buniek metanolom, obsah formazanu bol stanovený spektrofotometricky pri 485 nm. Výsledky boli vyjadrené vo forme indexu metabolickej aktivity heterofilov na základe pomeru priemernej optickej denzity (OD 485 ) leukocytárnych suspenzií so škrobom (aktuálne fagocytujúce bunky zvýšený metabolizmus) k OD 485 leukocytárnych suspenzií bez škrobu (fagocyty bez záťaže základný metabolizmus).

193 Agarózový MIT bol vykonaný podľa Bendixena a kol. (1976) a bol použitý na hodnotenie polyklónovej aktivácie lymfocytov. Leukocytárne suspenzie ( ml -1 ) v kultivačnom médiu boli rozdelené na dve časti. K jednej časti bunkovej suspenzie bol pridaný mitogén (fytohemaglutinín, PHA, Sigma, Nemecko) v dávke 20 µg.ml -1 s následnou inkubáciou (40 o C, 1 h), druhá časť bunkovej suspenzie bola inkubovaná len s kultivačným médiom bez mitogénu, pre hodnotenie spontánnej migrácie leukocytov. Po uvedenej dobe boli jednotlivé leukocytárne suspenzie aplikované do piatich jamiek v 0,8% agaróze s obsahom RPMI, 10 % fetálneho bovinného séra, 100 µg.ml -1 streptomycínu a 100 IU.ml -1 penicilínu a inkubované pri 40 o C, 24 h v 5% atmosfére CO 2. Priemer migračných zón leukocytov bol meraný po zväčšení kolmo na seba a výsledky boli vyjadrené ako migračný index. Výsledky analýz boli štatisticky spracované t-testom. Výsledky a diskusia V experimente bol sledovaný účinok dvoch dávok kadmia samostatne, i v kombinácií so zinkom a selénom na prepelice. Sledované hodnoty metabolickej aktivity fagocytov a mobility leukocytov v krvi utratených zvierat, na konci experimentu, sú uvedené v tabuľke č. 1. Tabuľka č. 1 K Cd1 Cd2 Zn Se Cd+Zn Cd+Se min. 2,56 2,08 2,05 2,57 2,76 2,67 2,29 IMAF max. 3,36 2,63 2,55 3,33 3,61 3,13 2,76 x 2,99 2,32 2,23 3,02 3,14 2,79 2,56 SD 0,239 0,127 0,135 0,246 0,261 0,178 0,125 min. 0,39 0,63 0,55 0,42 0,48 0,61 0,58 IML max. 0,84 0,88 0,85 0,75 0,64 0,75 0,77 x 0,62 0,76 0,71 0,58 0,55 0,69 0,68 SD 0,122 0,068 0,085 0,075 0,048 0,066 0,095 IMAF index metabolickej aktivity fagocytov, IML index migrácie leukocytov Najvyššie priemerné hodnoty IMAF sme zistili v skupine prijímajúcej selén (3,14), zinok (3,02) a v kontrolnej skupine (2,99). Najnižšia hodnota (2,23) bola v skupine s prídavkom kadmia vo vyššej koncentrácií. Štatisticky významne rozdiely na hladine významnosti P>0,001 boli medzi kontrolnou skupinou a skupinami Cd1, Cd2 a CdSe, medzi skupinou Cd1 a skupinami Zn, Se a CdZn, medzi Cd2 a Zn, Se a CdZn. Hladinu významnosti P>0,01 sme zistili medzi skupinami K : CdSe, Cd2 : CdSe, Se : CdSe a Zn : CdSe. Významný rozdiel na hladine P>0,05 bol medzi skupinou Cd1 : CdSe. Z týchto zistení je výrazne preukázaný negatívny

194 účinok kadmia, v nižšej i vyššej dávke, na aktivitu leukocytov a výraznejší protektívny účinok zinku než u selénu. Index migrácie leukocytov bol štatistický významne nižší (P>0,01) medzi skupinami Zn:Cd1, CdZn:Se a Cd2:Se. Na hladine významnosti P>0,05 medzi skupinami K:Cd1, Zn:Cd2. Medzi ostatnými skupinami neboli zistené štatisticky významné rozdiely. Sledovaním vplyvu kadmia na imunitný systém a ovplyvňovanie jeho účinku zinkom, sa zaoberali Vasilyeva a kol.. Zistili, že v nízkych dávkach Cd stimuluje imunitný systém, vyššie koncentrácie pôsobia imunodepresívne. Ujamik a kol. sledovali vplyv rôznych dávok kadmia na vybrané biochemické parametre, pričom negatívny účinok zistili až pri vysokých dávkach (100mg/kg ž.h.). Záver Pri sledovaní účinku kadmia na vybrané ukazovatele bunkovej imunity u japonských prepelíc, bol preukázaný jeho výrazný immunodepresivný účinok a vysoký protektívny vplyv zvýšených dávok zinku proti negatívnemu pôsobeniu Cd a taktiež ochranný účinok zvýšenej dávky selénu, na nižšej úrovni v porovnaní s účinkom zinku. Literatúra 11. BENDIXEN, G., BENTZEN, K., CLAUSEN, J. E., et al. (1976): Inhibition of human leucocyte migration. In Natvig, eds. Lymphocytes. Isolation, Fractionation and Characterization. Scand. I. Immunol., Suppl. 5, Universitetsforlaget, Nyegaard, Oslo, pp GOLDOVÁ M., REVAJOVÁ V., PISTL J., LETKOVÁ V., LEVKUT M., WAGSHAL G., CSIZSMÁROVÁ G., LOÓSZOVÁ A.: Eimeria colchici and immunocompetent cells in specific and nonspecific hosts. Acta Parasitologica 46, 2001, UYANIK, F. EREN, M. - ATASEVER, A. TUNOKU, G. KOLSUZ, H.: Changes in some biochemical parameters and organs of broilers exposed to cadmium and effect of zincon cadmium induced alteration, Izrael Vet. Med. Asotiation, 56, (4), VASILYEVA,C., BERZINA,H., REMEZ, I.: Complex of methods for the estimation of Cd and Zn action on chicken immunity methods of esti-mation of chicken immunity. Baltic J. Lab. Anim. Sci.,11,2001: Práca vznikla za podpory SP27/028 EO 02/028 OE 02

195 POROVNANIE KINETIKY SÉROVÝCH HLADÍN OXYTETRACYKLÍNU U OVIEC PO PRÍPRAVKOCH S PREDĹŽENÝM ÚČINKOM A ICH ZNÁŠANLIVOSŤ A COMPARISON OF THE SERUM LEVEL KINETIC OF OXYTETRACYCLINE AFTER LONG ACTION PREPARATIONS IN SHEEP AND THEIR TOLERANCE Neuschl, J., J Nagy, Sokol, J.,, Šály, J. University of Veterinary Medicine, Košice, Slovak Republic [email protected] Abstrakt Blood serum concentrations and biological half-life of oxytetracycline after long action preparations were investigated in adult sheep of the Slovak merino breed. Contemporarily their local tolerance has also been observed. In the first group oxytetracycline was administered in the form of preparation Tetravet 20% L. A. inj. a.u.v. and in the second group in form of preparations Engemycin 10% L.A. inj. a.u.v. Oxytetracycline was administered intramuscularly at a single dose of 20 mg per kg of b.w. The blood serum concentrations of oxytetracycline were studied in the intervals of 1st, 6th, 24th hours and 2nd, 3rd, 4th, 5th, 6th, 7th and 8th days after single administration of preparations. Intoduction The advantages of tetracycline preparations with protracted effect (long action - L.A.) against classical ones are in general known. The advantages of preparations with protracted effect (long action - L.A.) come from changed pharmacokinetics of tetracycline antibiotic as a result of usage of viscous vehicle on the basis of modern polymers or other adjuvant substances. Not only pharmacokinetic parameters, but also irritability, oedema, or possible occurence of necrotic changes in site of i.m. application of L.A. preparations may be influenced by the type of solvent. Concentration of preparations also plays an important role. Tetravet 20% L.A. inj. and Engemycin 10 % L.A. inj. often used in practice are on the basis of oxytetracycline. The first one contains vehicle dimethylacetamide and Engemycine 10 % L.A. polyvinyl-pyrrolidone. On the basis of above mentioned we started to compare kinetics of serum levels of oxytetracycline and biological half-life in sheep after one application of mentioned long action preparations: Tetravet 20 % L.A. inj. and Engemycin 10 % L.A. inj. The aim of the work was to judge local reaction in the site of application and tolerance of the medications.

196 Material and methods The experiment was realized with set of 8 adult sheep, breed Slovak merino weighing kg. Experimental set was divided into two groups. In the first group oxytetracycline was administered in the form of Tetravet 20% L.A. inj. a.u.v. (Sanofi Ltd., France). In the second group oxytetracycline was administered in the preparation form of Engemycin 10% L.A. inj. a.u.v. (Intervet Ltd., Holland). Oxytetracycline was administered to animals in a single dose of 20 mg.kg -1 of b.w. i.m. Concentrations of oxytetracycline in blood serum was observed at 1, 6 and 24 hour, then on day 2, 3, 4, 5, 6, 7 and 8 after application of preparations. Oxytetracycline was determined on the liquid chromatograph of Hewlett Packard firm (Avondale, PA, USA) serie 1050, at wave length 360 nm with sensitivity 0,05 µg/ml. Oxytetracycline was determined by Sokol and Matisová (1994). Concentration of oxytetracycline we stated in µg/ml. Constants of elimination were calculated using a method of the smallest squares according to one-compartment pharmacokinetic model. Constants of elimination from serum levels were counted from decreasing curve from interval 1 up to 120 hours. Biological half - life was calculated like this: mean constant of elimination 1n 2. Statistical evaluation was provided by Student t-test. Local reaction in the site of drug application was evaluated according to painful reaction of animals for palpation, presence of oedema and increased local temperature. Tolerance of preparations was evaluated according to general behaviour of animals, food reception and droppings consistence. Results Fig. 1 demonstrate dynamics of changes of oxytetracycline serum levels in sheep after a single Tetravet 20 % L.A. inj. and Engemycin 10 % L.A. inj. application. It is seen from figures that there are differences in serum levels hight (quantitative differences), but dynamics of level changes in individual observed time periods is substantially the same. In the first observed time interval (first hour) we notice unimportant higher concentrations of oxytetracycline (3.34 µg/ml) after Engemycin application compared to Tetravet (3.09 µg/ml). In all other time intervals we observe on the contrary higher concentrations after Tetravet application. These differences are not statistically significant in 6th hour, but in 24th hour and on day 2, 3, 4, and 5 of observing they are statistically significantly higher (p < 0,05) after Tetravet application compared to Engemycin. Maximum serum concentrations are recorded in 6th hour after application of both preparations. In this time interval the level of oxytetracycline is after Tetravet application 5.52 and 5.28µg/ml after

197 Engemycin application. Therapeutic concentrations of oxytetracycline (MIC above 0.5 µg/ml) are still recorded on day 4 after Tetravet (0.63 µg/ml) and on day 3 after Engemycin (0.60µg/ml) application. Measurable concentrations after Tetravet application were still perceivable on day 6 (0.06µg/ml ) and after Engemycin application on day 5 (0.26 µg/ml). Changes in general behaviour, food intake and changes in droppings consistence we have not registered after any preparation. We recorded painful reaction for palpation and raised temperature in the site of puncture in all animals one hour after application of Engemycin. Significant warm oedema was gradually developed in two of animals and it persisted for 3 days. We did not record any local changes at the site of puncture in three animals but short-time hyperaesthesia for palpation (within 12 hours) was registered in one sheep after Tetravet application. 7 µg/ml MIC 0,5 0 x x x x x x = p < I. Blood serum concentrations of oxytetracycline in sheep after simple administration of preparations Tetravet 20% L.A. inj. and Engemycin 10% L.A. inj. Tetravet Engemycin h Discussion It results from our comparative studies that there are quantitative differences in serum levels of oxytetracycline between Tetravet L.A. and Engemycin L.A., but dynamics of level changes in individual observed time periods is in substance the same. In the first observed time interval (first hour) we recorded nonsignificantly higher oxytetracycline concentration (3.34 µg/ml) after Engemycin against levels after Tetravet application

198 (3.09µg/ml). In all other time intervals we on contrary recorded higher concentrations after Tetravet. In 6th hour the differences were statistically nonsignificant while in 24th hour and on the day 2, 3, 4, and 5 of observing they were statistically significantly higher (p< 0,005) after Tetravet application compared to Engemycin. The highest levels after application of both preparations were recorded in 6 th hour. In this time interval measured oxytetracycline level after Tetravet application was 5.52 and after Engemycin 5.28 µg/mltherapeutic concentrations after Tetravet application were still recorded on 4th day (0.63 µg/ml) and after Engemycin on 3rd day (0.60 µg/ml). Measurable concentrations were perceivable still on the day 6 after Tetravet and on the day 5 after Engemycin application. Different course of serum levels accord with different level of other pharmacokinetic index biologic al half-life. It is hours in Tetravet and hours in Engemycin. No general side reactions were not observed after using tested preparations and they ere very well tolerated. In local irritability we recorded differences between preparations. Tetravet did not cause any reactions in the site of puncture, while Engemycin induced inflammatory oedema persisting for 3 days without other complications in 50 % of animals. Our findings suggest that Tetravet L.A. appears more beneficial in observed pharmacokinetic parameters as well as in tolerance compared to Engemycin L.A. It was proved that after Tetravet L.A. application oxyteracycline serum concentrations (p < 0.05) in all observed time intervals, except in 1st and 6th hours, were statistically significantly higher compared to Engemycin L.A. References Sokol, J., Matisová, E. (1994): J. Chromatogr. A, 669, Acknowledgement:This report has been supported by VEGA grant No. 1/0618/03

199 VPLYV SUBAKÚTNYCH DÁVOK SALINOMYCÍNU SODNÉHO NA HMOTNOSTNÉ PRÍRASTKY A ZDRAVOTNÝ STAV KURČIAT THE EFFECT OF THE SUBACUTE DOSES SODIUM SALINOMYCIN ON WEIGHT GAINS AND HEALTH IN CHICKS Neuschl J., Šály J., Korének M., Kremeň J.,Valenčáková,A. Univerzita veterinárskeho lekárstva, Komenského 73, Košice, [email protected] Abstrakt The study presents information about the toxic action of sodium salinomycin in the anticoccidial preparation Synvertas plv. a.u.v. in chicks under the condicions of subacute intoxication. The experiment was carried out in chicks of the meat hybrid Ross of both sexes, 5 weeks old. The first experimental group of chickens (n = 10) was administered sodium salinomycin at a dose of 5.3 mg/kg b.w. (53 mg of the preparation). The second experimental group (n = 10) was treated with sodium salinomycin at a dose of 10.6 mg/kg b.w. (106 mg of the preparation). The preparation was administered daily by a tube into a crop in the form of water suspension (1:5) at early hours for 7 d. The control group consisting of 6 chickens received the same volume of water in the same way as the experimental chickens.we observed the overall health state of chickens and looked for possible clinical symptoms of intoxication and determined live body weight. Key words: sodium salinomycin, subacute dose, chickens Úvod Napriek všetkým opatreniam, jedna z hlavných príčin hromadných strát a nízkych hmotnostných prírastkov hlavne u kurčiat zostáva kokcidióza. Preto účinná prevencia kokcidiózy je jedna zo základných podmienok produkcie brojlerov vo veľkokapacitných prevádzkach. Popri dodržaní zoohygienických zásad prevencie je preventívna aplikácia antikokcidík v krmive pri dodržaní zásad ich aplikácie rozhodujúcim a neodmysliteľným faktorom ochrany proti splanutiu kokcidiózy. V súčasnom období používané ionoforové antikokcidiká medzi ktoré patrí aj salinomycín majú malú terapeutickú šírku a niektoré z nich aj striktnú toxicitu u určitých druhov a niektorých kategórii hydiny. S uvedenou problematikou je úzko spojená problematika možných intoxikácii. V rámci záväznej toxikologickej testácie antikokcidika salinomycínu sodného boli zrealizované jeho toxikologické štúdie u kurčiat

200 v podmienkach akútnej, subakútnej a subchronickej intoxikácie (Neuschl a kol., 2001 a; Neuschl a kol., 2001 b; Šály a kol.,2002). V práci prezentujeme vplyv antikokcidika salinomycínu sodného na celkový zdravotný stav kurčiat so zameraním na hmotnostné prírastky a možné klinické príznaky intoxikácie pri jeho 7 dňovom podávaní v dávkach 1/20 a 1/10 z jeho LD mg/kg ž.hm. Materiál a metódy Pokus bol realizovaný na pokusnom súbore 26-tich kurčiat mäsového hybridu Ross, oboch pohlaví, vo veku 5-týždňov. Pokusný súbor kurčiat bol rozdelený do 2 pokusných skupín s počtom 10 jedincov. Salinomycín sodný vo forme prípravku Synvertas plv. a.u.v. (Biotika, Slovenská Ľupča) sa prvej pokusnej skupine kurčiat aplikoval v dávke 5,3 mg/kg ž.hm. (53 mg prípravku) čo predstavuje 1/20 z LD 50. Druhej pokusnej skupine kurčiat sa aplikoval v dávke 10,6 mg/kg ž.hm. (106 mg prípravku) čo predstavuje 1/10 z LD 50. Prípravok sa v uvedených dávkach aplikoval denne po dobu 7 dní v ranných hodinách vo forme suspenzie s vodou v pomere 1:5 sondou do hrvoľa. Kontrolnej skupine v počte 6 kurčiat sa aplikoval rovnaký objem vody. Kurčatá počas trvania pokusu boli kŕmené kŕmnou zmesou Hyd-03. Ku krmivu a vode mali kurčatá neobmedzený prístup. Možné klinické príznaky intoxikácie boli sledované denne. Kurčatá boli individuálne vážené pred pokusom (0. deň) a na konci experimentu (8. deň). Štatistická preukaznosť výsledkov bola posudzovaná Studentovým t-testom. Výsledky a diskusia Denné podávanie salinomycínu sodného vo forme prípravku Synvertas plv. v dvoch odstupňovaných dávkach 5,3 mg/kg ( 1/20 z LD 50 ). a 10,6 mg/kg ž.hm. (1/10 z LD 50 ) v priebehu 7 dní, nespôsobilo viditeľné klinické zmeny, ktoré by poukázali na poškodenie zdravotného stavu kurčiat. Nárast živej hmotnosti u kontrolných kurčiat počas sledovanej doby pokusu predstavuje 282 ±43 g. Priemerná hmotnosť kurčiat sa zvýšila z g na začiatku pokusu na g na konci pokusu. U prvej pokusnej skupiny (5,3 mg/kg ž.hm.) kurčiat sa priemerná hmotnosť za sledované obdobie zvýšila o 274± 65 g, čo predstavuje oproti kontrole zníženie o 2,84%. Živá hmotnosť u týchto kurčiat sa zvýšila z g na g. U kurčiat druhej pokusnej skupiny ( dávka 10,6 mg/kg ž.hm.) sa priemerná hmotnosť zvýšila o 61,5 ±132 g ( z 1 934,5 g na g) čo je zníženie oproti kontrolnej skupine kurčiat o 78,2% (p < 0,005) a oproti kurčatám prvej pokusnej skupiny o 77,56% (p < 0,005).

201 Skutočnosť, že 7 dňové podávanie salinomycínu sodného v prípravku Synvertas nenavodilo v priebehu experimentu žiadne viditeľné klinické príznaky otravy ani pri vyššej dávke by napovedalo, že salinomycín sodný je kurčatami dobre tolerovaný a mohli by tiež svedčiť, že miera jeho toxicity v testovanom prípravku je pre kurčatá nízka. Avšak zistenie, že dávke 10,6 mg/kg ž. hm. salinomycínu sodného na kg ž. hm. spôsobila na konci pokusu zníženie hmotnostných prírastkov oproti kontrolným kurčatám o 78,20% poukazuje na výraznú rastovú depresiu kurčiat a jednoznačne svedčí, že uvedená dávka pri 7 dňovom podávaní je pre 5-týždňové kurčatá toxická. Pri príjme 80 g kŕmnej zmesi na kus a deň by dávka 10,6 mg(kg ž. hm. salinomycínu sodného v uvedenom množstve kŕmnej zmesi zodpovedal koncentrácii minimálne 132,5 mg/kg krmiva. Z uvedeného vyplýva, že sledovanie hmotnosti a hmotnostných prírastkov je veľmi dôležitým ukazovateľom pri hodnotení toxicity antikokcidík. Pri podávaní nižšej dávky salinomycínu sodného (5,3 mg/kg ž.hm.) sme nezaznamenali jeho depresívny vplyv na hmotnostné prírastky. Táto dávka pri uvedenej spotrebe krmiva (80 g na kus a deň) predstavuje koncentráciu salinomycínu sodného 66,25 mg/kg krmiva, čo je mierne nad hranicou doporučenej koncentrácie. Záver Naše zistenia poukazujú na relatívne nízku mieru toxicity testovaného prípravku a jeho dobrú znášanlivosť pri dodržaní doporučenej koncentrácie salinomycínu sodného (5,3 mg/kg t.j. 66,25 mg/kg krmiva) a výrazný depresívny účinok na hmotnostné prírastky pri prekročení jeho doporučenej koncentrácie (10,6 mg/kg ž.hm. t. j. 132,5 mg/kg krmiva). Literatúra Neuschl, J., Šály, J., Šimko, Š., Magic, D. jr., Ševčíková, Z., Kremeň, J., Nagy, J., Korim, P.: 2001 a: Acute toxicity of sodium salinomycin in Synvertas plv. ad us. vet. preparation in chickens. Bull. Vet. Inst. Pulavy, 45, 2001, 2, pp Neuschl, J., Šály, J., Šimko, Š., Magic, D. jr., Tučková, M., Lenhardt, Ľ., Nagy, J., Kremeň, J.: 2001 b: Subacute toxicity of sodium salinomycin in the anticoccidial preparation Synvertas plv. ad us. vet. in chickens.. Bull. Vet. Inst. Pulavy, 45, 2001, 2, pp Šály, J., Magic, D. jr., Neuschl, J., Šimko, Š., Tučková, M., Ševčíková, Z., Kremeň, J., Šutiak, V.: 2002: Subchronic toxicity to chicks of sodium salinomycin in the preparation Synvertas plv. a. u. v. Folia Veterinaria, 46, 2002, 2, pp Spracovanie príspevku bolo podporené grantom VEGA č.1/0575/03

202 BIOLOGICKÁ DOSTUPNOSŤ CHLORIDU TETRACYKLÍNIA U OVIEC PO APLIKÁCII VUBIVET C PRM.A.U.V. V MLIEKU A VODE BIOLOGICAL AVAILABILITY OF CHLORTETRACYCLINIUM CHLORIDE IN SHEEP AFTER ADMINISTRATION OF VUBIVET C PRM.A.U.V. IN MILK AND WATER Neuschl, J., Nagy, J., Sokol, J., Šály, J. University of Veterinary Medicine, Košice, Slovak Republic [email protected] Abstract The standard chlortetracyclinium chloride biological availability and other pharmacokinetic parameters were abserved in adult sheep of the Slovak merino breed after administration of Vubivet C prm. in milk and in water. Both groups were given chlortetracyclinium chloride in Vubivet C prm. a.u.v. preparation in a single dose of 20 mg/kg b.w. The preparation was administered per os in 2% suspension by probe. Chlortetracyclinium chloride concentrations in blood serum were determined chromatographically after 1, 3, 6, 12 and 24 hour. After Vubivet C prm. administration in milk and water indicated that biological availability of Vubivet C prm. administered in milk is % lower than in water. When the preparation was applied in water the biological half-time of chlortetracyclinium chloride was 8.64 hr and 8.82 hr when applied in milk. Introductions Pharmacokinetic and biopharmaceutic studies have shown that not the dosage but the concentration of a drug in systemic blood and in the biophase, is decisive for a therapeutical effect. When drugs are administered extravascularly, especially orally, a certain amount of the administered dose will never get into the systemic circulation, i.e. their biological availability is not complete. The amount and composition of food, or enteral chyme may slow down not only the disintegration of solid drug forms, so reducing dissolution of effective curative substances in the enteral fluid but may also bind the drug physically or chemically. Significant chemical interaction between tetracycline antibiotics and calcium caseinate, or ions of bi-or trivalent metals resulting in production of very slowly absorbable and antibacterially ineffective chelate complexes is generally known. With this in mind the following captured our attention: in the instruction for administration of premix Vubivet C prm. a.u.v. which contains chlortetracyclinium chloride recommended to administration not

203 only in water or tea but also in milk and milky feed mixture.this stimulated us to start observation of the degree of biological availability and other pharmacokinetic parametres of chlortetracyclinium in sheep after single application of this preparation in water or milk. Material and methods Characteristic of the preparation. Vubivet C prm. a.u.v. is a powdered mixture, brown in colour, with a characteristic smell, contains 3 % of chlortetracyclinium chloride. Experimental group. The experiment was carried out in 8 adult sheep of the Slovak merino breed, weighing kg. The experimental sheep were divided into two groups. Both groups were given chlortetracyclinium chloride in Vubivet C prm. a.u.v. preparation (Biotika, Slovenská Ľupča, Slovakia) in a dose 20 mg/kg of live weight equivalent to 6.66 g of preparation per 10 kg of live weight. The preparation was administered per os as 2 % suspension by probe. Individuals from the first group were given Vubivet C prm. in 333 ml water, the second group in 333 ml milk. Vubivet C prm. administered in water represented a comparison standard. Chlortetracyclinium chloride concentrations in blood serum were observed at 1, 3, 6, 12 and 24 hours after application of the preparation. We determined chlortetracyclinium chloride chromatographically, according to Sokol and Matisová (1994), using a liquid chromatograph Hewlett Packard, Avondale, PA, USA (1050 series), at a wavelength 360 nm with sensitivity 0.05 µg.ml -1. The elimination constants were calculated according to a monocompartmental pharmacokinetic model from the descending curve over an interval 3-24 hours. Biological half-time was calculated as follows: ln 2/ke. The area under the curve (AUC) of chlortetracyclinium chloride was determined by numerical integration of data using the linear trapezium rule. We did not use the transferring data principle. The following parameteres of biological availability were observed: C max, T max and AUC of chlortetracyclinium chloride concentrations. Statistical significance was estimated by Student s t-test. Results At all observed time intervals (1, 3, 6, 12 and 24 hr.) we register higher serum levels of chlortetracyclinium chloride after administration of Vubivet C prm. in water then after administration of the same preparation in milk. Except for 24 hours, the differences between the measured values were statistically significant (p< 0.05). Maximum serum concentrations were recorded in 3 hours after administration of the preparation in water (2.2µg.ml -1 ) as well as in milk (1.72 µg.ml -1 Therapeutic concentrations of

204 chlortetracyclinium chloride (MIC over 0.5 µg.ml -1 ) were recorded even hours after application in both water and milk. The biological half-time of chlortetracyclinium chloride after application of Vubivet C prm. in water was 8.64 hr. and after application in milk 8.82 hr. Discussion We recorded significantly higher serum concentrations (p<0.05) of chlortetracyclinium chloride after adminsitration of Vubivet in water, with the exception at 24 hours. Based on the ratio between the total area under the curve of chlortetracyclinium chloride concentration in the blood serum after Vubivet administration in milk and water biological availability of Vubivet administered in milk was 33.79% lower than in water. The longer biological half-time of chlortetracyclinium chloride after administration of the preparation in milk indicates, at the same time, its slightly delayed enteral resorption. Considering our findings and the fact that average bacteriostatic concentrations for most gram-positive microbes range between µg.ml -1 and for most gram-negatives between µg.ml -1 serum we do not recommend giving Vubivet C prm. in milk not even in a low concentration. The recorded serum levels of chlortetracyclinium chloride after administration of Vubivet C prm. in milk (at 1 hr ; at 3 hr ; at 6 hr ; at 12 hr µg.ml -1 of serum) as compared with the significantly higher (p<0.05) levels after administration of the preparation in water (at 1 hr ; at 3 hr ; at 6 hr ; at 12 hr µg.ml -1 of serum) would most likely guarantee a good therapeutic effect only for susceptible strains. This is supported by the fact that chlortetracycline MIC in very susceptible strains is generally lower than 1µg.ml -1 but in medium susceptible strains it ranges from 1-5 µg.ml -1 of serum. References Sokol, J., Matisová, E. (1994) : Determination of tetracycline antibiotics in animal tissues of food-producing animals by high - performance liquid chromatography using solid-phase extraction. J. Chromat, A., 669, p Acknowledgement:This report has been supported by VEGA grant No.1/0618/03

205 ANTIMIKROSPORIDIÁLNY ÚČINOK ALBENDAZOL U KRÁLIKOV EXPERIMENTÁLNE INFIKOVANÝCH ENCEPHALITOZOON CUNICULI ANTIMICROSPORIDIAL EFFECT OF ALBENDAZOLE IN RABBITS EXPERIMENTALLY INFECTED BY ENCEPHALITOZOON CUNICULI Neuschl, J., Čonková, E.,Čellárová,E., Šály,J. University of Veterinary Medicine, Košice, the Slovak Republic, [email protected] Abstract In adult rabbits of the New Zealand white breed, female sex, development of experimentally induced encephalitozoonosis (Encephalitozoon cuniculi) has been observed after the therapeutic affect by albendazole compared with the positive and negative control groups. The negative control group were not infected by microsporidia. The positive control group were infected by Encephalitozoon cuniculi microsporidia with a single intraperitoneal dose of ml -1.The experimental group after inoculaction with Encephalitozoon cuniculi in the same dose and way as in the positive control group, albendazole was subsequently applied. The experimental group, albendazole was applied in the form of Aldifal 2.5% susp. in a dose 5 mg/kg of b. w. per os with tube. Albendazole has been administered to animals from the experimental group from day 7 after inoculation by Encephalitozoon cuniculi, twice a week for 11 weeks and overall this was applied 21 times. The titre of antibodies was determined by the IFAT method. Key words: Encephalitozoon cuniculi, rabbits, therapy, albendazole Introduction Works concerning the problems of pharmacological studies of Encephalitozoon cuniculi in vitro conditions demonstrate that the drugs examined had a higher or lower antimicrosporidial effect, but that in vivo were not very effective or had a high toxicity. In conditions in vivo albendazole seems to be the most eficacious. Taking all this into account, we present in our work development of encephalitozoonosis in rabbits, experimentally induced with E. cuniculi, after the terapeutic influence of albendazole in comparison with the non-treated-positive control group. Development of encephalitozoonosis degree we assessed on the basis of

206 clinical symptomatology development of the disease in relation to serological prevalence. Materials and methods The experiment was carried out on a group of adult rabbits of the New Zeland white breed, female sex. The experimental complex has been divided into two control and one experimental groups. There were 6 animal in each group. The first control group represented negative control group the animals were not infected by microsporidia. The other control group represented positive control group-the animals were infected with Encephalitozoon cuniculi microsporidia with a single intraperitoneal dose of ml -1. Animals from the experimental group after inoculation with E.cuniculi the same dose and way as in the positive control group albendazole was subsequently applied. Animals from the experimental group albendazole was applied in the form of Aldifal 2.5% susp. a.u.v. preparation in a dose of 5 mg/kg of b.w. per os with tube. Albendazole has been administered from day 7 after inoculation with E. cuniculi twice a week for 11 weeks, and overall this was applied 21 times. The titre of antibodies was determined by the IFAT method. In both positive control and experimental groups, titre of antibodies has been observed on day 0 (before infecting the animals), and after infecting, on experiment day 7, 14, 21, 30, 45, 60, 90 and 120. The titre of antibodies in the negative control group has been observed on day 0, 30 and 120. Body weight was recorded before, in the middle, and at the end of the experiment. Results In fig. 1 we present values of antibody titres in certain intervals in the experimental and control groups. Body weight of rabbits in the experimental, positive and negative control groups is presented in fig. 2

207 1:160 1:128 Experimental group Positive control group Negative control group 1:64 1: ( day ) The average value of the titre of antibodies in the course of encephalitozoonosis in rabbits of the experimental, positive and negative control groups ( kg ) 4,0 Negative control group Positive control group Experimental group 2,82,912,78 2,96 3,12 2,732,57 2,65 2,60 3,0 2,0 1,0 0,0 day 0 day 45 day 78 The body w eight of rabbits in the course of encephalitozoonosis of the experimental, positive and negative control groups

208 Discussion Detected low titre of specific serum antibodies in the treated group corresponded well with the course of the disease. Latent course of the disease lasted until the end of the experiment. From the middle of the experiment, bilateral, or unilateral conjunctivitis and lacrimation were recorded in 50% of animals, furthermore there was a mild temporary tendency to increased hair loss in rabbits, when handled, lasting approx. for 2 weeks. These sings do not show clinical form of the disease. Only some of typical signs of the clinical form of the disease in rabbits, (motor paresis particularly of hind quarters, torticollis, convulsions, tremors, and coma), as described by Innes et al. (1962), Wright and Craighead (1922), were recorded in the non-treated group in 50% of animals. The fact that along with the marked spontaneous alopecia, also central symptoms were registered simultaneously (incoordination of movements, myoclonus in back and scapula areas, or even mild torticollis in 1 rabbit) suggests that the course of the disease proceeded in clinical form. In other 3 animals the disease proceeded in latent form. In the non-treated group statistically insignificant decrease in body weight registered in the middle and at the end of the experiment, compared to initial body weight, or to the weight from the negative control group is directly linked with the degree of disease development. In the treated group, registered mild decrease in body weight has no connection with the disease. We suppose that this registered mild growth depression was induced by oesophagus irritation-long-lasting and relatively frequent peroral intubation. Our result concerning the influence of albendazole on the development of encephalitozoonosis in rabbits indicate its inhibitory effect on the development of the disease, and suggest that it is very well tolerated by rabbits. References Innes, J. R. Zeman, W., Frenkel, J. K., Borner, G. (1962): Ocult endemic encephalitozoonosis of the central nervous system in mice (Swiss-Bagy-O Grady strain) J. Neuropathol. Exp. Neurol., 21, pp Wright, J. H., Craighead, E. M. (1922) : Infectious motor paralysis in young rabbits. J. Exp. Med., 36, pp

209 VPLYV VYBRANÝCH METABOLICKÝCH PARAMETROV V KRVNOM SÉRE DONORIEK KRÁV NA ZISK A KVALITU EMBRYÍ THE INFLUENCE OF METABOLIC PARAMETERS IN BLOOD SERUM OF DONORS COWS IN RELATION TO EFFECT AND QUALITY OF EMBRYOS Novotný F., Macák V., Hajurka J., Valocký I., Černota S. Univerzita veterinárskeho lekárstva, Klinika pôrodníctva, gynekológie a andrológie, Komenského 73, Košice, Slovenská republika Clinic of Obstetrics, Gynaecology and Andrology, The University of Veterinary Medicine in Košice, Komenského 73, Košice Abstract The study focused on observation of influence of serum cholesterol, urea and total protein before and after superovulation on the yield and quality of embryos in donors cows. Positive correlation was found between the level of cholesterol and superovulatory response (r=0.74), production of embryos (r=0.65) and transferable embruos (0.33). Levels of urea were in negative correlation to the superovulatory response (r= -0.32), to flushed embryos (r=-0. 60) and transferable embryos ( r=-0.62). The influence of total proteins in the blood serum of donors cows on effectivity of embryo transfer was not proved in our experiments. Úvod Vyvážený metabolizmus organizmu u donoriek kráv je jednou zo základných požiadaviek pre úspešný priebeh embryotransferu.z veíkého počtu prác zameraných na problematiku embryotransferu je časť orientovaná na sledovanie metabolických ukazovateľov a ich vplyvu na výšku zabrezávania v klasickej reprodukcii (Ferguson,1991; Rajala-Schultz et.al.,2001) ako aj pri porovnávaní produkcie a kvality embryí v závislosti od krmnej dávky donoriek (Blanchard,Ferguson,Love,1990). Cieľom našej práce bolo posúdiť zisk a kvalitu embryí u donoriek v bežných farmových podmienkach chovu dojníc, kŕmených produkčnou krmnou dávkou. Materiál a metodika Do skupiny donoriek u ktorej sme sledovali metabolické ukazovatele sme zaradili 42 kráv plemena Slovenského pinzgauského a ich krížencov. Embryá sme získavali nechirurgickou metódou. Superovulačné ošetrenie sme navodili prípravkom Folicotropin Spofa a. u. v., ktorý sme aplikovali v zostupnej dávke počas 4 dní v 12 hodinových intervaloch.

210 Prvý, druhý deň 80 m. j., tretí, štvrtý deň 40 m. j., v tretí deň bol podaný prostaglandín PGF 2 alfa v dvoch dávkach po 500 µg v 12 hodinových intervaloch. Inseminované boli 3x dvojitou dávkou semena v priebehu dvoch dní. Výplach embryí bol vykonaný na deň po inseminácii, nechirurgickým spôsobom.. Kvalitu superovulačnej reakcie sme zisťovali palpačne a ultrasonograficky podľa počtu žltých teliesok na vaječníkoch. Vyhľadávanie a hodnotenie kvality embryí (získané a prenosuschopné) bolo vykonávané v Petriho miskách stereomikroskopom pri 50 násobnom zvačšení podĺa (Pivko a Grafenau, 1987). Vzorky krvi pre stanovenie cholesterolu, močoviny a celkových bielkovín v krvnom sére boli odobrané donorkám z vena jugularis a to pred a počas superovulácie (4x). Hladiny metabolických ukazovateľov sme stanovili fotometrickou metódou pomocou Bio La Testu. Získané výsledky koncentrácie metabolických parametrov v krvnom sére sledovaných zvierat sme štatistický spracovali za použitia počítača PC 214 AXL Autoscan programom Quattro Pro verzia 3.0. Stanovené boli parametre: aritmetický priemer a smerodajná odchýlka. Štatistická významnosť zaznamenaných rozdielov bola hodnotená t testom.vzťah výsledkov embryotransferu a metabolických ukazovateľov bol vyjadrený korelačnou analýzou výpočtom korelačného koeficientu r. Výsledky a diskusia U 42 donoriek, u ktorých sme sledovali metabolické ukazovatele, bolo celkovo vyplavených 83 embryí, čo je 5,9 ± 2,99 embryí na donorku, prenesených bolo 46 embryí čiže 55, 42% a úspešnosť bola 41,3%. Biochemickými analýzami sme určili koncentrácie vybraných metabolických ukazovateľov v krvnom sére kráv 3 dní pred a v priebehu superovulácie. Zistili sme nevýznamne sa znižujúce hladiny cholesterolu počas superovulácie a to z 4,33 ± 1,37 mmol/ l deň pred superovuláciou na 3,55 ± 0,92 mmol/l v posledný deň superovulačného ošetrenia (tab. 1). U donoriek, ktoré mali vyššie koncentrácie cholesterolu v krvnom sére sa dokázala signifikantne lepšia superovulačná odozva, tiež počet vyplavených prenesených a úspešne prenesených embryí, kde bola zistená tesná pozitívna korelácia /r = 0,74/ pre superovulačnú odozvu; /r = 0,65/ pre vyplavené embryá; /r = 0,50/ pre prenesené embryá; /r = 0,33/ pre úspešne prenesené embryá. Dawuda et.al. (2002) uvádzajú vysoký vplyv urey na redukciu zisku a kvality embryí v závislosti od času počas ktorého je urea skrmovaná, kedy zistili že urea je toxická pre embryá ale kravy majú schopnosť eliminácie toxicity počas 10 tich dní. Hladiny urey v krvnom sére donoriek sa nevýznamne znižovali počas superovulácie z 4,24 ± 0,7 mmol/l v deň pred superovulačným ošetrením na 3,9 ± 0,6 mmol/l v posledný deň superovulácie (tab. 2). Nižší počet žltých teliesok sme

211 zaznamenali u donoriek s vyššími hladinami urey v krvnom sére; /r = 0,32/, tiež počet vyplavených embryí /r = - 0,60/ a počet prenesených embryí /r = - 0,62/; sa znižoval u donoriek s vyššími hladinami urey v krvi. Hladiny celkových bielkovín v krvnom sére donoriek sa znižoval zo 68,02 ± 5,68 g/l v deň pred superovuláciou na 63,5 ± 6,9 g/l v posledný deň superovulačného ošetrenia. Nezistili sme závislosť koncentrácií celkových bielkovín v krvi donoriek a ich superovulačné odozvy, vyplavených ani prenesených embryí (tab. 3). Vplyv hladín cholesterolu na ovariálnu odpoveď po superovulácii skúmali Kweon a kol. (1985). Ktorí uvádzali, že so zvyšujúcou sa hladinou cholesterolu v krvnom sére sa zlepšuje superovulačná odozva na vaječníkocch a tiež počet získaných a prenosuschopnýcch embryí. Urea v krvnej plazme a v krvnom sére je ukazovateľom príjmu a metabolizmu dusíka, dáva obraz o exkrečnej schopnosti obličiek a syntetickej schopnosti pečene. Erbersdobler a kol. (1990) zistili zvýšené koncentrácie urey pri poruchách obličiek a nevýznamný vplyv hladín urey na štádium laktácie. Zmeny hladín urey sú závislé od kŕmneho režimu a zníženie ich hodnôt sa pozorovalo pri narušení pečene. Tab.1 Priemerné hodnoty cholesterolu (mmol/l) v krvnom sére donoriek kráv pred a počas superovulácie (n=14) před SO 3.deň před SO 2.deň před SO 1.deň deň SO priemer odchýlka Tab.2 Priemerné hodnoty urey (mmol/l) v krvnom sére donoriek kráv pred a počas superovulácie (n=12) priemer odchýlka před SO 3.deň před SO 2.deň před SO 1.deň deň SO Tab.3 Priemerné hodnoty celkových bielkovín (g/l) v krvnom sére donoriek kráv pred a počas superovulácie (n=14) priemer odchýlka před SO 3.deň před SO 2.deň před SO 1.deň deň SO Vysvetlivky: SO superovulácia referenčné hodnoty cholesterolu (mmo/l) referenčné hodnoty urey (mmol/l) SO SO SO 4.deň 4.deň 4.deň

212 referenčné hodnoty celkových bielkovín (g/l) Záver Zistili sme pozitívnu korelačnú závislosť hladín cholesterolu v krvnom sére donoriek a superovulačnou odozvou, produkciou embryí a počtom prenosuschopných embryí - negatívnu korelačnú závislosť hladín urey v krvi donoriek a ich superovulačnou odozvou, počtom vyplavených a prenosuschopných embryí - nebol dokázaný vplyv hladín celkových bielkovín v krvi donoriek na efektívnosť embryotransferu Literatúra Blanchard T., Ferguson J., Love L.,1990: Effect of dietary crudeprotein type on fertilization and embryo quality in dairy cattle. American Journal Veterinary Research, 51, Dawuda PM, Scaramuzzi RJ, Leese HJ, Hall CJ, Peters AR, Drew SB, Wathes DC., 2002:Effect of timing of urea feeding on the yield and quality of embryos in lactating dairy cows. Theriogenology; 58, Erbersdobler H. F., Zucker H., 1990 : Harnstoffgehalt der Milchein Indikato der Proteinversorgung von Michkühen. Kraftfutter, 1, Ferguson JD., 1991: Nutrition and Reproduction in Dairy Cows. Food Anim Pract 7, Kweon O. K., Ono H., Yamashina H. and Kanagawa H., 1985: Changes in variuos serum chemical components level before and after calving in Holstein cows. J. Hokkaido Vet. Med. Assoc. 29, 7-13 Pivko J., Grafenau P., 1987: Prenos embryí hovädzieho dobytka. Učebný text UVIO Bratislava, pp Rajala-Schultz PJ, Saville WJA, Frazer GS, Wittum TE., 2001: Association between milk urea nitrogen and fertility in ohio dairy cows. J.Dairy Sci, 84:

213 BIOPLEXY STOPOVÝCH PRVKOV A ICH VPLYV NA MINERÁLNY METABOLIZMUS OŠÍPANÝCH BIOPLEXES TRACE ELEMENTS AND THEIR INFLUENCE ON MINERAL METABOLISM OF PIGS Novotný, J., Kováč, G., Link, R., Húska, M. Univerzita veterinárskeho lekárstva Košice, Komenského 73, SR Abstract A four-week experiment was carried out on piglets (experimental group n = 10 and control group n = 10) to observe the effects of bioplexes of Fe, Cu, Zn, Mn, and Se on the micromineral profile of blood serum and tissue (liver, kidneys, loin muscles, and bones). Organic trace elements supplementation resulted in a significant increase in blood serum concentrations of Fe (P < 0.01), Cu (P < ), Zn (P < ), Mn (P < 0.01); concentration of Fe in liver (P < 0.05); Se in kidneys (P < 0.01), bones (P < 0.05); and Mn and Zn in bones (P < 0.01). Úvod Tradične používanou metódou dopĺňania stopových prvkov do krmív ošípaných je ich suplementácia vo forme premixov s obsahom anorganických solí (sírany, uhličitany, chloridy, oxidy). Avšak na ich absorpciu z lúmenu čriev pôsobí množstvo fyzikálno-chemických faktorov (fytáty, fosfáty, polyfenoly, anorganické ióny s rovnakým mechanizmom absorpcie), ktoré výrazne znižujú absorpciu, ako aj metabolickú utilizáciu týchto prvkov bunkami. Naviazaním stopových prvkov na organické látky (aminokyseliny, peptidy) sa zvyšuje biologická dostupnosť týchto prvkov, ktorá je pravdepodobne spôsobená odlišnými mechanizmami absorpcie. Výsledky v porovnávaní biologickej dostupnosti organických oproti anorganickým zdrojom stopových prvkov poukazujú na to, že organicky viazané stopové prvky sú počas trávenia rezistentnejšie pred reaktívnosťou iných chemických zlúčenín, majú dokonalejšiu rozpustnosť, preto sú lepšie absorbované a zapájané do biologických reakcií a štruktúr organizmu (Richards a Close, 2001). Cieľom experimentu bolo zhodnotiť biologickú dostupnosť a zabudovanie organicky viazaných stopových prvkov do organizmu ošípaných v období predvýkrmu. Tento efekt bol hodnotený na základe koncentrácie Fe, Cu, Zn, Mn a Se v krvnom sére, parenchymatóznych orgánoch, kostiach a bedrovej svalovine ošípaných.

214 Materiál a metódy: Použité zvieratá: Rovnako staré ošípané (vek pri začatí experimentu 65 dní, hmotnosť cca 20 kg) boli rozdelené do 2 skupín: pokusná skupina (n = 10 ks), kontrolná skupina (n = 10 ks). Experimentálny dizajn: V experimente trvajúcom 4 týždne sa u pokusnej skupiny skrmovala špeciálne upravená KZ OŠ-03 (Tajba a. s., Čaňa), ktorá obsahovala 1 % minerálno-vitamínový premix (Aminovitan P1CH Biofaktory s. r. o.) s organickými formami Cu, Fe, Zn, Se, Mn (Alltech s. r. o.). Kontrolnej skupine sa skrmovala klasická KZ OŠ-03 (Tajba a. s., Čaňa), s 1 % minerálno-vitamínovým premixom (Aminovitan P1 Biofaktory s. r. o.) ktorý obsahoval rovnaké množstvo anorganických foriem stopových prvkov. V priebehu experimentu sa použil dávkový typ kŕmenia (3 krát denne) suchou kŕmnou zmesou (1,50 až 1,75 kg KZ na kus a deň) s dostatočným prístupom k pitnej vode. Ošípané boli ustajnené v 4 kotcoch v priestoroch II. internej kliniky. Krv sa odoberala z očného splavu (Kováč a kol., 1990) v týždených intervaloch, avšak časový odstup medzi 1. a 2. odberom bol dvojtýždňový. Za účelom odobratia vzoriek parenchymatóznych orgánov, bedrovej svaloviny a kostí bolo v závere experimentu odporazených 8 kusov ošípaných (4 ks z každej skupiny). Z odporazených zvierat sme odobrali vzorky pečene (lobus hepatis dexter medialis), obličiek (cortex renis), bedrovej svaloviny (m. longissimus lumborum) a kostí (os pubis). Až do analýzy boli vzorky zmrazené pri teplote 18 C. Stanovenie koncentrácie stopových prvkov v tkanivách a krvnom sére: Analyzované vzorky boli mineralizované mokrou cestou v mikrovlnej peci MLS Koncentrácie Cu, Fe, Zn v tkanivách a krvnom sére sme stanovili na AAS fy Perkin Elmer AAnalyst 100 plameňovou metódou, koncentrácie Se a Mn sa stanovili na AAS 4100 ZL bezplameňovou metódou. Štatistické vyhodnotenie výsledkov: Bolo zrealizované v programe Microsoft Excel - Studentovým t testom. Výsledky a Diskusia Skrmovanie bioplexov stopových prvkov sa pozitívne odrazilo na štatistickom zvýšení koncentrácie Fe, Cu, Mn a Zn v krvnom sére pokusnej skupiny ošípaných (tab. 1). Pri porovnaní mikrominerálneho profilu krvného séra sledovaných skupín ošípaných s referenčným rozpätím (Jagoš a kol., 1990) sa v tomto intervale pohybovala koncentrácia Fe, Mn a Se u pokusnej skupiny a hladina Mn a Se u kontrolnej skupiny. U obidvoch skupín ošípaných sa však aj napriek dostatočnému obsahu Cu a Zn v KZ (odporúčaná koncentrácia Cu 6,5 ppm, Zn 90 ppm; Šimeček a kol., 1994)

215 vyskytla hypozinkémia a mierna hypokuprémia. U kontrolnej skupiny sa napriek vyššiemu obsahu Fe v KZ (o 38,75 ppm viac Fe ako u pokusnej skupiny) vyskytla aj sideropénia, čo je dôsledok nižšieho percenta absorpcie a biologickej dostupnosti anorganických foriem Fe (Johnson a Socha, 1998). Tab. 1 Koncentrácia stopových prvkov v krvnom sére ošípaných (µmol.l -1 ) Odber Vek 65 deň 72 deň 86 deň 93 deň Fe Pokus 16,11±2,31 17,14±2,28 17,52 ** ±2,18 18,29 ** ±2,12 Kontrola 15,43±1,79 15,33±1,62 13,88± 1,59 14,66±1,06 Cu Kontrola 17,70±0,84 17,90±1,24 17,11±1,17 17,80±0,94 Pokus 19,78 * ±1,90 21,02 ** ±1,86 21,02 *** ±1,26 22,71 *** ±2,29 Mn Pokus 0,38±0,03 0,40±0,03 0,58 ** ±0,04 0,57 ** ± 0,04 Kontrola 0,39±0,04 0,42±0,04 0,43±0,10 0,43±0,09 Zn Pokus 8,84±1,39 9,39 * ±1,06 9,17 ** ±0,88 9,82 ** ±0,69 Kontrola 8,21±1,40 8,02±1,22 Pokus 1,25±0,14 1,26±0,07 Se Kontrola 1,26±0,13 1,27±0,10 Legenda: *** P < 0.001; ** P < 0.01; * P < ,54±1,25 1,27±0,09 1,26±0,13 8,50±1,04 1,30±0,08 1,29±0,11 Obsah minerálnych prvkov v organizme ošípaných (analýza popolu) je relatívne rovnaký a tvorí rádovo 3 % telesnej hmotnosti (Whittemore, 1993). K orgánom s najvyššou kumuláciou stopových prvkov patrí pečeň a obličky, čo dokazujú aj hodnoty zistené v našom experimente (tab. 2). Pečeň obsahuje najvyššie koncentrácie Fe, Cu a Mn, obličky najvyššiu koncentráciu Se. Kŕmna zmes s obsahom bioplexov stopových prvkov (Aminovitan P1 CH) signifikantne zvýšila koncentráciu Fe v pečeni, Se v srdci, obličkách a kostnom tkanive, Mn a Zn v kostnom tkanive. Ťažko je však porovnávať nami zistené hodnoty stopových prvkov s literárnymi údajmi, ktoré sa týkajú analýzy mikrominerálneho profilu tkanív a orgánov (Edmonds a Arentson, 2001;Jensen-Waeren a kol., 1998; Tittiger, 1985), a to z dôvodu odlišného zloženia, množstva, typu použitých kŕmnych zmesí, ako aj líšiacej sa kategórie a hmotnosti ošípaných.

216 Tab. 2 Množstvo stopových prvkov v tkanivách (mg. kg -1 ) Pečeň Obličky Svalovina ZN Cu Fe Se Kosť POKUS 45,85±9,14 24,10±2,29 12,01±1,98 49,28 ** ±2,64 KONTRO LA 42,67±9,67 23,07±1,58 13,01±0,47 36,00±0,65 POKUS 5,03±0,54 3,52±0,68 0,45±0,25 0,87±0,34 KONTRO LA 5,73±0,33 2,90±0,36 0,97±0,67 0,73±0,20 POKUS 198,92 * ±34,1 42,94±13,92 7,36±3,53 37,11±11,19 KONTRO LA 109,07±46,23 39,20±8,29 6,86±1,40 35,26±1,67 POKUS 0,479±0,013 1,10 ** ±0,052 0,088±0,010 0,095 * ±0,007 KONTRO LA 0,413±0,058 0,950±0,064 0,076±0,025 0,069±0,014 Mn KONTRO 1,22±0,16 0,92±0,08 0,13±0,04 0,26±0,03 LA Legenda: * P < 0,05; ** P < 0,01 POKUS 1,03±0,06 0,79±0,11 0,15±0,06 0,36±0,04 ** Záver Štvortýždňový príjem bioplexov stopových prvkov (Fe, Cu, Zn, Mn a Se) v období predvýkrmu ošípaných signifikantne zvyšuje koncentráciu Fe, Cu, Zn a Mn v krvnom sére, koncentráciu Fe v pečeni, Se v obličkách a kostnom tkanive, Mn a Zn v kostnom tkanive. Literatúra 1. Edmonds, M. S., Arentson B. E.: Effect of supplemental vitamins and trace minerals on performance and carcass quality in finishing pigs. J. Anim. Sci. 2001, 79, Jagoš, P., Vrzgula, L., Illek, J. Interpretácia minerálneho profilu. In: Poruchy látkového metabolizmu hospodárskych zvierat a ich prevencia (L. Vrzgula). II. prepracované vydanie, 1990, Jensen-Waern, M., Lindberg R., Johannisson A., Petersson L., Wallgren P., Melin L.: Dietary zinc oxide in weaned pigs effects on performance, tissue concentrations, morphology, neutrophil functions and faecal microflora. Vet. Sci. 1998, 64, Johnson, A. B., M. Socha. Judging trace mineral bioavailability. Feed Int. 1988, 9: Kováč G., Martinček M., Mudroň P., Cilk D., Demonovič T., Paštek J., Stanislavský V., Ružička S.: Odber krvi u ošípaných Porovnanie doteraz zaužívaných metód a popis novšej metódy. 1990, Veterinářství, 40.

217 6. Richards M., Close W.: Mineral nutrition of the sow. In: Concepts in Pig Science 2001, The 3 rd Annual Turtle Lake Pig Science Conference, 2001, Šimeček, K., L. A. Zeman, J. Heger. Potreba živín a výživná hodnota krmív pre ošípané. Publikácia VÚŽV Nitra, 1994, 1, 77 s. 8. Tittiger, F.: Trace element levels in liver and kidney from cattle, swine and poultry slaughtered in Canada. Can. J. Comp. Med., 1985, 49, Whittemore, C. T.: The science and practice of pig production. Longman Scientific and Technical, Harlow, Essex, 1993, 660.

218 VPLYV SUPEROVULÁCIE NA KATECHOLAMINERGICKÝ SYSTÉM A AKTIVITU MONOAMINOOXIDÁZY HYPOFÝZY OVIEC THE EFECT OF SUPEROVULATION ON CATECHOLAMINERGIC SYSTEM AND ACTIVITY OF MONOAMINEOXIDASE OF PITUITARY GLAND OF SHEEPS Pástorová, B., Maraček, I., Staníková, A. Katedra normálnej anatómie, histológie a fyziológie, Ústav fyziológie, UVL Košice Abstract The hormonal effect of stimulation on catecholamine levels and activity of monoamineoxidase in the hypophysis of ewes in the estric period was studied by radioenzymatic method. The oestrous of ewes was synchronized with Ageline sponges ( 20µg chlorsuperlutin ). After synchronization we induced superovulation by means of 2000 IU serum gonadotrophin. The results indicate that hormonal serum gonadotrophin stimulation increases significantly (p<0,01) pituitary dopamine and epinephrine levels in ewes. Monoaminooxidase activity in the hypophysis decreased significantly to almost half in comparism to control values. Úvod Na začiatku osemdesiatych rokov Saavedra a i. (1975) ako prví demonštrovali prítomnosť katecholamínov v neurointermediálnom laloku hypofýzy potkanov. Neskoršie bolo potvrdené, že v hypofýze sa vo vysokej koncentrácii nachádza dopamín (Barden a i., 1982). Dopaminergické tuberoinfundibulárne narvové projekcie unervujú pars intermedia a lobus posterior hypofýzy. Funkcia dopamínu v hypofýze bola definovaná ako neuromediátora, neurohormónu alebo spoločná. V pars intermedia dopaminergické receptory participujú na uvoľňovaní melanotropínstimulačného hormónu. Je potvrdené (Saavedra, 1984), že estrogény sa podieľajú na metabolických a funkčných zmenách katecholamínov v hypofýze potkanov. V našej práci sme sa zamerali na vplyv PMSG, ktorého aplikácia je spojená a hyperestrogenizáciou a môže ovplyvňovať hladiny katecholamínov a aktivitu MAO v epifýze oviec v estrickom období. Materiály a metódy V štúdii sme použili 12 oviec plemena slovenské merino, 3-4 ročných o p.ž.h. 41±5kg. Estrus oviec sme synchronizovali agelínovými

219 hubkami (20 mg), ktoré sme im instilovali 12 dní. Po ukončení synchronizácie sme okamžite aplikovali 2000 IU PMSG. Katecholamíny (dopamín, norepinefrín a epinefrín) sme stanovili podľa Johnsona a i. (1984) pomocou testu CATECHOLA (Adico, Praha) rádioenzymaticky. Aktivitu MAO sme stanovili v tkanivových homogenátoch rádiochemicky (Wurtman a Axelrodt, 1963). Ako substrát bol použitý 14 C tryptamín špecifickej aktivity 18, Bq. Výsledky a diskusia Podanie 2000 IU PMSG spôsobuje signifikantný (p<0,01) vzostup (o 37%) hladín hypofyzárneho dopamínu. Epinefrín v hypofýze vzrastá z 5,01± 0,2 na 7,8±0,5 ng.mg -1 bielkovín. V hypofýze aktivita degradačného enzýmu katecholamínov MAO klesá približne na polovičné hladiny kontrolných oviec (p<0,01) z 205,01±0,1 na 102,3±2,4 pmol prod.mg -1. Anatomické a funkčné interakcie medzi estrogénmi a katecholamínmi sa nachádzajú i v hypofýze. Saavedra a i. (1984) zistili po aplikácii 17-ßestradiolu potkanom zmeny hladín hypofyzárnych katecholamínov a vzostup turnoveru dopamínu v pars intermedia hypofýzy. V našom experimente sme po podaní PMSG zaznamenali v hypofýze oviec signifikantný vzostup (p<0,001) hladín dopamínu a norepinefrínu. Tento vzostup hladín hypofyzárneho dopamínu po hyperestrogenizácii následkom aplikácie PMSG pravdepodobne súvisí so zistením, že cirkulujúce estrogény menia tuberoinfundibulárnu aktivitu dopaminergického systému. Je pravdepodobné, že estrogény stimulujú sekréciu prolaktínu (Sopková a i., 1999; Laciaková a i., 1999, 2000 )a znecitlivujú hypofyzárny frontálny lalok k inhibičnému vplyvu dopamínu. Záver Z našich výsledkov vyplýva, že aplikácia superovulačného preparátu PMSG selektívne ovplyvňuje metabolizmus dopamínu a epinefrínu v hypofýze oviec a súčasne znižuje aktivitu MAO Literatúra 1. BARDEN, N. CHEVILARD, C. SAAVEDRA, J.M. (1982): Neuroendocrinology, 35, LACIAKOVÁ, A. CABADAJ, R. PAŽÁKOVÁ, J. BAKOŠOVÁ, A. LACIAK, V. (1999): In: Proceeding of lect. And posters Hygiene Alimentorum XX, LACIAKOVÁ, A. TUREK, P. PAŽÁKOVÁ, J. (2000): In: Hyg. Alim., SAAVEDRA, J.M. CHEVILARD, C. (1984): Cell Mol. Neurobiology, 4,

220 5. SOPKOVÁ, D. SOKOL, J. CABADAJ, R. VÁRADY, J. (1999): CHemical Papers, 52, WURTMAN, J. AXELRODT, J. (1963): Biochem, Pharmacol., 12, Práca sa vytvorila v rámci riešenia grantu VEGA 1/0612/03

221 DYNAMIKA ZMĚN UKAZATELŮ METABOLICKÉHO PROFILU KREVNÍ PLAZMY NOSNIC V PRŮBĚHU SNÁŠKOVÉHO CYKLU CHANGES OF METABOLIC PROFILE PARAMETERS IN LAYING HENS DURING THE LAYING PERIOD Pavlík, A. Ústav morfologie, fyziologie a genetiky zvířat, Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, [email protected] Abstract The aim of the study was to compare some biochemical parameters of blood plasma (total protein, glucose, uric acid, alkaline phosphatase and cholesterol) in laying hens during laying period. In experiment, 36 ISA Brown laying hens were used. Hens were divided into 3 groups, 12 birds per cage. Each group was housed in 3 different systems. The blood was sampled from 22 week to 75 week of age. So far determined parameters of biochemical profile in laying hens were in some cases significant different, but they were in a physiological range. No distinct effect of housing system on the biochemical parameters was found. Úvod Zdravotní stav nosnic je jedním z důležitých faktorů, ovlivňujících jejich produkční vlastnosti v různých podmínkách chovu. Jednou z metod přispívajících k objektivnímu posouzení funkčního a zdravotního stavu organismu je biochemické vyšetření krve, které může poskytnou cenné informace o vnitřním prostředí zvířat. Mezi významné parametry biochemického profilu krevní plazmy patří např. obsah celkových bílkovin. Také koncentrace glukózy v krevní plazmě nosnic slouží jako významný ukazatel metabolických změn, jež mohou být spojeny s kapacitou snášky a se zvýšenými nároky na energii (SUCHÝ et al., 2004). Na rozdílné hodnoty koncentrace glukózy u nosnic ustájených v odlišných technologiích upozorňuje např. GUNES et al. (2002). Hladina kyseliny močové jako konečného produktu přeměny dusíkatých látek u ptáků kolísá v závislosti na příjmu purinů a její zvýšená úroveň v krvi často provází příznaky dny (KLIMEŠ, 1970). Aktivita alkalické fosfatázy odráží mj. také metabolický stav osteoblastů v kostní tkáni při její tvorbě a remodelaci. Tímto způsobem lze sledovat poruchy kostní tkáně, které by mohly mít souvislost s technologickými systémy ustájení nosnic. Cholesterol a jeho estery významně zasahují do metabolismu velkého množství pro organismus nepostradatelných látek. Problematikou změn obsahu cholesterolu v krevní plazmě nosnic a jeho vztahu k metabolismu a reprodukci nosnic se zabývali

222 např. SUCHÝ et al. (1999), KÜCÜKERSAN (2000), CHOWDHURY et al. (2002), SAHIN et al. (2002) a TŮMOVÁ et al. (2004). Cílem této práce bylo stanovit a porovnat vybrané ukazatele vnitřního prostředí nosnic v průběhu snáškového cyklu chovaných v různých technologických systémech a posoudit vliv jednotlivých technologických systémů na změny těchto ukazatelů. Materiál a metodika Do pokusu bylo zařazeno 36 nosnic hybridní kombinace ISA Brown. Nosnice byly rozděleny do třech skupin po 12 ks. Jednotlivé skupiny odpovídají použitým technologickým systémům ustájení (tradiční klecová technologie, obohacená klecová technologie odpovídající Směrnici Rady 1999/74/EC a podestýlková technologie). Ve věku 22 týdnů byly z vena brachialis odebrány první vzorky krve. Odběry krve probíhaly vždy mezi a hodinou. Byly stanoveny tyto biochemické ukazatele krevní plazmy: obsah celkových bílkovin, koncentrace glukózy, kyseliny močové, aktivita alkalické fosfatázy a obsah cholesterolu. Následné odběry vzorků krve byly prováděny ve 47. a 75. týdnu věku nosnic. Pro hodnocení obsahu cholesterolu byly použity krevní vzorky odebrané ve 22., 28., 35., 41., 47., 52., 58., 66. a 75. týdnu věku nosnic. Statistické vyhodnocení dat bylo provedeno jednofaktorovou analýzou rozptylu s následným testováním dle Scheffeho na hladinách významnosti P<0,05 a P<0,01. Výsledky a diskuse Průměrné hodnoty obsahu celkových bílkovin v krevní plazmě nosnic ustájených v jednotlivých technologiích se pohybovaly od 52,26 do 56,12 g.l -1. Ve všech technologiích se průměrné hodnoty obsahu bílkovin měnily jen mírně, což je v souladu s tvrzením autorů BURNHAM et al. (2003). Nižší průměrné hodnoty oproti námi zjištěným uvádějí KOELKEBECK a ODOM (1995), SAHIN et al. (2002). Naopak výrazně vyšší průměrné hodnoty uvádí např. KÜCÜKERSAN (2000). Koncentrace plazmatické glukózy v celém zkoumaném souboru nosnic nabývala rozmezí průměrných hodnot od 12,48 do 14,08 mmol.l -1. Nebyly zjištěny průkazné rozdíly mezi jednotlivými technologiemi, což nekoresponduje se zjištěním autorů GUNES et al. (2002), jež prokázali výrazné rozdíly mezi koncentracemi glukózy v krevní plazmě nosnic ustájených v klecích a v alternativních technologiích. Kolísání koncentrace glukózy v rozmezí podobném jako v našem experimentu uvádějí SUCHÝ et al Podobné koncentrace zjistili i KOELKEBECK a ODOM (1995), KURTOGLU et al. (2001). Nižší hladiny plazmatické glukózy uvádějí např. SAHIN et al. (2002).

223 Nejvyšší průměrné hodnoty kyseliny močové byly stanoveny v technologii podestýlkové v průběhu celé snášky a dosahovaly hodnot mezi 339,23 a 390,47 µmol.l -1. Zvýšená koncentrace v podestýlkové oproti ostatním technologiím by mohla být zapříčiněna vyšším příjmem dusíkatých látek, které získávají nosnice požíráním podestýlky. Podobné průměrné hodnoty kyseliny močové zjistili i KOELKEBECK a ODOM (1995). Průměrné hodnoty alkalické fosfatázy se v celém zkoumaném souboru zvířat pohybovaly od 7,62 do 15,07 µkat.l -1. Statisticky průkazné rozdíly mezi jednotlivými technologiemi (P<0,05) byly determinovány ve 47. a 75. týdnu věku. Podobné průměrné hodnoty aktivity alkalické fosfatázy v krvi nosnic uvádějí KURTOGLU et al. (2001), SAHIN et al. (2002) a EREN et al. (2004). Rozmezí průměrných hodnot cholesterolu celého sledovaného souboru se pohybovalo mezi 2,62 a 5,88 mmol.l -1 a průměrná hodnota celého souboru byla 3,82 mmol.l -1. Nejvyšší hodnoty byly stanoveny ve většině případů v krevní plazmě nosnic ustájených v tradiční technologii. Průměrné hodnoty naměřené v technologii obohacené a podestýlkové se od sebe výrazně nelišily. Širší rozmezí s vyšší maximální hodnotou, avšak u individuálních hodnot, uvádějí SUCHÝ et al. (1999). Vyšší průměrné hodnoty zjistili také BURNHAM et al. (2003) a TŮMOVÁ et al. (2004), nižší průměrné hodnoty plazmatického cholesterolu uvádějí např. SAHIN et al. (2002). Závěr Parametry metabolického profilu krevní plazmy nosnic se v průběhu snáškového cyklu pohybovaly ve všech skupinách nosnic ve fyziologickém rozmezí odpovídajícím hodnotám zdravých zvířat. V některých případech byly nalezeny statisticky průkazné rozdíly mezi jednotlivými technologickými systémy. Tyto diference jsou patrně způsobeny individuálními metabolickými rozdíly i rozdíly v užitkovosti jednotlivých skupin v průběhu snášky. Použitá literatura BURNHAM, M. R., PEEBLES, E. D., BRANTON, S. L., JONES, M. S., GERARD, P. D.: Effects of F-strain Mycoplasma gallisepticum inoculation at twelve weeks of age on the blood characteristics of commercial egg laying hens. Poult. Sci., 82, 2003: CHOWDHURY, S. R., CHOWDHURY, S. D., SMITH T. K.: Effects of dietary garlic on cholesterol metabolism in laying hens. Poult. Sci., 81, 2002:

224 EREN, M., UYANIK, F., KÜCÜKERSAN, S.: The influence of dietary boron supplementation on egg quality and serum calcium, inorganic phosphorus, magnesium levels and alkaline phosphatase activity in laying hens. Res. Vet. Sci., 76, 2004: GUNES, N., POLAT, U., PETEK, M.: Investigation of changes in blood biochemical parameters of hens raised in alternative housing systems. Veter. Fakult. Dergisi, Uludag Univ., 21, 2002: KLIMEŠ, B.: CHOROBY DRŮBEŽE. DRUHÉ VYDÁNÍ. PRAHA, SZN. 1970: 544 S. KOELKEBECK, K. W., ODOM, T. W.: Laying hen responses to acute heat stress and carbon dioxide supplementation: II. Changes in plasma enzymes, metabolites and electrolytes. Comp. Biochem. Physiol., 112, 1995: KÜCÜKERSAN, S.: The effect of niacin added to the laying hen rations on egg production and egg quality with some blood metabolites. Ankara Univ. Vet. Fak. Dergisi, 47, 2000: KUKTOGLU, V., KUKTOGLU, F., COSKUN, B.: Effects of boron supplementation of adequate and inadequate vitamin D3-containing diet on performance and serum biochemical characters of broiler chickens. Res. Vet. Sci., 71, 2001: SAHIN, K., KÜCÜK, N., SAHIN, N., GURSU, M. F.: Optimal dietary concentration of vitamin E for alleviating the effect of heat stress on performance thyroid status, ACTH and some seru metabolite and mineral concentrations in broilers. Vet. Med.- Czech, 47, 2002: SUCHÝ, P., STRAKOVÁ, A., HRUBÝ, A.: Variations in cholesterol concentrations in the blood plasma of hens throughout the laying period. Czech J. Anim. Sci., 44, 1999: SUCHÝ, P., STRAKOVÁ, E., JARKA, B., THIEMEL, J., VEČEREK, V.: Differences between metabolic profiles of egg-type and meat-type hybrid hens. Czech J. Anim. Sci., 49, 2004: TŮMOVÁ, E., HÄRTLOVÁ, H., LEDVINKA, Z., FUČÍKOVÁ, A.: The effect of digitonin on egg quality, cholesterol content in eggs, biochemical and haematological parameters in laying hens. Czech J. Anim. Sci., 49, 2004:

225 ÚČASŤ TRANSKRIPČNÉHO FAKTORA STAT-1 V REGULÁCII FUNKCIÍ OVARIÁLNYCH BUNIEK OŠÍPANÝCH INVOLVEMENT OF TRANSCRIPTION FACTOR STAT-1 IN REGULATION OF THE FUNCTIONS PORCINE OVARIAN CELLS Pavlová 1, S., Alexander V. Sirotkin 1,2, Andrej Benčo 2, Dušan Vašíček 1, Alžbeta Tandlmajerová 2 1 Výskumný ústav živočíšnej výroby, Hlohovská 2, Nitra 2 Univerzita Konštantína Filozofa, Tr. A.Hlinku 1, Nitra Abstract The aim of our work was to examine the involvement of transcription factor STAT-1 and hormones ghrelin and leptin in the regulation of ovarian functions: in proliferation, apoptosis, secretory activity and expression of CREB. It was observed, that the transfection of cultured porcine ovarian granulosa cells with gene construct encoding STAT-1 stimulated ocurrence of apoptosis, proliferation and inhibited the release of progesterone P 4. Furthermore, leptin addition increased the expression of STAT-1 whilst transfection of cells with STAT-1 gene construct modified the response of cell proliferation, apoptosis and secretory activity of leptin and ghrelin. These results suggest the involvement of STAT-1, ghrelin and leptin in control of ovarian cell function as well as the involvement of STAT-1 in mediating leptin and ghrelin action. Úvod Regulácia reprodukčných procesov si vyžadujú hľadanie nových biologicky aktívnych látok, ktoré by kontrolovali funkcie ovariálnych buniek okrem doteraz známych regulátorov. Regulácia biologických procesov sa uskutočňuje prostredníctvom hormónov, ktoré pôsobia cez svoje špecifické receptory a s nimi spojené signálové dráhy vedúce ku aktivácii alebo deaktivácii transkripčných faktorov a zodpovedajúcich génov. Transkripčný faktor (Signal Transducer and Activator of Transcription 1) v neovariálnych bunkách hrá úlohu v sprostredkovaní odpovede bunky na stres, môže brzdiť ich proliferáciu (Townsend a kol.,2004) a aktivovať apoptózu pravdepodobne cez inhibíciu anti-apoptotického proteínu Bcl-2 (Stephanou a kol., 2000). STAT-1 sprostredkuje účinky chemoterapeutika doxorubicínu a IFNγ (aktivátorov STAT-1) na apoptózu rakovinových buniek (Thomas a kol., 2004). Zatiaľ nebola preskúmaná účasť STAT-1 v regulácii funkcií ovariálnych buniek: ich proliferácii, apoptóze, sekrečnej aktivite. Zároveň nie sú známe vzájomné vzťahy STAT-1 s inými transkripčnými faktormi, napr.creb (c-amp response element-binding protein) a hormónmi, napr.

226 nedávno objavenými ghrelínom a leptínom. Ghrelín a leptín sú dôležitými regulátormi cicavčích a vtáčich ovarií (J.Pivko et al., 2003). Cieľom našej práce bolo zistiť, či sa STAT-1 zúčastňuje regulácií ovariálnych funkcií. Konkrétne, sledovať vplyv transfekcie ovariálnych buniek ošípaných génovou konštrukciou ktorá vyvoláva overexpresiu STAT-1 na funkcie buniek in vitro: skúmať vplyv tejto konštrukcie na expresiu samotného STAT-1 a CREB, na proliferáciu (akumuláciu PCNA, jadrový antigén proliferujúcich buniek nevyhnutný pri replikácii DNA počas S fázy BC; a cyklínu B1 potrebného pri prechode z G 2 do M fázy BC), na apoptózu (akumuláciu markerov apoptózy: BAX, ASK-1, proapoptotického, antiproliferačného proteínu p53; a anti-apoptotického proteínu Bcl-2) a na sekréciu P 4. Ďalej, preskúmať, či overexpresia STAT-1 ovplyvňuje účinok hormónov ghrelínu a leptínu na proliferáciu, apoptózu a sekrečnú aktivitu ovariálnych buniek. Materiál a metódy Použili sme granulózne bunky z vaječníkov necyklizujúcich ošípaných plemena biela ušlachtilá, zvieratá boli vo veku dní. Izoláciu a kultiváciu buniek sme uskutočnili podľa Sirotkina a kol., Pred prvotnou kultiváciou buniek sme robili primárnu transfekciu suspenzie granulóznych buniek s použitím transfekčného reagenta Roti-Fect (Carl Roth GmbH+Co, Karsruhe, Germany) podľa návodu výrobcu. Kontrolná kultúra buniek bola transfektovaná génovou konštrukciou bez fyziologického účinku pre EGFP (Clontech, Canada). Druhá kultúra buniek bola transfektovaná génovou konštrukciou pre STAT-1 (The Rockefeler University, New York, USA). Finálna kultivácia sa uskutočnila s nasledujúcimi prídavkami: ku jednej skupine buniek transfektovaných EGFP a STAT-1 sme pridávali hormón ghrelín (Peptides International, Louiseville, USA) (0,1,10,100 ng/ml). Ku druhej skupine bol pridaný leptín (Sigma, St.Louis, USA) (0,1,10,100 ng/ml). Prítomnosť PCNA, cyklínu B1, Bcl-2, p53, BAX, ASK-1, CREB, STAT-1 v bunkách kultivovaných v chamber-slides (Nange N. International, Naperville,USA) sme analyzovali imunocytochemickou metódou (Osborn a Isenberg (1994), v Sirotkin a kol., 2003), v bunkách kultivovaných v platničkách (B.Dickinson, Lincoln Park, USA) sme analyzovali metódou Western immunoblotting (Laemmli (1970) v Sirotkin a kol., 2003). Koncentrácie vylúčeného P 4 v médiach z platničiek boli analyzované použitím RIA súprav firmy DSL (Webster, USA) podľa návodu výrobcu. Výsledky boli štatisticky vyhodnotené pomocou programu Sigma Plot 8.0, preukaznosť rozdielov sme stanovovali Paired t-testom. Výsledky a diskusia Zistili sme, že transfekcia granulóznych buniek génovou konštrukciou pre STAT-1 vyvolala overexpresiu transkripčného faktora STAT-1 (obr.č.1).

227 Obr.č.1: Akumulácia STAT-1 v bunkách bez (control) a po transfekcii génovou konštrukciou pre STAT-1. C Control Transfection with STAT-1 Overexpresia STAT-1 mala vplyv na funkcie týchto buniek. Konkrétne, zistili sme, že STAT-1 stimuluje expresiu BAX, ASK-1, PCNA, Bcl-2, inhibuje expresiu CREB a produkciu progesterónu a neovplyvňuje expresiu p53 a cyklínu B1. Ghrelín stimuloval expresiu BAX, ASK-1, PCNA, p53 znižoval expresiu Bcl-2 a bazálnu produkciu progesterónu, neovplyvňoval expresiu cyklínu B1. Pod vplyvom STAT-1 ghrelín nadobúdal schopnosť stimulovať expresiu cyklínu B1, okrem toho STAT-1 blokoval inhibičný účinok ghrelínu na produkciu P 4. Nemenil účinok ghrelínu stimulovať expresiu ASK-1. Leptín aktivoval expresiu BAX, ASK-1, PCNA, Bcl-2, p53, cyklínu B1 a STAT-1, zvyšoval bazálnu produkciu progesterónu. STAT-1 zabraňoval stimulačným efektom leptínu na expresiu STAT-1, BAX, Bcl-2 a menil ich na inhibičný, blokoval stimulačný efekt leptínu na produkciu progesterónu. STAT-1 nemenil účinky leptínu na expresiu PCNA, p53 a cyklínu B1.Naše pozorovania o vplyve transkripčného faktora STAT-1 na indukciu apoptózy sa zhodujú s pozorovaniami Townsenda a kol.(2004) o pro-apoptotickom účinku STAT-1 v neovariálnych bunkách. V oboch prípadoch STAT-1 stimuloval expresiu BAX. Ako prví sme pozorovali zvýšenú expresiu ďalšieho markera apoptózy, ASK-1 pod vplyvom STAT-1. Overexpresia STAT-1 neovplyvnila expresiu p53, čo nepotvrdzuje výsledky Townsenda a kol.(2004) ktorí zistili stimulačný efekt na akumuláciu p53. Toto nasvedčuje tomu, že STAT-1 podporuje apoptózu prostredníctvom ASK-1, BAX a p53 pravdepodobne nie je zapojený do tohto procesu. V našich experimentoch STAT-1 zvyšoval expresiu Bcl-2. % of cells containing BAX Obr.č.2: Vplyv leptínu na expresiu BAX v bunkách bez(control) a po transfekcii génovou konštrukciou pre 80STAT Transfection with STAT-1 * Control * * * * * % of cells containing p Obr.č.3: Vplyv leptínu na expresiu p53 v bunkách bez(control) a po transfekcii génovou konštrukciou pre STAT-1 * Transfection with STAT-1 * * * * Control * Leptin dose added (ng/ml medium) Leptin dose added (ng/ml medium)

228 Obr.c.4:Vplyv ghrelinu na expresiu ASK-1 v bunkach bez(contol) a po transfekcii gen.konstr. pre 74STAT-1 * % of cells containing ASK Transfection with STAT-1 Control Ghrelin dose added (ng/ml medium) * * Obr.č.5: Vplyv leptínu na produkciu progesterónu v bunkách bez(control) a po transfekcii gén.konštr. pre 20 STAT-1 * Leptin dose added (ng/ml medium) Tieto výsledky sa nezhodujú s pozorovaniami Stephanoua a kol.(2000), keďže v rakovinových bunkách po transfekcii s génovou konštrukciou pre STAT-1 došlo k zníženej aktivite promótera Bcl-2. Podľa našich výsledkov môžme predpokladať, že STAT-1 podporuje postup v BC cez kontrolný bod G 1 /S a stimuluje proliferáciu vo fáze S, keďže stimuluje expresiu PCNA. Neovplyvňuje postup z G 2 do M fázy BC, pretože neovplyvňoval množstvo akumulovaného cyklínu B1 v bunkách. Sme prví, kto zistil vplyv STAT-1 na sekrečnú aktivitu ovárií (inhiboval sekréciu P 4 ). Pretože overepresia STAT-1 mala tlmiaci účinok na expresiu CREB, predpokladáme úlohu STAT-1 v regulácii CREB-u. Keďže ghrelín a leptín ovplyvňovali expresiu STAT-1 a STAT-1 moduloval ich účinky, STAT-1 pôsobí ako sprostred-kovateľ ich účinkov na ovariálne funkcie ošípaných. Záver STAT-1 je stimulátor apoptózy (stimuluje BAX, ASK-1), proliferácie (stimuluje PCNA), inhibítor produkcie progesterónu a expresie CREB ovariálnymi bunkami, a zároveň je sprostredkovateľom účinkov ghrelínu a leptínu. Poďakovanie: Úprimne ďakujem za technickú asistenciu pani Kataríne Tóthovej a Žofii Kuklovej, a za finančnú podporu APVP Literatúra Pivko J. et al. (2003): Regulation and evaluation of ovarian function and embryogenesis in normal and transgenic animals in vitro and in vivo. Nitra: Research Institute of Animal Production, Sirotkin A.V. et al. (2003): Involvement of MAP kinase in the mediation of GH action on ovarian granulosa cells. Mol. and Cell. Endocr. 205, Stephanou A. et al.(2000): Opposing actions of STAT-1 and STAT-3 on the Bcl-2 and Bcl-x promoters. Cell Death and Differentiation 7, Thomas M. et al. (2004): STAT-1, a modulator of chemotherapy-induced apoptosis. Cancer Research 64, Townsend P.A. et al. (2004): STAT-1 interacts with p53 to enhance DNA damageinduced apoptosis. J. Biol. Chem., Vol. 279, Issue 7, Progesterone release (ng/10 6 cells/day) * Control Transfection with STAT-1

229 VPLYV IGF-I NA DOZRIEVANIE OOCYTOV A VÝVOJ BOVINNÝCH EMBRYÍIN VITRO THE INFLUENCE OF IGF-I ON OOCYTE MATURATION AND BOVINE EMBRYO DEVELOPMENT IN VITRO Popelková 1, M., Makarevič 3, A., J. Pivko 3, J. Kačmárik 2, G. Kováč 1, M. Húska 1 1 II. interná klinika, Univerzita veterinárskeho lekárstva, Košice, 2 Klinika pôrodníctva, gynekológie a andrológie, Univerzita veterinárskeho lekárstva, Košice, 3 Ústav genetiky a reprodukcie HZ, Výskumný ústav živočíšnej výroby, Nitra Abstract The present study demonstrates the effect of insulin-like growth factor I (IGF-I) on bovine oocyte maturation and subsequent embryo development. The addition of 100 ng/ml IGF-I to maturation medium significantly enhanced oocyte nuclear maturation, compared with control group (93.5 vs 82.4 %, P < 0.05). IGF-I (100ng/ml) added to either IVM or IVM/IVC media significantly increased cleavage rate of bovine embryos (78.8 and 83.8 %, resp.) compared with control group (68.2 %). Positive cumulative effect of IGF-I added to IVM/IVC media was observed by higher D7 blastocysts formation (27.4 vs 15.3 %, P < 0.05). We can conclude that the supplementation of embryo media with IGF-I promotes oocyte nuclear maturation, embryo cleavage and D7 blastocyst rate. Úvod V poslednom desaťročí bolo vyvinuté značné úsilie s cieľom zvýšiť množstvo i kvalitu in vitro produkovaných (IVP) embryí. Štúdie porovnávajúce maturáciu, fertilizáciu a kultiváciu bovinných embryí in vivo a in vitro dokazujú, že pôvod oocytov je hlavným faktorom vplývajúcim na zisk blastocýst, kým kultivačné prostredie je rozhodujúcim faktorom určujúcim kvalitu embryí (Enright a i., 2000; Rizos a i., 2002). Cieľom IVP techník je imitovať a priblížiť sa podmienkam blízkym prostrediu in vivo. Inzulínu podobný rastový faktor I (IGF-I), hormón proteínovej povahy, sa spolupodieľa na regulácii folikulogenézy, dozrievaní oocytov i vývoji raných embryí in vivo u rôznych druhov zvierat. V procese rastu a selekcie folikulov zohráva IGF-I kľúčovú úlohu v sprostredkovaní účinku FSH na vaječník (Mazerbourg a i., 2003). IGF-I pôsobí prostredníctvom svojich receptorov, lokalizovaných tak na nezrelých oocytoch ako aj raných embryách (Lonergan a i., 2000) ako lokálny regulátor podieľajúci sa na koordinácii bunkovej proliferácie a diferenciácie (Mtango a i., 2003).

230 Prítomnosť maternálneho IGF-I predstavuje vo folikulárnej tekutine, vajcovodoch a maternici bohaté prostredie pre oocyty a následne embryá (Watson a i., 1999). Pri in vitro dozrievaní sú zdrojom IGF-I pre oocyt bunky kumulárnej granulózy, tesne obklopujúce oocyt. Po oplodnení, keď sa zygóty zbavujú kumulárnej vrstvy, nie je tento zdroj IGF-I prítomný, pretože zygóta nie je schopná vylučovať vlastný IGF-I. Aby sme vytvorili IVP podmienky podobné prostrediu in vivo, jedným z postupov môže byť pridávanie IGF-I do IVP médií. Materiál a metóda Bovinné oocyty boli získané aspiráciou z vaječníkov kráv odporazených na bitúnku a kultivované in vitro 24 h v maturačnom médiu TCM 199 (Gibco, USA) + 5 % FCS (fetálne teľacie sérum) s dodatkami (FSH, hcg, pyruvát sodný, gentamicín) bez alebo s prídavkom IGF-I v koncentrácii 50 a 100 ng/ml maturačného média. Časť oocytov bola po maturácii fixovaná a ofarbená fluorescenčným farbivom DAPI. Jadrové dozrievanie sme hodnotili pomocou fluorescenčného mikroskopu Leica. Druhá časť oocytov bola oplodnená in vitro semenom býka s overenou oplodňovacou schopnosťou a kultivovaná 20 h vo fertilizačnom médiu (Minitübe, SRN). Maturácia a fertilizácia oocytov prebiehala vo vlhkej atmosfére pri 39 C a 5 % CO 2. Následne, po odstránení zvyškov kumulárnych buniek a spermií, boli predpokladané zygóty kultivované v SOF médiu (Minitübe, SRN) + 10 % FCS s dodatkami pyruvátu sodného, gentamycínu a aminokyselín (Sigma, USA) bez alebo s prídavkom IGF-I (100 ng/ml). Kultivácia prebiehala v atmosfére s redukovanou koncentráciou kyslíka (5 % O 2 ) pri 39 C a 5 % CO 2. Delenia embryí bolo hodnotené na tretí deň (D3) a percento získaných blastocýst na siedmi deň (D7) kultivácie. Na vylúčenie partenogenetického vývoja bola časť embryí ofarbená farbivom DAPI a vyhodnotená pomocou fluorescenčného mikroskopu. Výsledky a diskusia Prídavok rastového faktora IGF-I do maturačného média v koncentráciách 50 a 100 ng/ml mal priaznivý vplyv na dozrievanie bovinných oocytov v podmienkach in vitro. Podiel oocytov, ktoré dozreli a dosiahli štádium metafázy II (MII) bol priamo úmerný vzostupnej koncentrácii pridávaného rastového faktora (Tab. 1). Signifikantný rozdiel P<0.05 sme zistili medzi kontrolou (0 ng/ml) a skupinou oocytov maturovaných v médiu s IGF-I (100 ng/ml).

231 Tab. 1 Vplyv IGF-I na dozrievanie bovinných oocytov in vitro Koncentrácia IGF I v IVM médiu (ng/ml) Celkový počet oocytov Metafáza II (%) * * P<0.05 (Chi-kvadrátový test) pri porovnaní s kontrolou (0 ng/ml) Testovali sme vplyv IGF-I na vývoj embryí v podmienkach in vitro po jeho pridaní do maturačného média (100/0) alebo do maturačného aj kultivačného média súčasne (100/100) voči kontrole (0/0). IGF-I v tejto koncentrácii signifikantne zlepšoval pomer deliacich sa embryí zaznamenaný na D3 u oboch skupín embryí a zvyšoval podiel D7 blastocýst (Tab. 2). V prípade pridania IGF-I do obidvoch médií bol zisk blastocýst v porovnaní s kontrolou signifikantne vyšší (27.4 vs 15.3 %, P<0.05). Tab. 2 Vplyv IGF-I na vývoj bovinných embryí in vitro Koncentrácia IGF I v IVM/IVC médiu (ng/ml) 0/0 100/0 100/100 Celkový počet oocytov Podiel delenia (%) D * 83.8* Blastocysty (%) D * * P<0.05 (Chi-kvadrátový test) pri porovnaní s kontrolou (0/0 ng/ml) Vo vaječníku pôsobí počas folikulárneho vývoja niekoľko rastových faktorov a cytokinínov v podobe intra-ovariálnych regulátorov in vivo. Účinok gonadotropínov je vo folikule pod kontrolou lokálne produkovaných parakrinných a autokrinných rastových faktorov (Bevers a i., 1997). Priebeh meiózy (jadrového dozrievania) in vitro je v bovinných oocytoch urýchlený prídavkom epidermálneho rastového faktora (EGF) a IGF-I do maturačného média bez séra a sprostredkovateľom ich účinku sú kumulárne bunky obklopujúce oocyt (Sakaguchi a i., 2002). V našej práci sme zaznamenali pozitívny vplyv IGF-I tak v 50 ng/ml ako aj 100 ng/ml koncentrácii v maturačnom médiu. Vyššia koncentrácia IGF-I (100 ng/ml) signifikantne stimulovala dozrievanie oocytov (82.4 vs 93.5 % MII oocytov, P < 0.05). Avšak, jadrové dozrievanie in vitro nemusí nevyhnutne znamenať, že tieto maturované oocyty sú rovnako oplodniteľné, alebo schopné sa po oplodnení vyvíjať. Je nutné rozlišovať medzi jadrovým a cytoplazmatickým dozrievaním. Zodpovedajúce cytoplazmatické dozretie súvisí so schopnosťou oocytu vytvoriť po preniknutí spermie samčie prvojadro a vyvíjať sa do pokročilého embryonálneho štádia. Stav cytoplazmatického

232 zrenia oocytov po maturácii je možné zhodnotiť aj mierou oplodnených a následne sa deliacich embryí. Nami zistený podiel delenia bovinných embryí zaznamenaný na D3 bol signifikantne vyšší pri podaní IGF-I, tak do IVM ako aj do IVM/IVC médií (78.8 a 83.8 % vs 68.2%, P < 0.05). Súčasné štúdie predpokladajú, že procesy ktoré sa udejú počas kultivácie po oplodnení sú dôležitejšie ako tie dejúce sa počas dozrievania. Zmeny v podobe narušenej expresie génov, zistené u bovinných blastocýst produkovaných in vitro nemožno pripísať pôvodu oocytov, ale sú pravdepodobne indukované kultivačnými podmienkami po dozretí a oplodnení (Knijn a i., 2002). Tie majú za následok najväčšie straty embryí počas kultivácie, ktoré sa udejú medzi štádiom moruly a blastocysty. U ľudí bolo zlepšenie tvorby blastocýst aj zvýšenie počtu buniek v blastocystách dosiahnuté znížením koncentrácie glukózy, prídavku aminokyselín a doplnením médií rastovými faktormi (Hardy a i., 2002). Prídavok IGF-I do kultivačného média mal priaznivý vplyv na vývoj preimplantačných štádií embryí znížením apoptózy a zvýšením bunkovej proliferácie u kráv, králikov, myší aj ľudí (Makarevič a Markkula, 2002; Demeestere a i., 2004). Podiel bovinných embryí v štádiu blastocysty dosiahnutý v D7 bol pozitívne ovplyvnený obohatením IVM aj IVM/IVC médií s IGF-I. Pridanie IGF-I súčasne do IVM aj IVC médií malo kumulatívny účinok v podobe pozitívneho vplyvu na percento získaných blastocýst voči kontrole (27.4 vs 14.3 %, P < 0.05). Bovinné blastocysty zo 7. dňa (D7) sa vyznačujú lepšou životaschopnosťou, kryotoleranciou a po prenose sa implantujú vo vyššej miere v porovnaní s blastocystami získanými na D8 a D9. Stimulačný účinok IGF-I na vývoj a počet buniek u bovinných in vitro vyprodukovaných embryí sa prejavoval aj vo zvýšenom percente zabreznutých kráv-recipientiek po transfere zmrazených/rozmrazených embryí (Moreira a i., 2001). Záver Prezentovaná práca popisuje vplyv IGF-I na dozrievanie oocytov a následný vývoj bovinných embryí in vitro. Prídavok IGF-I do maturačného média v koncentrácii 100 ng/ml signifikantne zlepšoval dozrievanie oocytov (štádium MII) v porovnaní s kontrolou (93.5 % vs 82.4, P < 0.05). Prítomnosť IGF-I vo vyšších koncentráciách (100ng/ml) v IVM ako aj IVM/IVC médiách signifikantne stimulovala delenie bovinných embryí (78.8 vs 83.8 %) v porovnaní s kontrolnou skupinou (68.2 %). Pozitívny kumulatívny účinok IGF-I pridaného do IVM/IVC média bol zaznamenaný zvýšenou tvorbou D7 blastocýst (27.4 vs 15.3 %, P < 0.05). Môžeme uzavrieť, že prídavok IGF-I buď do IVM alebo IVM/IVC médií

233 má pozitívny vplyv na jadrové dozrievanie oocytov, delenie embryí a zisk blastocýst v D7. Literatúra BEVERS, M.M., DIELEMAN, S.J., van den HURK, R., IZADYAR, F.: Regulation and modulation of oocyte maturation in the bovine. Theriogenology, 47, 1997, s DEMEESTERE, I., GERVY, C., CENTNER, J., DEVREKER, F., ENGLERT, Y., DELBAERE, A.: Effect of Insulin-like growth factor I during preantral follicular culture on steroidogenesis, in vitro oocyte maturation, and embryo development in mice. Biol Reprod, 70, 2004, s ENRIGHT, B. P., LONERGAN, P., DINNYES, A.: Culture of in vitro produced bovine zygotes in vitro vs in vivo: implications for early embryo development ang quality. Theriogenology, 54, 2000, s HARDY, K., WRIGHT, C., RICE, S., TACHATAKI, M., ROBERTS, R., MORGAN, D., SPANOS, S., TAYLOR, D.: Future developments in assisted reproduction in humans. Reproduction, 123, 2002, s KNIJN, H.M., WRENZYCKI, C., HENDRIKSEN, P.J., VOS, P.L., HERRMANN, D., VAN DER WEIJDEN, G.C., NIEMANN, H., DIELEMAN, S.J.: Effects of oocyte maturation regimen on the relative abundance of gene transcripts in bovine blastocysts derived in vitro or in vivo. Reproduction, 124, 2002, s LONERGAN, P., GUTIERREZ-ADAN, A., PINTADO, B., FAIR, T., WARD, F., FUENTE, J.D., BOLAND, M.: Relationship between time of first cleavage and the expression of IGF-I growth factor, its receptor, and two housekeeping genes in bovine two-cell embryos and blastocysts produced in vitro. Mol Reprod Dev, 57, 2000, s MAZERBOURG, S., BONDY, C.A., ZHOU, J., MONGET, P.: The Insulin-like growth factor system: a key determinant role in the growth and selection of ovarian follicles? A comparative species study. Reprod Dom Anim, 38, 2003, s MAKAREVIČ, A.V., MARKKULA, M.: Apoptosis and cell proliferetion of bovine embryos stimulated with Insulin-like growth factor I during in vitro maturation and culture. Biol Reprod, 66, 2002, s MOREIRA, F., BADINGA, L., BUMLEY, C., THATCHER, W.W.: Effects of bovine somatotropin on embryo transfer in lactating dairy cows. Theriogenology, 55, 2001, s. 367 (abstrakt). MTANGO, N.R., VARISANGA, M.D., DONG, Y.J., RAJAMAHENDRAN, R., SUZUKI, T.: Growth factors and growth hormone enhance in vitro embryo production and post-thaw survival of vitrified bovine blastocysts. Theriogenology, 59, 2003, s RIZOS, D., LONERGAN, P., WARD, F.: Consequences of bovine oocyte maturation, fertilization or early embryo development in vitro versus in vivo: implication for blastocyst yield and blastocyst quality. Mol. Reprod. Dev., 61, 2002, s SAKAGUCHI, M., DOMINKO, T., YAMAUCHI, N., LEIBFRIED RUTLEDGE, M.L., NAGAI, T., FIRST, N.L.: Possible mechanism for acceleration of meiotic progression of bovine follicular oocytes by growth factors in vitro. Reproduction, 123, 2002, s WATSON, A. J., WESTHUSIN, M. E., WINGER, Q. A.: IGF paracrine and autocrine interactions between conceptus and oviduct. J Reprod Fertil Suppl, 54, 1999, s

234 VPLYV SEZÓNY NA PRODUKCIU LH A TESTOSTERÓNU U INTAKTNÉHO A KASTROVANÉHO JELEŇA KARPATSKÉHO (CERVUS ELAPHUS). EFFECTS OF SEASON ON THE SECRETION OF LH AND TESTOSTERONE IN INTACT AND CASTRATED RED DEER STAGS (CERVUS ELAPHUS) Pošivák J. 1, Lazar G. 1,Valocký I. 1, Horňáková Ľ. 1, Čurlik J. 2 1 Department of Obstetrics, Gynecology and Andrology, UVM Košice, Slovakai, 2 Dept. of Parazitol., Diseases of Fish, Bees and Game Animals, UVM Košice, Slovakia Abstract At 2-4 monthly intervals during the year blood samples were collected every 15 min for 6h from 2 intact and 3 castrated red deer stags to study the relationship between season and the secretion of LH and testosterone. In the intact stags plasma LH and testosterone concentrations changed during the year; the LH levels were maximal in August during the phase of testicular redevelopment, while the testosterone levels were maximal from September to November coinciding with the time of peak testicular activity and the mating season. The castrated stags had higher plasma levels of LH than the intact stags at all times of the year, and there was no clear seasonal cycle in LH levels in these animals. Introduction In the red deer (Cervus elaphus) the adult stag shows marked changes in testicular activity during the year. During the mating season in September and October both the spermatogenic (Frankenberger, 1953; Hochereau-de Reviers & Lincoln, 1978) and androgenic (Brüggermann, Adam & Karg, 1965; Lincoln, 1971a) functions of the testes are at a maximum, and the testes are about 5 times larger than in the sexually quiescent period in April, May and June. This seasonal cycle in testicular activity is presumably dictated by changes in the secretion of LH and FSH by the anterior pituitary. Brüggermann et al. (1965) have recorded marked changes in the pituitary content of LH in stags according to the season, and the purpose of the present study was to establish whether there are corresponding changes in the blood levels of this gonadotrophin. Materials and Methods The study was made on 5 male red deer. They were housed indoors in individual pens with visual contact between neighbours, and given

235 chopped hay and concentrates. At the age of 13 months 3 of the animals were castrated. The present observations extended from September to October by which time the stags were 27 months old. On 6 occasions, i.e. every 2-4 months, blood samples were collected at 15-min intervals for 5-7h from all the animals. In August and October, one intact (No. 2) and one castrated (No. 5) stag was given a single injection of 500 ng synthetic LH- RH (ICI Pharmaceuticals) via the jugular cannula, and blood samples were collected for a further 2h. The blood samples were centrifuged immediately and the plasma stored at 20 C until assayed for LH by a double-antibody radioimmunoassay (Scaramuzzi, Caldwell & Moor, 1970) using an antibody raised to ovine LH (Martensz, Baird, Scaramuzzi & Van Look, 1976) and an ovine LH standard (NIH-LH-S14). A dilution curve for plasma samples from stags containing high levels of LH was parallel to the standard curve for the assay, and all samples for one animal were measured simultaneously. The levels of testosterone in the plasma were determined by radioimmunoassay using an antiserum which has been shown to have low cross-reactivity with a wide range of androgens and oestrogens with the exception of 5α-dihydrotestosterone (23.9%) (Corker & Davidson, 1978). The detection limit of the testosterone assay was 3.2 ng/ml and the intraassay coefficient of variation was 11.5%. Results There were seasonal changes in the levels of LH and testosterone in the intact animals that could be correlated with the antler cycle. At the beginning of the study the stags were already in a sexually active state, having undergone sexual development in the previous months before the first mating season (September-November). At this time plasma levels of LH were low, although small fluctuations were sometimes evident. Large variations in the testosterone levels occurred at this stage, and again 2 months later in November. In the following January and May the testosterone levels were reduced, while the LH levels remained low. In August, when the stags were 22 months old, resurgence of sexual activity was apparent. At this stage peaks of LH had become very conspicuous, and each peak was associated with an increase in plasma testosterone concentration. In October, when the stags were again sexually active, the levels of LH were reduced but the small peaks were associated with large increases in the levels of testosterone. In the castrated stags there were no clear seasonal changes in the blood levels of LH or testosterone. At all times the LH levels were higher than for intact animals at any season and the 6h profiles consisted of very frequent oscillations with up to 10 peaks per 6h sampling period. The

236 plasma levels of testosterone were generally undetectable and never exceeded 0.40 ng/ml. The i.v. injection of 500 ng LH-RH into Stag 2 (intact) stimulated an increase in plasma levels of LH, and there was a consequent increase in testosterone levels. The LH response was greatest in August, while the testosterone response was greatest in October. The injection of 500 ng LH- RH to the castrated stag (No. 5) induced an increase in LH levels at both periods that was as large in amplitude as that seen in August in the intact stag, but the testosterone levels remained undetectable. Discussion The structural changes in the testes of the stag during the year have been described for young and older animals (Frankenberger, 1953; Lincoln, 1971a, b; Hochereau-de Reviers & Lincoln, 1978). The steroidogenic and spermatogenic functions of the testes are greatest in the autumn between September and November, with a nadir in the spring and early summer from April to June. The seasonal cycle in testosterone secretion causes changes in each of the androgen target organs which wax and wane in size or activity. Such effects are seen in the antlers, for example, which are cast and regrown each spring when circulating levels of testosterone are hardly detectable. Shedding of the velvet from the mature antler is induced by increasing testosterone levels before the mating season in the autumn, and the antlers then remain as a dead, bony structure attached to the antler pedicles throughout the autumn and winter, while testosterone levels remain high (Lincoln, Youngson & Short, 1970). Because of this testicular control of the antler cycle, stags which are castrated as adults grow antlers but these remain permanently in velvet and are not cast, as observed in the present study. While it is possible to predict the endocrine status of a stag from observations of its secondary sexual characteristics, the details of the hormonal changes are not revealed. The present study employing sequential blood sampling shows that testosterone secretion in the stag fluctuates enormously in the short term, even during the sexually active period in the autumn and winter. At this time plasma levels of testosterone may change from undetectable (<0.20 ng/ml) to above 10.0 ng/ml within 1h). Testosterone sectetion is therefore markedly episodic in the stag as in many other mammalian species, and the seasonal cycle in testosterone secrection involves changes in the size and frequency of the episodes of release. The changes in LH secretion might be expected to dictate the pattern of testosterone secretion, and the results for the August and October sampling periods support this view since there is a consistent relationship

237 between the plasma LH and testosterone peaks. This relationship, however, is not apparent at most times of the year and it leads to some doubt as to whether the fluctuations in LH are solely responsible for the changes in testosterone. This point is clarified, however, by the study with LH-RH which illustrates that the tesis changes its responsiveness to LH, and at the time of maximum testicular size in October a small increase in the levels of LH can result in a relatively large increase in the level of testosterone in the plasma. This heightened responsiveness during the period of full testicular development means that even small changes in LH may induce the release of testosterone. The observations of spontaneous increases in testosterone in the plasma at this time (September to January) in the apparent absence of changes in LH may reflect the lack of sensitivity of the radioimmunoassay to detect the changes in LH rather than the control of testosterone secretion by another factor. From other reports it is known that the number, size and activity of the Leydig cells of the testis of the stag increases in the autumn (Brüggermann et al., 1965; Lincoln, 1971a; Hochereau-de Reviers & Lincoln, 1978) and these changes could account for the enhanced responsiveness to LH. While the circulating levels of LH in the intact stag change with season, there is no clear cycle in the castrated animals. In these the LH levels are increased due to the lack of inhibitory steroid feedback from the testes, and the plasma levels are maintained by very frequent peaks of release; the frequency (up to 10/6h) is higher than that ever seen in the intact animal, even in the middle of the rut. This implies that steroid negative feedback operates at all times of the year in the normal animal, and there is a change in hypothalamic sensitivity to this negative feedback resulting in the seasonal changes in LH secretion. A similar situation is thought to occur in the sheep, although seasonal changes in plasma levels of LH do occur even in the castrated animal (Pelletier & Ortavant, 1976a, b). Changes in daylength influence the seasonal changes in gonadotrophin secretion in the stag (Jaczewski, 1954; Pollock, 1975) and the present results are consistent with the view that daylength has its effects primarily by changing the sensitivity of the hypothalamus to circulating steroids. Acknowledgement: These studies were supported by Ministry of Education of Slovak Republic, Grant VEGA 1/0565/03. References 1. Brüggermann, J., Adam, A. & Karg, G. H. (1965). I.C.S.H.-Bestimungen in hypophysen von rehböcken (Capreolus capreolus) und hurschen (Cervus elaphus) unter berückstichtigung des saisoneinflusses. Acta endocr., Copenh.48,

238 2. Corker, C.S. & Davidson, D. W. (1978). The radioimmunoassay of testosterone in various biological fluids without chromatography. J. Steroid Biochem. 9, Frankenberger, Z. (1953). Pohlavni cyklus jelene (Cervus elaphus L.). Cske Morf. 1, Hochereau-de Reviers, M. T. & Lincoln, G. A. (1978). Seasonal variation in testicular histology of the red deer stag. (Cervus elaphus) J. Reopord. Fert. 54, Jaczewski, Z. (1954). The effect of changes in length of daylight on the growth of antlers in the deer (Cervus elaphus L.). Folia Biol. 2, Lincoln, G. A. (1971a). The seasonal reproductive changes in the red deer stag (Cervus elaphus). J. Zool., Lond. 163, Lincol, G. A. (1971b). Puberty in a seasonally breeding male, the red deer stag (Cervus elaphus L.). J. Repord. Fert. 25, Lincol, G. A., Youngson, R. W. & Short, R. V. (1970). The social and sexual behaviour of the red deer stag. J. Repord. Fert., Suppl. 11, Martensz, N. D., Baird, D.T., Scaramuzzi, R. J. & Van Look, P. F. A. (1976). Androstenedione and the control of luteinizing hormone in the ewe during anoestrus. J. Endocr. 69, Pelletier, J. & Ortavant, R. (1976a) Photoperiodic control of LH release in the ram. I. Influence of increasing and decreasing light periods. Acta endocr., Copenh. 78, Pelletier, J. & Ortavant, R. (1976b). Photoperiodic control of LH release in the ram. II. Light androgen interactions. Acta endocr., Copenh. 78, Pollock, A. M. (1975). Seasonal changes in appetite and sexual condition in red deer stags maintained on a six.month photoperiod. J. Physiol., Lond. 244, 95-96P. 13. Scaramuzzi, R. J., Caldwell, B. V. & Moor, R. M. (1970). Radioimmunoassay of LH and estrogen during the estrous cycle in the ewe. Biol. Reprod. 3,

239 METODICKÝ POSTUP ZMRAZOVANIA SEMENA BARANOV V PLÁVAJÚCOM ZÁVESNOM ZMRAZOVAČI METHOD OF FREEZING OF RAM SEMEN IN THE SWIMMING HANG UP FREEZER Riha, Ľ., Apolen, D., Pivko, J., Grafenau, P., Kubovičová, E. Ústav genetiky a reprodukcie hospodárskych zvierat, VÚŽV Nitra Ústav šľachtenia oviec a kôz, Trenčianska Teplá Abstract Many factors influence survivability of sperms after deep freezing. One of the most important principle during semen conservation is creation of such environment, which comes up close to the natural conditions created by seminal plasma. For achieving this intention, available diluents which protect sufficient number of fertile sperms are necessary. By the use of the new methods, diluents on the base of Tris with addition of egg yolk are prepared and are widly used in various animal species, including rams. Úvod Využívanie biotechnických metód napomáha intenzifikovať chov oviec. Vyspelí chovatelia si nevedia predstaviť reprodukciu v chove oviec bez využitia umelej inseminácie. Insemináciu je možné realizovať buď nariedeným čerstvým, resp. konzervovaným semenom. Čerstvým semenom je možné inseminovať priamo v chove, bezprostredne po jeho odobratí a nariedení. Vo vzdialenejších chovoch sa inseminácia robí konzervovaným semenom. Konzerváciu semena možno robiť zmrazovaním, alebo schladením, čo je alternatívou zmrazovania. Najlepšie výsledky inseminácie so schladeným semenom možno dosiahnuť, ak je inseminačná dávka deponovaná do 6 až 12 hodín po jeho odobratí a spracovaní. V chovoch v ktorých nie je možné dodržať toto časové rozpätie je vhodnejšie použiť pre výkon inseminácie zmrazené semeno, ktorého doba skladovania je neobmedzená. Treba však brať do úvahy, že úspešnosť inseminácie v tomto prípade nezodpovedá súčasným požiadavkám. Materiál a metódy Metodický postup procesu zmrazovania semena je náročný, nakoľko semeno baranov je oveľa citlivejšie v porovnaní so semenom iných plemenníkov. Súčasťou riedidiel používaných na riedenie semena určeného na zmrazovanie je glycerol, ktorý zabraňuje prasknutiu akrozómovej membrány počas zmrazovacieho procesu. Spermie baranov sú na glycerol, ako aditívum riedidiel, oveľa citlivejšie ako spermie býka.glycerol však po

240 20-30 minutách pôsobí na spermie toxicky, preto je vhodné použiť ho tesne pred mrazením. Semeno môžeme zmrazovať pomocou programovatľného zmrazovača, alebo v izotermickom boxe nad hladinou tekutého dusíka. Jednoduché a pomerne lacné zariadenie, vhodné pre prax je Plávajúci závesný zmrazovač, pomocou ktorého je možné realizovať náročný proces zmrazovania baranieho semena. Plávajúci závesný zmrazovač zahŕňa: styrofoamovú debnu, parník z nehrdzavejúcej ocele, pontónové príslušenstvo, uzatváraciu závoru, háčiky, a vešiak na 0,5 ml makrotuby (kapacita 36 pejet). Plávajúci závesný zmrazovaž obsahuje nasledovné príslušenstvo: Adaptér na 2,5 ml makrotuby udrží 72 makrotúb Adaptér na 0,5 ml stredné pejety udrží 100 pejet Adaptér na 0,25 ml mini pejety udrží 150 pejet 65 mm plastikový pohárik Postup zmrazovania: nastaviť vzdialenosť vešiaka nad tekutým dusíkom na požadovanú vzdialenosť. Výška pejet môže byť upravená na 10 mm, 15 mm, 20 mm, 25 mm a 30 mm nad tekutým dusíkom zavesením držiakov vešiaka do štrbín na stranách pontónov. Úprava na 10, 20 alebo 30 mm výšku je pripravená na oboch stranách pontónov na 3 štrbinách. Ak je potrebné nastavenie 15 mm a 25 mm výšky, pontóny musia byť spojené a otočené pre prístup a prešmyknutie sa držiakov vešiaka na druhú štrbinu. v ďalšom kroku naplniť parník z nehrdzavejúcej ocele tekutým dusíkom do výšky približne 6 cm. Využiť normu hĺbky na bočnej strane parníka na naplnenie približného množstva tekutého dusíka. Nechať parník chladnúť prinajmenšom 10 minút a pridať ďalšiu dávku tekutého dusíka v takom množstve, aby bola opäť dosiahnutá výška minimálne 6 cm. Pridať vrchnák styrofoamovej debny a nechať ustáliť. Priložiť makrotuby na vešiak obsahujúci pontónové príslušenstvo. Ak sú použité pejety, tieto musia byť umiestnené na vhodný adaptér vešiaka, ktorý potom musí byť umiestnený v príslušenstve pontónu. Naplnený vešiak a pontónové príslušenstvo bude klesať a ponárať pejety do tekutého dusíka minimálne 20 minút. Čas potrebný na vznášanie je môžné znížiť a krivku zmrazovania je môžné modifikovať pridaním 5 ml kovových guličiek ako záťaž na každý zo 4 pontónov. Čas potrebný na vznášanie je tak zredukovaný o 1 minútu na každých 5 guličiek pridaných na každý pontón. Zasunúť uzatváraciu závoru do určenej štrbiny nachádzajúcej sa na každom konci príslušenstva medzi pontónmi. Uhlopriečkovite zavesiť háčiky pod výstupky na uzatváraciu závoru.

241 Opatrne nadvihnúť príslušenstvo pontónu pomocou háčikov a preložiť do Styrofoamovej debny. Jemne spustiť príslušenstvo pontónu do tekutého dusíka v parníku z nehrdzavejúcej ocele a udržiavať požadovanú hladinu s tekutým dusíkom. Tekutý dusík môže vyšplechnúť pri prenikaní vešiaka do kvapaliny. Opatrne vyberať háčiky s príslušenstva pontónu. Nechytať sa žiadnej časti príslušenstva pri vyberaní háčikov, pretože to môže spôsobiť predčasné ponorenie semena do tekutého dusíka. Vrátiť vrchnák Styrofoamovej debny na pôvodné miesto. Tekutý dusík pomaly prenikne do pontónov cez malé kruhové otvory na koncoch pontónov, čo spôsobí, že vznášajúci sa vešiak na zmrazovanie semena začne klesať. Keď tekutý dusík prenikne do pontónov cez malé dierky, pontóny sa pomaly ponoria, až na miesto, kde dusík preteká cez veľké vodorovné štrbiny. Tekutý dusík prenikajúci cez tieto štrbiny zaplaví pontóny a spôsobí klesanie príslušenstva do bodu ponorenia sa pejet do tekutého dusíka. Keď sa pojety ponoria, premiestniť uzamykajúcu závoru pomocou dvoch háčikov. Prichytiť háčiky k vydvihnutým držiakom nachádzajúcim sa na vonkajších okrajoch medzi pontónmi na každom konci a vybrať príslušenstvo. Keď je príslušenstvo vybraté, nakloniť pontóny dovnútra a pejety popadajú do tekutého dusíka. Tekutý dusík z pontónov vyliať do parníka z nehrdzavejúcej ocele. Vybrať príslušenstvo pontónu z debny. Držiak z nehrdzavejúcej ocele obsahuje 6 dierok na vsadenie plastového pohárika. Vešiak by mal byť po použití vytemperovaný na izbovú teplotu a vysušený pre ďalšie použitie. Malé dierky na predných stranách pontónov slúžiace na prenikanie tekutého dusíka by mali byť pred každým použitím vyčistené dodaným čistiacim drôtom. Diskusia Pri riešení výskumnej úlohy sme chceli poukázať na možnosť, že aj náročný proces zmrazovania baranieho semena sa dá realizovať pomocou jednoduchého a pomerne lacného zariadenia Plávajúci závesný zmrazovač, pričom kvalita inseminačných dávok je porovnateľná s inými metódami zmrazovania a pri ich hodnotení sa dajú využívať pomerne jednoduché laboratórne analýzy, ktoré si nevyžadujú ekonomicky náročnú laboratórnu techniku a prístrojové vybavenie.

242 Záver Laboratórne skúšky čerstvého odobratého a hlbokozmrazeného semena Čerstvé odobraté semeno po nariedení príslušným riedidlom a po pridaní aditív do každého riedidla aj s kontrolnou vzorkou podrobíme laboratórnym skúškam. Hlboko zmrazené inseminačné dávky po zmrazení podrobíme krátkodobému termickému testu, kde tesne po rozmrazení stanovíme % progresívne sa pohybujúcich spermií ( aktivitu). Rozmrazené inseminačné dávky počas krátkodobého termického testu uložíme do termostatu pri teplote 38 o C. Po uplynutí 30 a 60 min. odoberieme vzorky na stanovenie % progresívne sa pohybujúcich spermií ( aktivitu ). Z posudzovaných inseminačných dávok vykonáme nátery a farbenie podľa Giemsa na stanovenie % morfologických zmien. Záverečným hodnotením vplyvu zmrazovania semena baranov na morfológiu a preživateľnosť je % kotnosti z pripúšťania pokusnej skupiny bahníc. Literatúra Gil, F. J., Lundehein, M., Söderquit, Z., Rodriguez-Martínez, H.: Influence of extender, temperature, and addition of glycerol on post-thaw sperm parameters in ram semen. Theriogenology 59, 2003, Laureiro, J.G.: Fertility of frozen ram semen under field conditions With special reference to influence of extenders and freezing procedures. Acta Universitatis Agriculturae Suectae Veterinaria 110, Mesároš, P., Gamčík, P., Schvarc, F.: Prežívateľnosť spermií barana pri použití rôznych druhov riedidiel po hlbokom zmrazení v tekutom dusíku. Vet. med., 22, (10), 1977, č. 10. Mesároš, P., Gamčík, P.: Štúdium možnosti zmrazovania semena barana v riedidle bez glycerínu. Vet. med., 42, 10, 1992, Mortimer, S.T., Maxwell, W.M.CH.: Effect of medium on the kinematics of frozen thawed ram spermatozoa. Society for Reproduction and Fertility, ISSN, 2004,

243 METABOLICKÝ PROFILOVÝ TEST METABOLIC PROFILE TEST Schneidgenová, M. Slovenská poľnohospodárska univerzita, Katedra fyziológie živočíchov Abstract The aim of our work was to provide information regarding the basics and meaning of metabolic profile test in rearing of dairy cattle. Metabolic profile test is significant method in detection of subclinical stage of metabolic disorders. It allows control of health and good physiological status of animal. For better diagnostic is necessary to select fitting profile ( proteins, energetic, mineral, vitamine profiles...). It is also very important to choose representative sample of animal in order to have significant results about all herd and to avoid metabolic diseases. In conclusion, metabolic profile test is useful help for farmers and breeders to keep animals in good condition. Úvod Pre dosiahnutie a udržanie vysokej úžitkovosti hospodárskych zvierat je najdôležitejšou podmienkou ich dobrý zdravotný stav. Zdravie zvierat je ovplyvňované nespočetnými faktormi, ktoré ho môžu udržať a upevniť, ale aj narušiť. V súčasných moderných podmienkach živočíšnej výroby sú na zvieratá kladené vysoké požiadavky a len súlad podmienok chovu a miery produkčného zaťaženia zvieraťa je zárukou zachovania jeho zdravia. Ochorenie má veľký vplyv na produktivitu a ziskovosť chovu. Priamy dopad choroby na organizmus zvieraťa sa môže prejavovať znížením príjmu krmiva, znižovaním dojivosti a prírastkov na hmotnosti, chradnutím a v neposlednom rade i úhynom zvieraťa. V záujme prevencie priamych i nepriamych strát v chovoch dojníc je nevyhnutné rozpracovanie vhodných postupov včasnej diagnostiky vyvíjajúcich sa metabolických resp. produkčných chorôb stáda. Závažnosť produkčných chorôb spočíva v tom, že prebiehajú väčšinou subklinicky, čo sťažuje ich včasnú a úspešnú diagnostiku v terénnych podmienkach. Dôslednejšie vyšetrenie stáda a odhalenie produkčných ochorení je možné cez odber biologického materiálu a jeho rozbor pomocou laboratórnych diagnostických metód, ktoré tvoria neoddeliteľnú súčasť tzv. metabolického profilového testu (MPT). Podľa Ofúkaného (1983) metabolický profilový test predstavuje súbor klinických, biochemických, hematologických, acitetických a atofyzikálnych sledovaní a analýz.

244 Výsledky metabolického testu slúžia ako podklad pre uskutočnenie preventívnych a terapeutických opatrení (úprava kŕmnej dávky, odborné veterinárne úkony, zlepšenie zoohygieny, zlepšenie kvality objemových krmív atď.), ktoré zrealizuje chovateľ v spolupráci s odborným poradcom pre výživu a veterinárnym lekárom. Vrzgula et al. (1990) uvádzajú, že zdravie zvierat, ktoré je základným predpokladom efektívnej výroby, ovplyvňuje celý rad faktorov, predovšetkým však človek ako subjekt riadenia výrobného procesu. Základným problémom tvorby a ochrany zdravia zvierat, a tým i úrovne produkcie, ako aj biologickej hodnoty a zdravotnej bezchybnosti živočíšnych produktov je zabezpečenie dostatočného príjmu potrebných živín (energia, N-látky, minerálne látky, vitamíny, voda, kyslík) a optimálneho prostredia pre biotechnologický proces premenu látok v živočíšnom organizme. Ako uvádza Fečková (2001), za najspoľahlivejší spôsob kontroly látkového metabolizmu z hľadiska hodnotenia homeostázy sa považuje stanovenie biochemických ukazovateľov krvi a moču a komplexné posúdenie vzájomných vzťahov jednotlivých ukazovateľov. Podľa Slaninu et al. (1991), rozsah profilových testov určuje na základe zistených problémov v chove vedúci tímovej skupiny a závisí od technického vybavenia pracovísk. Podľa Kantíkovej a Balážika (2003) sa vykonáva tzv. základný metabolický test alebo rozšírený metabolický test, ktorý môže zahŕňať ukazovatele nasledujúcich metabolických profilov: hematologický, makrominerálny, mikrominerálny, dusíkový, energetický, enzymatický, vitamínový, acidobázický, močový, bachorový, mliekový. Parametre v jednotlivých profiloch možno doplniť ďalšími, diagnosticky významnejšími parametrami, resp. niektoré vynechať ako diagnosticky nezávažné vzhľadom na predpokladanú metabolickú poruchu. Dusíkový (bielkovinový)profil Vencl (1991) uvádza, že trávenie a metabolizmus dusíkatých látok je výrazne ovplyvňované mikrobiálnou činnosťou v bachore. Prijaté bielkoviny krmív sú z väčšej časti štiepené na aminokyseliny a až na amoniak. Stupeň rozkladu dusíkatých látok kŕmnej dávky (asi 70%) je daný obsahom rozpustných nebielkovinových látok a vlastnosťami bielkovín krmiva. Mikrobiálny rozklad bielkovín krmív je vyrovnávaný tvorbou bielkovín biomasy mikroorganizmov žijúcich v predžalúdkoch. Rozsah tvorby mikrobiálnej biomasy, pri ktorej sa využívajú produkty rozkladu dusíkatých látok, závisí hlavne na množstve stráviteľnej organickej hmoty v bachore. Stráviteľná organická hmota tak významne ovplyvňuje množstvo vytvorenej mikrobiálnej bielkoviny a je dôkazom úzkej súvislosti

245 metabolizmu dusíkatých látok a energie u prežúvavcov. Pri nedostatku energie a zvýšenom prívode rozložiteľných dusíkatých látok sa zvyšuje množstvo amoniaku v bachorovej tekutine, zvyšuje sa tvorba močoviny v pečeni a vylučovanie dusíka močom, prípadne mliekom. Energetický profil Slanina a Beseda (1992) uvádzajú, že energetický profil hovädzieho dobytka je závislý od príjmu energie, vlákniny a bielkovín, úžitkovosti, gravidity, veku a zdravotného stavu. Nesprávny príjem energie sa u hovädzieho dobytka zaraďuje medzi najčastejšie nutričné nedostatky. Osobitný význam má najmä u vysokoúžitkových dojníc a v intenzívnom výkrme. Najzávažnejším obdobím energetického profilu je prvá fáza laktácie, spadajúca do kritických biologických fáz dojníc. Pre uvedené obdobie je typická energetická deficiencia, čo sa prejavuje znížením koncentrácie a mobilizáciou lipidových zdrojov organizmu. Charakteristickým ochorením dojníc v dôsledku narušenia metabolizmu cukrov a tukov je ketóza. Enzýmový profil Enzýmový profil sa využíva najmä v diagnostike funkčných porúch pečene, pri myopatiách, resp. chorobách kostí a srdcového svalu. Minerálny profil Nedostatok minerálnych látok v kŕmnej dávke zvierat sa nemusí prejaviť zreteľnými klinickými príznakmi, ale často prebieha za príznakov subklinických, uvádza Veselý (1988). U samíc sa tak znižuje laktácia, prejavujú sa poruchy plodnosti, mláďatá sa rodia s nízkou životnosťou a v malom počte, dosahujú sa nízke denné prírastky na hmotnosti, pričom sú zvieratá málo odolné voči rôznym ochoreniam. Záver Cieľom našej práce bolo popísať význam metabolického profilového testu so zameraním na využitie výsledkov v praxi kvôli včasnému odhaleniu skrytých chorôb a porúch v chovoch dojníc. Metabolický profilový test umožňuje odhaliť poruchy zdravotného stavu ešte pred objavením sa klinických príznakov ochorenia a čas vykonať preventívne opatrenia, ktoré by zabránili, alebo aspoň zmiernili prejavy metabolického ochorenia a jeho dopad na produkciu a najmä ekonomiku chovu.

246 Literatúra 1. OFÚKANÝ, L Výsledky vyšetrení metabolického profilového testu u hovädzieho dobytka v r v SSR. In: Veterinářství, roč. 29, 1983, č. 2, s VRZGULA, L. et al Poruchy látkového metabolizmu hospodárskych zvierat a ich prevencia. 2. vyd., Bratislava : Príroda. 1990, 503 s. ISBN FEČKOVÁ, M Hodnotenie vybraných ukazovateľov metabolického profilu dojníc v podmienkach PD Močenok. Diplomová práca. 2001, s SLANINA, Ľ. et al Vademecum vet. medicíny. Bratislava : ŠVS SR s KANTÍKOVÁ, M. BALÁŽIK, T Diagnostika metabolických porúch alebo prevencia je vždy lacnejšia. In: Slovenský chov, roč. 8, 2003, č. 7, s VENCL, B Energie v krmní dávce a množství a složení mléka. In: Náš chov, 1991, č. 5, s SLANINA, Ľ. BESEDA, I Metabolický profil hovädzieho dobytka vo vzťahu k zdraviu a produkcii. 2 vyd. Bratislava : ŠVS SR. 1992, ISBN VESELÝ, Z Výživa a krmení hospodářskych zvířat. 2 vyd. Praha : SZN, s.

247 NOVÝ REGULÁTOR OVARIÁLNYCH FUNKCIÍ OŠÍPANÝCH HORMÓN THROMBOPOIETÍN NEW REGULATOR OF OVARY FUNCTION OF PIGS HORMONE TROMBOPOIETINE Sirotkin, A. V., P. Sanislo, H.-J. Schaeffer 2, I. Florkovičová, J. Kotwica 3, L. Hetényi 1 Výskumný ústav živočíšnej výroby, Nitra, Slovensko; Research Institute of Animal Production, Nitra, Slovakia, 2 Universitäts- Frauenklinik, Köln, Germany a 3 Institute of Animal Production and Food Research, Olsztyn-Kortowo, Poland Abstract The effect of TPO, with and without blockers of protein kinase A (PKA, KT5720) and mitogen activated protein kinase (MAPK, PD98059), was investigated using cultured porcine ovarian cells. TPO stimulated proliferation (expression of PCNA), apoptosis (bax), accumulation of protein kinases (PKA, MAPK, TK, cdc2/p34) and transcription factor CREB, but inhibited secretion of A, E, TGF and IGFBP-3 and stimulated P, OT, inhibins and IGF-I output. PKA and MAPK blocker were able to prevent or reverse these TPO effects. These results offer the first evidence that TPO is a potent regulator of ovarian cell functions, including proliferation, apoptosis, the secretion of steroids, peptides, growth factors and binding proteins, and the expression of some intracellular messengers. They also demonstrate the importance of PKA and MAPK in mediating the effects of TPO on ovarian cells. Úvod Thrombopoietín (TPO) je peptidný hormón, známy ako aktivátor proliferácie a diferenciácie megakariocytov (Drachmann a kol., 1999; Matsumura a kol., 2000). Preto sa používa pri liečbe porúch krvotvorného systému.. Napriek tomu, že mrna pre syntézu TPO bola zistena aj v ovariálnych bunkách ľudí (Furunashi a kol., 1999) a škrečkov (Kaszubska a kol., 2000; Ryll et al., 2000), účasť TPO v regulácii reprodukčných procesov zatiaľ nebola preskúmaná. Hormóny ovplyvňujú funkcie buniek cez vnútrobunkové proteín kinázy proteín kinázu A (PKA), tyrozín kinázy (TK), aktivované mitogénmi proteín kinázy (MAPK) a závislé od cyklínov proteín kinázy (CDK) a iné. Vnútrobunkové mechanizmy účinku TPO neboli zatiaľ zistené. Cieľom nášho výskumu bolo zistiť biologickú úlohu a vnútrobunkové mechanizmy účinku TPO v ováriach ošípaných.

248 Materiál a metódy Ovariálne folikuly izolované z vaječníkov necyklujúcich ošípaných vo veku dní sme kultivovali v médiu DMEM/F-12 s 10% teľacieho fetálneho séra bez- a s TPO (v dávkach 0, 1, 10 alebo 100 ng/ml média), blokátormi PKA (KT5720, 10 ng/ml) a MAPK (PD98059, 10ug/ml). Produkciu progesterónu (P), androstendionu (A), estradiolu (E), oxytocínu (OT), inhibínov A a B, rastových faktorov IGF-I a TGF2 beta, väzbového faktoru pre IGF IGFBP-3, markerov apoptózy (BAX), proliferácii (PCNA), MAPK/ERK1,2, TK (phosphotyrosín), PKA a regulovaného camp/pka/mapk transkripčného faktoru CREB-1 sme analyzovali pomocou metód RIA/EIA, ELISA, SDS PAGE-Western imunoblotting a immunocytochémii (Sirotkin a kol., 2003). Výsledky a diskusia Počas pokusov sme pozorovali, že kultúra ovariálnych folikulov bola sprevádzaná akumuláciou v inkubačnom médiu rôznych hormónov, ktorá sa zvyšovala s časom inkubácie, a akumuláciou signálnych látok vo vnútri buniek. Prídavky TPO zvyšovali expresiu PCNA, bax, PKA, MAPK, TK, cdc2/p34 a CREB (Obp. 1), inhibovali sekréciu A, E, TGF and IGFBP-3 a stimulovali vylučovanie P, OT, inhibínov a IGF-I. Blokátor PKA potláčal expresiu bax, TGF a MAPK, zvyšoval expresiu PKA, CREB a OT, a neovplyvňoval iné analyzované parametre. Blokátor MAPK inhiboval sekréciu inhibínov, ale nie iných látok. Blokátory PKA a MAPK pridané spolu s TPO zabraňovali, obracali alebo zosilňovali efekty TPO na väčšinu analyzovaných parametrov Niektoré efekty blokátora PKA sú uvedené na Obr. 2. Obr. 1. Stimulačný vplyv TPO na expresiu vnútrobunkových signálnych látok v kultivovaných ovariálnych bunkách ošípaných (Údaje SDS PAGE- Westerm immunoblotting)

249 TPO stimulates the expression of some signalling molecules in porcine ovarian follicles VI. Celoslovenský seminárz fyziológie živočíchov PCNA -36K Bax -23K CDK -34K TK -48K PKA -47K CREB-43K TPO dose (ng/ml) ng/ml Obr. 2. Efekt TPO a TPO v kombinácii s blokátorom PKAna vylučovanie IGF-I (vľavo) a inhibínu A (vpravo) kultivovanými ovariálnými bunkami ošípaných (údaje RIA-ELISA). Údaje sú priemery + smerodajné odchylky, * - preukazné rozdiely s kontrolou (kultúry bez TPO).

250 PKA blocker promotes TPO effect on IGF-I (left) and inhibin A (right) release by porcine ovarian follicles Hormone release (ng/mg tissue/day) TPO + blocker * TPO * alone Preparation dose added (ng/ml medium) * * Hormone release (ng/mg tissue/day) Preparation dose added (ng/ml medium) * * TPO + blocker TPO alone * * Tieto výsledky sú prvé svedectvá o novej úlohe TPO v organizme je dôležitý regulátor reproduktívnych procesov. Naše pozorovania demonštrujú, že TPO je zapojený do regulácie proliferácie, apoptózy a sekrécie steroidných, peptidových hormónov, rastových faktorov a ich väzbových proteínov. Okrem toho, naše výsledky potvrdzujú dôležitosť vnútrobunkových mechanizmov závislých na PKA a MAPK v kontrole základných funkcií ovariálnych buniek. Účinky TPO na PKA, MAPK a CREB, a modifikácia účinkov TPO blokátormi PKA a MAPK sú prvými svedectvami toho, že TPO môže kontrolovať funkcie ovariálnych buniek cez PKA- a MAPK-závislé vnutrobunkové mechanizmy. Závery (1) Thrombopoietín (TPO) je dôležitý regulátor proliferácie, apoptózy, sekrécie peptidových, steroidných hormónov, rastových faktorov a ich väzbových proteínov ovariálnymi bunkami.

251 (2) Proteín kináza A (PKA) a MAK kináza (MAPK) kontrolujú tieto ovariálne funkcie (3) Vnútrobunkové mechanizmy závislé na PKA a MAPK sprostredkujú efekty TPO na vaječníky. Literatúra Drachman JG, Rojnukarin P, Kaushansky K. Thrombopoietin signal transduction: studies from cell lines and primary cells. Methods 1999,17: Furunashi M, Miyabe Y, Oda H. A case of thrombopoietin-producing ovarian carcinoma confirmed by immunocytochemistry. Gynecological Oncology 1999,74: Kaszubska W, Zhang H, Patterson RL, Suhar TS, Uchic ME, Dickinson RW, Schaefer VG, Haasch D, Janis RS, DeVries PJ, Okasinski GF, Meuth JL. Expression, purification, and characterization of human recombinant thrombopoietin in chinese hamster ovary cells. Protein Expression and Purification 2000,18: Ryll T., Dutina G, Reyes A, Gunson J, Krummen L, Etcheverry T. Performance of small-scale CHO perfusion cultures using an acoustic cell filtration device for cell retention: characterization of separation efficiency and impact of perfusion on product quality. Biotechnology and Bioengineering 2000,69: Sirotkin AV, Florkovicova I, Makarevich AV, Schaeffer H-J, Kotwica J, Marnet P-G, Sanislo P. Oxytocin mediates some effects of insulin-like growth factor-i on porcine ovarian follicles. Journal of Reproduction and Development 2003, 49: Wendling F, Vainchenker W. Thrombopoietin and its receptor. European Cytokine Network 1998,9: Kontaktná adresa: RNDr. Alexander Sirotkin, DrSc., Lab. endokrinológie, Výskumný ústav živočíšnej výroby, Hlohovská 2, Nitra.

252 VPLYV ZINKU A KADMIA NA ICH DISTRIBÚCIU VO VAJCIACH JAPONSKÝCH PREPELÍC INFLUENCE OF ZINC AND CADMIUM ON DISTRIBUTION IN JAPANESE QUAIL EGGS Skalická, M., Koréneková, B., Naď, P.,*Dolinská, S., *Kušnírová, E. Katedra výživy,dietetiky a chovu zvierat, Univerzita veterinárskeho lekárstva, Košice, *Prešovská univerzita, Prešov Abstract The effect of zinc and cadmium on quality of Japanese quail eggs was investigated. Japanese quails (n=80) were divided into 3 groups. Each group consisted of 20 birds. Group 1 was the control group. In the experimental group G2, 0.12mg of Cd for one quail was added. In experimental group 3, Zn was administered daily in form of water solution in dose 12 mg of Zn for one quail. In group G4, combination of Cd and Zn, in dose 0.12mg of Cd and 12 mg of Zn. The levels of Zn and Cd in eggs were evaulate vith method AAS. It was observed protective effect of Zn against of Cd long-term application in Japanese quail. Úvod Zinok je esenciálny prvok pre zvieratá. Je súčasťou viacerých biochemických reakcií. Úloha zinku pre metabolizmus organizmu vyplýva z jeho účasti v štruktúre rozličných enzýmov, dehydrogenázy, aldolázy, fosfatázy, peptidázy a i. Viac než 70 enzýmov obsahuje zinok. Pri ďalších enzýmoch pôsobí ako ko-faktor (Zowczak-Drabarczyk et al., 2004). Jeho resorpcia je závislá od viacerých faktorov napr. vek, vzájomný pomer s inými elementami. Dokázalo sa to pri ošípaných, hydine a psoch. Deficit zinku sa pozoroval aj u hydiny. Nedostatok zinku narušuje aj reprodukciu. Narušená osteogenéza ako dôsledok karencie zinku sa zistila pri hydine (Kottferová, 1996). Kadmium sa zaraďuje medzi významné kontaminanty životného prostredia, pričom na globálnej emisii zeme sa podieľa ročne tonami s viac než 90% príjmom zo zdrojov spôsobených ľudskou činnosťou (Stoeppler, 1991). Vyššie dávky kadmia môžu viesť k toxickým účinkom (Massanyi et al., 1999). Japonské prepelice sú chované na produkciu vajec a mäsa. Cieľom experimentu bolo sledovanie hladín zinku a kadmia v bielku, žltku a škrupine vajec Japonských prepilíc a ochranný účinok zinku voči kadmiu.

253 Materiály a metódy V experimente boli použité Japonské prepelice v počte 80ks, rozdelené do 4 skupín po 20ks. Skupina K bola kontrolná. V skupine 2, bolo podané Cd (CdCl 2.2 H 2 0)v dávke 0.12 mg Cd na 1 kus. V 3 skupine bol zinok denne podávaný vo forme vodného roztoku (ZnSO 4.6H 2 O) v dávke 12 mg na jednu prepelicu. V skupine 4, bola podávaná kombinácia Zn+Cd, (12 mg Zn a 0,12 mg Cd), Prepelice boli kŕmené kompletnou kŕmnou zmesou HYD 10. Kŕmna zmes a voda boli podávané ad libitum. Podmienky experimentu boli v súlade s etickými požiadavkami. Biologický pokus trval 58 dní. Vzorky boli spracované mikrovlnným rozkladom a analyzované na prítomnosť Zn a Cd na AAS podľa metodiky, ktorú uvádza Kocourek, (1992). Štatistické vyhodnotenie výsledkov bolo analyzované Studentovým t - testom v programe Microsoft Excel 7,0 na hladine významnosti P 0,05; P 0,01 a P 0,001 medzi skupinami. Výsledky a diskusia Kadmium Zistili sme, že po prídavku Zn (Tab.1) sa hladiny Cd štatisticky významne znížili v bielku, žĺtku aj v škrupine na 35. deň, kým na 50. deň sa štatisticky významne znížili v bielku a škrupine v porovnaní so skupinou, kde bolo podávané len Cd. Korelačné koeficienty boli významné v žĺtku na 35. a 50.deň (r = 0,858; 0,835). V skupine, s prídavkom Cd, bolo zistené výrazné zvýšenie Cd v bielku, žĺtku a hlavne v škrupine vajec. Po prídavku Cd+Zn sa na 35. aj 50. deň pokusu štatisticky významne zvýšili hladiny kadmia v bielku žĺtku a škrupine Japonských prepelíc v porovnaní so skupinou s prídavkom Zn. Zinok Pozorovali sme, že po prídavku Zn (Tab.2) sa hladiny Zn štatisticky významne zvýšili v bielku, žĺtku aj v škrupine na 35. aj 50. deň v porovnaní s Cd skupinou. Korelačné koeficienty boli významné v žĺtku na 35. deň (r =-0,823). V skupine, s prídavkom Cd, bolo hladina Zn v bielku a žĺtku porovnateľná s kontrolou. Po prídavku Cd+Zn sa na 35 deň. v škrupine štatisticky významne znížili hladiny Zn. Na50. deň pokusu štatisticky významne znížili hladiny Zn v bielku, žĺtku a škrupine Japonských prepelíc v porovnaní so skupinou s prídavkom Zn.

254 Množstvo kadmia a zinku (mg.kg 1 ) vo vajciach japonských prepelíc TAB. 1 Hladiny 35.deň 50.deň kadmia bielok žltok škrupina bielok žltok škrupina kontrola x 0,011 0,013 0,024 0,022 0,020 0,027 sd 0,004 0,008 0,010 0,011 0,011 0,013 xmax 0,015 0,027 0,039 0,040 0,040 0,050 Cd 10 x 0,029 0,087 0,823 0,055 0,024 0,725 sd 0,008 0,033 0,207 0,018 0,009 0,194 xmax 0,040 0,130 1,020 0,085 0,041 0,910 Zn x 0,005*** 0,024** 0,019*** 0,016** 0,016 0,010*** sd 0,001 0,005 0,011 0,003 0,005 0,002 xmax 0,006 0,030 0,030 0,019 0,019 0,013 CdZn x 0,022*** 0,022 0,024 0,017 0,033** 0,046*** sd 0,004 0,010 0,007 0,008 0,006 0,025 xmax 0,030 0,033 0,034 0,030 0,041 0,091 TAB. 2 Hladiny 35.deň 50.deň zinku bielok žltok škrupina bielok žltok škrupina kontrola x 36,280 82,012 82,343 26,118 69,388 76,505 sd 2,205 7,670 8,359 1,707 20,356 8,975 xmax 39,250 90,720 90,910 28,420 98,050 89,590 Cd10 x 38,963 83,675 39,957 22,100 70,165 31,817 sd 2,389 7,688 2,092 4,016 10,273 9,151 xmax 41,700 93,600 42,720 26,600 88,300 48,300 Zn x 73,494*** 67,100* 66,355*** 71,089*** 53,840** 50,821** sd 3,593 19,743 7,214 4,965 6,866 3,369 xmax 77,125 97,450 75,650 77,930 61,750 55,654 Cd+Zn x 74,357 54,373 21,337*** 65,197 46,838* 19,426*** sd 32,526 13,236 2,902 8,607 3,859 5,859 xmax 123,450 73,020 25,550 75,456 51,380 29,356 * štatistická významnosť na hladine P 0,05; ** štatistická významnosť na hladine P 0,01; *** štatistická významnosť na hladine P 0,001. Zn je nevyhnutný pre rast, operenie, rast dlhých kostí. Jeho množstvo v kŕmnej diéte nemalo by byť menej ako 25 mg.kg -1. Sahin and Kucuk (2003) navrhli, že suplementácia 60 mg Zn/kg KZ chráni prepelice pred negatívnymi účinkami tepelného stresu. Na druhej strane pri podaní

255 vysokej dávky Zn sa organizmus homeostatickým mechanizmom vyrovnáva so zvýšeným príjmom Zn. Zistilo sa, že vysoké hladiny Ca redukujú Zn absorpciu u dospelých prepelíc, tento sa jav sa prejavuje aj u vajec (Mbe et al., 2003). Vysoký obsah Zn a Cd spôsobuje rozličné anémie organizmu. Nízke hladiny Fe dôsledku pridania vysokej dávky Zn sú redukované nízkou dávkou Ca alebo vysokou dávkou vitamínu D. Dlhotrvajúci prídavok Zn a Cd spôsobil zníženi hladín Ca v škrupine. Záver Z pokusu vyplýva, že prídavok Zn mal ochranný účinok voči negatívnemu vplyvu dlhodobého podávania Cd vo vajciach u Japonských prepelíc. Literatúra 1. MASSANYI, P., UHRIN, V., TOMAN, R., KOVACIK, J., BIRO, D.: Histological changes in the oviduct of rabbits after administration of cadmium, J. Animal Feed Sci., 8, 1999, MBE,I.,RAPP, C., BAIN, MM., NYS, Y.: Supplementation of a corn soybean meal diet with manganese, copper, and zinc from organic or inorganic sources improves eggshell quality in aged laying hens. Poult. Sci., 2003, 82, KOCOUREK, 1999, Method's of analysis residues substance in food. (1992) Praha, Czech republic 4. KOTTFEROVÁ J.: Residual contaminants of cadmium in relation to environmental protection, health and quality of food products, Dissertation work, Košice, SAHIN, K., KUCUK., O.: Zinc supplementation alleviates heat stress in Japanese quail, J. Nutrition., 133, 2003, STOEPPLER, M In: Merian E.: Metals and their compounds in the environment. VCH Weinhem- NY - Basel - Cambridge, ZOWCZAK-DRABARCZYK, M., TORLINSKA, T., ISKRA, M., MIELCARZ, G., MATYLLA, G., TORLINSKI, L.: Serum zinc concentration in patients colorectal cancer, Trace Elelements and Electrolytes 21, 2004, VEGA 1/0564/03; 1/1336/04

256 VPLYV BIELKOVINOVÝCH FRAKCIÍ BOVINNEJ AMNIÓNOVEJ TEKUTINY NA PROLIFERÁCIU LYMFOCYTOV PERIFÉRNEJ KRVI INFLUENCE OF BOVINE AMNIOTIC FLUID POLYPEPTIDE FRACTIONS ON PROLIFERATION OF PERIPHERAL BLOOD LYMPHOCYTES Sobeková, A., Kostecká, Z., Blahovec, J. Katedra chémie, biológie a biochémie, Univerzita veterinárskeho lekárstva, Košice Abstract Polypeptide substances of amniotic fluid influence the cell proliferation and differentiation of developing animal embryo. The aim of this study was to determine the mitogenic effect of some peptide components of bovine amniotic fluid on bovine peripheral blood lymphocytes using MTT colorimetric assay. We have observed inhibition of ConA-induced lymphocyte proliferation by Peak I of amniotic fluid. On the other hand, peptides of Peak II have activated proliferation of indicator cells. The proliferation of peripheral lymphocytes was not significantly changed after the addition of natural bovine amniotic fluid. Úvod Amniónová tekutina je bohatá na látky bielkovinovej povahy, ktoré ovplyvňujú rast a vývoj plodu. Imunomodulačné vlastnosti amniónovej tekutiny môžu byť rozhodujúce v regulácii imunity matky počas gravidity ako aj v imunitnej odpovedi mláďat (Parvin a kol., 1994). Látky prítomné v amniónovej tekutine sú schopné chrániť plod pred bakteriálnou infekciou (Saito a kol., 1993), ale aj spôsobovať supresiu proliferácie lymfocytov indukovaných mitogénmi (Lang a kol., 1994, Parvin a kol., 1994). Cieľom našej práce bolo stanoviť mitogénny účinok izolovaných látok peptidickej povahy z bovinnej amniónovej tekutiny na hovädzích periférnych lymfocytoch využijúc kolorimetrický metyltetrazóliový test. Materiál a metódy Odber a gélová chromatografia bovinnej amniónovej tekutiny Amniónová tekutina bola získaná punkciou amniónového vaku po predchádzajúcej laparotómii a hysterotómii od kravy v 16. týždni gravidity. Odobratá amniónová tekutina bola odtučnená chloroformom a uskladnená v lyofilizovanom stave. Nariedená vzorka (1 g lyofilizátu na 5 ml elučného roztoku) bola podrobená gélovej chromatografii na kolóne Sephadexu

257 G-10 (2 x 45 cm). Elúcia bola zabezpečená 0,04 mol.l -1 NH 4 HCO 3 s rýchlosťou toku 9,5 ml.h -1. Prítomnosť peptidov bola stanovená spektrofotometricky pri vlnovej dĺžke 280 nm. Frakcie amniónovej tekutiny (Peak I a Peak II) boli testované na mitogénnu aktivitu. Mitogénom-indukovaná proliferácia lymfocytov periférnej krvi Bovinné lymfocyty periférnej krvi boli získané centrifugáciou pomocou Histopaque Izolované lymfocyty (3,5 x 10 6 buniek.ml -1 ) suspendované v kompletnom kultivačnom médiu (RPMI-1640 s prídavkom 100 jednotiek penicilínu a 100 µg streptomycínu na 1 ml, plus 2 mmol.l -1 glutamínu, bez fenolovej červene) boli nasadené v triplikátoch do 24-jamkových plastových platničiek o objeme 1 ml na jamku. Niektoré jamky boli suplementované 10 % fetálneho teľacieho séra (FS). Konkanavalín A (Con A) a frakcie amniónovej tekutiny po gélovej filtrácii (Peak I, Peak II) boli nariedené kompletným kultivačným médiom a pridané do jamiek s konečnou koncentráciou 10 µg.ml -1. Mitogénna aktivita frakcií amniónovej tekutiny bola stanovená optimalizovaným MTT kolorimetrickým testom (Blahovec a Sobeková, 2001). Na štatistické vyhodnotenie bol použitý Studentov t-test. Výsledky a diskusia Bovinná amniónová tekutina bola chromatograficky rozdelená na tri píky. Konkanavalínom A indukovaná proliferácia lymfocytov periférnej krvi nebola signifikantne ovplyvnená pridaním prirodzenej bovinnej amniónovej tekutiny (údaje nie sú uvedené). Frakcie amniónovej tekutiny získané gélovou chromatografiou však na aktivitu periférnych lymfocytov pôsobia (Obr. 1). Inhibičné účinky boli zaznamenané v prípade frakcií z Peak I, na druhej strane bola pozorovaná aktivácia lymfocytov peptidmi prítomnými v Peak II. Peak III nevykazoval žiaden významný efekt (údaje nie sú uvedené). Z literatúry je známe, že amniónová tekutina myší spôsobuje supresiu proliferácie konkanavalínom A indukovaných lymfocytov sleziny a tymocytov (Parvin a kol., 1994). V prípade použitia periférnych mononukleárnych buniek amniónová tekutina ľudí, myší a potkanov inhibovala ich proliferáciu (Lang a kol., 1994, Parvin a kol., 1994). U ľudských lymfocytov boli detegované mrna nukleové kyseliny pre receptory inzulínu podobných rastových faktorov (IGF-I a IGF-II), ale nebol detegovaný gén pre expresiu korešpondujúcich rastových faktorov. Avšak po stimulácii lymfocytov fytohemaglutinínom bola expresia obidvoch rastových faktorov IGF-I a IGF-II potvrdená (Nyman a Pekonen,

258 1993). Rastové faktory IGF podporovali lektínom indukovanú proliferáciu purifikovaných T lymfocytov (Kooijman a kol., 1992). 0,45 * 0,4 0,35 * 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 C C/Peak I C/Peak II C/ConA C/FS C/FS/Peak I C/FS/Peak II Obr. 1: Proliferácia lymfocytov periférnej krvi za prítomnosti ConA a frakcií získaných gélovou filtráciou (Peak I a Peak II). Výsledky sú priemerom troch meraní. C- lymfocyty v kompletnom kultivačnom médiu, C/ConA, C/Peak I a C/Peak II lymfocyty -1 v kompletnom kultivačnom médiu s prídavkom 10 µg.ml ConA, Peak I alebo Peak II, C/FS lymfocyty v kompletnom kultivačnom médiu s prídavkom 10 % fetálneho teľacieho séra, C/FS/ConA, C/FS/Peak I a C/FS/Peak II lymfocyty v kompletnom kultivačnom médiu s prídavkom fetálneho teľacieho séra a ConA, Peak I alebo Peak II, C/FS/ConA/Peak I a C/FS/ConA/Peak II lymfocyty v kompletnom kultivačnom médiu s prídavkom fetálneho teľacieho séra, ConA, Peak I alebo Peak II. C/FS/ConA C/FS/ConA/Peak I C/FS/ConA/Peak II

259 V našej práci konkanavalínom A indukovaná proliferácia periférnych lymfocytov bola inhibovaná látkami prítomnými v prvom píku separovanej amniónovej tekutiny a aktivovaná molekulami menších peptidov. Na základe vlastností použitého gélového nosiča možno predpokladať, že látky prítomné v prvom píku predstavujú zmes inzulínu podobných rastových faktorov (IGF-I a IGF II), prekurzorových foriem IGF-II a väzobného proteínu IGFBP-1 (Blahovec a kol., 2001). Záver Amniónová tekutina bovinného pôvodu obsahuje polypeptidy skupiny IGF, ktoré inhibujú proliferáciu periférnych hovädzích lymfocytov, indukovanú konkanavalínom A. Okrem toho sú v amniónovej tekutine prítomné malé peptidy, ktoré stimulujú proliferáciu indikátorových buniek. Práca pola podporovaná Vedeckou grantovou agentúrou MŠ SR (VEGA 1/0616/03). Literatúra Blahovec J., Kostecká Z., Lacroix M.C., Cabanie L., Godeau F., Mester J., Cavaille F. (2001): Mitogenic activity of high molecular weight forms of insulin-like growth factor-ii in amniotic fluid. J. Endocrinol. 169, Blahovec J., Sobeková A. (2001): The optimization of the rapid colorimetric assay for the growth and prolifreration of peripheral blood lymphocytes. Folia veter., 45, Kooijman R., Willems M., Rijkers G.T., Brinkman A., van Buul-Offers S.C., Heijnen C.J., Zegers B.J. (1992): Effects of insulin-like growth factors and growth hormone on the in vitro proliferation of T lymphocytes. J. Neuroimmunol., 38, Lang A.K., Searle R.F. (1994): The immunomodulatory activity of human amniotic fluid can be correlated with transforming growth factor beta 1 and beta 2 activity. Clin. Exp. Immunol., 97, Nyman T., Pekonen F. (1993): The expression of insulin-like growth factors and their binding proteins in normal human lymphocytes. Acta Endocrinol (Copenh). 128, Parvin M., Isobe K., Zohreh H., Goto S., Nakashima I., Tomoda Y. (1994): Amniotic fluid enhances allogeneic cytotoxic T cell responses, whereas it suppresses mitogen-stimulated lymphocyte proliferation. Microbiol. Immunol., 38, Saito S., Kasahara T., Kato Y. (1993): Elevation of amniotic fluid IL-6, IL- 8 and granulocyte colony stimulating factor in term and preterm parturition. Cytokine, 5, patologickej fyziológie a genetiky

260 ORGANIZAČNÉ, HYGIENICKÉ A VETERINÁRNE KRITÉRIÁ NA ČINNOSŤ ZARIADENÍ PRE LABORATÓRNE ZVIERATÁ ORGANIZATION, HYGIENIC AND VETERINARY CRITERIAS FOR THE PROCEEDING OF EQUIPMENTS FOR THE LABORA- TORY ANIMALS Sokol, J. 1, Hanzel, S. 1, Golian, J. 2, Rajský, D. 3, Pavličová, S. 2 1 Krajská veterinárna a potravinová správa Trnava 2 Slovenská poľnohospodárska univerzita Nitra 3 Regionálna veterinárna a potravinová správa Dunajská Streda Abstract The methodic technique of control comfortable with the legal norms of European Corporation and EU (86/609/EHS and 2003/65/ES) and Slovak Republic (regulations of government of the SR č. 289/2003 Z. z. and 489/2003 Z. z.) were processed. Classified object of methodic technique for the keeping of laboratory animals and for the practice of experiments to animals were verified. Comfortable with actual legislation we were processed technique of editing of paper about compliance of requirements to keeping and location of experimental animals. Úvod Predmetná problematika je značne špecifická. S ohľadom na vecnú náplň a rozsah sa však dotýka viacerých profesií a skupín. Zahŕňa organizačné, technologické, hygienické a veterinárne kritériá. Samostatný okruh tvoria postupy schvaľovania a úradných kontrol. Okrem toho k riešeniu tejto problematiky stanoviská vyjadrujú aj zástupcovia tretieho sektora a ochranárskych organizácii. Cieľom práce bolo 1) vykonať analýzu právnych noriem uplatňovaných v ES/EÚ a SR 2) vypracovať metodický postup kontroly 3) overiť metodický postup kontroly v konkrétnom zariadení pre chov laboratórnych zvierat a v zariadení na vykonávanie pokusov na zvieratách a 4) vypracovať návrh pre postup pri vydávaní stanoviska na posúdenie vhodnosti zariadenia na chov pokusných zvierat a zariadenia na vykonávanie pokusov na zvieratách.

261 Materiály a metódy Metodický postup kontroly bol vypracovaný v súlade s ustanoveniami smerníc 86/609/EHS a 2003/65/ES a nariadení vlády SR č. 289/2003 Z. z. a 489/2003 Z. z. Predmetný metodický postup kontroly bol overený v zariadení pre chov pokusných zvierat v zariadení na vykonávanie pokusov na zvieratách Ústavu experimentálnej farmakológie SAV oddelenie toxikológie a chov laboratórnych zvierat, pracovisko Dobrá Voda. Výsledky a diskusia ad 1) legislatíva a právne normy uplatňované v Európskych spoločenstvách /Európskej únii - smernica Rady 86/609/EHS z 24. novembra 1986 o aproximácií zákonov, nariadení a administratívnych ustanovení členských štátov týkajúcich sa ochrany zvierat na experimentálne a iné vedecké účely (Úradný vestník Európskych spoločenstiev L 358, , s. 1-28) - smernica 2003/65/ES Európskeho parlamentu a Rady z 22. júla 2003, ktorou sa mení a dopĺňa smernica Rady 86/609/EHS z 24. novembra 1986 o aproximácií zákonov, nariadení a administratívnych ustanovení členských štátov týkajúcich sa ochrany zvierat na experimentálne a iné vedecké účely (Úradný vestník Európskych spoločenstiev L 230, , s ) Slovenskej republike - zákon č. 488/2002 Z. z. o veterinárnej starostlivosti a o zmene niektorých zákonov v znení neskorších predpisov (Zbierka zákonov SR, čiastka 186, uverejnená 22. augusta 2002) - nariadenie vlády SR č. 289/2003 Z. z., ktorým sa ustanovujú požiadavky na ochranu zvierat používaných na pokusné účely alebo iné vedecké účely

262 (Zbierka zákonov SR, čiastka 139, uverejnená 31. júla 2003) - nariadenie vlády SR č. 489/2003 Z. z., ktorým sa mení a dopĺňa nariadenie vlády SR č. 289/2003 Z. z., ktorým sa ustanovujú požiadavky na ochranu zvierat používaných na pokusné účely alebo iné vedecké účely (Zbierka zákonov SR, čiastka 207, uverejnená ) - metodický pokyn na posúdenie vhodnosti zariadenia na chov a držanie pokusných zvierat a zariadenia na vykonávanie pokusov na zvieratách a na vykonávanie kontrol dodržiavania požiadaviek na ochranu zvierat používaných na pokusné alebo iné vedecké účely (ŠVPS SR č. 2304/ z 5. marca 2004) - úprava metodického pokynu č. 2304/ z 5. marca 2004 (ŠVPS SR č. 3740/ z 23. apríla 2004) ad 2) metodický postup kontroly zahŕňa kontrolu dokladových materiálov podmienok chovu zvierat (stavebno-dispozičné riešenie, technológia ustajnenia / kŕmenia / napájania, mikroklíma, hygiena a výstražné zabezpečovacie systémy) zdravotného stavu zvierat infraštruktúry (skladovanie krmív, priestory na čistenie a dezinfekciu, skladovanie čistiacich a dezinfekčných prostriedkov, expedícia zvierat a likvidácia odpadov) priestorov a technického vybavenia na vykonávanie pokusov vrátane chirurgických techník a postupov stanovenia maximálneho jednorázového stavu zvierat v jednotlivých typoch zariadenia.

263 ad 3) overenie metodického postupu kontroly bolo vykonané v zariadení - pre chov pokusných zvierat a - na vykonávanie pokusov na zvieratách v Ústave experimentálnej farmakológie SAV oddelenie toxikológie a chov laboratórnych zvierat, pracovisko Dobrá Voda. Predmetný metodický postup kontroly sme doplnili o ďalšie nevyhnutné záležitosti týkajúce sa identifikačných znakov, druhov zvierat určených na pokusné alebo iné vedecké účely, kontrolných zistení a zodpovedných osôb prevádzkovateľa a kontrolného orgánu. Na základe analýzy a posúdenia konštatujeme, že tento postup kontroly je vhodný na širšie využitie pre vykonávanie kontrol orgánov štátnej správy vo veterinárnej oblasti. ad 4) postup vydávania dokladov o splnení požiadaviek Na základe priebežných rokovaní so zástupcami Univerzity veterinárskeho lekárstva v Košiciach, Krajských veterinárnych a potravinových správ v SR a praxe sme vypracovali návrh pre postup pri vydávaní dokladu o splnení požiadaviek na starostlivosť a umiestnenie pokusných zvierat. Kompetencia Krajskej veterinárnej a potravinovej správy - v prípade, že sa kontrolou preukáže súlad zariadenia s požiadavkami podľa nariadenia vlády SR č. 289/2003 Z. z., Krajská veterinárna a potravinová správa vydá žiadateľovi stanovisko o splnení požiadaviek na starostlivosť a umiestnenie pokusných zvierat podľa vzoru uvedeného v prílohe č. 4 metodického pokynu ŠVPS SR č. 3740/ z 23. apríla v prípade, že sa kontrolou preukáže nesúlad zariadenia s požiadavkami podľa nariadenia vlády SR č. 289/2003 Z. z., Krajská veterinárna a potravinová správa uloží opatrenia na odstránenie nedostatkov a stanoví termíny na ich odstránenie vo väzbe na rozsah potrebných úprav a ich časovú náročnosť v prípade výrazných nedostatkov Krajská veterinárna a potravinová správa vydá stanovisko o nesplnení požiadaviek na starostlivosť a umie-

264 stnenie pokusných zvierat podľa vzoru uvedeného v prílohe č. 4 metodického pokynu ŠVPS SR č. 3740/ z 23. apríla STANOVISKO VYDANÉ KRAJSKOU VETERINÁRNOU A POTRAVINOVOU SPRÁVOU SLÚŽI AKO PODKLAD NA VYDANIE ROZHODNUTIA ŠTÁTNEJ VETERINÁRNEJ A POTRAVINOVEJ SPRÁVY SR O SCHVÁLENÍ / NESCHVÁLENÍ PRÍSLUŠNÉHO TYPU ZARIADENIA. KOMPETENCIA REGIONÁLNEJ VETERINÁRNEJ A POTRAVINOVEJ SPRÁVY - vykonáva kontrolu dodržiavania požiadaviek na ochranu zvierat používaných na pokusné alebo iné vedecké účely v súlade s 21 nariadenia vlády SR č. 289/2003 Z. z. Uvedený návrh bol zahrnutý do úpravy metodického pokynu ŠVPS SR č. 3740/ z 23. apríla Záver V súlade s právnymi normami Európskych spoločenstiev a Európskej únie (smernice 86/609/EHS a 2003/65/ES) a Slovenskej republiky (nariadenia vlády SR č. 289/2003 Z. z. a 489/2003 Z. z.) sme vypracovali metodický postup kontroly. Následne sme jeho vecný obsah overili v zariadení pre chov laboratórnych zvierat a vykonávanie pokusov na zvieratá. Postup vydávania dokladu o splnení požiadaviek na starostlivosť a umiestenie pokusných zvierat sme vypracovali v súlade s platnou legislatívou. Literatúra u autorov. Kontaktná adresa: Prof. MVDr. Jozef Sokol, DrSc. Krajská veterinárna a potravinová správa Zavarská 11, Trnava tel.: 033/ [email protected]

265 ZMENY KVALITATÍVNYCH UKAZOVATEĽOV BRAVČOVÉHO MÄSA POČAS DLHODOBÉHO MRAZIARENSKÉHO USKLADNENIA THE CHANGES OF NUTRITIONAL CHARACTERISTICS OF PORK MEAT DURING THE LONG PERIOD OF FREEZING STORAGE Sopková, D. Ústav fyziológie, Univerzita veterinárskeho lekárstva, Košice, SR Abstract Freezing is one of the most cautious ways of meat preservation. It enables long-term storage without application of chemical additives and significant side-effect. However, criteria of frozen meat have not been unambigously determined. The changes in the nutritional characteristics of pork meat (m. longissimus dorsi) of normal quality, and that of altered quality (PSE: pale, soft, exudative) were observed in dependence on the length of freezing storage. The aim was to deepen and to make objective the knowledge on the effect of freezing process on the parameters of quality of pork meat. During freezing storage, the differences in the contents of total proteins and aminoacids between the PSE and control meat were eliminated, the values of valine, lysine, leucine, custine, histidine and arginine significantly decreased, probably in the form of free aminoacids due to the elevated losses of meat juice after defreezing. Úvod Pre zabezpečenie plynulého zásobovania trhu mäsom a mäsovými výrobkami je nevyhnutná konzervácia a úschova potravín, ktorá v plnom rozsahu zachováva alebo len minimálne mení vlastnosti potravín. Z tohoto dôvodu je v popredí využívanie mraziarenskej techniky. Zmrazovanie potravín a ich uchovávanie v pásme teplôt pod -18 o C je veľmi výhodný spôsob konzervovania potravín, pretože nie je nutné aplikovať chemické prísady a potraviny si po rozmrazení uchovávajú svoje vlastnosti, ale kritériá kvality zmrazeného mäsa nie sú jednoznačne stanovené. Hodnotenie kvality zmrazeného mäsa sa vykonáva organolepticky a fyzikálnochemickými metódami. Počas skladovania mäsa alebo roztokov izolovaných proteínových preparátov v zmrazenom stave dochádza k bočnej (side-to side) agregácii molekúl v prípade myozínu a aktomyozínu a agregácii alebo intramolekulárnej transformácii v prípade globulárnych proteínov (MATSUMOTO, 1990; IGUCHI a kol.1991). Toto vedie k zmenám v

266 extrahovateľnosti, enzymatickej aktivity, viskozity a funkčných vlastností týchto proteínov. Zníženie extrahovateľnosti v soliach rozpustných frakcií (v podstate myofibrilárne proteíny) a ATP-ázovej aktivity sú vo všeobecnosti považované za primárne indikátory zmien v dôsledku zmrazenia (denaturácia), pričom prvá z nich je považovaná za relatívnu mieru zmien vyskytujúcich sa v mäse počas skladovania pri negatívnych teplotách (MATSUMOTO, 1990; PARTMAN, 1997). V práci sledujeme vplyv mraziarenských teplôt a dlhodobého mraziarenského skladovania na hodnoty aminokyselín s cieľom prehĺbiť poznatky o nutričných parametroch mrazeného bravčového mäsa. Materiál a metódy Materiál bol odoberaný na bitúnku, kde sa vyselektovalo dvanásť ošípaných s atypickým priebehom zrenia a následnými kvalitatívnymi zmenami mäsa PSE (pokusná skupina), a dvanásť ošípaných s normálnym priebehom zrenia mäsa (kontrolná skupina). Po porážke zvieraťa a 24 hodinovom chladení v chladiarni pri 4 o C, sme odoberali materiál na rozrábkovej linke vykostením karé priamo z bravčových polovičiek. Bravčové karé sa rozdelilo na dvanásť častí, jedenásť z nich bolo hlboko zmrazených prúdom chladeného vzduchu v zmrazovacích tuneloch pri - 40 o C, prúdení vzduchu 4-6 m.s -1 a uložených do mraziarenského skladu na dlhodobé uskladnenie pri teplote -18 o C, relatívnej vlhkosti 90-95%. Jedna vzorka bola určená na laboratórne vyšetrenia hneď po odobratí materiálu ako čerstvá surovina. Vzorky bravčového karé, skladované v mraziarni boli pravidelne v mesačných intervaloch z mraziarne vyberané a spracovávané. Vzorky pre stanovenie aminokyselín boli spracované kyslou hydrolýzou. Mäsový homogenát, prenesený do infúznych fliaš bol zaliaty 6N HCl. Hydrolýza prebiehala v sušičke pri C ± 3 0 C po dobu 24 hodín (MIKULÍK, 1984; CSAPÓ a kol.1986). Aminokyseliny boli analyzované klasickou metódou stĺpcovej chromatografie na ionexoch automatickým analyzátorom aminokyselín AAA T 339. Zastúpenie jednotlivých aminokyselín bolo vyjadrené v g.kg -1 a v mol.kg -1 celkového množstva aminokyselín. Matematicko štatistické porovnanie jednotlivých parametrov medzi pokusnou a kontrolnou skupinou bolo robené Studentovým T-testom. Na vyhodnotenie dynamiky zmien jednotlivých testovaných parametrov v priebehu 12 mesačného mraziarenského skladovania sme použili test ANOVA a na porovnávanie kontrastov v rámci mesiacov TUKEY S test. Výsledky V mrazenom mäse medzi porovnávanými skupinami sme zistili:

267 porovnaním strát mäsovej šťavy - vysoko signifikantne (P<0,001) väčšie straty mäsovej šťavy v PSE mäse po prvom mesiaci mraziarenského skladovania a (P<0,01) po druhom mesiaci skladovania, v priebehu ďalších mesiacov sa rozdiely v množstve uvolnenej mäsovej šťavy medzi PSE a kontrolným mäsom zmenšujú a sú nesignifikantné rozdiely v obsahu vody - medzi mrazeným PSE a kontrolným mäsom, na hladine významnosti (P<0,01) konštatujeme po 1., 2. a 3. mesiaci skladovania. Po 4., 5. a 6. mesiaci je už nižší obsah vody v PSE mäse menej signifikantný (P<0,05) a od siedmeho mesiaca sa obsah vody v sledovanom mäse takmer vyrovnáva a rozdiely napriek neustálemu poklesu sú štatisticky nevýznamné pomerne vyrovnané hodnoty celkových bielkovín v PSE a kontrolnom mäse prezentujú len malé rozdiely medzi porovnávanými skupinami, signifikantne vyššie (P<0,05) hodnoty celkových bielkovín boli v čerstvom PSE mäse v porovnaní s kontrolnou skupinou a tiež v PSE mäse po prvom mesiaci skladovania. V ďalších mesiacoch sú rozdiely medzi porovnávanými skupinami štatisticky nevýznamné. Počas skladovania sledovaním dynamiky zmien v rámci skupín: Zvyšujúce sa percento strát mäsovej šťavy u obidvoch sledovaných skupín v závislosti od dĺžky mraziarenského skladovania: v PSE mäse signifikantné zvýšenie (P<0,01) sme zistili po 7., 8., 9. mesiaci a vysoko signifikantné zvýšenie (P<0,001) po 10. a 11. mesiaci mraziarenského skladovania v kontrolnom mäse vysoko signifikantne (P<0,001) stúplo množstvo uvolnenej mäsovej šťavy už po piatom mesiaci mraziarenského skladovania a stúpajúcu tendenciu si udržalo až do konca mraziarenského skladovania. Obsah vody v PSE a kontrolnom mäse v závislosti od dĺžky mraziarenského skladovania priamo súvisel a odzrkadľoval zvyšujúce sa straty mäsovej šťavy v priebehu skladovania: v PSE mäse sme zaznamenali signifikantný pokles (P<0,01) obsahu vody v porovnaní s čerstvou surovinou po štyroch mesiacoch a vysoko signifikantný pokles (P<0,001) od piatich mesiacov skladovania v kontrolnom mäse intenzívnejší pokles obsahu vody, signifikantné zníženie (P<0,05) už po treťom mesiaci, od štvrtého

268 mesiaca mraziarenského skladovania vysoko signifikantné (P<0,001) zníženie obsahu vody Hodnoty celkových bielkovín v priebehu mraziarenského skladovania mierne klesali, predovšetkým v PSE mäse, tento pokles bol však štatisticky nevýznamný. HODNOTY AMINOKYSELÍN V TESTOVANOM MÄSE V priebehu mraziarenského skladovania zaznamenávame: signifikantný pokles u esenciálnych aminokyselín: valínu od 7. mesiaca (P<0,001), lyzínu od 8. mesiaca (P<0,01) a leucínu od 10. mesiaca (P<0,01), signifikantný pokles neesenciálnych aminokyselín konštatujeme u cystínu od 6. mesiaca (P<0,001), histidínu od 9. mesiaca (P<0,01) a arginínu od 10. mesiaca (P<0,01) signifikantné zvýšenie sme zaznamenali u esenciálneho izoleucínu od 6. mesiaca a fenylalanínu od 7. mesiaca skladovania na hladine významnosti (P<0,05) a u neesenciálnej kyseliny glutámovej od 3. mesiaca (P<0,001) v kontrolnej skupine štatisticky nevýznamné kolísanie hodnôt aminokyselín konštatujeme u esenciálneho treonínu, metionínu a neesenciálneho alanínu, tyrozínu, kyseliny asparágovej, glycínu, prolínu a serínu Záver V priebehu mraziarenského skladovania sa rozdiely v obsahu celkových bielkovín a aminokyselín medzi PSE a kontrolným mäsom eliminujú, pravdepodobne vplyvom zvýšených strát mäsovej šťavy v kontrolnom mäse po rozmrazení a následným znížením obsahu vody, takmer na hodnoty PSE mäsa. Na základe týchto výsledkov predpokladáme, že hodnoty valínu, lyzínu, leucínu, cystínu, histidínu a arginínu sa znižujú vplyvom zvýšených strát mäsovej šťavy v podobe voľných aminokyselín. V priebehu mraziarenského skladovania sa signifikantne zvýšili hodnoty izoleucínu, fenylalanínu a kyseliny glutámovej, kde pravdepodobne nedochádza k stratám v podobe voľných aminokyselín stratou mäsovej šťavy a zvýšenie hodnôt môže byť čiastočne zapríčinené zvyšujúcimi sa stratami vody v priebehu mraziarenského skladovania a tým vyššou koncentráciou svalových proteínov.

269 ANALÝZA PRODUKTOV DEGRADÁCIE LIPIDOV V TUKOVOM TKANIVE OŠÍPANÝCH POČAS MRAZIARENSKÉHO USKLADNENIA THE ANALYSIS OF PRODUCTS OF HYDROLYTIC AND OXIDATIVE DEGRADATION OF ADIPOSE TISSUE Sopková D., Staníková, A., Maraček, I. Ústav fyziológie, Univerzita veterinárskeho lekárstva, Košice, SR Abstract The changes in the basic lipid constants (peroxidation number, number of fat acidity and thiobarbituric acid) of pork meat (m. longissimus dorsi) of normal quality, and that of altered quality (PSE: pale, soft, exudative) were observed in dependence on the length of freezing storage. The aim was to deepen and to make objective the knowledge on the effect of freezing process on the parameters of quality of pork fat. Statistically significant changes in the basic lipid constants in thermally untreated frozen pork fat occur in general after month 6 of freezing storage in both groups. Úvod Tuk ošípaných a hydiny má pomerne vysoký obsah nenasýtených mastných kyselín, čo ovplyvňuje jeho konzistenciu a náchylnosť na oxidáciu (JOHNSTON a kol. 1992; PIPOVÁ a kol. 1995; BYRNE a kol. 2002).Na výslednú kvalitu tuku získaného z jatočných zvierat majú vplyv intravitálne faktory, ako je druh zvieraťa, jeho pohlavie, vek, zloženie kŕmnej dávky, a lokalizácia v tele živočícha (GRACEY a kol. 1999; ENSER a kol. 2000), ale tiež fyzické zaťaženie, zlé zaobchádzanie so zvieratami a iné stresové faktory pôsobiace tesne pred odporazením zvyšujú spotrebu energie, čo spôsobuje zvýšenie počtu voľných radikálov v bunkách, ktoré značne urýchľujú oxidatívnu degradáciu tuku post mortem (BYSTRICKÝ a kol. 1999; MÁTÉ a kol. 1999). Pretože produkty oxidatívnej degradácie veľmi výrazne negatívne ovplyvňujú organoleptické vlastnosti potravín, ich analýze sa venuje veľká pozornosť. Existuje celý rad metód, od tých najjednoduchších kvalitatívnych až po veľmi presné analytické metódy (BAKALOVÁ a kol. 2000; FENAILLE a kol. 2001). Finálnym produktom, ktorý vzniká v najväčšom množstve je malonyldialdehyd (MARCINČÁK a kol. 2002). Pri hlbokej oxidácii tukov vznikajú cyklické peroxidy a z nich hydroxykyseliny, tzv. lojovatenie tukov (MÁTÉ a kol., 1999). Počas získavania, spracovávania a skladovania tukov dochádza k chemickým zmenám, ktoré senzoricky a dieteticky znehodnocujú tuky a sú zdrojom zdraviu škodlivých zlúčenín. Stres a zlé zaobchádzanie so

270 zvieratami tesne pred porážkou zvyšuje počet voľných radikálov a hladinu adrenalínu v organizme, čo značne urýchľuje degradáciu tuku post mortem. Zamerali sme sa preto na analýzu produktov hydrolytickej a oxidatívnej degradácie lipidov normálneho a PSE mäsa v priebehu 12-mesačného mraziarenského uskladnenia. Materiál a metódy Dvanásť ošípaných s atypickým priebehom zrenia mäsa a následnými kvalitatívnymi zmenami mäsa PSE tvorilo pokusnú skupinu, a dvanásť ošípaných s normálnym priebehom zrenia mäsa kontrolnú skupinu. Po porážke zvieraťa a 24 hodinovom chladení v chladiarni pri 4 o C, sme odoberali materiál na rozrábkovej linke vykostením karé priamo z bravčových polovičiek, na ktorých bola ponechaná minimálne 2 cm vrstva chrbtovej slaniny, potrebná na stanovenie kvality tukovej zložky mäsa. Bravčové karé sa rozdelilo na dvanásť približne rovnakých častí, jedenásť z nich bolo hlboko zmrazených prúdom chladeného vzduchu v zmrazovacích tuneloch pri -40 o C, prúdení vzduchu 4-6 m.s -1 a uložených do mraziarenského skladu na dlhodobé uskladnenie pri teplote -18 o C, relatívnej vlhkosti 90-95%. Jedna časť bola určená na laboratórne vyšetrenia hneď po odobratí materiálu ako čerstvá surovina. Materiál na stanovenie kvality tukovej zložky mäsa: peroxidové číslo (PČ) metódou podľa HELCLOVÁ a kol. (1991) číslo kyslosti tukov (ČKT) metódou HELCLOVÁ a kol. (1991) tiobarbiturové číslo (TBA) metódou podľa BULLA a MARNETTA (1985) bol skladovaný v mraziarni a pravidelne v mesačných intervaloch z mraziarne vyberaný a spracovávaný. Matematicko štatistické porovnanie jednotlivých parametrov medzi pokusnou a kontrolnou skupinou bolo robené Studentovým T-testom. Na vyhodnotenie dynamiky zmien jednotlivých testovaných parametrov v priebehu 12 mesačného mraziarenského skladovania sme použili test ANOVA a na porovnávanie kontrastov v rámci mesiacov TUKEY S test. Výsledky a diskusia V tukovom tkanive medzi porovnávanými skupinami konštatujeme, že: hydrolytické zmeny tukovej zložky sú prezentované vo všeobecnosti vyššími hodnotami ČKT v PSE skupine signifikantne vyššie (P<0,05) sú hodnoty ČKT v prvom, druhom a ôsmom mesiaci mraziarenského skladovania oxidačné zmeny zaznamenané PČ sme zistili v kontrolnej skupine, signifikantne vyššie (P<0,001) hodnoty PČ v šiestom mesiaci a (P<0,05) vo štvrtom, piatom a siedmom mesiaci skladovania

271 maximálnu prípustnú hodnotu PČ 6 mmol.kg -1 tuku sme u obidvoch sledovaných skupín namerali v 11. mesiaci skladovania rozdiely v TBA čísle medzi pokusnou a kontrolnou skupinou sú štatisticky nevýznamné V priebehu mraziarenského skladovania. Porovnaním hodnôt základných tukových konštánt počas 12-tich mesiacov mraziarenského skladovania a zhrnutím dosiahnutých výsledkov medzi skupinami sme zistili, že k štatisticky významným zmenám v tepelne neošetrenom mrazenom bravčovom tuku dochádza: ČKT po šiestom mesiaci uskladnenia v obidvoch sledovaných skupinách (hodnoty nad 1 mg KOH.g -1 ) PČ po šiestom mesiaci uskladnenia v PSE skupine, v kontrolnej skupine po štvrtom mesiaci uskladnenia (3,5 až 4,2 mmol.kg -1 ) TBA po šiestom mesiaci uskladnenia v kontrolnej skupine, po siedmom mesiaci uskladnenia v PSE skupine (0,9 až 1 mmol.kg -1 ) Záver Analýzou výsledkov získaných pri sledovaní kvality čerstvého tukového tkaniva jatočne opracovaných tiel ošípaných sme zistili, že hydrolytické poškodenie tukového tkaniva je ovplyvnené stresovými faktormi pôsobiacimi pred porážkou. Zaznamenali sme signifikantne vyššie hodnoty čísla kyslosti tukov u ošípaných s kvalitatívne zmeneným PSE mäsom. Nezistili sme však štatisticky významne vyššie hodnoty produktov oxidatívnej degradácie tukov v čerstvej surovine medzi pokusnou a kontrolnou skupinou, čo je v súlade s výsledkami BYSTRICKÝ a DIČÁKOVÁ (1988); BYSTRICKÝ a kol. (1999). Hodnoty primárnej oxidatívnej degradácie lipidov už v čerstvom tukovom tkanive obidvoch skupín ošípaných sú však všeobecne vyššie (PČ PSE skupina 2,35; kontrolná skupina 2,31mmol.kg -1 ) a naznačujú, že toto poškodenie je podmienené aj inými faktormi ako stresovým zaťažením. Skladovanie takejto suroviny vedie k urýchleniu oxidatívnych zmien v tukovej zložke aj pri mraziarenských teplotách. Deštruované bunky tkanív sú bohatým zdrojom nenasýtených mastných kyselín, tvoriacich vnútrobunkové štruktúry. Tieto sú v priebehu propagačnej fázy autooxidácie zdrojom voľných radikálov a urýchľujú produkciu hydroperoxidov a peroxidov mastných kyselín aj v ostatných tukoch. Po zvýšení teploty dochádza k rýchlemu priebehu terminálnej fázy autooxidácie, produkcii terminálnych produktov oxidatívnej degradácie lipidov tuchnutie tukov. Danému problému je možné predísť:

272 maximálnou možnou elimináciou stresu zvierat in vivo a predovšetkým ante mortem suplementáciou krmiva antioxidantmi, hlavne vitamínom E dodržiavaním teplôt v mraziarenských skladoch s maximálnym zvýšením teploty na -15 o C, ako stanovuje POTRAVINOVÝ KÓDEX SR Súčasná legislatíva nestanovuje požiadavky pre sledovanie základných tukových konštánt (ČKT, PČ, TBA) v čerstvej a mrazenej surovine. Tretia časť POTRAVINOVÉHO KÓDEXU SR ustanovujúca konkrétne požiadavky pre všetky komodity v piatej hlave konkretizuje len osobitné požiadavky pre škvarené živočíšne tuky vrátane bravčovej masti. V zmysle NARIADENIA VLÁDY SR č. 286/2003 z.z, Prílohy č.4 v časti B, ustanovujúcej osobitné hygienické požiadavky pre živočíšne tuky a mäsové výrobky tiež absentuje čerstvá a mrazená surovina. Na základe našich zistení navrhujeme legislatívne stanoviť požiadavky na čerstvé a mraziarensky ošetrené tukové tkanivo. Literatúra BYRNE, D.V., BREDIE, W.L.P., BAK, L.S., BERTELSEN, G., MARTENS, H., MARTENS, M.: Sensory and chemical analysis of cooked porcine meat patties in relation to warmed-over flavour and pre-slaughter stress. Meat Science, 59, 3, 2002, BYSTRICKÝ, P., DIČÁKOVÁ, Z.: Živočíšne tuky v potravinách. Slov. vet. čas., Supl. 1, 1998, BYSTRICKÝ, P., DIČÁKOVÁ, Z., PAULSEN, P.: Oxidačné zmeny v tukovom tkanive ošípaných. Hygiena Alimentorum XX, 1999, GRACEY, J.F., COLLINS, D.S., HUEY, R.J.: Meat hygiene. Tenth edition. W. B. Saunders company LTD, 1999, 757.FENAILLE, F., MOTTIER, P., TURESKY, R.J., ALI, S., GUY, P.A.: Comparison of analytical techniques to quantify malondialdehyde in milk powders. J. Chromatogr. A, 921, 2001, MARCINĆÁK, S., TUREK, P., SOKOL, J., POPELKA, P., BYSTRICKÝ, P.: Determination of malondialdehyde in pork by HPLC as the 2,4- dinitrophenylhydrazine derivate. Folia Vet., 46, 3, 2002, MÁTÉ, D., TUREK, P., KORIMOVÁ, Ľ.: Využitie prírodných antioxidantov v mäsovej výrobe. Hygiena Alimentorum XX, 1999, PIPOVÁ, M., CABADAJ, R., NAGY J.: Hygiene of Poultry,Eggs, Fish, and Game. Datahelp Košice, 1995, 110 s.

273 ŠUNKA V PLECHU Z PSE MÄSA CANNED HAM FROM PSE MEAT Sopková, D. Ústav fyziológie, Univerzita veterinárskeho lekárstva, Košice, SR Abstract The changes in the technological characteristics of pork meat (m. longissimus dorsi) of normal quality, and that of altered quality (PSE: pale, soft, exudative) were observed in dependence on the length of freezing storage. The aim was to deepen and to make objective the knowledge on the effect of freezing process on the parameters of quality of pork meat. According the sensory analysis of the product canned ham from PSE and control pork meat, all the sensory parameters, above all juiciness were evaluated more favourable in the control meat. During the long-term freezing storage, however, the sensory differences between the products are smaller, and since month 8, there is no perceptible difference between samples. Úvod Kvalitatívna odchýlka bravčového mäsa PSE (pale-bledé, softmäkké, exudative-vodnaté mäso); je sprievodným javom intenzívneho šľachtenia, s cieľom získať maximálne úžitkovú ošípanú s vysokým podielom svaloviny. Zmeny biologických pomerov v organizme prasiat vedú k zvýšenej citlivosti vysoko úžitkových zvierat na stres, a to je hlavná, hoci sekundárna príčina vzniku PSE bravčového mäsa (BODAK a kol. 2002). Pre PSE mäso je charakteristický rýchly priebeh glykolýzy. Vo svalovine je zvýšená koncentrácia iónov Ca 2+, ktoré spôsobujú zvýšenú aktivitu enzýmu ATPázy. Vplyvom nadbytku ADP a anorganického fosfátu dochádza k rýchlejšiemu priebehu glykogenolýzy, čím sa uvoľní veľké množstvo tepelnej energie a vznikajúca kyselina mliečna spôsobí zníženie ph na hodnoty 5,8 a nižšie. (ALVARADO a SAMS, 2002; ŠIMEK a kol. 2002). Interakcia zvýšenej teploty svaloviny a jej zvýšenej kyslosti vyvoláva čiastočnú denaturáciu svalových bielkovín. Tým sa obmedzí schopnosť PSE mäsa viazať vlastnú vodu, štruktúra svalového tkaniva sa otvára a z mäsa samovoľne odteká množstvo mäsovej šťavy (LAWRIE, 1998; SCHÄFER a kol. 2001; ALVARADO a SAMS, 2002). K nadmernej strate vody dochádza už pri chladení a chladiarenskom skladovaní (ŠIMEK a kol. 2003), mrazení a rozmrazovaní bravčových polovičiek s PSE svalovinou. Ťažkosti so zužitkovaním PSE mäsa, súvisia s jeho bledou

274 farbou, zvýšenou stratou vody, teda i hmotnosti a stratou pojivovej schopnosti diela. PSE mäso je pre výrobcu drahšie a spotrebiteľa menej atraktívne. V práci sledujeme zmeny technologických vlastností bravčového mäsa (m. longissimus dorsi) normálnej kvality a mäsa s kvalitatívnou odchýlkou PSE v závislosti od dĺžky mraziarenského uskladnenia. Vhodnosť mäsa na ďalšie technologické spracovanie posudzujeme senzorickým hodnotením výrobku šunka v plechu z testovaného mäsa. Materiál a metódy Ako pokusný materiál slúžil MLD (musculus longissimus dorsi) dvadsiatichštyroch jatočných ošípaných plemenného typu Landras. Na dôkaz PSE mäsa s atypickým priebehom zrenia a následnými kvalitatívnymi zmenami boli použité tieto metódy: stanovenie hodnoty ph 1hod. p.m. (post mortem) a ph 24 hod. p.m. stanovenie farebného jasu meraním remisie svetla spektrálnym fotokolorimetrom SPEKOL pri 520 nm a stanovenie percenta strát mäsovej šťavy samovoľným odkvapom Vykostené bravčové karé sa rozdelilo na dvanásť častí, ktoré sa odvážili, jedenásť z nich bolo uložených v mraziarni (teplota -18 o C, relatívna vlhkosť %) a jedna bola určená na laboratórne vyšetrenia hneď po odobratí materiálu ako čerstvá surovina. Vzorky skladované v mraziarni boli v mesačných intervaloch z mraziarne vyberané a spracovávané. Na senzorické posúdenie mrazeného mäsa sme pripravili výrobok šunka v plechu. Mäso obidvoch porovnávaných skupín sme oddelene naložili do láku podľa návodu výrobcu nádoby na výrobu šunky (ROSTEX n.p. Vyškov, závod Moravská Třebová) pozostávajúceho z 25 g dusitanovej soliacej zmesi, troch gramov cukru a 0,1 l vody na 1-1,2 kg mäsa. Na senzorické posúdenie výrobku šunka v plechu sme použili: 5-bodovú stupnicovú metódu posúdenia kvality: šesť členov laickej hodnotiteľskej komisie posudzovalo vybrané kvalitatívne ukazovatele: - vzhľad na nákroji, -vôňu, -šťavnatosť, a chutnosť vždy na troch vzorkách, podľa vypracovanej bodovacej škály. trojuholníkový test: šesť členov komisie testovalo rozdiely kvality v dvoch trojiciach vzoriek. Pravdepodobnosť preukazného rozdielu medzi vzorkami sme vyhodnocovali podľa PRÍBELU a kol. (2001). Výsledky a diskusia Percentuálne straty vo váhe po tepelnom spracovaní výrobku: z čerstvého PSE mäsa sú väčšie o viac ako 10%

275 straty vo váhe šunky po tepelnom opracovaní rastú úmerne od dĺžky mraziarenskeho uskladnenia predovšetkým u výrobku z kontrolného mäsa od štvrtého mesiaca rozdiel v stratách medzi PSE a kontrolným mäsom predstavuje len 3% a menej rozdiely medzi skupinami sa takmer vyrovnali a percentuálne straty sa ustálili v ôsmom až dvanástom mesiaci skladovania (PSE mäso 31%, kontrolné mäso 30%) Senzorické hodnotenie šunky v plechu z PSE a kontrolného mäsa: 5-bodovou stupnicou posúdenia kvality vo všetkých kvalitatívnych parametroch a tiež vo výslednom hodnotení je šunka v konzerve z kontrolného mäsa hodnotená priaznivejšie ako šunka z PSE mäsa štatisticky významne (P<0,001) vyššie bodové hodnotenie vykazuje výrobok z kontrolného čerstvého mäsa v šťavnatosti, avšak v priebehu dlhodobého mraziarenského skladovania sa tieto rozdiely zmierňujú od štvrtého mesiaca uskladnenia rozdiely v šťavnatosti už nie sú štatisticky významné ostatné kvalitatívne ukazovatele vzhľad, vôňa a chuť, tak ako aj celkové bodové hodnotenie sa zhoršujú od piateho mesiaca a odzrkadľujú pokles kvality obidvoch testovaných výrobkov v závislosti od dĺžky mraziarenského uskladnenia napriek poklesu kvality obidvoch výrobkov, vo všetkých testovaných parametroch je šunka v plechu z PSE mäsa hodnotená ako horšia trojuholníkovým testom bol zistený najpreukaznejší rozdiel medzi vzorkami zhotovenými z čerstvého ešte nezmrazeného mäsa preukazný rozdiel medzi výrobkami 99,9% sme zaznamenali aj po 1., 2., 3. a 4. mesiaci skladovania, kedy z 12-tich odpovedí 11 bolo správnych na preukázanie rozdielov medzi vzorkami na hladine pravdepodobnosti P = 90% je potrebných 8 správnych odpovedí, čomu zodpovedá hodnotenie v 6. a 7. mesiaci výsledky trojuholníkového testu po 8., 9., 10. a 11. mesiacoch skladovania nie sú štatisticky významné, kedy už posudzovateľmi nebol dokázaný preukazný rozdiel medzi vzorkami výsledky trojuholníkového testu poukazujú na zmierňovanie senzoricky postrehnuteľných rozdielov medzi PSE a kontrolným mäsom v priebehu dlhodobého mraziarenského skladovania po viac ako ôsmich mesiacoch.

276 Podľa senzorickej analýzy výrobku šunka v plechu, je vo všetkých kvalitatívnych parametroch, predovšetkým však v šťavnatosti šunka z kontrolného mäsa hodnotená priaznivejšie. V priebehu 12- mesačného mraziarenského skladovania sa však senzorické rozdiely medzi výrobkom z PSE a kontrolného mäsa zmierňujú a od ôsmeho mesiaca už nie je senzoricky postrehnuteľný preukazný rozdiel medzi vzorkami, čo sa dá vysvetliť stále zvyšujúcou sa stratou mäsovej šťavy po rozmrazení, hlavne u kontrolného mäsa a tiež zvyšujúcim sa percentom strát mäsovej šťavy po tepelnom spracovaní výrobku. Záver Zhrnutím technologických parametrov testovaného mäsa, konštatujeme výrazné zhoršovanie kvality mrazeného mäsa a súčasne zmierňovanie rozdielov medzi kvalitatívne nezmeneným mäsom a PSE mäsom od šiesteho mesiaca mraziarenského skladovania. Literatúra ALVARADO, C.Z., SAMS, A. R.:The role of carcass chilling rate in the development of pale, exudative turkey pectoralis. Poultry Sci. 81, 9, 2002, BODAK, E., KOLACZ, R., GRUDNIK, T.: C-reactive protein in the blood serum of pigs exposed to transportation stress. Folia Veterinaria, 46, 2, 2002, JOO, S.T., KAUFFMAN, R.G., WARNER, R.D., BORGGAARD, C., STEVENSON-14. BARRY, J.M., LEE, S., PARK, G.B., KIM, B.C.: Objectively predicting ultimate quality of post-rigor pork musculature. Asian Australasian J. of Animal Sciences, 13, 1, 2000, LAWRIE, R.A.: Lawrie s Meat Science (Sixth edition). Woodhead Publishing, Cambridge,1998, 336s. PRÍBELA, A., MAĽA, P., SABOLOVÁ, G., TUREK, P., MÁTÉ, D., BARANOVÁ, M., NAGY, J.: Senzorické hodnotenie potravinárskych surovín, aditívnych látok a výrobkov. Učebné texty, Inštitút vzdelávania veterinárnych lekárov, Košice, 2001, SCHÄFER, A., ROSENVOLD, K., PURSLOW, P.P., ANDERSEN, H.J.: Critical post mortem ph and temperature values in relation to drip loss in pork. In: Future of Meat: Congress Proceedings of the 47 th ICoMST, Krakow, 2001, 206. ŠIMEK, J., VORLOVÁ, L., STEINHAUSER, L.: Jakostní odchylky masa a jejich identifikace. Maso, 4, 2002, ŠIMEK, J., CHLÁDEK, G., KOUTNÍK, V., STEINHAUSEROVÁ, I., STEINHAUSER, L.: The influence of selenium, ph and intramuscular fat content on drip losses in beef. Folia Veterinaria, 47, 1, 2003,

277 NUTRIČNÉ PARAMETRE BRAVČOVÉHO KVALITATÍVNE ZMENENÉHO - PSE MÄSA THE NUTRITIONAL PARAMETERS OF PORK MEAT OF ALTERED QUALITY- PSE MEAT Sopková, D. Ústav fyziológie, Univerzita veterinárskeho lekárstva, Košice, SR Abstract The changes in the levels of amino-acids of pork meat (m. longissimus dorsi) of normal quality, and that of altered quality PSE (pale, soft, exudative) were observed in dependence on the length of freezing storage. The aim was to deepen and to make objective the knowledge on the effect of freezing process on the parameters of quality of pork meat. According to our finding, pork meat with PSE, regarding total proteins and aminoacids, is not nutritionally less valuable than that qualitatively unchanged. The results showed generally higher values of essential isoleucine, treonine, valine, leucine and phenylalanine, non essential tyrosine, glutamic acid, cystine, aspartic acid and alanine in the fresh musculature of pigs with PSE meat. The finding was emphasised by the sum of essential aminoacids in the PSE meat and correlated with statistically significantly higher values of total proteins in the PSE meat. Úvod Proteíny sú najvýznamnejšou zložkou mäsa z nutričného i technologického hľadiska. Obsah proteínov v čistej svalovine je 18 22%. Majú vysokú biologickú hodnotu, ide väčšinou o tzv. plnohodnotné bielkoviny s vyrovnaným obsahom esenciálnych aminokyselín (PIPEK, 1995; STEINHAUSEROVÁ a STEINHAUSER, 2000). Proteíny mäsa sú charakterizované jednak množstvom - kvantitou a jednak pomerom zastúpených esenciálnych aminokyselín - kvalitou (FAIXOVÁ a FAIX, 2002; 2003). Zdroje živočíšnych bielkovín (mäso, mlieko, vajcia) sú plnohodnotné tak po stránke kvantity ako aj po stránke vhodného zastúpenia aminokyselín. Sú hodnotnejšie ako rastlinné bielkoviny, pretože zastúpením jednotlivých aminokyselín sú bližšie bielkovinám ľudského tela (KUNACHOWICZ, 1998). Interakcia zvýšenej teploty kvalitatívne zmenenej PSE svaloviny a jej zvýšenej kyslosti vyvoláva čiastočnú denaturáciu svalových bielkovín. Tým sa obmedzí schopnosť PSE mäsa viazať vlastnú vodu, štruktúra svalového tkaniva sa otvára a z mäsa samovoľne odteká množstvo mäsovej šťavy (LAWRIE, 1998; SCHÄFER a kol. 2001; ALVARADO a SAMS, 2002). Sledovali sme

278 preto hodnoty aminokyselín ako dôležitých nutričných parametrov svaloviny ošípaných v nornálnom a kvalitatívne zmenenom PSE mäse počas 12- mesačného mraziarenského skladovania. Materiál a metódy Ako pokusný materiál slúžil MLD (musculus longissimus dorsi) dvadsiatichštyroch jatočných ošípaných plemenného typu Landras vážiacich kg. Po porážke zvierat a 24 hodinovom chladení v chladiarni pri 4 o C, sme odoberali materiál na rozrábkovej linke vykostením karé, ktoré sme rozdelili na dvanásť približne rovnakých častí. Vzorky mäsa boli hlboko zmrazené prúdom chladeného vzduchu v zmrazovacích tuneloch pri -40 o C, prúdení vzduchu 4-6 m.s -1 a uložené do mraziarenského skladu na dlhodobé uskladnenie pri teplote -18 o C, relatívnej vlhkosti 90-95%. Jedna vzorka bola určená na laboratórne vyšetrenia hneď po odobratí materiálu ako čerstvá surovina. Vzorky bravčového karé, skladované v mraziarni boli pravidelne v mesačných intervaloch z mraziarne vyberané a spracovávané. Na dôkaz mäsa s atypickým priebehom zrenia a kvalitatívnymi zmenami PSE boli použité: 1. stanovenie hodnoty ph 1hod. p.m. (post mortem) a ph 24 hod. p.m. 2. stanovenie farebného jasu meraním remisie svetla spektrálnym fotokolorimetrom SPEKOL pri 520 nm 3. stanovenie percenta strát mäsovej šťavy samovoľným odkvapom Vzorky pre stanovenie aminokyselín boli spracované kyslou hydrolýzou. Mäsový homogenát, prenesený do infúznych fliaš bol zaliaty 6N HCl. Hydrolýza prebiehala v sušičke pri C ± 3 0 C po dobu 24 hodín (CSAPÓ a kol.1986). Aminokyseliny boli analyzované klasickou metódou stĺpcovej chromatografie na ionexoch automatickým analyzátorom aminokyselín AAA T 339 (Mikrotechna Praha). Zastúpenie jednotlivých aminokyselín bolo vyjadrené v g.kg -1 celkového množstva aminokyselín. Matematicko štatistické porovnanie jednotlivých parametrov medzi pokusnou a kontrolnou skupinou bolo robené Studentovým T-testom. Na vyhodnotenie dynamiky zmien jednotlivých testovaných parametrov v priebehu 12 mesačného mraziarenského skladovania sme použili test ANOVA a na porovnávanie kontrastov v rámci mesiacov TUKEY S test. Výsledky a diskusia Podiel množstva jednotlivých aminokyselín v mäse je na hornej hranici rozmedzia stanoveného potravinovými tabuľkami pre mäso jatočných zvierat (bravčové karé) podľa VOJTAŠŠÁKOVEJ a kol. (2002). V čerstvom mäse medzi porovnávanými skupinami výsledky prezentujú:

279 všeobecne vyššie hodnoty aminokyselín v čerstvej svalovine ošípaných s kvalitatívne zmeneným PSE mäsom vysoko signifikantne (P<0,001) vyššie hodnoty v PSE mäse konštatujeme u esenciálneho izoleucínu signifikantne vyššie hodnoty (P<0,01) konštatujeme u esenciálneho treonínu, valínu, leucínu, neesenciálneho tyrozínu, kyseliny glutámovej a cystínu štatisticky významne vyššie hodnoty (P<0,05) v PSE mäse zaznamenávame aj u esenciálneho fenylalanínu a neesenciálnej kyseliny asparágovej a alanínu tieto výsledky korelujú so štatisticky významne vyššími (P<0,05) hodnotami celkových bielkovín v čerstvom PSE mäse V priebehu 12 mesačného mraziarenského skladovania zaznamenávame: signifikantný pokles u esenciálnych aminokyselín: valínu od 7. mesiaca (P<0,001), lyzínu od 8. mesiaca (P<0,01) a leucínu od 10. mesiaca (P<0,01), signifikantný pokles neesenciálnych aminokyselín konštatujeme u cystínu od 6. mesiaca (P<0,001), histidínu od 9. mesiaca (P<0,01) a arginínu od 10. mesiaca (P<0,01) signifikantné zvýšenie sme zaznamenali u esenciálneho izoleucínu od 6. mesiaca a fenylalanínu od 7. mesiaca skladovania na hladine významnosti (P<0,05) a u neesenciálnej kyseliny glutámovej od 3. mesiaca (P<0,001) v kontrolnej skupine štatisticky nevýznamné kolísanie hodnôt aminokyselín konštatujeme u esenciálneho treonínu, metionínu a neesenciálneho alanínu, tyrozínu, kyseliny asparágovej, glycínu, prolínu a serínu Hodnotenie profilu aminokyselín odhalilo signifikantné rozdiely u esenciálneho izoleucínu, treonínu, valínu, leucínu a fenylalanínu, neesenciálneho tyrozínu, kyseliny glutámovej, cystínu, kyseliny asparágovej a alanínu. Je pravdepodobné, že vyššie hodnoty niektorých aminokyselín v PSE mäse sú čiastočne zapríčinené nižším obsahom vody v PSE mäse a následne vyššou koncentráciou svalových proteínov, ale tiež vplyvom hormonálnych a metabolických zmien, ktoré prebiehajú v organizme pri vyrovnávaní sa zvierat so stresovou situáciou. Súčasťou stresovej reakcie je zvýšená sekrécia Somatotropného hormónu (STH), ktorú vyvoláva dopaminergná stimulácia. Biologický význam vyplavenia STH pri strese spočíva v proteoanabolizme kompenzujúcom pôsobenie glukokortikoidov (GOLDSTEIN, 1995). STH urýchľuje prepravu aminokyselín plazmatickou membránou a podporuje ich zabudovanie do polypeptidových reťazcov na ribozómoch granulárneho endoplazmatického

280 retikula, ako uvádza JELÍNEK a KOUDELA (2003), stimuluje tiež syntézu nukleových kyselín a tým významne podporuje proteosyntézu, ktorou možno dokumentovať pozitívnu dusíkovú bilanciu v organizme stresovaných zvierat. Záver Mäso ošípaných s kvalitatívnou odchýlkou PSE z pohľadu celkových bielkovín a aminokyselín nie je nutrične menej hodnotné ako mäso normálne, kvalitatívne nezmenené. Problematika PSE mäsa spočíva skôr v ťažkostiach pri jeho technologickom využití v mäsovej výrobe, ako potvrdzujú BYRNE a kol. (2001); ŠIMEK a kol. (2003) a iní. V priebehu mraziarenského skladovania sa rozdiely v obsahu celkových bielkovín a aminokyselín medzi PSE a kontrolným mäsom eliminujú, pravdepodobne vplyvom zvýšených strát mäsovej šťavy v kontrolnom mäse po rozmrazení a následným znížením obsahu vody, takmer na hodnoty PSE mäsa. Literatúra BYRNE, D.V., BREDIE, W.L.P., BAK, L.S., BERTELSEN, G., MARTENS, H., MARTENS, M.: Sensory and chemical analysis of cooked porcine meat patties in relation to warmed-over flavour and pre-slaughter stress. Meat Science, 59, 3, 2001, FAIXOVÁ, Z., FAIX, Š.: Influence of metal ions on ruminal enzyme activities. Acta Vet. Brno, 71, 2002, FAIXOVÁ, Z., FAIX, Š.: Forestomach absorption of amino acids and peptides. Folia Veterinaria, 47, 2003, GOLDSTEIN, D.S. : Stress, catecholamines and cardiovascular diseases. New York, Oxford Univ. Press., 1995, JELÍNEK, P., KOUDELA, K.: Fyziologie hospodářských zvířat, MZaLU Brno, 2003, KUNACHOWICZ, H., NADOLNA, I., PRZYGODA, B., IWANOW, K.: Food composition tables, Insyitut Zywności i zywnienia, Warszawa, 1998, 694 s. PIPEK, P.: Složení a vlastn. masa. In: Steinhauser a kol., LAST, 1995, 11. STEINHAUSEROVÁ, I., STEINHAUSER, L.: Maso a jeho složení. In: Steinhauser a kol.: Produkce masa, 2000, 5-33.ŠIMEK, J., CHLÁDEK, G., KOUTNÍK, V., STEINHAUSEROVÁ, I., STEINHAUSER, L.: The influence of selenium, ph and intramuscular fat content on drip losses in beef. Folia Veterinaria, 47, 1, 2003, VOJTAŠŠÁKOVÁ, A., KOVÁČIKOVÁ, E., PASTOROVÁ, J.: Potravinové tabuľky. Mäso jatočných zvierat, Bratislava, 2002, 292.

281 CADMIUM AND LEAD CONTENTS IN SELECTED ORGANS OF DOMESTIC PIG (SUS SCROFA) Robert Stawarz, Grzegorz Formicki Pedagogical University of Cracow, Institute of Biology, Department of Vertebrate Zoology, ul. Pobrzezie 3, Krakow Introduction Environmental and food contamination with heavy metals is the major problem. Exposure to heavy metals leads to a variety of adverse effects. The harmful effects of heavy metals generally results from generation of reactive oxygen species, DNA damage, disruption of ionic homeostasis (Waalkes 2003; de Faverney et al. 2004; Grosell et al. 2004; Manzl et al. 2004), enzyme inactivation due to strong bonds with SH groups (Massanyi et al. 1995; Viarengo et al. 1996) and alteration of many physiological parameters (Audet & Couture 2003). Although the detailed mechanism of metal action is various for various heavy metals. Copper and zinc, for instance, are essential trace elements that function as cofactors of variety of important enzymes (Gaetke and Chow 2003). Other heavy metals such as cadmium and lead do not play any biological role and exposure to Cd and Pb leads to severe consequences, although the body has some capacity to respond to such exposure. Intoxication with Cd and Pb results from accident, occupational hazard or environmental contamination. Cadmium is especially dangerous element due to its extremely biological half-life, which makes it a cumulative toxin (Goering et al 1994). Lead, although less toxic than cadmium, also has relatively long half-life in tissues and is considered as neurotoxic substance (Dorea, 2004). Significant route of heavy metals intake is the digestive tract (Sandstead 1995). Thus the mineral content of food may be important in health implications. The presence of heavy metals in the environment suggests that they may be cumulated in meat and other tissues of farm animals, which may pose a risk to consumers. On the other hand some reports indicate that meat contain relatively low levels of heavy metals and the main risk is associated with consumption of other tissues in the form of offal (Crête et al. 1989). The aim of this study was to evaluate cadmium and lead contents in lungs, skin, liver, kidney, intestine, and stomach of a pig (Sus scrofa). Materials and methods Samples of swine lungs, skin, liver, kidney, intestine, and stomach were taken from a slaughterhouse in Kłobuck (Central Poland). All the pigs were six month old males. The samples were dried in a dryer at 80ºC for 24 h and

282 then at 105ºC, until stabilisation of dry weight. The dry mass was estimated and samples were burnt at 480ºC for 4 days. The obtained ash was digested in 2 ml HNO 3 until complete dissolution and then the solutions were filled up with distilled water to 10 ml volumes. Cadmium and lead levels were estimated using a BUCK 200A atomic absorption spectrophotometer with an acetylene-air flame. Results Cadmium and lead were detected in all investigated tissues. The level of lead were higher then the level of cadmium. The highest cadmium content were detected in the kidney (4,804±1,951 g/g dry mass, and the lowest in the skin (0,854±0,377 g/g d.m.). The highest lead level had been detected in kidney too (10,953±4,249 g/g d.m.) and the lowest, in pig s skin (3,366±2,462 g/g d.m.). Analysis of variance ANOVA has shown, that there are significant differences in cadmium concentrations among organs (p=0,0000), and significant differences in lead content among organs (p=0,0046). Tab. 1. Cadmium and lead content in organs and tissues of domestic pig Sus scrofa. kidney lung liver stomach skin heart small intestine Cadmium (Cd). Mean and standard deviation in g/g d.m. 4,804±1,951 2,986±0,837 1,599±0,466 1,918±0,446 0,854±0,337 1,529±0,384 2,458±0,700 Lead (Pb). Mean and standard deviation in g/g d.m. 10,953±4,249 8,798±7,306 7,154±5,162 7,758±4,485 3,366±2,462 7,197±5,648 3,523±2,703 U Mann-Whitney analysis has shown, that the mean level content is similar in kidney, lung, liver, stomach and heart. The lead contents in small intestine and skin were similar, and lowest that in the other organs. The mean level of cadmium in kidneys was highest, and differences between mean cadmium content and means of contents in the other organs are statistically significant. The results are set together in table 1 and illustrated with figure 1.

283 Fig. 1. Cadmium and lead content in organs and tissues of domestic pig Sus scrofa. Discussion This analyses demonstrate that intake and accumulation of the pollutant by mammals is significant. For elements such as cadmium and lead it is now well established that food chain transfer and uptake by mammals does occur. This fact suggest that cadmium, and lead are still present in environment, and that the presence of the lead is higher then cadmium, probably as a result of long time used lead fuel in the past. It is well known too, that emissions from some types of factories can contaminate their more distant surroundings up to kilometers (Piskorova et al. 2003). The presence of trace elements in organs and tissues of domestic pig Sus scrofa, indicate, that similar pattern of contamination is possible in human body, as the human and pig metabolism have a lot of similarities with reference to mechanisms and processes. Investigated pigs were raised in high quality environment conditions. The animals and the fodder were under veterinary control. Kidney Cd and Pb concentrations were generally higher than concentrations in lung, liver and the other organs. Low Cd concentration founded in liver may be connected with saturation in liver Pb accumulation which might be due to an insufficient Pb binding capacity of the liver as the exposure to Pb. The target organ of chronic cadmium intoxication is the kidney. It is assumed that after inhalation and ingestion of inorganic cadmium compounds and uptake by the lungs and the gastrointestinal tract, cadmium first accumulates in the liver, where induces metallothionein. In our study,

284 the level of cadmium was highest in the kidney, not in the liver. It suggest, that cadmium contamination of pigs is rather chronic and not connected with single exposition with food or by the air. The similar cadmium content in lung and in the small intestine, suggest, that pigs are opened for chronic doses of low level of cadmium both in food and air. Cadmium concentrations were generally found in the other of kidney > lung > small intestine > stomach > liver > heart > skin. Compared to lead, cadmium concentrations were less variable among tissues and organs of individual specimens. Gastrointestinal and respiratory systems are considered the most frequent and the most important entrance gateways of noxious substances into the living organism. Metal substances reach tissues where they can accumulate (Keogh and Siegers, 1996). Small intestine does not accumulate metals, and their presence is probably temporary, as a result of their absorption. Higher levels of cadmium and lead in stomach are the result of presence of the thick muscle layer, where metals can be stopped for a longer time. The existence of investigated metals in alimentary canal to prove directly presence of cadmium and lead in food, and indirectly in whole environment. High content of the investigated metals in lung shows, that air is not devoid of lead and cadmium. Regular monitoring of heavy metal concentrations in the tissues of wild and domestic animals from air-pollution areas is highly needed. Concentrations of Cd in many places which are not directly open to contaminants, often exceeding the maximum permissible values and were also found. Considering this fact, with respect to the transmission of emissions to long distances pollution surveys should not be focused solely on the territory with air-pollution load (Piskorova et al. 2003). Bibliography Audet D., Couture P. (2003). Seasonal variations in tissue metabolic capacities of yellow perch (Perca flavescens) from clean and metal contaminated environments. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences, 60, Crête M., Nault R., Walsh P., Benedetti J.L., Lefebvre M.A., Weber J.P., Gagnon J. (1989). Variation in cadmium content of caribou tissues from northern Québec. The Science of The Total Environment, 80: De Faverney R.C., Orsini N., de Sousa G., Rahmani R. (2004). Cadmium induced apoptosis through the mitochondrial pathway in rainbow trout hepatocytes: involvement of oxidative stress. Aquatic Toxicology. 69,

285 Dorea J.,G. (2004). Mercury and lead during breast-feeding. British Journal of Nutrition, 92: Gaetke L.,M. Chow C.,K. (2003). Copper toxicity, oxidative stress, and antioxidant nutrients. Toxicology, 189, Goering P.L., Waalkes M.P., Klaassen C.D., Toxicology of cadmium. In: Goyer R.,A., Cherian M.,G. (Eds), Handbook of experimental Pharmacology: Toxicology of metals, Biochemical effects, vol. 115, Springer-Verlag, New York, pp Grosell M., McDonald M.,D., Walsh P.,J., Wood C.,M. (2004). Effects of prolonged copper exposure in the marine gulf toadfish (Opsanus beta) II: copper accumulation, drinking rate and Na+/K+ ATPase activity in osmoregulatory tissues. Aquatic Toxicology, 68, Keogh J.,P., Siegers C.,P. (1996). Influences on the gastrointestinal system by essential and toxic metals. In: Toxicology of Metals. CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida Manzl C., Enrich J., Ebner H., Dallinger R., Krumschnabel G. (2004). Copper induced formation of reactive oxygen species causes cell death and disruption of calcium homeostasis in trout hepatocytes. Toxicology, 196, Massanyi P., Toman R., Valent M., Čupka P. (1995). Evaluation of selected parameters of a metabolic profile and levels of cadmium in reproductive organs of rabbits after an experimental administration. Acta Physiologica Hungarica, 83, Piskorová L., Vasilková Z., Krupicer, I., (2003). Heavy metal residues in tissues of wild boar (Sus scrofa) and red fox (Vulpes vulpes) in the Central Zemplin region of the Slovak Republic. Czech J. Anim. Sci., 48, 2003 (3): (Short Communication). Sandstead H.,H. (1995). Requirements and toxicity of essential trace elements illustrated by zinc and copper. Am. J. Clin. Nutr. 61, 621. Viarengo A., Pertica M., Mancinelli G., Burlando B., Canesi L., Orunesu M. (1996). In vivo effects of copper on the calcium homeostasis mechanisms of mussel gill cell plasma membranes. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Pharmacology, Toxicology and Endocrinology, 113, Waalkes M.,P. (2003). Cadmium carcinogenesis. Mutation Research, 533,

286 DENNÝ PROFIL HLADÍN MELATONÍNU VO VYBRANÝCH TKANIVÁCH A MELATONÍNOVÝCH RECEPTOROV V HYPOTALAME POTKANA. DAILY PROFILE OF MELATONIN CONCENTRATION IN SELECTED TISSUES AND MELATONIN RECEPTORS IN HYPOTHALAMUS OF RAT. Stebelová K., Herichová I., Zeman M. Katedra živočíšnej fyziológie a etológie, Prírodovedecká fakulta UK, Mlynská dolina B-2, Bratislava Summary Melatonin (Mel) is a hormone synthesized primarily in the pineal gland. Mel production is under circadian control and is inhibited by light. Nighttime Mel concentrations in the pineal and plasma are higher than during the daytime. While Mel synthesis in retina and Harderian glands was definitely proven, direct evidence for Mel synthesis in GIT is still missing. In our study we determined Mel levels in plasma, pineal, GIT and different peripheral tissues and measured expression of gene encoding Mel receptors in hypothalamus during 24 hours (RT-PCR). Rhythmic pattern of Mel was estimated in plasma, pineal and pancreas while concentrations in spleen, kidney, duodenum and colon did not exhibited a rhythmic profile. Úvod Hormón melatonín (Mel) je produkovaný v endokrinnej žľaze epifýze. Syntetizuje sa z esenciálnej aminokyseliny L-tryptofán. Jedným z medzistupňov biosyntézy Mel je biogénny amín serotonín. Tvorba Mel je stimulovaná počas tmavej fázy dňa a inhibovaná svetlom dopadajúcim na sietnicu oka. Svetelný impulz je prenášaný do suprachiazmatických jadier hypotalamu (SCN), ktoré ovplyvňujú epifýzu a tvorbu Mel prostredníctvom sympatikového nervového systému. Mel má významnú funkciu pri riadení cirkadiánnych rytmov. Vďaka svojej malej lipofilnej molekule sa Mel nachádza v mnohých tkanivách organizmu. Intracelulárne procesy ovplyvňuje cez špecifické receptory, ktoré sa nachádzajú na plazmatickej membráne bunky. Receptory sú spojené s regulačnými G- proteínmi sú označované ako MT 1 a MT 2, receptor MT 3 patrí do rodiny chinónreduktázových enzýmov (Dubocovich a kol., 1998). Syntéza Mel bola dokázaná okrem epifýzy aj v tkanive retiny a v Harderianových žľazách laboratórnych hlodavcov. Nové poznatky poukazujú aj na syntézu Mel v ľudských lymfocytoch (Carrillo-Vico a kol., 2004). V gastrointestinálnom trakte (GIT) vtákov a cicavcov sa Mel

287 nachádza vo vyšších koncentráciách ako v cirkulácii (Herichová a Zeman, 1999; Bubenik a Brown, 1997). Možná tvorba Mel in situ v enterochromafilných bunkách mukózy GIT sa predpokladá, ale doposiaľ nie je jednoznačne potvrdená. V týchto bunkách prebieha aj masívna syntéza serotonínu. Predpokladanú tvorbu Mel v GIT podporujú aj nálezy mrna enzýmov konvertujúcich serotonín na Mel (Stefulj a kol, 2001). Mel môže ovplyvňovať viacero procesov v GIT. Exogénne podávaný Mel ovplyvňuje spontánnu peristaltiku čreva potkana (Harlow a Weekley, 1986) a redukuje zvýšený svalový tonus a spazmus izolovaného segmentu tenkého čreva potkana indukovaný serotonínom (Bubenik, 1986). Centrálny účinok Mel na motilitu čreva môže byť sprostredkovaný cholecystokinínom (Benouali- Pellisier, 1994). Najnovšie údaje poukazujú na úlohu Mel pri regulácii neutralizácie ph chýmu v dvanástniku (Sjőblom a Flemstrőm, 2004). Cieľom našej práce bolo zistiť, či obsah Mel v tkanivách GIT dvanástniku, pankrease a hrubom čreve a v tkanivách sleziny, obličiek vykazuje denný rytmus podobne ako v epifýze a plazme. Ďalším cieľom bola detekcia expresie génu kódujúceho MT 1 receptory v SCN hypotalamu potkana počas 24 hod. Materiál a metódy V pokuse sme použili 26 potkanov Wistar (14 samcov, 12 samíc) z chovnej stanice Dobrá Voda. Zvieratá boli chované pri svetelnom režime LD 12:12 (od 7:00 hod do 19:00 hod) a vodu a krmivo mali k dispozícii ad libitum. Odbery tkanív sme robili v 4 hod intervaloch v priebehu 24 hodín (začiatok o 13:00 hod). Experimentálne skupiny tvorili 4 zvieratá. Zvieratá boli usmrtené dekapitáciou po 30 sekundovej CO 2 anestéze. Počas tmavej fázy dňa sme odbery robili pri tlmenom červenom svetle. Krv sme odoberali do heparinizovaných skúmaviek. Epifýzu, hypotalamus a tkanivá dvanástnika, hrubého čreva, pankreasu, obličiek a sleziny sme bezprostredne po extirpácii uschovali v ľade a následne pri 18 ºC, hypotalamus sme uložili pri 80 ºC. Mel z tkanív sme extrahovali chloroformom, z epifýz metanolom. Koncentrácie Mel v plazme sme merali priamo vo vzorkách bez predchádzajúcej extrakcie. Hladiny Mel sme stanovovali rádioimunoanalýzou (RIA) modifikovanou na podmienky nášho laboratória (Zeman a kol., 2001). Expresiu Mel receptorov (MT 1 ) sme analyzovali pomocou polymerázovej reťazovej reakcie (PCR) s použitím špecifických primerov. Výsledok expresie sme kvantitatívne porovnávali vzhľadom ku expresii konštitutívne exprimovanému génu glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenáza (gapdh).

288 Prítomnosť rytmického profilu v dátach sme verifikovali kosínorovou analýzou (Klemfuss a Clopton, 1993), rozdiel medzi dvoma experimentálnymi skupinami sme overovali nepárovým t-testom. Výsledky Koncentrácie Mel v plazme a jednotlivých orgánoch, ako aj expresia receptorov pre Mel sa medzi pohlaviami signifikantne nelíši, preto ich prezentujeme spoločne. Očakávaný signifikantný cirkadiánny rytmus hladín Mel sme zistili v epifýze a v krvnej plazme potkana. Nočné hladiny Mel v epifýze dosahovali hodnoty do 2000 ± 500 pg/epifýzu, denné hladiny sa pohybovali v rozsahu od 234 ± 50 do 245 ± 14 pg/epifýzu. V plazme boli nočné hladiny Mel približne 5,5 krát vyššie ako denné hladiny (110 ± 15 pg/ml vs. 20 ± 5 pg/ml). Amplitúda rytmu koncentrácie Mel v epifýze bola 978 pg/epifýzu a táto hodnota bola približne 20-násobne vyššia ako amplitúda rytmu Mel v plazme (50 pg/ml) (tab. 1). epifýza pg/epi. plazma pg/ml pankreas pg/g hrubé črevo pg/g dvanástnik pg/g slezina pg/g obličky pg/g mezor amplitúda ns ns ns ns akrofáza (h:min) 19:50 19:52 19:30 ns ns ns ns P 0,001 0,001 0,001 0,340 0,698 0,054 0,267 Tab. 1: Hodnotenie priebehu rytmických zmien hladín Mel vo vybraných orgánov počas 24-hodinového cyklu pomocou kosínorovej analýzy (ns = nesignifikantné). Signifikantný denný rytmus koncentrácií Mel sme zaznamenali v tkanive pankreasu (tab. 1). Hodnota amplitúdy bola podobná ako v plazme. Priemerné denné hladiny Mel sa pohybovali v rozsahu od 100 ± 16 pg/g do 114 ± 25 pg/g a nočné dosiahli 200 ± 20 pg/g tkaniva. Akrofázy rytmov v epifýze, plazme a v pankrease sa navzájom významne nelíšili. Zmeny koncentrácie Mel v tkanive sleziny vykazovali rytmický priebeh na úrovni významnosti P = 0,054 (tab. 1). Najvyššie hladiny hormónu sme namerali na konci tmavej fázy dňa o 05:00 hod (127 ± 10 pg/g tkaniva). Počas svetlej fázy dňa sa hladiny Mel pohybovali v rozsahu od 93 ± 6 pg/g do 103 ± 12 pg/g tkaniva. V tkanive obličky sme nezaznamenali signifikantné rytmické zmeny v rytme koncentrácii Mel v priebehu dňa (tab. 1). Nočné hladiny hormónu v obličkách boli signifikantne vyššie v porovnaní s hladinami počas dňa (P < 0,05, t-test, df = 24) a dosahovali až 144 ± 50 pg/g tkaniva v noci, kým cez deň sa pohybovali v rozsahu od 78 ± 20 pg/g do 96 ± 26 pg/g tkaniva. Hladiny Mel

289 v tkanivách GIT dvanástniku a hrubom čreve nevykazovali periodické zmeny počas 24-hod cyklu. Signifikantne vyššie koncentrácie tohto hormónu sme zistili v tkanive hrubého čreva ako v tkanive dvanástnika (187 ± 15 pg/g vs 133 ± 10 pg/g; P < 0,01). V hypotalame potkanov sme nezistili signifikantné zmeny medzi dennými a nočnými hodnotami v expresii génu kódujúceho MT 1 receptor (graf 1). 4 mt1/gapdh (relative units) :00 21:00 1:00 5:00 9:00 Graf 1: Priebeh expresie MT 1 receptorov v hypotalame počas 24 hod (n = 3). Záver Naše výsledky potvrdili cirkadiánny rytmus hladín Mel v epifýze a plazme potkana. Novým zistením je rytmický priebeh hladín Mel v pankrease, čiastočne aj v slezine, ktorý bol paralelný so zmenami v epifýze a plazme. Naopak, koncentrácie Mel v obličkách, dvanástniku a v hrubom čreve nevykazovali rytmické zmeny. Toto zistenie naznačuje, že napriek svojej lipofilnej molekule Mel nevykazuje rytmické zmeny vo všetkých orgánoch, ale fyziologický význam tohto zistenia je zatiaľ nejasný. Projekt bol podporený grantom VEGA č. 1/1294/04. Zoznam literatúry Dubocovich M.L., Yun K., Al-Ghoul W.M., Benloucif S., Masana M.I. FASEB J : Carrillo-Vico A., Calvo J.R., Abreu P., Lardone P.J., Garcia-Maurino S., Reiter R.J., Guerrero J.M. FASEB J : Herichova I., Zeman M. VET. MED. CZECH : Bubenik G.A., Brown G.M. Biol Signals : Stefulj J., Hortner M., Ghosh M., Schauenstein K., Rinner I., Wolfler A., Semmler J., Liebmann P.M. J. Pineal Res : Harlow H.J., Weekley B.L. J. Pineal Res : Bubenik G.A. J.Pineal Res : Benouali-Pellisier S. J. Pineal. Res : Sjőblom M, Flemstrőm G. J. Pineal Res : Zeman M., Nosáľová V., Bobek P., Zakálová M., Černá S. Biologia : Klemfuss H., Clopton P.L. J. Interdisciplinary Cycle Res :1-16

290 VPLYV VITAMÍNU E NA PRODUKCIU VAJEC U NOSNÍC THE EFFECT OF VITAMIN E ON EGGS PRODUCTION IN LAYING HENS Šály, J., Kušev, J., Baranová, D., Neuschl, J., Máteová, S., Kremeň, J., Univerzita veterinárskeho lekárstva, Komenského 73, Košice, [email protected] Abstract The effect of vitamin E on the egg production was observed in the laying hens of hybrid Shaver in their 1.st and 7 st month of egg- laying. The control and experimentals groups at both ages categories of laying hens (10 in each group of both age categories) were fed a complex feed mixture for laying hens of the Hyd-10. Vitamin E in drinking water at a dose of 20 mg/day/hen was administered to the first experimental groups and at a dose of 30 mg to the second experimental groups. Addition of vitamin E at both doses increased the egg weight most pronouncedly in the laying hens in their 1 st month of egg-laying. The increase in egg-laying in the experimental groups was not signicant. The most pronounced increase in weight was found out in the egg-white, then in the egg-yolk and eggshel. At the dose of 30 mg of vitamin E and higher weight of eggs the largest eggshells damage and decrease in both the eggshell solidity and thickness occurred. Administration of vitamin E caused the significant increase in its content in the blood plasma and the decrease in the lipid content in the blood serum in comparison with the control laying hens. The content of anorganic phosphorus and total proteins in the blood serum were increased with the dose of vitamin E. In the content of calcium and ALP, ASP and ALT activities there were only slight differences between the laying hens with addition of vitamin E and control ones Keywords: laying hens, vitamín E, egg production, biochemical parameters Úvod Vitamín E ovplyvňuje v živočíšnom tele rozličné tkanivá a vykazuje aktivitu v rôznych metabolických systémoch (Scott,1962). Známy je vplyv vitamínu E na plodnosť cicavcov. Očakávať možno jeho priaznivý vplyv aj na kvalitu vaječnej produkcie. Pomerne málo štúdií sa venuje jeho úlohe v rozmnožovaní hydiny a najmä vplyvu u nosníc. Niektorí autori (Arscot a Parker, 1967,) referujú o poruchách plodnosti a zmenách na pohlavných orgánoch u kohútov pri nedostatku tohto vitamínu. Bell a Freeman (1971) opisujú u nosníc pri avitaminóze E pokles znášky a liahnivosti. Šály a kol. (1988) pri sledovaní vplyvu rôznych nutričných

291 látok na vaječnú produkciu zistili zvýšenie hmotnosti vajec u nosníc, ktorým bol podávaný vitamín E. Niektorí autori (Nishiwaki a kol., 1977) uvádzajú, že príčinou znižovania kvality škrupiny s vekom nosníc môže byť aj zvyšovanie hmotnosti vajec. Materiál a metodiky V dvoch pokusoch sme použili nosnice hybrida Shaver, a to v prvom pokuse v 1. mesiaci a v druhom pokuse v 7. mesiaci znášky. V oboch pokusoch boli nosnice po 10 kusoch rozdelené na kontrolnú skupinu a dve pokusné skupiny. Všetky nosnice boli kŕmené rovnako kompletnou kŕmnou zmesou pre nosnice HYD-10 s obsahom 153 g.kg -1 N- látok, 11,5 MJ.kg -1 ME, 3,14 % vápnika, 0,51 % fosforu, 42 mg mangánu, 51 mg zinku a 10 mg vitamínu E v jednom kilograme. Kontrolné skupiny nosníc v oboch pokusoch boli napájané čistou pitnou vodou. Prvé pokusné skupiny nosníc dostávali v pitnej vode vitamín E v dávke 20 mg na nosnicu a deň a druhé pokusné skupiny nosníc v dávke 30 mg na nosnicu a deň. Vitamín E bol do pitnej vody pridávaný vo forme Combinalu E forte. Nosnice boli na tomto systéme diéty 30 dní. Od nosníc sa odoberala krv na biochemické vyšetrenia z vena cutanea ulnaris. Pevnosť škrupiny sme merali na pružinovom prístroji podľa Marcinka a Gažu (1964) a udávame ju v newtonoch (N).Tvar vajec bol posudzovaný podľa pomeru pozdĺžneho a priečneho priemeru vajca zisteného v mieste najväčšieho obvodu. Biochemické vešetrenia krvného séra sme vyšetrovali fotometricky pomocou Bio-La-testov (Lachema Brno). Výsledky sa štatisticky vyhodnocovali T testom. Výsledky a diskusia Vitamín E v porovnaní s kontrolnými nosnicami zvýšil hmotnosť vajec u oboch vekových skupín nosníc. Tento vzostup bol výraznejší u mladších nosníc (v prvom mesiaci znášky) a pri vyššej dávke vitamínu E (P < 0,05). U nosníc v 7. mesiaci znášky bola hmotnosť vajec vyššia ako u nosníc v 1. mesiaci znášky. V hodnotách indexu tvaru vajec medzi jednotlivými skupinami nosníc neboli preukazné rozdiely. U nosníc v 7. mesiaci znášky bol index vajec vyšší ako u nosníc v 1. mesiaci znášky a zvyšoval sa s hmotnosťou vajec. I keď intenzita znášky v porovnaní s kontrolnými nosnicami bola vyššia pri oboch vekových skupinách s aplikáciou vitamínu E, tento rozdiel nebol preukazný. Podávaním vitamínu E v pitnej vode sa u nosníc v 1. mesiaci znášky zvýšila hmotnosť žĺtka, bielka i vaječnej škrupiny. Najvýraznejší podiel malo pritom zvyšovanie hmotnosti bielka, a to o 1,06 g u nosníc s dávkou 20 mg vitamínu E a o 2,9 g s dávkou 30 mg vitamínu E. Hmotnosť škrupiny sa

292 v porovnaní s kontrolnými nosnicami zvýšila o 0,31 g a 0,47 g. Pevnosť i hrúbka vaječnej škrupiny bola nižšia u nosníc v 7. mesiaci znášky ako u nosníc v 1. mesiaci znášky. U starších nosníc bola najnižšia pevnosť i hrúbka škrupiny u nosníc s vyššou dávkou vitamínu E a vyššou hmotnosťou vajec. tento pokles však nebol signifikantný. u nosníc v 1. mesiaci znášky bola pevnosť i hrúbka škrupiny nepreukazne vyššia u oboch pokusných skupín v porovnaní s kontrolnými nosnicami. Zatiaľ čo u nosníc v 1. pokuse bolo 4, 89, 3, 56 a 7,8 % vajec s poškodenou škrupinou u nosníc v 7. mesiaci znášky (2. pokus) to bolo u kontrolných 15,45 %, u prvej pokusnej skupiny 15,63 % a druhej pokusnej skupiny 16,20 %. Najviac poškodených vajec bolo v oboch pokusoch u nosníc s vyššou dávkou vitamínu E, u ktorých bola najvyššia hmotnosť vajec. Obsah vápnika v krvnom sére nosníc v 1. mesiaci znášky sa pohyboval pri dolnej hranici požadovanej úrovne a u nosníc v 7. mesiaci znášky pod hranicou. Medzi jednotlivými skupinami nosníc (vrátane kontrolnej) neboli zistené preukazné rozdiely v jeho obsahu. V obsahu anorganického fosforu bol zistený u nosníc v 7. mesiaci znášky preukazný rozdiel (P < 0,05) medzi kontrolnými nosnicami a nosnicami s vyššou dávkou vitamínu E. Obsah vitamínu E v krvi nosníc bol v oboch pokusoch u pokusných nosníc preukazne vyšší (P <0,01) v porovnaní s kontrolnými nosnicami. Najvyššie hodnoty boli namerané pri dávke 30 mg vitamínu E na nosnicu a deň. Obsah celkových lipidov sa u nosníc v 7. mesiaci znášky v porovnaní s kontrolnými nosnicami preukazne znížil (P < 0,05). U nosníc v 1. mesiaci znášky bolo zníženie celkových lipidov v priamej závislosti od dávky vitamínu E nepreukazné. Obsah celkových bielkovín bol v oboch pokusoch v priemere vyšší v pokusných skupinách ako u kontrolných nosníc. V aktivite alkalickej fosfatázy, aspartátaminotransferázy a alanínaminotransferázy medzi jednotlivými skupinami nosníc neboli preukazné rozdiely. U nosníc v prvom mesiaci znášky je vysoká intenzita znášky, ale hmotnosť vajec je nízka (Šály a kol., 1978) a s vekom nosníc sa zvyšuje (Jee, 1985). V našich pokusoch bola tiež hmotnosť vajec u nosníc v 1. mesiaci znášky nižšia ako u nosníc v 7. mesiaci znášky. Prídavkom vitamínu E sme dosiahli zvýšenie hmotnosti vajec, čo má u mladých nosníc značný ekonomický význam v súvislosti s lepšou obchodnou realizáciou hlavne konzumných vajec (Hadbavný a kol., 2001). Asi od 6. mesiaca znášky sa znižuje u sliepok metabolizmus kostného vápnika (Schubert a Gruhn, 1975), čím sa vysvetľuje aj znižovanie kvality vaječnej škrupiny s vekom nosníc. V obsahu sledovaných škrupinotvorných minerálnych látok v krvnom sére nosníc došlo len k zvýšeniu obsahu anorganického fosforu. O interakcii medzi vitamínom E a lipidmi referujú Abawi a kol., (1985). U oboch

293 vekových skupín nosníc sa prídavkom vitamínu E znížil obsah lipidov v krvnom sére. Prídavkom vitamínu E v pitnej vode sa tiež preukazne zvýšil obsah vitamínu E v krvi, a to u všetkých pokusných skupín nosníc. Záver Výsledky nášho pokusu dokazujú, že vitamín E v dávkach 20 a 30 mg na nosnicu a deň zvyšuje hmotnosť vajec. U nosníc v 7. mesiaci znášky toto zvýšenie hmotnosti vajec spôsobilo výraznejší pokles kvality vaječnej škrupiny ako u nosníc v 1. mesiaci znášky. Literatúra Abawi, F. G., Sullivan, T. W., Schneider, S. E., 1985: Interaction of dietary fat levels of vitamins A and E in broiler chicks. Poult. Sci., Arscot, G. H., Parker, J. E., 1967: Effectiveness of vitamin E in reversing sterility of male chickens fed a diet high in linoleic acid. J. Nutr., 91, 219. Bell, D. J., Freeman, B. M., 1971: Physiology and Biochemistry of the Domestic Fowl. Academic Press, London. Hadbavný, M., Korim, P., Korimová, J., 2001: Economical-organisational problems of hen rearing and broiler fattening.12 th Symp. Poultry Diseases, UVM Košice, Jee, D., 1985: Factor influencing egg size. Wld. Poult., 49, 43. Marcinka, K., Gažo, M., 1964: Pevnosť škrupiny vajec z klietkového chovu nosníc. II. Príspevok k stanoveniu pevnosti vaječnej škrupiny. Vedecké práce VÚCHH v Ivánke pri Dunaji, 2, Nishiwaki, M., Ichinoe, K., Nakojo, S., 1977: Studies on the changes of egg contents of chickens during the laying period. Changes egg weight and the weight of egg content in connection with age at first egg. J. Agric. Sci. (Tokyo), 22, Scott, M. L., 1962: Antioxidants, selenium and selphur amino acids in the vitamin E nutrition of chicks.nutr. Abstr. Rev., 31, 1 8. Schubert, R., Gruhn, K., 1975: Zum Mineralstoffwechsel der legenden Henne unter dem Aspekt der Schalenqualität. Monatshefte für Veterinärmedizin, 30, Šály, J., Fried, K., Kušev, J., 1978: Kvalita vaječnej škrupiny vo vzťahu k niektorým ekologickým faktorom. Hydin. Priem., 20, Šály, J., Jantošovič, J., Kušev, J., Matejovičová, M., Ravasz, M., 1988: Niektoré príčiny poruchy znášky vo veľkochovoch nosníc a možnosti jej zlepšenia. Zborník referátov zo VI. Sympózia o problematike chorôb a chovu hydiny, Košice, 18. Práca bola realizovaná za podpory projektu: VEGA č. 1/0575/03

294 METABOLIZMUS VÁPNIKA V SÚVISLOSTI S TVORBOU VAJEČNEJ ŠKRUPINY CALCIUM METABOLISM RELATED TO THE EGG SHELL FORMATION Šály, J., Baranová, D., Neuschl, J. Univerzita veterinárskeho lekárstva, Komenského 73, Košice, [email protected] Abstract Calcium needed for the egg shell formation is obtained from feed and bone tissue.the laying hen create a depot of nonstabile calcium in the medular bone.maximum of the calcium retention ability of a laying hen in 24 hour is 1,8 g. The rest to 2,0 2,2 g in egg shell has to be fillled from the body reserves what means 25 40%.This amount of calcium depends on the concentration of Ca in feed, feed intake, absorption etc, Due to our findings is the increasing of Ca in feed over 4% useless.laying hens to age of up to 40.wk. require 3,3% and after 3,7% Ca in feed mixture.callcium is transported to lumen of oviduct from blood by the cells of uterus.action is performed by molecules of calcium-binding proteins,and regulated by 1,25 dihydroxycholecalciferol.therefore,lack of it disturbes absorption of Ca from gut transport via wall of uterus for egg shell formation,too.increasing calcium content from 3,1% to 4,0 and 5% in feed improved the egg shell quality, increased calcium content and deecreased alkaline phosphatase activity in blood serum.incresing calcium content in the feed from 4% to 5% did not improve these parameters. Keywords : Egg shell quality, Ca metabolism Úvod Počas tvorby vaječnej škrupiny dochádza k poklesu obsahu vápnika v krvi asi o 1-10mg% (Hertelendy a Taylor, 1961). Bunky uteru premiestňujú ióny Ca do lumenu vajcovodu proti koncetračnému gradientu a na aktívnom transporte vápnika sa zúčastňujú bielkoviny viažuce vápnik (Ehrenspeck a kol., 1971). Ich tvorbu reguluje metabolit vitamínu D 1,25 dihydroxicholekalciferol. Pri nedostatku vitamínu D3 je narušený vnútrobunečný prechod vápnika cez stenu uteru (Krampitz a kol., 1976). Vaječná škrupina spôsobuje zmeny vápnika v krvi. Škrupina obsahuje asi 2 g vápnika, ktorý je deponovaný z krvi asi 20 hodín počas tvorby škrupiny t.j. rýchlosťou 100 mg za hodinu. Keď je obsah vápnika v krvi nosnice 25 mg%, toto množstvo je počas kalcifikácie škrupiny vymenené každých 15 minút (Hertelendy a Taylor, 1961).

295 Denná potreba vápnika pre zabezpečenie tvorby škrupiny, môže byť určovaná podľa obsahu Ca v škrupine 2,2 g, záchovnej potrebe vápnika 0,1 g a perceta retencie. Pri celkovej telesnej potrebe na nosnicu 2,3 g na deň a 1 vajce a 50% retencii je pri 100% znáške potreba vápnika v krmive 4,6 g na deň (Petersen, 1965). Hunt /1971/ udáva, že nosniciam vo veku týždňov postačuje obsah vápnika v krmive v množstve 3,3% a od 40. týždňa veku 3,7%. Grega a Barowicz (1979) považujú dávku 3,75% za nízku a doporučujú obsah vápnika v krmive 4-4,5%. Podľa viacerých autorov (Griminger, 1961, Hunt, 1971, Voght, 1976) zvyšovanie obsahu vápnika v krmive nad 4-4,5% nie je odôvodnené, pretože ho nosnica aj tak nevyužije. Vhodný pomer obsahu vápnika k obsahu fosforu je 5-7:1.Tento pomer sa zvyšuje so zvyšovaním znášky, nakoľko vajcom sa vylúči asi 20 krát viac vápnika ako fosforu. (Harms, 1981). Materiál a metodiky V prvej časti pokusu bolo 30 nosníc hybrida Shaver, ktoré boli umiestnené v individuálnych klietkach za rovnakých podmienok mikroklímy, po dobu 10 dní jednotne kŕmené kompletnou kŕmnou zmesou pre nosnice znáškového typu. V druhej časti pokusu bol nosniciam 1. pokusnej skupiny obsah vápnika v kŕmnej zmesi zvýšený na 5% a v pitnej vode bol podávaný vitamín D3 v dávke 200 m.j. a vitamín C v dávke 100 mg na nosnicu a deň. Nosniciam 2. pokusnej skupiny bol obsah vápnika v kŕmnej zmesi upravený na 4% a v pitnej vode podávaný vitamín D3 v dávke 200 m.j. a vitamín C v dávke 100 mg na nosnicu a deň. Nosnice kontrolnej skupiny boli kŕmené kŕmnou zmesou ako obe pokusné skupiny, ale bez zvýšenia vápnika a prídavku vitamínov D a C. Obsah minerálnych látok v kŕmnej zmesi bol: 3,1% vápnika, 0,5%, fosforu, 0,27% horčíka, 56 mg mangánu, 41 mg zinku a asi 600 m.j vitamínu D3 v 1 kg kŕmnej zmesi. Ako zdroj vápnika bol použitý uhličitan vápenatý. Vitamín D bol podávaný v prípravku Combinal D3 vo vodorozpustnej forme a vitamín C v prípravku Celaskon 25% pulvis a.u.v. Krv na biochemické vyšetrenie na konci pokusu bola od nosníc získaná dekapitáciou. Biochemické vyšetrenia krvi boli robené fotokolorimetricky pomocou Bio-Lachema testov (Brno, ČR). Pevnosť škrupiny sme zisťovali prístrojom, ktorý navrhli Marcinka a Gažo (1964).Výsledky boli vyhodnocované Studentovým t.-testom. Výsledky a diskusia V 1. pokusnej skupine nosníc s 5% obsahom v krmive sa pevnosť vaječnej škrupiny nepreukazne zvýšila z 19,9 N na 21,78 N v porovnaní s pevnosťou pred apklikáciou. V porovnaní s kontrolnými nosnicami (19,49 N) sa úpravou výživy pevnosť škrupiny preukazne (P< 0,05) zlepšila. U nosníc so 4% obsahom vápnika sa pevnosť škrupiny preukazne

296 zvýšila v porovnaní s pevnosťou pred aplikáciou z 20,3 N na 22,24 N (P< 0,05). I v porovnaní s kontrolnými nosnicami (P< 0,01). Medzi pokusnými nosnicami neboli signifikantné rozdiely v pevnosti vaječnej škrupiny. Hrúbka vaječnej škrupiny sa u nosníc 1. pokusnej skupiny nepreukazne zvýšila z 0,372 na 0,383 mm. V porovnaní s kontrolnými nosnicami (0,364 mm) bola hrúbka škrupiny signifikantne vyššia (P<0,01). U nosníc 2. pokusnej skupiny bola hrúbka škrupiny na konci pokusu (0,386 mm) nepreukazne vyššia ako pred úpravou výživy (0,376 mm) a preukazne vyššia (P< 0,01) ako u kontrolných nosníc na konci pokusu. V hrúbke škrupiny neboli preukazné rozdiely medzi 1. a 2. pokusnou skupinou nosníc. V 1. pokusnej skupine nosníc bolo percento vajec s poškodenou škrupinou pred pokusom 10,4 a po pokuse 9,09 v 2. pokusnej skupine 10,9 a 6,82 a v kontrolnej skupine nosníc 10,6 a na konci pokusu 9,7. Hmotnosť vajec bola na konci pokusu v 1. skupine 64,45 g, v 2. skupine 62,14 g a u kontrolných nosníc 62,8. Rozdiely v hmotnosti vajec medzi jednotlivými skupinami neboli štatisticky významné. V percente popola (1. skupina 52,4, 2. skupina 52,6 a kontrolná skupina 51,8) a vápnika (24,8, 24,5, 23,2) neboli signifikantné rozdiely medzi jednotlivými skupinami nosníc, ako aj medzi sledovanými fázami pokusu. Pri zvýšení obsahu vápnika v krmive a súčasnej aplikácii vitamínov D a C v pitnej vode sa obsah vápnika v krvnom sére v 1. pokusnej skupine (4,95 mmol.l -1 ) a v 2. skupine (4,83 mmol) preukazne (P< 0,05) zvýšil v porovnaní s kontrolnými nosnicami (4,3 mmol.l -1 ). Obsah fosforu v sére bola pri 1. pokusnej skupine (2,5 mmol.l -1 ) preukazne vyššia (P< 0,05) v porovnaní s 2. skupinou (1,79 mmol.l -1 ) i s kontrolnými nosnicami (1,73 mmol.l -1 ). U kontrolných nosníc bola aktivita sérovej alkalickej fosfatázy 13,23 ukat.l -1, čo bolo vysoko preukazné zvýšenie (P< 0,01) v porovnaní s oboma pokusnými skupinami nosníc (5,93 a 6,9 ukat.l -1 ). Najvyššie percento popola v tíbiach nosníc bolo v 1. pokusnej skupine (62,95), potom v 2. skupine (62,25) a u kontrolných nosníc (61,2). Tieto rozdiely v percente popola v tíbiach, ako aj v percente vápnika a fosforu v tíbiach medzi jednotlivými skupinami nosníc neboli signifikantné. V našom pokuse sme obsah vápnika v kŕmnej zmesi zvýšili z 3,1% na 4 a 5% spolu s vitamínmi D a C. Zlepšenie ukazovateľov kvality vaječnej škrupiny pri 4 a 5% obsahu vápnika v krmive bolo spojené so zvýšením obsahu vápnika v krvnom sére a znížením aktivity alkalickej fosfatázy, čo poukazuje na zlepšenie metabolizmu tohto dôležitého škrupinotvorneho minerálu. Zvýšenie obsahu vápnika v kŕmnej zmesi na 5% nezlepšilo už ďalej ukazovatele kvality škrupiny a metabolizmu vápnika pri zabezpečení dostatočného prijmu vitamínu D a C. Tieto výsledky poukazujú, že kvalita kŕmnej zmesi pre nosnice nezabezpečuje pri vysokej

297 znáške potrebnú pevnosť vaječnej škrupiny. Výsledky tiež potvrdzujú údaje iných autorov (Griminger, 1961, Hunt, 1971), že je neúčelné zvyšovať obsah vápnika v krmive nosníc nad 4%. Záver Kŕmne zmesi pre nosnice nedosahujú požadovanú kvalitu po stránke obsahu vápnika pre zabezpečenie vaječnej produkcie. Pri dostatočnom dotovaní nosníc vitamínom D však postačuje 4% obsah vápnika v kŕmnej zmesi pre tvorbu kvalitnej vaječnej škrupiny. 5% obsah vápnika v krmive je neúčelný. Zvýšenie obsahu vápnika zo 4% na 5% však neviedlo k zlepšeniu ukazovateľov metabolizmu vápnika, znášky a kvality vaječnej škrupiny. Literatúra Ehrenspeck, G.H., Schraer, H., Schraer, R. (1971):Calcium transfer across isolated avian shell gland. Am.J.Physiol., 220, Grega, T., Barowicz, T. (1979): O mocy skorupy jaja. Drobiarstvo, 27, 7-9. Griminger, P. (1961): Calcium requirement of laying hens. Feedstuffs, 33, 54. Harms, R.H. (1971): How important are calcium: phoshorus rations for chickens. Feedstuffs, 43, Hertelendy, F., Taylor, T.G. (1961): Changes in bood calcium associated with egg shell calcification in the domestic fowl. 1. Cahnges in the total calcium. Poult.Sci., 40, Hunt, C.E. (1971): Kalzium und Schalenqualität. Dtsch. Geflugelwirtsch., 23, 449. Krampitz, G., Hamm, M., Engels, J. (1976): Untersuchungen zur Frage des molekularen Mechanismus der Eischalenbildung. 4. Vorkommen und biologische Bedeutung vitamin D-abhähninger Cabindender Systeme eine Übersicht. Arch.Geflügelkde, 40, Marcinka, K., Gažo, M. (1964): Pevnosť škrupiny vajec z klietkového chovu nosníc. II. Príspevok k stanoveniu pevnosti vaječnej škrupiny. Vedecké práce VÚCHH, Ivánka pri Dunaji, 2, 237. Petersen, G.G. (1965): Factors influencing egg shell quality - a review. Worlds Poult. Sci. J., 21, Thaeler, D.A. (1979): The egg laying bird: major physiological changes in calcium associated with oestrogen control. Worldś Poult. Sci. J., 35, Práca bola realizovaná za podpory projektu: VEGA č. 1/0575/03

298 VPLYV SIMULOVANEJ MIKROGRAVITÁCIE NA RAST KOSTÍ NOHY PREPELICE JAPONSKEJ EFFECT OF SIMULATED MICROGRAVITY ON LEG BONE GROWTH IN JAPANESE QUAIL Škrobánek, P., Baranovská, M., Šárniková, B. Ústav biochémie a genetiky živočíchov SAV, Ivanka pri Dunaji, SR Abstract The purpose of this study was to assess the influence of simulated microgravity (hypodynamy) on morphological characteristics of the long bones of the right leg of Japanese quail females from 3 to 56 days of age. Femur and tibiotarsus were obtained at 14, 28, 42 and 56 days of age and the variables studied were: weight (g), length and width (mm), bone breaking strength (N) and bone index (ash weight /bone length; mg/mm). All bone variables increased with bird age. However, the effect of hypodynamy on the examined variables was considerable. The tibiotarsus mean weight was significantly (P < 0.001) reduced by g, although the femur mean weight in hypodynamy reared quails was almost identical to that of the age-matched control at 56 days of age. Similarly, there was significantly decreased tibiotarsus mean length by 3.16 mm (P < 0.01) and tibiotarsus mean width by 0.44 mm (P < 0.001) at the end of experiment. In the same way, bone index and bone breaking strength of both bones in birds reared under hypodynamy were lower than those of control (P < 0.001). Our results suggest that although hypodynamy reduce bone growth of test birds, the long bones of the right leg of female Japanese quail were capable to grow and develop under conditions of simulated microgravity. Úvod S využitím úžitkových vlastností prepelice japonskej sa uvažuje pri dlhodobých pobytoch človeka v podmienkach kozmu. Výskum za posledné tri desaťročia potvrdil reálnosť tejto myšlienky. Absencia gravitácie na palube orbitálnej stanice MIR a ani ďalšie špecifiká kozmického letu neboli prekážkou pre uskutočnenie embryogenézy a liahnutia prepelice japonskej v kozmickom prostredí. Ako však bude prebiehať ich ďalší vývin ostáva nezodpovedanou otázkou, keďže po vyliahnutí zotrvali prepeličie mláďatá v mikrogravitácii maximálne päť dní. Čiastočnú odpoveď však môžeme získať aj prostredníctvom experimentov v pozemských podmienkach, a to pomocou metódy simulácie beztiažového stavu, tzv. hypodynamiou. Cieľom nášho pokusu bolo skúmať vplyv hypodynamie na rast dlhých kostí nohy prepelice japonskej od 3 do 56 dní veku.

299 Materiál a metódy V experimente bolo použitých 80 kurčiat prepelice japonskej samičieho pohlavia o priemernej hmotnosti 7,29 g. Na tretí deň po vyliahnutí bola jedna polovica z nich vystavená pôsobeniu hypodynamie (Škrobánek a Hrančová, 2003) a druhá umiestnená v odchovnom boxe (kontrola). Za týchto podmienok boli zvieratá držané až do veku 56 dní. Chovateľské podmienky (svetlo, teplota, kŕmenie, atď.) boli pre obidve skupiny rovnaké. Vo veku 14, 28, 42 a 56 dní bol dekapitovaný alikvotný počet zvierat pokusnej a kontrolnej skupiny. Z ich pravej nohy bola odobratá stehenná (femur) a holenná kosť (tibiotarsus). Po dôkladnom odstránení svalstva a vysušení bola zistená ich hmotnosť (g), dĺžka a hrúbka (mm). Pevnosť kostí (N) bola stanovená na modifikovanom prístroji vyvinutom Marcinkom a Gažom (1964). Neskôr po odtučnení dietyléterom a vysušení pri 105 C počas 4 hodín boli obidve kosti spopolnené v muflovej peci pri 550 C v priebehu 6 hodín. Z pomeru hmotnosti popola (mg) a dĺžky kosti (mm) bol vypočítaný tzv. index kosti (Seedor a kol., 1991). Získané údaje boli štatisticky spracované a rozdiely medzi pokusnou a kontrolnou skupinou boli porovnané t-testom. Výsledky a diskusia Vplyv hypodynamie na sledované parametre skúmaných kostí nohy prepelice japonskej je zaznamenaný v tabuľke. Výsledky experimentu ukázali, že absolútna hmotnosť femuru a tibiotarsu sa zvyšovali s vekom. Hmotnosť obidvoch kostí zvierat odchovávaných v hypodynamii bola však v porovnaní s vekovo zhodnou kontrolou významne nižšia už na 14. deň veku (P < 0,001). Maximálny rozdiel v hmotnosti kostí bol zaznamenaný na 28. deň, pričom až do konca pokusu neboli pokusné prepelice i napriek zvýšenej rastovej intenzite schopné vzniknutú diferenciu eliminovať. Vo veku 56 dní bola hmotnosť femuru štatisticky nevýznamne nižšia o 0,05 g a tibiotarsu o 0,154 g (P < 0,001). Podobne bola hypodynamiou postihnutá absolútna dĺžka tibiotarsu, ale žiadne významné rozdiely neboli zaznamenané pri femure. Na konci experimentu bol tibiotarsus pokusnej skupiny zvierat kratší o 3 mm (P < 0,01). Priemerná hrúbka dlhých kostí nohy pokusných zvierat bola v porovnaní s kontrolou tiež odlišná počas celého experimentu. Prepelice vystavené hypodynamii mali vo veku 56 dní hrúbku tibiotarsu nižšiu o 0,44 mm (P < 0.001) a femuru o 0,01 mm. Pevnosť obidvoch skúmaných kostí sa s vekom výrazne zvyšovala u obidvoch skupín, predsa len jej absolútne hodnoty boli signifikantne nižšie u pokusných zvierat (P < 0,001). Index kosti, stanovený ako podiel hmotnosti popola a dĺžky konkrétnej kosti bol opäť nižší v pokusnej skupine ako kontrole. Index femuru prepelíc odchovávaných v hypodynamii bol signifikantne znížený

300 oproti kontrole v 14 a 42 dňoch veku (P < 0,01 resp. 0,05) a index tibiotarsu v 28 a 42 dňoch (P < 0,01). Rast je najčastejšie skúmaný faktor postnatálneho vývinu jedincov (Ricklefs, 1979). Mnohé štúdie sa zaoberajú skúmaním rastu a vývinu prepelice japonskej v štandardných pozemských podmienkach (Lilja a Marks, 1991; Hyánková a kol., 2001). Naopak, iba niekoľko prác bolo venovaných vplyvu zmenenej gravitácie (mikrogravitácie) na postnatálny vývin prepelice japonskej, avšak len do veku 5 dní (Boďa a kol., 1992; Sabo a kol., 2001). Cieľom našej práce bolo posúdiť vplyv simulovanej mikrogravitácie (hypodynamie) na morfometrické vlastnosti dlhých kostí nohy prepelice japonskej až do veku 56 dní. Dosiahnuté výsledky ukázali, že hypodynamia mala signifikantne negatívny vplyv na väčšinu skúmaných charakteristík dlhých kostí nohy počas celého experimentu. Zaznamenané skutočnosti neboli predsa len neočakávané, pretože simulovaná ako aj reálna mikrogravitácia sú považované za výrazné stresové faktory (Juráni a kol., 1991). Rovnako v našom predošlom pokuse (Škrobánek a kol., 2003) sme pozorovali negatívny vplyv hypodynamie na živú hmotnosť, spotrebu a konverziu krmiva prepelice japonskej, čo sa v konečnom dôsledku muselo prejaviť aj vo vývine jej kostrovej sústavy. Súčasné výsledky to len potvrdili. Záver Naša práca je prvou štúdiou zaoberajúcou sa vplyvom simulovanej mikrogravitácie (hypodynamie) na vývin dlhých kostí nohy prepelice japonskej od 3 do 56 dní veku. Dosiahnuté výsledky ukázali, že napriek retardačnému vplyvu hypodynamie pokračoval rast a vývin skúmaných kostí nohy prepelice japonskej až do štádia jej dospelosti. Literatúra Boďa K., Sabo V., Juráni M., Guryeva T.S., Kočišová J., Košťál Ľ., Lauková A., Dadasheva O.A.: Acta Vet. Brno, 61, 1992: Hyánková L., Knížetová H., Dědková L., Hort J.: Br. Poult. Sci., 42, 2001: Juráni M., Boďa K., Výboh P., Zeman M., Lamošová D., Somogyiová E., Košťál Ľ., Baumgartner J.: Physiologist 34 (Suppl), 1991: Marcinka K., Gažo M.: Vedecké práce Výskumného ústavu pre chov hydiny, 2, 1964: Lilja C., Marks H.L.: Growth Dev. Aging, 55, 1991: Ricklefs R.: 1979: The Auk, 96, 1979: Sabo V., Boďa K., Guryeva T.S., Dadasheva O.A., Bella I.: Folia Vet. 45 (Suppl.1), 2001: S9-S11. Seedor G., Quartuccio H.A., Thompson D.D.: J. Bone and Mineral Res., 6, 1991: Škrobánek P., Hrančová M.: Acta Vet. Brno, 72, 2003:

301 Tabuľka. Hmotnosť, dĺžka, hrúbka, index a pevnosť dlhých kostí nohy prepelice japonskej odchovanej v hypodynamii Vek F e m u r T i b i o t a r s u s (dni) Hypodynamia Kontrola Hypodynamia Kontrola Hmotnosť (g) 14 0,162±0, ,215±0,023 0,204±0, ,285±0, ,256±0, ,436±0,023 0,331±0, ,528±0, ,355±0, ,458±0,036 0,394±0, ,537±0, ,461±0,061 0,511±0,051 0,445±0, ,559±0,053 Dĺžka (mm) 14 24,69 ± 1,54 25,99 ± 1, ± 1, ,45 ± 1, ,50 ± 3,41 35,10 ± 0, ± 3, ,20 ± 1, ,47 ± 1,02 36,30 ± 0, ± 1, ,90 ± 0, ,67 ± 0,27 37,35 ± 0, ± 1, ,46 ± 1,10 Hrúbka (mm) 14 1,60 ± 0, ,90 ± 0,20 1,50 ± 0, ,70 ± 0, ,10 ± 0, ,35 ± 0,08 1,80 ± 0, ,15 ± 0, ,30 ± 0, ,60 ± 0,08 2,05 ± 0, ,45 ± 0, ,61 ± 0,17 2,62 ± 0,21 2,00 ± 0, ,44 ± 0,09 Index kosti (mg/mm) 14 0,976±0, ,117±0,072 1,001±0,114 1,170±0, ,462±0,301 1,592±0,186 1,031±0, ,144±0, ,258±0, ,366±0,090 1,056±0, ,158±0, ,311±0,199 1,427±0,251 1,081±0,102 1,192±0,224 Pevnosť kosti (N) 14 25,16±1, ,16±1,05 20,31±1, ,11±0, ,33±1, ,21±1,04 24,06±1, ,87±3,64 + P < 0,05; ++ P < 0,01; +++ P < 0,001 Práca bola podporená Vedeckou grantovou agentúrou Ministerstva školstva SR a Slovenskej akadémie vied, grant č. 2/3046/23.

302 SPRÁVANIE SA POTKANOV OŽIARENÝCH GAMA-LÚČMI V OBLASTI HLAVY V TESTE NA HORÚCEJ PLATNI A V KRÍŽOVOM LABYRINTE BEHAVIOR OF RATS IRRADIATED WITH GAMMA RAYS ON THE HEAD IN HOT PLATE TEST AND IN PLUS MAZE Šmajda, B., Kisková, J., Oravcová, Z., Tomášová, L. Katedra fyziológie živočíchov, Ústav biologických a ekologických vied Prírodovedeckej fakulty UPJŠ v Košiciach Abstract The effect of ionizing radiation on nociception in hot plate test and on some behavioral parameters in elevated plus maze were studied in female Sprague-Dowley rats. Irradiation of rats (n=16) with a single dose of 10 Gy on the head caused a statistically significant decrease in nociception (measured as latency time of escape from hot plate) immediately after irradiation, but no changes during following 4 days (with even significantly shorter latency in irradiated animals on the 2 nd day). Irradiation of rats (n=6) with a whole-body dose of 6 Gy caused a statistically significant decrease in rearing behavior and an increased number of crossings of the open center of elevated plus maze compared with the sham-irradiated control group. No significant differences were detected up to the 4 th day after irradiation. These results suggest, that the applied doses of radiation can cause only short-lasting and reversible changes in nociception and in parameters of explorative behavior in female rats. Úvod Hoci nervový systém nepatrí medzi rádiosenzitívne systémy organizmu, zistilo sa, že niektoré jeho funkcie môžu byť ovplyvnené už pomerne malými dávkami žiarenia (Mickley a spol.1989). Bolo tiež zistené, že po ožiarení potkanov neletálnou dávkou dochádza u nich k dočasnej analgézii (Teskey a Cavaliers, 1984). V našich predošlých experimentoch sme zistili, že dávka 6 Gy gama-lúčov aplikovaná celotelovo alebo 10 Gy s obmedzením na hlavu zvieraťa vyvolala zníženie citlivosti na tepelné podnety (Kereškényiová a Šmajda, 2004). Cieľom nášho prvého experimentu bolo zistiť časovú dynamiku zníženia citlivosti na tepelné podnety počas niekoľkých dní po ožiarení potkanov gama-lúčmi v oblasti hlavy. V druhom experimente sme sledovali zmeny parametrov exploratívneho správania a emotívne podmieneného správania po celotelovom ožiarení.

303 Materiál a metódy. V experimente sme použili dospelé samice potkanov kmeňa Sprague- Dowley o priemernej hmotnosti 320 g, chovaných za štandardných podmienok v ústavnom zverinci. Polovica zvierat (n=16) bola ožiarená jednorazovou dávkou 10 Gy gama-lúčov zo zdroja 60 Co (prístroj CHISOSTAT, Chirana, Praha) v oblasti hlavy, pričom zvyšok tela bol tienený olovenou platňou o hrúbke 2 cm. Kontrolné zvieratá (n=16) boli podrobené rovnakej manipulácii, až na samotné ožiarenie. K zisťovaniu citlivosti na tepelné podnety sme použili test na horúcej platni s teplotou platne 55 0 C. Sledovali sme latentný čas do úniku z platne. V ďalšom experimente sme vo vyvýšenom krížovom labyrinte s dvoma zatvorenými a dvoma otvorenými ramenami (dĺžka ramien : 40 cm) sledovali exploračné správanie (počet vztýčení na zadné končatiny) a emotívne podmienené správanie ( počet prechodov cez nechránený stred labyrintu) po ožiarení jednorazovom celotelovou dávkou 6 Gy počas 5-minútového testu. Uvedené parametre sme zaznamenávali ihneď po ožiarení, resp. 1, 3, 5 a 24 hodín po ožiarení. Výsledky oboch experimentov sme štatisticky hodnotili neparametrickým Mann-Whitneyovým testom a nepárovým t-testom. Výsledky. Pri hodnotení latentného času do úniku z platne sme štatisticky významný rozdiel medzi oboma skupinami zaznamenali bezprostredne po ožiarení s kratšími latentnými časmi u skupiny kontrolných zvierat. Na druhý deň po ožiarení boli hodnoty ožiarených zvierat na úrovni kontrol a na 3. a 4. deň po ožiarení boli kratšie, než u kontrol (na 3. deň bol rozdiel štatisticky významný) (tab.1). Pri testovaní zvierat vo vyvýšenom krížovom labyrinte sme zistili postupný pokles vztyčovacej aktivity u ožiarených i kontrolných zvierat v priebehu pokusu. Štatisticky významný pokles vztyčovacej aktivity (P< 0.05) u ožiarených zvierat voči kontrolnej skupine nastal bezprostredne po ožiarení. V ďalších intervaloch sme podobný rozdiel už nezistili (obr.1) Dni po ožiarení Kontroly Ožiarené Hodnota P / / * / / / / / / * / / Tab.1 : Latentné časy úniku zvierat (n=16) z horúcej platne. Hodnoty udané ako aritmetický priemery +/- SEM. * - P =<0.05

304 Pri testovaní zvierat vo vyvýšenom krížovom labyrinte sme zistili postupný pokles vztyčovacej aktivity u ožiarených i kontrolných zvierat v priebehu pokusu. Štatisticky významný pokles vztyčovacej aktivity (P< 0.05) u ožiarených zvierat voči kontrolnej skupine nastal bezprostredne po ožiarení. V ďalších intervaloch sme podobný rozdiel už nezistili (obr.1) kontroly ožiarené 8 počet hodiny Obr.1 : Vztyčovacia aktivita potkanov (n=6) počas 5-minútového testu vo vyvýšenom krížovom labyrinte. Hodnoty udané ako aritmetický priemer +/- SEM Počet prechodov cez stred labyrintu bol u ožiarených zvierat oproti kontrolám štatisticky významne znížený (P<0.05) v deň ožiarenia, neskôr rozdiely neboli štatisticky významné. U kontrolnej skupiny sme pozorovali približne exponenciálny pokles počtu prechodov, kým u ožiarených zvierat sme takýto trend nezaznamenali (obr.2). kontroly ožiarene počet hodiny Obr.2 : Počet prechodov potkanov (n=6) cez otvorený stred krížového vyvýšeného labyrintu. Hodnoty udané ako aritmetický priemer +/- SEM

305 Diskusia. Výsledky testovania citlivosti potkanov na tepelný podnet po ožiarení sú v súlade so staršími literárnymi údajmi (Teskey a Kavaliers, 1984), i s našimi predošlými pozorovaniami (Šmajda a spol., 2003; Kereškényiová a Šmajda, 2004) u samcov, kde sme po rovnakej dávke aplikovanej na hlavu zistili výrazný analgetický účinok žiarenia pri testovaní 30 minút po ožiarení. Naše terajšie výsledky poukazujú na rýchly ústup tohto účinku žiarenia, ktorý zrejme možno zaradiť medzi prejavy tzv. prodromálneho syndrómu žiarenia (Coggle, 1983). Predĺženie času úniku počas ďalších dní u kontrolnej skupiny vysvetľujeme habituáciou na nové prostredie testovacej aparatúry a čiastočne i na samotný podnet. Táto habituácia bola oveľa menej viditeľná u ožiarených zvierat. V druhom zvolenom modeli ožarovania sme zmeny správania opäť zaznamenali len krátko po ožiarení, kedy boli u ožiarených zvierat štatisticky významne znížené priemerné počty vztýčení, čo môžeme považovať za výrazný prejav exploračnej aktivity zvieraťa, ako aj počet prechodov cez stred labyrintu, spojený s vystavením sa otvorenému priestoru ako miera hladiny úzkosti. Už jednu hodinu po ožiarení tieto rozdiely v prípade oboch parametrov vymizli. Záver. Naše výsledky naznačujú, že jednorazová dávka 10 Gy gama lúčov aplikovaná na hlavu vyvolá u samíc potkanov krátkodobý prechodný pokles nocicepcie na termálny podnet. Stredneletálna dávka 6 Gy aplikovaná celotelove pozmenila exploračné správanie a emotívne podmienené správanie krátko po ožiarení s ústupom zmien do jednej hodiny. Práca bola podporovaná grantom VEGA č.1/0440/03 Literatúra 1. Coggle, J.E: Biological effects of radiation, Taylor & Francis, London, Kereškényiová,E., Šmajda,B.: Endogenous opioids and analgesic effects of ionizing radiation in rats. Acta.Vet.Brno, 73, , Mickley, G.A., Bogo,V., West,B.R.: Behavioral and neurophysiological changes with exposure to ionizing radiation. In: Walker,R.I., Cerveny,T.J. (eds): Textbook of military medicine: Medical conseqences of nuclear warfare. TMM Publications, Falls Church, Šmajda,B., Slivková,E., Kisková,J.: Analgetické účinky žiarenia a endogénne opiáty u potkanov. V.Celoslovenský seminár z fyziológie živočíchov, Zborník prednášok, , SPU Nitra, Teskey,G.C., Kavaliers,M.: Ionizing radiation induces opioid-mediated analgesia in male mice. Life Sci. 35, , 1984.

306 POROVNANIE CHOLESTEROLÉMIE A SOMATOMETRICKÝCH UKAZOVATEĽOV V SKUPINE DOSPELÝCH OSÔB COMPARATION OF BLOOD CHOLESTEROL AND SOMATOMETRIC PARAMETERS IN ADULTS Šramková, K., Kopčeková, J., Daniška, J. Katedra výživy ľudí FAPZ SPU Nitra Abstract The survey study included 109 randomly selected adult persons (85 women and 24 men), aged The objective of this study was to monitor the distribution of risk factors obesity and total cholesterol. Overweight was present in 23,5 % of women and 25,0 % of men. Obesity was present in 7,1 % of women and 20,8 % of men. Obesity is associated with an increased risk of many major chronic diseases. Elevated blood cholesterol was assed in 24,8 % of all group. Úvod Zvýšená koncentrácia krvného cholesterolu je rizikovým faktorom kardiovaskulárnych chorôb. So zvýšenou hladinou cholesterolu sa dáva do súvislosti aj vysoký príjem tuku, najmä však vysoký príjem saturovaných mastných kyselín. Aj u jednotlivcov konzumujúcich menej tuku, ktorých hmotnosť je blízka ideálnej, môže dôjsť k zvýšeniu hladiny tuku v krvi (tzn. cholesterolu a triacylglycerolov), keď vo svojej strave nahradia nenasýtené mastné kyseliny nasýtenými (Kelly, 2002). Cieľom štúdie bolo porovnať cholesterolémiu a vybrané somatometrické ukazovatele nutričného stavu v dvoch skupinách dospelej populácie podľa veku. Materiál a metódy Somatometrické parametre (telesnú hmotnosť, telesnú výšku, body mass index) a hladinu cholesterolu v krvi sme sledovali v náhodne vybratej skupine 109 dospelých osôb vo veku rokov, z toho 85 žien (78,0 %) a 24 mužov (22,0 %). Vyšetrované osoby sme podľa veku rozdelili do dvoch skupín: mladší dospelí vo veku rokov (s priemerným vekom 21,53 ± 1,24 rokov) a starší dospelí vo veku rokov (s priemerným vekom 45,24 ± 8,81 rokov). Body mass index index telesnej hmotnosti (BMI) sme vypočítali ako podiel telesnej hmotnosti v kilogramoch a druhej mocniny telesnej výšky v metroch. Podľa BMI sme vyšetrované osoby klasifikovali nasledovne: s normálnou telesnou hmotnosťou (u žien s BMI 24 a menej, u mužov 25 a menej), so zvýšenou hmotnosťou (u žien 24,1-28,9, u mužov 25,1-29,9)

307 a s obezitou (u žien 29 a viac, u mužov 30 a viac). Hladinu cholesterolu v krvi sme merali prístrojom Accutrend GCT a namerané hodnoty sme klasifikovali nasledovne: normálne (menej ako 5,20 mmol/l), hraničné (5,20-6,49 mmol/l) a rizikové (6,50 mmol/l a viac) (Avdičová et al., 2000, Kleinwächterová, Brázdová, 2001). Pri hmotnosti a cholesterolémii sme vyhodnotili štatistickú významnosť rozdielov u mladších a starších žien. Z telesnej výšky sme vypočítali ideálnu telesnú hmotnosť podľa vzorcov: pre ženy = 20,8. (výška v metroch) 2, pre mužov = 22. (výška v metroch) 2. V oboch skupinách vyšetrovaných osôb sme sledovali rozdiely medzi skutočnou a vypočítanou ideálnou telesnou hmotnosťou. Výsledky a diskusia Priemerná hmotnosť súboru žien bola vyššia ako mužov, a to ako v skupine mladších (rozdiel 23,76 kg), tak aj starších osôb (rozdiel 17,89 kg). Priemerná hmotnosť skupiny starších osôb bola vyššia o 11,42 kg ako u mladších osôb, podobne ako aj BMI (rozdiel bol 4,67 kg.m -2 ) (tab. 1). Rozdiely v hmotnosti mladších a starších žien boli vysoko preukazné, zatiaľ čo rozdiely u mužov neboli preukazné. Tab. 1 Somatometrické ukazovatele a cholesterolémia Skupina mladší starší n % 100,0 100,0 vek [roky] telesná hmotn. [kg] telesná výška [cm] BMI [kg.m -2 ] cholesterol [mmol/l] ideálna tel. hm. [kg] rozdiel * [kg] 21,53 ± 1,24 61,89 ± 12,21 170,87 ± 8,07 21,06 ± 2,89 4,09 ± 0,42 64,37 ± 6,17-2,48 ± 8,66 45,24 ± 8,81 73,31 ± 15,24 168,64 ± 8,27 25,73 ± 4,78 5,18 ± 1,31 60,17 ± 7,43 13,13 ± 13,64 * rozdiel medzi skutočnou a ideálnou hmotnosťou Podľa hodnotenia BMI (tab. 2) mal v mladšej skupine najvyšší podiel osôb (85,0 %) normálnu hmotnosť (91,5 % mladších žien a 61,5 % mladších mužov), kým v skupine starších osôb bol síce tiež najväčší podiel s normálnou hmotnosťou (42,9 %), ale tento podiel bol o 42,1 % menší ako u mladších. Počet starších osôb so zvýšenou hmotnosťou bol potom v porovnaní s mladšou skupinou vyšší o 23,4 % a s obezitou bolo viac starších osôb o 18,7 %. V skupine starších osôb malo normálnu hmotnosť len 42,2 % žien a 45,4 % mužov. V celom súbore vyšetrovaných osôb malo

308 na základe BMI normálnu hmotnosť 66,0 %, zvýšenú hmotnosť 23,9 % a obezitu 10,1 % osôb. Tab. 2 Hodnotenie indexu telesnej hmotnosti BMI (kg/m2) SKUPINA Hmotnosť normálna zvýšená obezita mladší ženy n (%) muži n (%) spolu n (%) 43 (91,5 %) 8 (61,5 %) 51 (85,0 %) 4 (8,5 %) 4 (30,8 %) 8 (13,3 %) starší ženy n (%) muži n (%) spolu n (%) Spolu ženy n (%) muži n (%) spolu n (%) 16 (42,2 %) 5 (45,4 %) 21 (42,9 %) 59 (69,4 %) 13 (54,2 %) 72 (66,0 %) 16 (42,2 %) 2 (18,2 %) 18 (36,7 %) 20 (23,5 %) 6 (25,0 %) 26 (23,9 %) 0 (0 %) 1 (7,7 %) 1 (1,7 %) 6 (15,6 %) 4 (36,4 %) 10 (20,4 %) 6 (7,1 %) 5 (20,8 %) 11 (10,1 %) Hladinu cholesterolu v krvi malo v normálnom rozpätí v skupine starších osôb o 51,3 % menej v porovnaní s mladšou skupinou (tab. 3), hraničnú hladinu cholesterolu krvi malo o 28,9 % viac a rizikovú o 22,4 % viac starších osôb. Cholesterolémia v mladšej skupine bola prevažne v normálnom rozpätí, len jeden muž (1,7 %) mal hraničnú hodnotu. U starších osôb malo 30,6 % z nich hraničnú a 22,4 % rizikovú hodnotu. Rozdiely v cholesterolémii u mladších a starších žien boli vysoko preukazné a rozdiely u mužov boli preukazné. Tab. 3 Hodnotenie cholesterolémie (mmol/l) SKUPINA < 5,20 5,20-6,49 6,50 mladší ženy n (%) muži n (%) spolu n (%) 47 (100 %) 12 (92,3 %) 59 (98,3 %) 0 (0 %) 1 (7,7 %) 1 (1,7 %) 0 (0 %) 0 (0 %) 0 (0 %) starší ženy n (%) muži n (%) spolu n (%) Spolu ženy n (%) muži n (%) spolu n (%) 16 (42,2 %) 7 (63,6 %) 23 (47,0 %) 63 (74,2 %) 19 (79,2 %) 82 (75,2 %) 11 (28,9 %) 4 (36,4 %) 15 (30,6 %) 11 (12,9 %) 5 (20,8 %) 16 (14,7 %) 11 (28,9 %) 0 (0 %) 11 (22,4 %) 11 (12,9 %) 0 (0 %) 11 (10,1 %) Zo všetkých vyšetrovaných malo normálnu cholesterolémiu 75,2 %, hraničnú 14,7 % a rizikovú 10,1 % osôb. Z rozdielu medzi skutočnou a vypočítanou ideálnou telesnou hmotnosťou sme zistili, že v porovnaní s ideálnou hmotnosťou malo vyššiu skutočnú hmotnosť (tzn. kladný rozdiel z tab. 4) o 44,5 % viac starších osôb

309 (43,3 % mladších a 87,8 % starších). Zo všetkých osôb spolu malo vyššiu skutočnú hmotnosť v porovnaní s ideálnou 63,3 % osôb a nižšiu 36,7 %. Tab. 4 Rozdiel medzi skutočnou a ideálnou hmotnosťou (kg) SKUPINA záporný kladný mladší ženy n (%) muži n (%) spolu n (%) 32 (68,1 %) 2 (15,4 %) 34 (56,7 %) 15 (31,9 %) 11 (84,6 %) 26 (43,3 %) starší ženy n (%) muži n (%) spolu n (%) Spolu ženy n (%) muži n (%) spolu n (%) 4 (10,5 %) 2 (18,2 %) 6 (12,2 %) 36 (42,4 %) 4 (16,7 %) 40 (36,7 %) 34 (89,5 %) 9 (81,8 %) 43 (87,8 %) 49 (57,6 %) 20 (83,3 %) 69 (63,3 %) Záver V súbore 109 náhodne vybratých osôb, rozdelených podľa veku na skupinu mladších a starších dospelých osôb sme zistili, že hraničnú a rizikovú hladinu cholesterolu malo o 51,3 % viac starších osôb v porovnaní s mladšou skupinou. Hladina cholesterolu sa s vekom značne zvyšovala. Staršie osoby mali tiež v priemere vyššiu telesnú hmotnosť a body mass index. Zvýšenú telesnú hmotnosť a obezitu malo podľa hodnotenia BMI o 42,1 % viac starších osôb. Vyššiu skutočnú hmotnosť v porovnaní s vypočítanou ideálnou hmotnosťou malo o 44,5 % viac starších osôb. So stúpajúcim vekom sa zvyšujú sledované parametre, ktorých rizikové hodnoty sa prejavujú ako závažné faktory mnohých civilizačných chorôb, zaraďovaných do metabolického (Reavenovho) syndrómu. Literatúra: AVDIČOVÁ, M. et al Metodická príručka pre prácu v poradniach zdravia. Bratislava : Ministerstvo zdravotníctva, s. ISBN KELLY, C Tuky vo výžive a kardiovaskulárne ochorenia. Bratislava : Ústav vedecko-technických informácií pre pôdohospodárstvo Vydavateľstvo NOI, s. ISBN KLEINWÄCHTEROVÁ, H., BRÁZDOVÁ, Z Výživový stav člověka a způsoby jeho zjišťování. Brno : IDVPZ, s. ISBN

310 KOSTNÁ DENZITA, RIZIKO OSTEOPORÓZY A NUTRIČNÉ PARAMETRE BONE DENSITY, RISK OF OSTEOPOROSIS AND NUTRITIONAL PARAMETERS Šramková, K. 1, Bitter, K. 2, Lukáčová, O. 3 1 Katedra výživy ľudí FAPZ SPU Nitra, 2 Špecializovaný odborný ústav sv. Svorada, n.o. Nitra-Zobor, 3 Národný ústav reumatických chorôb Piešťany Abstract The aim of the study was to evaluate bone density in 161 adults (116 women and 45 men) aged years (average age 45,90 years). Prevalence of the osteoporosis was 5,80 % in women and 0,45 % in men, prevalence of osteopenia was 48,72 % in women and 6,30 % in men. According to body mass index was evaluated normal weight only in 26,1 % women with osteopenia. The highest age was in the osteoporosis group in women and in men too. The lowest body mass index was in women with osteopenia and in men with osteoporosis. Half of the litre and more per day was daily consumed quantum of milk in 2,78 % of women (all from group with normal density). The most of milk products was consumed in women and in men from group with osteopenia and normal bone density. Úvod Osteoporóza je metabolické ochorenie skeletu, charakterizované nízkou kostnou denzitou, poruchou mikroštruktúry s následným zvýšením jej fragility a rizika zlomeniny (WHO Technical Report Series 843, 1994). Incidencia osteoporózy, najmä však jej komplikácií, má v súčasnej dobe vzostupný trend. Riziko vzniku osteoporózy je funkciou dvoch zložiek: maximálneho množstva kostnej hmoty (PBM, peak bone mass), dosiahnutého v priebehu dospievania, a rýchlosti úbytku kostnej hmoty v dospelosti. Obe zložky možno kvantitatívne hodnotiť a do istej miery aj ovplyvniť (Štěpán, 1990). Materiál a metódy Sledovali sme 161 náhodne vybratých osôb (116 žien a 45 mužov vo veku od 14 do 70 rokov, priemerný vek bol 45,90 rokov). U respondentov sme vykonali osteodenzitometrické meranie na pätovej kosti dolnej končatiny. Kostnú denzitu sme merali ultrazvukovým osteodenzitometrom SAHARA HOLOGIC 4500C a interpretovali sme T-skóre (počet smerodajných odchýlok od priemeru BMD (bone mass density) u mladých zdravých osôb rovnakého pohlavia) a Z-skóre (počet odchýlok od priemeru

311 BMD u rovnako starých osôb rovnakého pohlavia). Osteoporóza je definovaná pri T-skóre -2,5 a menej, osteopénia -2,49 až -1 a normálny nález -1 a viac. Sledovali sme aj parametre pre hodnotenie nutričného stavu: index telesnej hmotnosti (BMI) a podiel telesného tuku. BMI sme klasifikovali podľa Kellera et al. (1993): asténia (telesná slabosť) BMI < 20, normálna hmotnosť BMI 20-24,9, nadmerná hmotnosť (ľahká obezita) BMI 25-29,9, obezita stredného stupňa (výrazná) 30-39,9 a ťažkého stupňa (morbídna) BMI 40 kg.m -2. Telesný tuk sme merali na princípe bioelektrickej impedančnej analýzy prístrojom Omron BF300. Dotazníkovou metódou sme zisťovali konzumáciu mlieka a mliečnych výrobkov v mladšom a súčasnom období. Výsledky žien sme štatisticky vyhodnotili T-testom. Výsledky a diskusia Najväčší podiel vyšetrovaných žien bol s ON, u mužov s NN (tab. 1). Celkový podiel osôb s OP alebo ON bol 38,51 %. Osteoporózou trpí viac žien ako mužov o 5,35 % (12,89-krát vyšší výskyt OP u žien), osteopénia sa týka o 42,42 % viac žien (7,73-krát vyšší výskyt ON u žien ako u mužov). Tab. 1 Porovnanie výskytu osteoporózy a osteopénie u žien a mužov OP ON NN Spolu n % n % n % n % Ženy 5 5, , , Muži 1 0, , , Spolu 6 3, , , V skupine žien i mužov bol priemerný vek najvyšší v skupine OP a najnižší s NN (tab. 2). So stúpajúcim vekom bol výskyt osteoporózy vyšší u žien i mužov. U žien sme pri hodnotení veku zistili vysoko preukazné rozdiely medzi skupinami OP-ON a OP-NN. Podľa hodnôt BMI sme zistili nadmernú hmotnosť až u 73,29 % respondentov a normálnu telesnú hmotnosť len u žien s ON (26,09 %). Najnižšiu hodnotu BMI mali ženy s ON a muži s OP. Nízka hodnota BMI (menej ako 19 kg.m -2 ) je definovaná ako rizikový faktor osteoporózy (Štěpán, Wendl, 1998). Medzi skupinami žien sme v BMI nezistili preukazné rozdiely. Podiel tuku bol najvyšší v skupine s OP u žien i u mužov. U žien boli rozdiely v tuku preukazné medzi skupinami OP-ON a OP-NN.

312 Tab. 2 Základné charakteristiky súboru žien OP ON NN Ženy vek [roky] telesná hmotn. [kg] telesná výška [cm] BMI [kg.m -2 ] T-skóre Z-skóre telesný tuk (%) telesný tuk (kg) Muži vek [roky] telesná hmotn. [kg] telesná výška [cm] BMI [kg.m -2 ] T-skóre Z-skóre telesný tuk (%) telesný tuk (kg) 64,80 ± 4,60 68,20 ± 12,50 1,65 ± 2,20 25,10 ± 4,50-2,70 ± 0,10-2,00 ± 0,20 35,80 ± 2,40 23,70 ± 3,70 55,00 ± 0,00 70,00 ± 0,00 1,65 ± 0,00 26,08 ± 0,00-2,50 ± 0,00-2,40 ± 0,00 35,40 ± 0,00 25,10 ± 0,00 48,70 ± 12,50 67,20 ± 12,80 1,63 ± 9,10 21,90 ± 0,40-1,60 ± 0,40-0,90 ± 0,70 31,40 ± 8,10 22,20 ± 9,20 51,60 ± 10,40 83,90 ± 7,70 1,77 ± 7,60 26,80 ± 2,30-1,50 ± 0,30-0,80 ± 0,60 23,80 ± 5,90 20,20 ± 6,20 46,80 ± 12,70 69,10 ± 13,00 1,64 ± 5,40 25,50 ± 4,80 0,20 ± 0,90 0,80 ± 0,80 31,80 ± 7,80 22,80 ± 9,10 45,90 ± 14,50 83,40 ± 31,40 1,78 ± 7,60 26,30 ± 3,90 0,20 ± 0,90 0,90 ± 0,70 22,10 ± 4,90 19,10 ± 6,40 Hodnotením konzumácie mlieka a mliečnych produktov v minulosti (do veku 20 rokov) sme zistili, že väčšina respondentiek (40,74 %) konzumovala mlieko v množstve menej ako pol litra. Pol litra mlieka denne a viac pilo len 12,96 % respondentiek, najviac v skupine NN (16,36 %). V súčasnosti väčšina (54,63 %) respondentiek konzumuje menej ako 0,25 l mlieka denne (a to až 80 % respondentiek zo skupiny OP). Mlieko nechutí 15,74 % respondentkám a 5,56 % respondentiek trpí neznášanlivosťou mlieka. Pol litra mlieka denne a viac konzumuje len 2,78 % respondentiek, z nich všetky zo skupiny NN. V súčasnosti respondentky pijú priemerne 0,25 l mlieka denne, čo je o 0,05 l mlieka menej ako v období do 20 rokov. U mužov sme zistili, že situácia s konzumáciou mlieka do 20 rokov bola priaznivejšia. Pol litra mlieka denne a viac konzumovalo až 39,02 % respondentov, najviac zo skupiny NN (41,38 %). Mlieko v množstve do pol litra denne konzumovalo do veku 20 rokov 66,67 % respondentov, opäť najviac v skupine NN (41,38 %). V súčasnosti až 46,51 % respondentov konzumuje menej ako 0,25 l mlieka denne (všetci zo skupiny OP). Neznášanlivosťou mlieka trpí len 2,33 % respondentov. Mlieko nechutí 6,98 % respondentom. Pol litra mlieka denne a viac pije len 16,28 % respondentov, najviac z nich sme zaznamenali v skupine NN (20,00 %).

313 Ďalej sme zistili, že v súčasnosti muži priemerne denne vypijú 0,32 l mlieka, čo je o 0,08 l mlieka menej ako v období do 20 rokov. Väčšina žien uprednostňuje polotučné mlieko (48,67 % žien a všetci muži s OP) (tab. 3). Skupina žien s OP najčastejšie konzumuje mlieko nízkotučné. Tab. 3 Najčastejšie konzumované mlieko (%) OP ON NN Spolu Ž M Ž M Ž M Ž M Níz 83,33 0,00 25,00 8,33 29,85 30,00 30,97 23,26 Pol 0,00 100,00 52,50 75,00 50,75 40,00 48,67 51,16 Pln 0,00 0,00 5,00 16,67 2,98 20,00 3,54 18,60 Źiad 16,67 0,00 17,50 0,00 16,42 10,00 16,82 6,98 SPOL U Níz nízkotučné, Pol polotučné, Pln plnotučné, Žiad žiadne Porovnaním konzumácie mliečnych výrobkov v minulosti a v súčasnosti sme zistili, že ani u žien, ani u mužov sa situácia výrazne nezmenila. Najviac mliečnych výrobkov v minulosti aj v súčasnosti konzumujú muži i ženy zo skupiny ON a NN. V skupine OP väčšina (80 %) žien a všetci muži konzumujú mliečne výrobky len niekedy. Záver Zistili sme vyššiu prevalenciu OP i ON u žien ako u mužov. V skupine s OP bol vyšší vek i podiel telesného tuku. Mlieko v množstve pol litra denne a viac konzumuje 2,78 % žien (všetky zo skupiny NN) a 16,28 % mužov (najviac zo skupiny NN). Najčastejšie konzumované bolo polotučné mlieko. Najviac mliečnych výrobkov v minulosti aj v súčasnosti konzumujú muži i ženy zo skupiny ON a NN. Literatúra: 4. KELLER, U., MEIER, R., BERTOLI, S Klinická výživa. Praha : Scientia Medica, s. ISBN ŠTĚPÁN, J Syndrom osteoporózy. Praha : Avicenum, s. 6. ŠTĚPÁN, J., WENDL, J Osteoporóza v praxi. Praha : Triton, s. ISBN WORLD HEALTH ORGANISATION, 1994, Technical Report Series 843, 1994.

314 VÝSKYT RUJE PO HORMONÁLNOM OŠETRENÍ U ZVERNICOVO CHOVANÝCH DANIELIC PO SEZÓNNEJ ANESTRII THE ONSET OF ESTRUS CYCLE IN FARMED FALLOW DEER (DAMA DAMA) FOLLOWING SEASONAL ANOESTRUS Šťavová Ľ. 1,Harvánková M. 1, Harbáč D. 1, Košúthová L. 2 1 Klinika pôrodníctva, gynekológie a andrológie, Univerzita veterinárskeho lekárstva, Košice 2 Ústav parazitológie, chorôb rýb, včiel a zveri, Univerzita veterinárskeho lekárstva, Košice Abstract In our experiment we monitored concentration of progesterone, estradiol 17β, LH and onset and repetition of estrus cycles with its detection after anoestrus period in fallow deer. There were used five fallow deer does (n=9), three to five years of age and kg of bodyweight. Fallow deer does are profound seasonaly polyestric animals. The lenght the estrus cycle increased and became more variable as the season proceeded but was not affected by age of the doe or liveweight. The onset of the first signs of estrus following the anoestrus period is in days. Mean duration of the estrous cycle in farmed fallow deer during the major rutting season is 21 days with a range of days. Our results pinpoint these hormonal changes: preovulatory level of LH release reached 20 ng/ml approximately 4h following the onset of estrus, the range of progesterone concetrations was 0,1-0,3 ng/ml and estradiol 17β level reached pg/ml. These hormonal changes found in farmed fallow deer are similar to those of other deer species so far investigated. Úvod Klasickým poslaním farmových chovov jeleňovitých ako rozvíjajúceho sa odvetvia živočíšnej výroby je produkcia mäsa a pantov ( parožie v lyku) na výrobu pantokrínu. Farmový chov sa zásadne odlišuje od chovov jeleňovitej zveri vo voľnej prírode a zverniciach jednak väčšou hustotou populácie na jednotku plochy, čo ovplyvňuje výživu, reprodukciu, etológiu, ale aj zdravotné aspekty chovanej zveri. Tieto otázky je potrebné skúmať na odbornej úrovni, pretože pri vznikajúcich farmových chovoch v krajinách EÚ sú s tým malé skúsenosti a veterinárno-zdravotnej a chovateľskej problematike nie je venovaná potrebná starostlivosť. UVL s jej odbornými pracoviskami má predpoklady sledovať a analyzovať všetky aspekty farmového chovu jeleňovitých a mnohé otázky porovnávať

315 s chovom vo voľnej prírode, príp. vo zverniciach, kde sa zver chová za iných podmienok. V podstate všetky farmové chovy danielej zveri u nás budú zamerané na intenzívny charakter chovu, preto tu bude mať rozhodujúcu úlohu výživa, ktorá bude následne ovplyvňovať aj ďalšie aspekty chovu ako sú reprodukcia-produkcia, zdravotný stav a bude nutné sledovať otázky reprodukcie danielej zveri a pomocou riadenej reprodukcie zvýšiť celkovú natalitu oproti klasickému priebehu reprodukcie, čím sa zvýši obrat stáda a tým aj jeho ekonomická efektívnosť. Materiál a metodika Vo farmových podmienkach chovu na účelovom zariadení UVL sme u danielic indukovali ruju a ovuláciu v jednotlivých ročných obdobiach pomocou progestagénov a následne sme monitorovali hormonálne profily progesterónu, estradiolu 17β a luteinizačného hormónu (LH) RIAmetódami. V našej práci sme sledovali koncentráciu LH, progesterónu a estradiolu 17β v sére 5 danielic ( 3-5 ročných), od ktorých bola odoberaná krv v 2 hodinových intervaloch počas 46 hodín pri indukovanej a spontánnej ruji. Výsledky Štyri danielice mali rovnaké sérové hormonálne profily s preukázateľným preovulačným uvoľnením LH 20 ng/ml, ktoré nastalo 4 hodiny po nástupe ruje. Na začiatku ruje sme u všetkých štyroch danielic zaznamenali malé zvýšenie progesterónu od 0,1-0,3 ng/ml a postupné ale nepreukazné zvyšovanie estradiolu 17β až do 25 pg/ml. Zostávajúca danielica vykazovala signifikantné zvýšenie sérovej koncentrácie progesterónu na začiatku ruje od 0,3-0,8 ng/ml a znížené hladiny LH v počiatočnom preovulačnom uvoľnení LH 10 ng/ml. Výskyt ruje Začiatok nastupujúcej ruje bol stanovený pri všetkých 5 danielicach medzi 48 až 56 h po extrakcii intravaginálnych tampónov obsahujúcich 0,5 g progesterónu. Výskyt ďalšej už spontánnej ruje bol odhadovaný a aj potvrdený o 21 dní neskôr. V priebehu tohto obdobia bol zabezpečený odber krvi v 2 hodinových intervaloch. Všetkých 5 danielic sa vrátilo do ruje v priebehu 19 hodinového časového obdobia. Tretia monitorovaná ruja bola detekovaná u všetkých 5 danielic za 21 resp. 22 dní po druhej ruji, čo poukazuje na skutočnosť, že ovulácia nastala počas obdobia, kedy bol vykonávaný intenzívny odber. Koncentrácie sérového progesterónu v následných po sebe idúcich pohlavných cykloch poukazujú na skutočnosť, že sa jednalo o fyziologický pohlavný cyklus trvajúci 21-22

316 dní. Žiadna z danielic nevykazovala neobyčajne krátky alebo dlhý pohlavný cyklus. Diskusia a záver Danielice sú vysoko sezónne polyestrické, v našich zemepisných šírkach vykazujú ruju v jeseni, ktorá nastupuje po sezónnom alebo laktačnom anestre v lete. Prvá ruja nastupuje v rozpätí 12 až 14 dní, koncom októbra a začiatkom novembra a prechod z anestrie do ruje je charakteristický výskytom jednej alebo viacerých tichých ovulácií, ktoré sú spojené s krátkou životnosťou žltého telieska. Ako uvádza Asher a Macmillan (1986) pri farmovom chove danielej zveri pri intenzívnych podmienkach chovu s intenzívnym príjmom energie nastupuje pripúšťacia sezóna už o 2 mesiace skôr. Vo farmových podmienkach chovu na podobnom princípe ako u malých prežúvavcov je možné indukovať ruju aj v mimosezónnom období a tak zabezpečiť kontinuálnu reprodukciu, ktorá by prispela k zvýšeniu ekonomiky chovu. V tomto pokuse všetkých 5 danielic vykazovalo po indukovanej ruji spontánnu ruju vo vopred predpokladanej dobe, kedy boli následne vykonávané intenzívne odbery krvi v intervale dvoch hodín. Možnosť monitoringu a kontinuálny priebeh pokusu ovplyvnili dva hlavné faktory: 1.) Intravaginálne ošetrenie bolo vysoko účinné a zosynchronizovalo ruju do 8 hodín 2.) Ako už bolo pozorované a uvádzané, u danielic bola dĺžka pohlavných cyklov medzi jednotlivými danielicami vyrovnane rovnomerná, čo umožnilo a spôsobilo výskyt druhej a tretej ruje v priebehu 19 hodinového obdobia. Zistené výsledky sú porovnateľné s prácami ďalších autorov, zaoberajúcich sa problematikou reprodukcie jeleňovitej zveri. Zistené časové súslednosti nástupu ruje a presnej doby ovulácie sú predpokladom vhodnej doby pripúšťania z ruky alebo umelej inseminácie v systéme riadenej reprodukcie danielej zveri. Poďakovanie Táto práca bola vytvorená s podporou grantu MŠ SR, VEGA 1/0565/03 Literatúra 1. Asher GW, Macmillan KL (1986) Induction of oestrus and ovulation in anoestrous fallow deer (Dama dama) by using progesterone and GnRH treatment. J Reprod Fert 78: Asher GW, Peterson AJ, Watkins WB (1988) Hormonal changes during luteal regression in farmed fallow deer, Dama dama. J Reprod Fert 84:

317 3. Karahutová Ľ., Pošivák J., Lazar G., Valocký I., Čurlík J. (2005) Nástup ruje a hormonálne zmeny u farmovo chovaných danielic po sezónnej anestrii. Zborník prác a abstraktov, 81. Fyziologické dni, február 2005, Lazar G., Pošivák J., Valocký I., Karahutová Ľ., Kačmárik J., Lazar P., Čurlík J., Trávniček M., Maraček I., Cigánková V., Ciberej J., Macák V., Novotný F. (2003) Comparative evaluation of estrus synchronization, superovulatory response, recovery rate of embryo yeld in mouflon and sheep. III. International Symposium on Wild Fauna, Italy, May Lazar G., Pošivák J., Valocký I., Karahutová Ľ., Kačmárik J., Čurlík J., Lazar P., Maraček I., Cigánková V., Macák V., Novotný F. (2004) Laparoskopické monitorovanie aktivity vaječníkov muflónice. 7. Košický morfologický deň s medzinárodnou účasťou pri príležitosti 55. výročia UVL. 28.máj 2004, Pošivák J., Lazar G., Karahutová Ľ., Valocký I., Čurlík J. (2005) Prenos embryí u danielej zveri. Zborník prác a abstraktov, 81. Fyziologické dni, február 2005, Pošivák J., Lazar G., Valocký I., Karahutová Ľ., Kačmárik J., Čurlík J., Lazar P., Maraček I., Cigánková V., Novotný F., Macák V., Hura V. (2004) Embryo transfer in fallow deer and interspecific embryo transfer between in mouflon and sheep. The 5 th Middle-european buiatrics congress. Hajdúszoboszló, 2-5. júna 2004, Pošivák J., Lazar G., Valocký I., Karahutová Ľ. (2004) Riadená reprodukcia u daniela škvrnitého (Dama dama). Zborník posterov, XXI. Dni živočíšnej fyziológie s medzinárodnou účasťou IX 2004, Pošivák J., Lazar G., Valocký I., Karahutová Ľ., Kačmárik J., Ciberej J., Čurlík J., Lazar P., Maraček I., Cigánková V., Macák V., Novotný F. (2004) Porovnanie vplyvu sezóny na produkciu LH a testosterónu u jeleňa lesného a kastrovaného jeleňa. 7. Košický morfologický deň s medzinárodnou účasťou pri príležitosti 55. výročia UVL. 28.máj 2004, Pošivák J., Lazar G., Valocký I., Karahutová Ľ., Kačmárik J., Čurlík J., Lazar P., Maraček I., Cigánková V., Macák V., Novotný F. (2004) Prenos embryí u daniela škvrnitého (Dama dama). 7. Košický morfologický deň s medzinárodnou účasťou pri príležitosti 55. výročia UVL. 28.máj 2004,

318 FUNKCIA ŠTÍTNEJ ŽĽAZY A STREDNOMOLEKULOVÉ PEPTIDY V KRVNOM SÉRE HOVÄDZIEHO DOBYTKA V PODMIENKACH EKOLOGICKY PODMIENENÉHO NEDOSTATKU JÓDU A PRI JEHO KOREKCII FUNCTION OF THYROID GLAND AND MIDDLE MOLECULAR PEPTIDS IN BLOOD SERUM OF CATTLES AT CONDITIONS ECOLOGICALLY CONTINGENT BY IODINE INSUFFICIENCY AND AT ITS NORMALIZATION Turianica, I., *Rostoka, L., Angelovičová, M., Daniška, J., Krivosudská, E. Slovenská poľnohospodárska univerzita v Nitre, Slovenská republika *Užhorodská národná univerzita v Užhorode, Ukrajina Abstract Function of thyroid gland and middle molecular peptides (MMP) of blood serum in cattle under the ecologically condition of iodine ins insufficiency and correction was studied. The aim of this work was studying influence of ecologically conditioned iodine deficiency on the hormonal function of thyroid gland reserves of middle moleculare peptides in the blood serum as well as increase of body weight in cattle. Development of iodine deficiency in tissues of organism in cattle adequately expressed its insufficiency in environments. Iodine correction even during of two month increasing of its reserves, activating of hormonal function of thyroid gland and increasing of body weight of cattle, particularly under ecologically conditioned of iodine deficiency. Key words: iodine, iodine deficiency, T 4, T 3, fattening cattle, body weight Táto práca bola podporovaná Vedeckou grantovou agentúrou prostredníctvom finančnej podpory VEGA č. 1/1330/04. Úvod V tejto súvislosti je dôležité poznať spektrum účinkov tyreoidných hormónov, ktoré translatujú svoj efekt na mnohé metabolické články takmer na všetkých úrovniach (Fabri, 1989; Rostoka et al., 1991; Turjanitsa et al., 1995, 1996). Tyreoidná homeostáza vo fyziologických podmienkach a vo väčšine experimentov a patológii sa nachádza v úzkom vzťahu s účinkami vnútorných faktorov organizmu a vonkajších faktorov prostredia (Mickevič, 1981; Wildmeister, 1981). Môže sa vysloviť hypotéza, že štítna žľaza je spojená s účinkami faktorov vonkajšieho prostredia a je dôležitým článkom účasti v adaptačných reakciách organizmu (Barsano, 1981; Robbins, 1981).

319 Sledovaním funkčnej aktivity štítnej žľazy u hovädzieho dobytka podľa jednotlivých etáp ontogenézy a výkrmu v podmienkach ekologicky podmieneného jódového nedostatku, je potrebné poukázať na prítomnosť jej jednotlivých rastových zvláštností a vplyv na tvorbu peptidových rezerv. Cieľom príspevku je podať informáciu a poznatky o funkcii štítnej žľazy a peptidoch o strednomolekulovej hmotnosti v krvnom sére výkrmových býčkov počas výkrmu a dvojmesačnej jódovej korekcii. Materiál a metodika Použil sa výkrmový hovädzí dobytok pelemena Karpatská bura. Určenie: obsah T 4 v krvnom sére rádioimunologické metódy s použitím štandardných roztokov RIO-T 4 -PH, T 3 - rádioimunologické metódy s použitím štandardných roztokov RIO-T 3 -PH, peptidy o strednej molekulovej hmotnosti (SMP) podľa Gabrielana et al. (1983) na spektrofotometri vlnovej dĺžky 254 nm Spektromom 204M. Výsledky a diskusia Funkcia štítnej žľazy a strednomolekulové peptidy v krvnom sére u býkov počas výkrmu a dvojmesačnej korekcii jódom Tabuľka 1 Ukazovateľ Bez doplnkov jódu (n=48) Po doplnkoch jódu počas 2 mesiacov (n=52) Štatistická preukaznosť P<0,05 t-test x s x s T 3 (nmol.l -1 ) 1,46 0,04 1,65 0,05 + T 4 (nmol.l -1 ) 36,3 1, ,97 + SMP v krvi (kda) Telesná hmotnosť (kg) 0,08 0,002 0,134 0, ,00 225,7 6,3 + SMP peptidy o strednej molekulovej hmotnosti Je potrebné poukázať na skutočnosť, že jódový nedostatok v organizme býkov možno normalizovať pridaním jódového doplnku. Na farme Sasovka v Podkarpatskej oblasti (horská oblasť), ktorá sa vyznačuje výrazným ekologicky podmieneným jódovým deficitom, sa zistilo, že doplnky jódovaného oleja významne kompenzujú ekologický nedostatok jódu a stimulujú hormónovú funkciu štítnej žľazy. Následkom toho sa

320 zlepšujú aj prírastky telesnej hmotnosti výkrmových býkov. Býci vo výkrme s telesnou hmotnosťou 137,0 kg po prijímaní jódovaného oleja (dávka 400,0 mg jódu na deň) počas dvoch mesiacov zvýšili hodnotu sledovaného ukazovateľa o 64 %. Znamená to, že býci dosiahli priemerný denný prírastok telesnej hmotnosti 1,40 kg. Všetky tieto ukazovatele sa zlepšili následkom zmien hormónovej aktivity štítnej žľazy. Produkcia tyroxínu sa počas tejto lehoty zvýšila o 77,5 % a najaktívnejšej formy trijódtyronínu počas normalizovaného jódového výkrmu o 13 %. Podobná dynamika jódovo-hormónového zabezpečenia býkov, ktorá je sprevádzaná efektívnejšími prírastkami telesnej hmotnosti poukazuje na účelovú jódovú korekciu a efektívnosť korekcie funkcie štítnej žľazy a na druhej strane na jódovo-tyreoidnú reguláciu metabolizmu. Svedčia o tom vyššie prírastky telesnej hmotnosti býkov. Je potrebné zdôrazniť, že doplnky jódu vo forme jódovaného oleja v dávke 2 mg.kg -1 telesnej hmotnosti a deň počas dvojmesačného výkrmu býkov 4 6 mesačných pozitívne vplývali na ich výkrmové vlastnosti, čo sa prejavilo zvýšením ich prírastkov. Tento stav bol dosiahnutý udržaním hormónovej aktivity štítnej žľazy na vyššej úrovni, o čom svedčí vyšší obsah tyroxínu a trijódtyronínu v krvnom sére býčkov pred vyskladnením v porovnaní s hodnotou toho istého ukazovateľa u býkov, u ktorých sa nerobila jódová korekcia (tabuľka 2). Funkcia štítnej žľazy a strednomolekulové peptidy v krvnom sére býkov pred vyskladnením po dvojmesačnej jódovej korekcii Tabuľka 2 Ukazovateľ Bez jódového doplnku (n=26) S jódovým doplnkom počas 2 mesiacov (n=20) Štatistická preukaznosť P<0,05 x s x s t-test T 3 (m.j.) 1,54 0,06 1,28 0,06 + T 4 (m.j.) 26 1,04 65,2 2,91 + SMP krvi (Da) 0,103 0,004 0,141 0,006 + Telesná hmotnosť , ,6 + (kg) SMP peptidy o strednej molekulovej hmotnosti Záver Na základe výsledkov biologických pokusov možno konštatovať, že ekologicky podmienený jódový nedostatok spôsobuje vznik jódového deficitu v tkanivách a celkovo v organizme výkrmových býkov adekvátne

321 vo vzťahu k jeho nedostatočnému výskytu v okolitom prostredí. Tento nedostatok vo výžive výkrmových býkov možno normalizovať jódom vo forme jódovaného oleja. Dvojmesačná jódová korekcia u výkrmových býkov, u ktorých bol jódový nedostatok v organizme, vyvolala zvýšenie jódových rezerv, aktivizáciu hormónovej aktivity štítnej žľazy a zvýšenie denných prírastkov telesnej hmotnosti. Literatúra BARSANO, CH.P Environmental factors altering thyroid function their assesment. In: Environm. Health Perspect, 1981, s FABRI, Z.J Tyreoidný status organizmu pri fyziologicky extrémnych stavoch a patológii v podmienkach jódového nedostatku : autoreferát Diz. Dokt. Biol. vied Kijev, 1989, 44 s. MICKEVIČ, M.S Mechanizmy hormonálnych regulácií a úloha spätných väzieb pri vzniku a homeostáze. Moskva : Veda, 1981, 335 s. ROBBINS, J Factors altering thyroid hormone metabolism. In: Environm. Health. Perspect, roč. 38, 1981, s ROSTOKA, L.M. TURJANICA, I.M. PAŠČENKO, A.E. et al In: Stres, adaptácia a disfunkcia. Kišinev, 1991, s TURJANITSA, I. FABRI, J. PAŠČENKO, E. et al Functional peculiarites of the hypophysis-thyroid gland system in patients with viral hepatitis B depending on the organism iodine reserves. In: 7th European Congress of Clinical Microbiology and Infections Deseases Abstract. Vienna, 1995, s TURJANITSA, I. FABRI, I. PAŠČENKO, E. KUĽČICKIJ, O.K. et al Jódno-tyreoidný status organizmu v podmienkach prírodného jódového deficitu. 1. vyd. Užhorod : Patent, 1996, 145 s.

322 LIMITY NUTRIČNEJ FYZIOLÓGIE PRI REGULOVANÍ METABOLICKÝCH FUNKCIÍ DOJNÍC. LIMITS NUTRITIONAL PHYSIOLOGY FOR REGULATION METABOLIC FUNCTION IN DAIRY COWS. Vajda. V., Maskaľová I. Katedra výživy dietetiky a chovu zvierat, Univerzita veterinárskeho lekárstva, Košice Abstract: Transition period is the most critical period in the production cycle of dairy cows. Dry matter intake, concentration of energy and proteins, structure of the feed and carbohydrate composition are important factors affecting milk production. Nutritional imbalances, deficiencies, or erratic management of feeding programs for dairy cows create large number of health problems and metabolic diseases. The presented system of biological control of the level of nutrition lactating cows in the farms comes from the analysis of nutritional and dietetic value of feeds. The calculated parameters of TMR are evaluated in relation to analyzed markers of ruminal fermentation, blood intermediate metabolism for specific biologic phase. Úvod: Vysoký genetický potenciál a saturácia nutričných potrieb dojníc vyžaduje zmeny fyziológie trávenia a predstavujú metabolické limity, ktoré ovplyvňujú zdravie, produkciu, reprodukciu a efektívnosť výroby mlieka. Zvyšovanie laktácie limituje nároky na: kvalitu krmív a zmenu typového zloženia krmných dávok zvýšením podielu koncentrovaných krmív z 15 na súčasných 30% z celoročného podielu na spotrebe sušiny; zmenu systému kŕmenia s ovplyvnením fyziológie trávenia a posilnením postruminálneho črevného trávenia pre úhradu energie a živín pri vysokej produkcii mlieka u dojníc; Reguláciu procesov nutričnej fyziológie zameranú na podporu adaptácie bachorovej mikroflóry a proliferáciu papíl bachorovej steny čím sa dosiahne vyššia produkcia a bachorová absorpcia unikavých mastných kyselín (UMK), ako aj vyššia syntetická aktivita a produkcia mikrobiálnych bielkovín (Goff a Horst 1997). Reguláciu procesov intermediarneho metabolizmu je zameraná na: stabilizáciu hladín krvnej glukózy prídavkom glukogénnych substancií: - propylén glykol, glycerol (Overton a kol 1998), reguláciou lipomobilizácie sérových hladín NEFA mobilizáciu telových rezerv pre energetické potreby, ako aj pre syntézu mliečneho tuku. Nutričná podpora kapacity pečene pre využitie NEFA pre substitúciu energie (Drackley 1999) a export do krvi vo forme triglyceridov (VLDL) a tým prevencia tukovej infiltrácie pečene - cholín, metionín, lyzín

323 (Piepenbrink a Overton 2000). Živiny a energiu prijatú v KD Tamminga (2000) člení ako aminogénnu (ame), glukogénnu (gme), ketogénnu (kme) a voľnú energiu (vme). Vzájomná transformácia živín podľa funkcie a formy je metabolicky limitovaná: - aminogénne živiny aminokyseliny (ktoré môžu byť metabolicky transformované na ketogénnu a parciálne na glukogénnu formu energie), - glukogénne živiny - kys. propionová, glycerol, glukóza (môže byť premenené na ketogénnu, ale nie aminogénnu formu), - ketogénne živiny - nemôže byť premenená na aminogénnu ani glukogénnu formu. Zvýšená Intenzita výživy, úmerne s produkciou zvyšuje potreba energie, ale hlavne potreba špecifických živín a ich prívod z tráviaceho systému do intermediárneho metabolizmu. Podiel živín na úhradu energetických potrieb dojníc podľa intenzity výživy špecifikuje Tamminga (2000): Typ energie Záchov. 1. fáza 2. fáza 3. fáza Zasušenia záchovná potreba > 3x ZP 2,5-3x ZP 1,5-2,5x ZP 1,5x ZP Voľná anegia v ME 85% 31% 36% 42% 53% Ketogénna - k ME - 29 % 26 % 23% 17,5% Glukogénna - - g ME 5% 22% 20% 18% 15% Aminogénna -a ME 10% 18% 17,5% 17% 15% Materiál a metódy: Bola vykonaná biologická kontrola úrovne výživy u klinicky zdravých dojníc v 10tich chovoch s ročnou produkciou l mlieka s analýzou úroveň bachorového a intermediárneho metabolizmu vyjadrené v priemerných hodnotách a individuálnych odchýlkach nad a pod referenčné hodnoty podľa produkčných skupín. Výsledky a diskusia: 1.) Úroveň bachorovej fermentácie - v chovoch je analyzovaná v tab. 2. Tab. 2. Analyzované hodnoty bachorovej fermentácie u zvierat. Ukazovateľ pred pôrodom po pôrode vrchol laktácie ph 6,72±0,3 (33% ) 6,18±0,4 (50% ) 6,22±0,5(44 13% ) NH 3 mg/100ml 17,8±5,9(35 9 ) 19,8±7,3 (32 24 ) 21,5±10(30 26 ) UMK mmol/l 89,5±22 (33% ) 99,9±24 (15 6% ) 107,6±29 (17 26% ) Kys octová mmol/l 59,7±14 60,3±7 66,1±18 % 67,0±4,4 (69% ) 60,3±6,9 (17 13% ) 61,5±3,5(22 4 ) K. propion. mmol/l 18,0±7,4 24,6±4,5 28,1±10 % 19,6±4,6 (63 13% ) 24,6±4,5 (9 44% ) 25,7±4,5 (% 59 ) C 3 : C 2 1 : 3,6 1 : 2,6 1 : 2,5 - U dojníc v príprave na pôrod analyzované parametre vykazujú vzostup hodnôt ph, pokles NH 3 a UMK mimo referenčných hodnôt u jednej

324 tretiny dojníc, kým vzostup hladín kys. octovej a pokles kys. propiónovej bol potvrdený u dvoch tretín vyšetrených dojníc. Analyzovaný bachorový profil potvrdzuje charakter fermentácie objemového typu kŕmnej dávky, nízku úroveň adaptácie bachora v príprave na pôrod a koncentrovaný typ kŕmnej dávky. - U dojníc po pôrode pokles ph u polovice zvierat v skupine. Kolísanie individuálnych hodnôt UMK, zvýšenie hladín kys. propiónovej potvrdzuje tendenciu k acidifikácii bachora ako následok nízkej úrovne adaptácie a náhly prechod na produkčný typ krmnej dávky. 2. Úroveň metabolických ukazovateľov krvného séra dojníc pre analýzu metabolizmu bielkovín, sacharidov a tukov, ale aj metabolickú záťaž pečene v peripartálnej a prvej fáze po vrchol laktácie sú zhrnuté v tabuľke 3. Tab. 3. Priemerné sérové hodnoty metabolických ukazovateľov. Ukazovateľ pred pôrodom po pôrode vrchol laktácie Celk. Bielk.. g/l 69±6,9 (43% ) 74±7,8 (22% ) 78±7,1(22% 7% ) Albumín g/l 33,5±2,6 ( 6% ) 29,4±3,6 (31% ) 32,8±2,9 (8% ) Urea mmol/l 4,7±1,2 (17% 6% ) 4,7 ±1,3 (15% 9% ) 5,8±1,5 (28% 2) NEFA mmol/l 0,49±0,2 (68% ) 0,56±0,4 (50% ) 0,58±0,5 (26% ) Glukóza 3,6±0,8 (17% ) 3,0±0,8 (19% ) 3,6±0,9 (7 11% ) Cholesterol 2,7±1,4 2,7±0,7 4,1±1,3 (30% ) Triglyceridy 0,5±0,2 (17 8% ) 0,4±0,2 (38% ) 0,3±0,3(17 13% ) Bilirubín ukat/l 4,7±2,3 (37% ) 5,4±3,1 (46% ) 3,8±1,3 (11% ) AST ukat/l 0,41±0,1 (7% ) 0,54±0,1 (69% ) 0,5±0,1 (57% ) Analýza úrovne metabolických ukazovateľov krvného séra potvrdila: U dojníc pred pôrodom ako limitujúci faktor vystupuje prejav výraznej lipomobilizácie z príčin deficitného prívodu energie pred pôrodom. Zisťované sérové hladiny NEFA v priemere aj individuálne u 68% zvierat prevyšujú hodnotu (0,35 mmol/l) doporučovanú pre dojnice v obdobím pred otelením. Zistený stav je v priamej korelácii: - s nízkou koncentráciou energie v TMR - nízkou úrovňou bachorovej fermentácie pred pôrodom. Analyzovaný stav energetického metabolizmu je sprevádzaný pečeňovou záťažou so zvýšením hladín bilirubínu a AST u 37% resp. 7% zvierat. U dojníc po pôrode pokles úrovne celkových bielkovín a albumínu individuálne u 22 % resp. 31% dojníc potvrdzuje limitovaný príjem bielkovín. Alarmujúci stav pečeňovej záťaže s individuálnym zvýšením hodnôt bilirubínu u 46% a AST u 69% dojníc koreluje s poklesom hodnôt energetického metabolizmu a stavom lipomobilizácie (50%), podmienený limitovaným príjmom energie v peripartálnej fáze, nízkou mierou

325 bachorovej adaptácie, rýchlym prechodom na koncentrovaný typ KD s poklesom funkčnosti bachora a príjmu krmiva u dojníc po pôrode. 3. Prídavok cholín-chloridu u dojníc v peripartálnej a prvej fáze laktácie v dávke 120 g/deň/kus v období od 3. týždňa pred pôrodom až do 80. dňa po pôrode (Tab.2) a jeho vplyv na metabolické parametre dojníc potvrdili: 1. V peripartálnom období u dojníc v obidvoch skupinách bola potvrdená zvýšená úroveň lipomobilizácie a vzostup hladín NEFA v priemere aj individuálne u 85% dojníc. 2. V postpartálnej fáze 21. deň p.p. a vrchole laktácie v kontrolnej skupine dojníc pri zvyšovaní laktácie spolu s prehlbovaním negatívnej energetickej bilancie dochádza k vzostupu hladín NEFA v priemere aj individuálne u všetkých zvierat. Tab. 2. Vplyv prídavku cholín-chloridu na hodnoty energetického a proteínového metabolizmu u dojníc. Ukazovateľ 14 dní a.p. 21dní p.p dní p.p. Pokus Kontr. Pokus Kontr. Pokus Kontr. Glukóza mmol/l 3,7±0,6 3,1±0,4 3,1±0,6 3,4±0,3 3,6±0,5 3,4±0,2 NEFA mmol/l 0,4±0,2 0,4±0,2 0,3±0,1 0,5±0,2 0,4±0,2 0,7±0,3 Cholest. mmol/l 2,6±0,6 3,8±1,2 3,1±0,6 6,0±0,6 5,1±1,0 6,0±0,7 Močov. mmol/l 4,9±0,9 5,3±1,2 4,1±0,6 6,7±0,9 6,4±0,7 7,5±0,6 Kreatinín umol/l 120±18 116±10 95±27 148±12 129±17 131±20 AST (umol/l) 0,36±0,1 0,42±0,1 0,46±0,1 0,63±0,1 0,57±0,1 0,35±0,1 Vzostup hladín močoviny a kreatinínu nad hornú referenčnú hranicu metabolicky potvrdzuje zvýšenie proteolýzy svalových bielkovín u dojníc. Pečeň u kontrolných zvierat je zaťažená vplyvom zvýšenej lipomobilizácie a ureogenézy. V pokusnej skupine zvierat analyzované parametre tak v priemere, ako aj individuálne u väčšiny dojníc vykazujú hladiny na úrovni referenčných hodnôt bez náznakov metabolickej záťaže. Záver: Výsledky analýz v sledovaných komerčných chovoch potvrdili: - nedostatočnú adaptáciu bachorového a intermediárneho metabolizmu, lipomobilizáciu s prejavmi tukovej infiltrácie pečene vplyvom nízkej koncentrácie energie v TMR v príprave na pôrod, - rýchly prechod na koncentrovaný typ KD s tendenciou k acidifikácií bachora a poklesom príjmu krmiva v postpartálnej fáze, pri vrchole laktácie je kritické zvýšenie hladín sérovej močoviny. Suplementácia cholínu stabilizovala: - energetický metabolizmus a využitie VMK v pečeni, - bielkovinový metabolizmus s poklesom

326 proteolýzy a úrovne močoviny v krvi, - funkciu pečene s elimináciou záťaže u pokusných dojníc. Literatúra: Drackley, J. K J. Dairy Sci. 82: Goff, J. P., Horst, R. L.: J. Dairy Sci 80: Overton, T.R., Drackley, J. K., Douglas, G.N., Emmert, L.S., Clark J.H.: J. Dairy Sci. 81: 295 Piepenbrink,M.S., Overton T.R.: J. Dairy. Sci. 83, 1: 257. Tamminga, S.: Edinburg. Occ.Public. Br. Soc. Anim. Sci 27:53-62.

327 VPLYV MONOKLONOVÝCH PROTILÁTOK NA AKROZÓMOVÚ REAKCIU BÝČÍCH SPERMIÍ. INFLUENCE OF MONOCLONAL ANTIBODIES ONTHE ACROSOME REACTION OF BOVINE SPERM. Valentovičová, J., Simon, M., Antalíková, J. Ústav biochémie a genetiky živočíchov SAV, Ivanka pri Dunaji Abstract Capacitacion and acrosome reaction of sperm are accompanied by changing of sperm membrane proteins. Therefore, identification and characterization of these proteins can help us to better understand molecular mechanisms of these processes. The aim of study was: 1. To determine the localization of some proteins by mabs against bovine sperm antigens. 2. To test the influence of antisperm monoclonal antibodies on the acrosome reaction of bovine spermatozoa treated by 0,1mM calcium ionophore. The indirect immunofluorescence assay showed the localization of the antigens under study on sperm head membranes. None of mabs stimulated but all inhibited the acrosome reaction of capacitated bovine sperm. Úvod Čerstvo ejakulované spermie cicavcov nie sú schopné oplodniť vajíčko. Spermie musia pobudnúť určitý čas v maternici alebo vo vajcovode, kde po niekoľkohodinovom pobyte dochádza ku kapacitácii spermií. Kapacitácia umožnuje spermiám dosiahnuť akrozómovú reakciu a oplodniť vajíčko (Yanagimachi, 1994). Vzhľadom na to, že počas kapacitácie a akrozómovej reakcie dochádza ku migrácii a uvoľnovaniu niektorých bielkovín, ich identifikácia a lokalizácia proteínov napomáha poznaniu molekulových mechanizmov týchto procesov. Naším cieľom bolo pomocou monoklonových protilátok (mabs), pripravených proti niektorým bielkovinám, určiť lokalizáciu proteínov, ktoré tieto protilátky určujú. Druhým cieľom bolo testovať vplyv protilátok na akrozómovú reakciu býčích spermií. Materiál a metódy mabs boli získané štandardnou hybridómovou technikou (Dušinský et al., 1988). V práci sme analyzovali päť mabs (520-21, 520-4, , 519-2, 508-1), ktoré vykazujú reakciu na hlavičke spermií. Lokalizácia antigénov detegovaných mabs na hlavičke býčích spermií

328 Použili sme nepriamy imunofluorescenčný test a dva postupy opracovania spermií (Ambrose et al., 1996). Pri prvom spôsobe sme použili intaktné spermie a pri druhom permeabilizované spermie. Indukcia kapacitácie a akrozómovej reakcie in vitro Na dosiahnutie kapacitácie sme spermie inkubovali 3 hodiny pri 37 C a 5% CO 2 v SP- TALP médiu. Akrozómovú reakciu sme stimulovali vápnikovým ionofórom (A23 187) v koncentrácii 0,1 mm v DMSO po dobu 1 hodiny. Podiel akrozómovo reagovaných spermií sme detegovali použitím dvojitého farbenia (Congo red, Giemsa stain) (Kovács a Foote, 1992). Stimulácia akrozómovej reakcie monoklonovými protilátkami Po 3 hodinovej inkubácii spermií (kapacitácia) sme pridali induktor akrozómovej reakcie (A23 187) alebo supernatant mab a inkubovali 1 hodinu. Inhibícia akrozómovej reakcie monoklonovými protilátkami Kapacitáciu sme indukovali v SP-TALP médiu po dobu 2,5 hodiny, následne sme pridali supernatant mab. Po 30 minútovej inkubácii sme pridali vápnikový ionofór a inkubovali 1 hodinu v termostate. Výsledky a diskusia mabs , a reagovali s akrozómovým regiónom hlavičky spermie (Tab.1). Rozdiel sme zaznamenali v počte reagujúcich spermií, pričom pri opracovaní spermií prvým spôsobom (intaktné spermie) reagovala len časť spermií ( %, %, %), ale po permeabilizácii spermií 100% z celkového počtu spermií.výsledky ukázali, že antigénové determinanty rozpoznávané týmito mabs sa u časti populácie spermií nachádzajú na vonkajšej cytoplazmatickej membráne v oblasti akrozómu a u všetkých spermií na akrozómovej membráne, resp.v akrozómovom obsahu. Protilátky a vykazovali v nepriamom imunofluorescenčnom teste s intaktnými spermiami reakciu na povrchu celej spermie okrem posteriórnej časti hlavičky. Po permeabilizácii spermií, tzn. po uvoľnení akrozomálneho obsahu protilátky nevykazovali žiadnu reakciu. Predpokladáme, že antigén detegovaný mabs a sa nachádza na plazmatickej membráne spermií a neexprimuje sa na akrozómovej membráne, resp. v akrozómovom obsahu. Pri testovaní protilátok sme zistili, že žiadna zo skúmaných protilátok nestimulovala akrozómovú reakciu u kapacitovaných býčích spermií (Tab.2). Vzorky po pridaní mab vykazovali signifikantne nižší počet akrozómovo reagovaných spermií ako u vzorky stimulovanej vápnikovým ionofórom (Obr.1). Po preinkubovaní spermiovej suspenzie s mab a následnej stimulácii vápnikovým ionofórom vykazovali všetky vzorky počet

329 akrozómovo reagovaných spermií približne na úrovni kontrolných vzoriek, tzn. vzoriek nestimulovaných induktorom akrozómovej reakcie (Tab.3). Výnimku tvorila protilátka , ktorá inhibovala úroveň akrozómovej reakcie na 20%. Môžeme teda konštatovať, že všetky použité protilátky inhibovali akrozómovú reakciu kapacitovaných spermií stimulovanú vápnikovým ionofórom. Výsledky štúdií vplyvu protispermiových protilátok na akrozómovú reakciu nie sú jednotné. Niektorí autori (Romano et al., 1993) potvrdili stimulačný vplyv protispermiových protilátok na akrozómovú reakciu. Naopak Zouari et al., 1992, a tiež Tasdemir et al., 1995 referovali pokles počtu akrozómovo reagovaných spermií po pridaní protispermiových protilátok vo vzorkách stimulovaných vápnikovým ionofórom. Tieto rozličné výsledky naznačujú, že vplyv protispermiových protilátok na akrozómovú reakciu pravdepodobne závisí od konkrétnej molekuly rozpoznávanej protilátkami a jej významu v procese kapacitácie a akrozómovej reakcie. Tabuľka 1 Lokalizácia antigénov detegovaných mabs na hlavičke býčích spermií NIF-intaktné spermie NIF-permeabilizované spermie mab plazmatická membrána akrozomálny obsah akrozóm, 45% +++akrozóm, 100% celá spermia okrem - posteriórnej časti hlavičky celá spermia okrem - posteriórnej časti hlavičky akrozóm, 70% ++ akrozóm, 100% akrozóm, 20% ++ akrozóm,100%

330 Tabuľka 2 Tabuľka 3 Stimulácia akrozómovej reakcie mabs. Inhibícia akrozómovej reakcie stimulovanej 0,1mM A AR% -počet akrozómovo reagovaných spermií v %. mab AR % mab AR % Obrázok 1 Počet akrozómovo reagovaných spermií (%) detegovaných dvojitým farbením. 1 mŕtve spermie s uvoľneným akrozómom (falošná akrozómová reakcia) 2 mŕtve spermie s intaktným akrozómom 3 živé spermie s uvoľeným akrozómom (akrozómovo reagované spermie) 4 živé spermie s intaktným akrozómom Stimulácia akrozómovej reakcie býèích spermií 0,1 mm A Dvojité farbenie. Kontrola (SP-TALP médium). Dvojité farbenie % 32% Tabuľka 2 2 Tabuľka % 44% Stimulácia akrozómovej reakcie 3 29% 3 6% 1 14% 2 36% Literatúra Ambrose, J.D., Rajamahendran, R., Yoshiki, T., Lee, C.Y.G.: Anti-bull sperm monoclonal antibodies: I. Identification of major antigenic domains of bull sperm and manifestation of interspecies cross-reactivity. In: J. Androl., 1996, č.17, s

331 Dušinský, R., Simon, M., Nouzovská, D.: Preparation of monoclonal antibodies to the surface antigens of bovine cells. In: Vet. Med.,1988, č. 33, s Kovács, A., Foote, R.H.: Viability and acrosome staining of bull, boar and rabbit spermatozoa. In: Biotechnik & Histochemistry, 1992, č.67,s Romano, R., Santucci, R., Marrone, V., Francavilla, F.: Effect of ionophore challenge on hamster egg penetration and acrosome reaction in human sperm. In: Am. J. Reprod. Immunol., 1993, č. 29, s Tasdemir, I., Tasdemir, M., Fukuda, J., Kodama, H., Matsui, T., Tanaka, T.: Effect on sperm-immobilizing antibodies on the spontaneous and calcium ionophore (A23187) induced acrosome reaction. In: Int. J. Fertil. Menopausal. Stud., 1995, č. 48, s Zouari, R., De Almeida, M., Feneux, D., 1992: Effect of sperm-associated antibodies on the dynamics of sperm movement and on the acrosome reaction of human spermatozoa. J Reprod Immunol., 1992, č. 22, s Yanagimachi, R.: Mammalian fertilization. In: Knobil, E, Neill, JD (eds), Physiology of Reproduction., New York: Raven Press, 1994, s Táto práca bola podporená APVT a VEGA-2/3045/03.

332 CHOISEN HISTOLOGICAL PARAMETERS OF OVIDUCT IN PUERPERAL EWES AFTER CARBETOCIN TREATMENT Valocký, I., Lenhardt, Ľ., Krajničáková, M., Lazar, G., Pošivák, J., Horňáková, Ľ., Novotný, F. Klinika pôrodníctva, gynekológie a andrológie, Univerzita veterinárskeho lekárstva, Komenského 73, Košice Clinic of Obstetrics, Gynaecology and Andrology, The University of Veterinary Medicine in Košice, Komenského 73, Košice Abstrakt Our work focused on the observation of the oviduct in ewes during puerperium after carbetocin (Depotocin-Léčiva) treatment. Twenty-four Slovak merino sheep 3-4 years old and weighing kg were used in the experiment. The animals were divided into two groups. The experimental ewes (n = 12) were administered 0.07 mg carbetocin (Depotocin, Léčiva) after lambing at h 24 and 72. The first dose was given intramuscularly (i.m.), the second one was given subcutaneously (s.c.). The control ewes (n = 12) were administered with a saline solution at the same intervals. The animals of the both groups were slaughtered on days 7, 17, 25, and 34 postpartum (n = 3). The measurement of the left and right oviduct weight in both groups revealed significant differences (P < 0.05) on day 17 postpartum. Significant differences in oviduct length between both groups were found on day 25 (P < 0.05) postpartum. Significant differences (P < 0.05) in secretory and ciliary cells between both groups were recorded on day 34 postpartum. The results of the evaluated parameters extend and update knowledge about oviduct in sheep postpartum and are an important part of continues control of reproductive activity. Key words: puerperium; ewe; oviduct; epithelium; secretory cells; ciliary cells Introduction Current knowledge of the micro-morphological structures of the oviduct mucosa and uterus in cows at the level of light and electron microscopy including enzymatic reactions were summarized by U h r í n (1992) and in heifers in the postnatal period, including biometric parameters by Š ť a s t n ý (1993). The oviduct mucosa comprises primary cilia with a secondary and tertiary forking. Their size and shape depend on the topographic sections of the oviduct and oestrus stage; and they may change during are in production cycle (U h r í n, 1992).

333 Differences in the cells evaluated between oestrus stages were found by W i l l e m s e and Van V o r s t e n b o s c h (1975). The authors reported that during early luteal phase there is an intensive secretion of the products of the secretory cells while the activity of ciliary cells gradually stops. Cyclic changes in cells caused by the effect of various levels of exogenous hormones in ewes have been confirmed by the study of S a w y e r et al. (1984). V e r h a g e et al. (1984) observed differences in the oviductal cell percentages in cats with increased concentrations of progesterone. In the light of the processes taking place in the oviduct mucosa in individual phases of the oestrus cycle and the current knowledge about oxytocin effects, our study focused on observing the effects of repeated applications of carbetocin (Depotocin, Léčiva) at h 24 and 72 after lambing on the oviduct epithelium in the puerperium. This study was carried out under the active monitoring of the puerperium by the use of biotechnical methods of controlled reproduction. Materials and methods Twenty-four Slovak Merino ewes 3-4 years old and weighing kg were included in the study. The animals were kept in the normal production conditions and were divided into two groups (n = 12). The feed ration consisted of silage, fodder beet, hay, and the feed mixture OV-5 for postparturient ewes. Feed salt and water were provided ad libitum. The experimental ewes (n = 12) were administered 0.07 mg carbetocin (Depotocin, Léčiva) after lambing at h 24 and 72. The first dose was given intramuscularly (i.m.), the second one was given subcutaneously (s.c.). The control ewes (n = 12) were administered with a saline solution at the same intervals. Three animals from each group were slaughtered on days 7, 17, 25 and 34 post partum. Samples for histological analysis were taken from the oviducts nearly 5 cm from the funnel of the ampullar part. The collected samples were fixed in 10 % formalin. The cell percentage was assessed in fields of vision for 100 cells. After dehydration and embedding in paraffin, 7-10 (nm thick sections were stained with haematoxycin-eosin. The excisions were assessed by a projection microscope. The oviduct length was measured by callipers and the weight by an anylytical balance. The mean and standard deviation were calculated. The statistic significance was evaluated by the Student t-test. Results and discussion In the control ewes, this weight ranged from ± 0.14 to ± 0.06 g with the lowest weight recorded on day 34 postpartum. The mean

334 oviduct weight in the experimental group varied between ± 0.03 and ± 0.52 g with the lowest values on day 25 after lambing. Significant differences (P < 0.05) between both groups in the weight of the right and left oviduct were found on day 17 postpartum. The mean oviduct length in the control group ranged from ± 0.87 to ± 1.10 cm and in the experimental group from ± 1.23 to ± 0.36 cm. Significant differences in the oviduct length between the control and the experimental group were recorded on day 25 postpartum (P < 0.05). Having calculated the secretory cells we found that their percentages ranged from 38.0 ± 2.0 to 46.9 ± 1.63 % in the control group. Significant differences (P < 0.05) in the percentage of secretory cells in the oviductal epithelium between both groups were recorded on day 34 postpartum. Calculation of the ciliary cells showed that their percentages ranged from 42.1 ± 2.1 to 56.8 ± 1.52 % in the experimental ewes and from 53.2 ± 1.62 to 61.9 ± 1.85 % in the control ones. Significant differences in the calculation of the ciliary cells of the oviductal epithelium between both groups were recorded on day 34 postpartum (P < 0.05). In is known from the available literatury data that changes in the weight of reproductive organs take place during oestrus. Their weight and length may also change after hormonal application (W h y m a n and M o o r e, 1980; Y l o s t a l o et al., 1982). The results of the oviductal weight and length in the ewes observed are similar to those reported by B u r o v (1982) in postparturient ewes and may be compared with their size dynamics as presented by Š ť a s t n ý (1993) in heifers in dioestrus. Having assessed the weight of oviducts we found a significant increase (P < 0.05) in the group treated with carbetocin on day 17 after lambing. In accordance with the findings of R o y and K a r i m (1983) we suppose that the carbetocin applied stimulates oxytocin activity through the prostaglandins and that temporary formation may be connected with the activation of proteinkinase C with a consequent effect on oestrogen synthesis and oviduct weight. The above presuppositions are also supported by the discovery of the positive effect of carbetocin applied in early puerperium to stimulate the folliclegenesis of the ovaries as reported by K r a j n i č á k o v á et al. (1991,1992). Having calculated the percentage of secretory cells in the oviductal epithelium we observed their highest incidence in the experimental group compared with the control with a significantly higher percentage (P < 0.05) on day 34 postpartum. The percentages of secretory cells in the control group corresponds with the results presented by U h r í n (1992) in the metoestrous and dioestrous of the oestrous cycle in cows. V e r h a g e et al.

335 (1973) experimentally proved that the administration of oestrogens increases the percentage of secretory cells. On the other hand, their reaction compared to the ciliary cells was delayed by 3 to 4 day. In our experiments we observed a lower percentages of ciliary cells in the experimental group with a statistical significance (P < 0.05) on day 34 postpartum. O d o r et al. (1980) found that in the oviduct of the rhesus monkey the percentage of ciliary cells decreased not only in folds but also in the ampulla of the oviduct. Taking into account the fact that every part of the oviduct reacts on the application of hormones specifically as reported by N a y a k et al. (1976) it is necessary to follow up our results in the remaining parts of the oviduct in further experiments. Conclusion With regard to the results of our experiment, we assume that a multiple application of carbetocin may have influenced the synthesis of the prostaglandins with a consequent effect on the percentage increase in secretory cells and a decrease in ciliary ones. The results of this study support our previous knowledge about the positive effect of applied carbetocin applied in the early puerperium of ewes. Acknowledgments. These studies were supported by Ministry of Education of Slovak Republic, Grant VEGA 1/0565/03. References Burov, V. B., 1982: The involution of reproductive organs in sheep (In Russian). Veterinariya (Moscow), No. 2, Krajničáková, M., Bekeová, E., Elečko, J., Maraček, I., Hendrichovský, V., 1991: Biometric parameters of the uterus and ovaries after Depotocin inj. Spofa application during the early puerperium of ewes (In Slovak). Vet. Med. (Praha), 36, Krajničáková, M., Bekeová, E., Maraček, I., Hendrichovský, V., 1992: The weight changes in ovaries and the numbers of surface follicles after the application of Depotocin inj. Spofa in ewes in puerperium (In Slovak). Živ. Výroba, 37, Nayak, R. K., Albert, E., N., Kassira, W. N., 1976: Cyclic ultrastructural changes in ewe uteine tube (oviduct) infundibular epithelium. Am. J. Vet. Res., 37, Odor, L. D., Gaddum-Rosse, P., Rumery, R. E., Blandau, R. J., 1980: Cyclic variations in the oviductal ciliated cells during the menstrual cycle and after estrogen treatment in the pig-tailed monkey. Macaca namestrina. Anat. Rec., 198,

336 Roy, A.C., Karim, S. M. M., 1983: Interaction between oxytocin and prostaglandins in reproduction (Review). J. Obstet. Gynaecol., 14, Sawyer, H. R., Olson, P. N., Gorell, T. A., 1984: Effects of progesterone on the oviductal epithelium in estrogen-primed prepubertal heifers. Light and electron microscopic observations. Am. J. Anat., 169, Šťastný, P., 1993: Structural Changes in the Oviductal Mucosa and Uterus in Postnatal Period (In Slovak). Monography, Acta Zootechnica, Nitra, 28, pp Uhrin, V., 1992: The Fuctional Morphology of the Oviductal Epithelium and the Uterus of Cows (In Slovak). Monography, Slovak Academy of Science, Nitra, pp Verhage, H. B., Murray, M. K., Boomsma, A. R., Renfeldt, P. A., Jaffe, G. R., 1984: The postovulatory cat oviduct and uterus: Correlation of morphological features with progesterone receptor levels. Anat. Rec., 208, Ylostalo, P., Lindgren, P. B., Nullius, S. J., 1981: Ultrasonic measurement of ovarian follicles, ovarian and uterine size during induction of ovulation with human gonadotropins. Acta Endocrinol, 98, Whyman, D., Moore, R. W., 1980: Effects of PMSG and the prostaglandin F-2 alfa analogue, cloprostenal on superovulation, fertilization, and egg transport in the ewe. J. Reprod. Fertil., 60, Willemse, A. H., Van Vorstenbosch, C. J., 1975: The influence of estradiol benzoate on the secretory activity of the epithelium of the ampulla tube in ovariectomized ewes: An electron microscopical study. Tijdschr. Diergeneesk., 100,

337 KVANTITATÍVNE A KVALITATÍVNE ZMENY FOLIKULOV OVÁRIÍ PO INDUKOVANEJ RUJI OVIEC V ANESTRICKOM OBDOBÍ. QUANTITATIVE AND QUALITATIVE FOLLICULAR CHANGES OF OVARIES IN EWES AFTER OESTROUS INDUCTION DURING ANESTRUS. Vlčková R., Lacková Z., Antal J., Maraček I. Katedra normálnej anatómie, histológie a fyziológie, Ústav fyziológie, Univerzita veterinárskeho lekárstva v Košiciach Abstract Three days after lamb weaning and than hours after FGA (40 mg) and ecg (1000 U.I.) treatment (for days) for oestrous induction and OR stimulation three sheep of Improved Wallachian breed were examined using the laparotomic ultrasound method and digital fotography. Sheep were milked during this period. There was increasing in the number of follicles >3 mm in diameter (selection stage) three days after weaning. Despite measuring after treatment was more important in the number of < 3 mm follicles (recruitment stage). This may reflect that folliculogenesis begins early after parturition and proceeds in better follicular waves. Úvod U oviec obahnených skoro v chovnej sezóne sa prvá tichá postpartálna ovulácia vyskytuje dní neskôr. Po prvej ovulácii nasleduje krátky cyklus a druhá tichá ovulácia po 6-8 dňoch (1). Po nej nasleduje normálny cyklus a tretia ovulácia s estrom asi dní post partum. U týchto bahníc je nevyhnutné hormonálne ošetrenie. Trojvlnový model folikulárnych zmien bol pozorovaný nielen počas chovnej sezóny, ale aj počas anestru (2). Priebeh týchto folikulárnych vĺn je pod vplyvom FSH, ktorý je zodpovedný za nábor, výber a diferenciáciu folikulov. Podaním vysokých dávok gonadotropínov pôsobiacich podobne ako FSH (ecg), v čase náboru novej kohorty folikulov, obídeme mechanizmus selekcie folikulov (princíp superovulácie); folikuly > 1,7 mm nepodľahnú atrézii a vedú k zvýšeniu počtu folikulov potenciálnych stať sa preovulačnými (3). Cieľom práce bolo porovnať a vyhodnotiť folikulárnu aktivitu ovárií oviec tri dni po odstavení jahniat a po arteficiálnom ošetrení na vyšší počet ovulácií (OR) v laktačnej anestrii použitím laparotomickej techniky USG a digitálneho fotoaparátu. Materiál a metódy

338 Sledovaných bolo šesť oviec plemena zošľachtená valaška v chove z lokality Nízke Tatry ( m.n.m.) v zimnom období po produkcii mliečnych jatočných jahniat na Vianočný trh. Tri dni po odstavení jahniat boli ovciam aplikované vaginálne tampóny napustené 40 mg FGA (fluorogeston acetát) a následne u nich bola vykonaná laparotómia za účelom získania USG snímok a fotografií (tri z týchto oviec už vykazovali známky gravidity, a teda súbor sledovaných oviec sa zúžil na tri). Po 12 dňoch boli tampóny vybraté a ovciam sa i.m. injikovalo 1000 M.J. ecg. Po hodinách sa vykonala laparotómia a USG vyšetrenie ovárií 5 MHz sondou a získali sa fotografické snímky. Tieto snímky (USG+ Foto) boli spracované kvalitatívne aj kvantitatívne a výsledky boli vyhodnotené t- testom. Výsledky a diskusia Hodnotili sme sumárny počet folikulov, počet folikulov o veľkosti < 3 mm a > 3 mm a diameter najväčšieho folikulu. Dané parametre sú porovnané medzi USG a FOTO v čase tri dni po odstavení jahniat a po hormonálnom ošetrení (graf dolu). Graf 1. Porovnanie folikulárnej aktivity pri hodnotení USG snímok a fotografií USG ods 6 USG oš FOTO ods FOTO oš Σ F F < 3 F> 3 max. F Rovnaké parametre sme hodnotili aj pri pravom a ľavom ováriu tri dni po odstavení jahniat a po ošetrení a navzájom sme ich porovnávali (tabuľka 1 a 2).

339 Tabuľka 1. Porovnanie folikulov tri dni po odstave a po hormonálnom ošetrení- USG a FOTO. Skupina Vaječník Folikuly Σ F<3mm F>3mm Priemer max.f (mm) Max. (mm) odstav pravý 6,56±1,45 3,39±1,34 2,30±0,58 5,34±1,16 6,42 (n=3),us ľavý 5,35±1,65 2,58±0,63 2,67±1,16 4,35±1,38 6,69 G ** * ošetrenie pravý 2,67±1,18 1,50±1,41 1,17±0,47 4,12±2,23 7,56 (n=3),us ľavý 2,50±0,71 1,50±0,71 1,00±1,41 3,02±1,20 3,87 G ** * odstav (n=3),foto pravý ľavý 8,25±1,15 *** 6,58±3,58 5,25±1,25 5,43±3,24 2,67±1,89 1,15±0,59 4,23±0,95 3,33±0,18 5,40 6,22 ošetrenie pravý 5,8±0,57 4,10±0,71 1,70±1,27 3,76±1,05 5,40 (n=3),foto ľavý 4,46±2,18 3,77±1,74 0,70±0,43 3,23±0,66 5,40 *P<0,05 **P, ***P<0,01 F Pozorovali sme signifikantný nárast počtu folikulov na pravom vaječníku (tab. 1), pričom bol vyšší počet folikulov < 3 mm- folikuly v nábore. V tomto štádiu sú folikuly pod dominantným vplyvom FSH. Z grafu 1 je zjavná vyššia folikulárna aktivita ovárií tri dni po odstavení jahniat, t.j dní post partum, kedy sa už vyskytuje normálny estrálny cyklus s fertilnou ovuláciou (1). Priemerný diameter najväčšieho folikulu bol v tomto čase skúmania väčší (4,92±1,43 mm) ako po ošetrení (3,27±2,82 mm), čo dokazuje veľkosť preovulačného folikulu, porovnateľnú s literatúrou (4,5). Najväčší folikul bol zaznamenaný u oviec po hormonálnom ošetrení (7,56 mm), ale iba o 1 mm menší dominantný folikul sa vyskytoval aj u oviec tri dni po odstave. Antrálne folikuly tejto veľkosti majú charakter ovulačných tesne pred ovuláciou alebo regresiou (6). Záver Z našich pozorovaní sa dá usúdiť, že folikulogenéza u zošľachtených valašiek prebieha aj v čase dojčenia jahniat a počas galaktopoézy. Galaktopoetický komplex hormónov tak vplýva na aktivitu folikulov a ich diferenciáciu v integrácii s hormónmi riadiacimi a ovplyvňujúcimi folikulogenézu. Literatúra 1. Hunter R.H.F., Physiology and technology of Reproduction in Female Domestic Animals, Academic Press, London.

340 2. Noel B., Bister J.L., Paquay R., Ovarian follicular dynamics in Suffolk ewes at different periods of the year. J. Reprod. Fertil., 99: Monniaux D., Mariana J.C., Gibson W.R., Growth factors and antral follicular development in domestic ruminants. Theriogenology, 47: Bartlewski P.M., Beard A.P., Cook S.J., Chandolia R.K., Honaramooz A., Rawlings N.C., Ovarian antral follicular dynamics and their relationships with endocrine variables throughout the oestrous cycle in breeds of sheep differing in prolificacy. J. Reprod. Fertil., 115: Evans A.C.O., Duffy P., Boland M.P., 2000a. Waves of follicle development during the estrous cycle in sheep. Theriogenology, 53: Bartlewski P.M., Duggavathi R., Aravindakshan J., Barret D.W.M., Cook S.J., Rawlings N.C., Effects of a 6-day treatment with medroxyprogesterone acetate after prostaglandin F 2 α- induced luteolysis at midcycle on antral follicular development and ovulation rate in nonprolific Western White-faced ewes. Biol. Reprod., 86, Práca vznikla pri riešení grantu VEGA 1/0612/03.

341 MÔŽU MATERNÁLNE HORMÓNY PRÍTOMNÉ VO VAJCI OVPLYVNIŤ POSTEMBRYONÁLNY VÝVIN A SPRÁVANIE MLÁĎAT PREPELÍC JAPONSKÝCH? CAN MATERNAL HORMONES IN EGG AFFECT DEVELOPMENT AND BEHAVIOR OF JAPANESE QUAIL HATCHLINGS? Zeman, M. 1,2, Okuliarová, M. 1, Slobodová D. 1, 1 Katedra živočíšnej fyziológie a etológie, Prírodovedecká fakulta UK, Mlynská dolina B-2, Bratislava 2 Ústav biochémie a genetiky živočíchov, SAV, Ivanka pri Dunaji Summary Transgenerational transfer of hormones from mother to eggs and embryos may have consequences on development and behaviour of progeny. Epigenetic effects of testosterone were suggested to effect level of fearfulness and learning abilities that may determine surviving in new environment as well as the activity of selected physiological systems. Manipulations of maternal hormone concentration may be potentially used to influence postembryonic performance in precocial birds. Úvod Aktivita jednotlivých fyziologických systémov a výsledná výkonnosť a úžitkovosť živočíchov je určovaná genetickou výbavou organizmu a podmienkami prostredia, v ktorých sa genotyp manifestuje. V postgenomickej ére moderného biologického výskumu má pochopenie interakcií genotypu s prestredím kľúčovú úlohu a ponúka široké možnosti využitia získaných poznatkov v medicíne i v poľnohospodárstve. Tento vzťah je dlhodobo predmetom intenzívneho výskumu a súčasný rozvoj molekulárno-biologických metód dovoľuje priame hodnotenie existujúcich interakcií. Pozornosť sa zameriava na epigenetické adaptácie po vystavení organizmov definovaným (často extrémnym) podmienkam prostredia. Epigenetickou adaptáciou rozumieme dlhodobé zmeny fyziologických procesov a správania, ktoré vznikli v dôsledku vystavenia organizmov určitým podmienkam prostredia počas senzitívnych (kritických) štádií vývinu (Nichelmann et al., 2001) Tieto zmeny sú permanentné, ale nie geneticky fixované a sú pravdepodobne vyvolané na úrovni zmenej expresie génov. Tento problém je možné výhodne anylyzovať na aviárnom modeli, ktorý poskytuje viaceré výhody pre riešenie naznačených problémov. Tieto spočívajú najmä v izolovanosti vyvíjajúceho sa embrya od endokrinného

342 prostredia matky a jednoduchej manipulovateľnosti s podmienkami prostredia, v ktorých sa embryo vyvíja. Endokrinný systém je súčasťou komplexných regulačných vzťahov, ktoré zabezpečujú adaptáciu živočíchov v danom prostredí.v tomto smere sa venuje veľká pozornosť steroidným hormónom, ktoré môžu regulovať expresiu génov a môžu mať teda epigenetické účinky. Jedným z aktuálnych a málo prebádaných problémov je prenos hormónov medzi generáciami ako epigenetický prenos biologickej informácie. Z tohto hľadiska budeme venovať najväčšiu pozornosť dominantnému androgénu - testosterónu. Na rozdiel od cicavcov, kde embryo je pod priamym hormonálnym vplyvom matky, u vtákov sa dlho predpokladalo, že hormóny ovplyvňujúce prenatálny rast pochádzajú výhradne z vyvíjajúceho sa zárodku. Štúdie v posledných desiatich rokoch však dokázali, že vaječný žĺtok obsahuje hormóny materského pôvodu (Schwabl, 1993, McNabb et al., 1998). Tieto môžu výrazne ovplyvňovať vývin mláďat, pretože mláďatá kanárika, ktorým bol v embryonálnom štádiu aplikovaný testosterón, rastú po vyliahnutí rýchlejšie a intenzívnejšie sa dožadujú potravy (Schwabl, 1996). Ďalší autori (Eising et al., 2001) pozorovali u čajok skoršie liahnutie, rýchlejší rast a vyššiu schopnosť konkurovať súrodencom v hniezde u mláďat ovplyvnených androgénmi. Na druhej strane, u prekociálnych druhov vtákov sú účinky testosterónu na rast a správanie menej jasné (Henry a Burke, 1999). Cieľom našej práce bolo zistiť, či experimentálne zvýšený obsah testosterónu v žĺtku ovplyvňuje rast a vybrané charakteristiky správania mláďat prepelice japonskej, ktorú sme si zvolili ako modelový organizmus. Prepelica japonská patrí medzi prekociálne druhy, ktoré krátko po vyliahnutí charakterizuje bohatý repertoár správania, determinujúci ich ďalšie prežitie. Majú dobre vyvinutú lokomočnú aktivitu spojenú s aktívnym vyhľadávaním potravy a rýchlou schopnosťou učiť sa rozpoznávať okolité prostredie a príslušníkov svojej sociálnej skupiny (Bateson, 1991). Komparatívnou výhodou tohto modelu sú aj relatívne podrobne analyzované mechanizmy regulujúce vývin a rast. Materiál a metódy Použili sme oplodnené vajcia prepelice japonskej (Coturnix coturnix japonica) z reprodukčného chovu na Ústave biochémie a genetiky živočíchov SAV v Ivanke pri Dunaji. Pred začiatkom inkubácie bol do vajec experimentálnych skupín injekčne aplikovaný testosterón propionát (Agovirin-LÉČIVA) v rôznych dávkach, riedený v 20 µl olivového oleja. Testosterón sme aplikovali priamo do žĺtka cez tupý pól vajca, pričom

343 miesto vpichu bolo dezinfikované etanolom a uzatvorené parafínom. Do kontrolnych vajec sme aplikovali 20 µl olivového oleja. Bezprostredne po vyliahnutí boli mláďatá označené farebnými krúžkami, odvážené a umiestnené do chovných klietok s teplotou C, konštantným osvetlením počas 24 hodín a voľným prístupom k vode a krmivu (HYD 13). Počas prvých dvoch dní života sme testovali behaviorálne prejavy mláďat a použili sme T-bludisko, test tonickej imobility a test otvoreného poľa Údaje získané v jednotlivých behaviorálnych testoch sme vyhodnocovali t-testom. Výsledky a diskusia Po aplikácii testosterónu do žĺtka v dávke 2,5 pg/vajce sme pozorovali zvýšenú hmotnosť vyliahnutých mláďat a zvýšená hmotnosť pretrvávala počas celej fázy rýchleho rastu mláďat. Podanie vyššej dávky testosterónu (25 ng), ktorá sa stále môže považovať za fyziologickú, viedlo k zníženiu hmotnosti tela v porovnaní s kontrolnymi jedincami (6,5 ± 0,1 vs 6,8 ± 0,1 g). Priebeh zmien hmotnosti počas fázy rýchleho rastu sme v tomto pokuse nesledovali. V T-bludisku sme nezistili signifikantné rozdiely medzi mláďatami z kontrolnej skupiny (K-skupina) a mláďatami z testosterónom (25 ng/vajce) ovplyvnenej skupiny (T-skupina) v celkovom únikovom čase. V opakovanom teste s rovnakými jedincami mláďatá T-skupiny potrebovali signifikantne kratší čas na únik z bludiska v porovnaní s mláďatami K- skupiny. V bludisku je správanie pod kontrolou dvoch motivácií: strach a snaha o znovuzískanie sociálneho kontaktu. Ak predpokladáme, že získaný výsledný čas v bludisku je odrazom sociálne motivovaného správania (Jones et al., 1999), tak mláďatá T-skupiny na základe ich rýchlejšieho úniku z bludiska by mohli prejavovať väčšiu snahu získať kontakt so svojimi sociálnymi partnermi. Na druhej strane môže bludisko predstavovať aj prostriedok na meranie učenia (Gilbert et al., 1989), a preto nižší celkový únikový čas v druhom opakovanom teste môže znamenať aj lepšiu schopnosť učiť sa u mláďat ovplyvnených testosterónom. Stav tonickej imobility bol u mláďat T-skupiny indukovaný na signifikantne menší počet pokusov ako u mláďat K-skupiny a mláďatá T- skupiny zotrvali v tonickej imobilite signifikantne dlhšiu dobu ako mláďatá K-skupiny. Je známe, že tonická imobilita koreluje s úrovňou vnímania strachu (Jones et al., 1999). Dlhšie trvanie tonickej imobility indukované na menší počet pokusov môže preto u jedno až dvojdňových mláďat T-skupiny signalizovať zvýšenú mieru bojazlivosti.

344 Parametre zaznamenávané v teste otvoreného poľa neboli signifikantne odlišné medzi jedincami K-skupiny a jedincami T-skupiny. Mláďatá T- skupiny však mali tendenciu prejavovať zníženú vokalizáciu a zvýšenú pohybovú latenciu. Získané výsledky naznačujú, že testosterón prenatálne aplikovaný do žĺtka prepeličích vajec predĺžil u vyliahnutých jedno až dvojdňových mláďat tonickú imobilitu, a tým zvýšil úroveň bojazlivosti. S tým môže súvisieť aj relatívne nižšia vokalizácia a dlhšia pohybová latencia pozorovaná v teste otvoreného poľa. Na druhej strane mal testosterón pozitívny vplyv na sociálne motivované správanie a schopnosť učenia. Záver Inve stícia testosterónu do žĺtka formujúceho sa vajca môže predstavovať jeden z možných epigenetických maternálnych účinkov, ktorý prispieva k fenotypovej variabilite mláďat a determinuje stratégie prežívania v konkrétnom prostredí po vyliahnutí. Poďakovanie Táto práca bola podporovaná Agentúrou na podporu vedy a techniky na základe zmluvy č. APVT a grantom VEGA 1/1294/04. Zoznam literatúry Bateson, P. P. G. 1991: Making sense of behavioural development in the chick. s In: Andrew, R. J. (ed) Neural and behavioural plasticity: Oxford University Press. Eising et al.: Proc R Soc Lond B Biol Sci., 268: , Gilbert, D. B. et al.: Pharmacol. Biochem. Behav., 34: , Henry, H. a Burke, B.: Poult Sci., 78: , Jones, R. B. et al.: Anim. Behav. 58: , McNabb, A.F.M. a Wilson, C.M: Amer. Zoolog., 33: , Nichelmann, M. et al.: Life Sci., 69: , Schwabl, H.: Proc Natl Acad Sci U S A., 90: , Schwabl, H.: Comp Biochem Physiol A., 114: , 1996.

345 STANOVENIE VÝSKYTU PATOLOGICKÝCH SPERMIÍ BÝKOV, BARANOV A ŽREBCOV EVALUATION OF OCCURRENCE OF PATHOLOCICAL SPERMATOZOA IN BULLS, RAMS AND STALLIONS Zemanová, J., Massányi, P., Lukáč, N., Trandžík, J. Katedra fyziológie živočíchov, Slovenská poľnohospodárska univerzita v Nitre Abstract In this study evaluation of present status in insemination of farm animals focused on bull (n=20), ram (n=10) and stallion (n=7) semen quality is reported. Microscopic and submicroscopic structure of normal and pathological speramtozoa was studied. Stained samples were evaluated on optic microcope Carl Zeiss at the magnification 1.500x. Evalation of percentual occurence of pathological spermatozoa determined 10.98% of pathological spermatozoa in bulls, 10.56% in rams and 11.19% in stallion semen. As the physiological value is 20%, we can conclude that the semen of studied breeding animals was of good quality. Úvod Riadená reprodukcia hospodárskych zvierat predstavuje predpoklad rozvíjania úžitkovosti hospodárskych zvierat. Už viac ako 50 rokov plní umelá inseminácia na celom svete svoju úlohu pri zlepšovaní genofondu úžitkových vlastností zvierat a veterinárnej starostlivosti o reprodukčný proces, ako aj pri využívaní biotechnologických metód riadenej reprodukcie. Z vývojového aspektu je spermia produktom spermatogenézy, ktorá prebieha v semenotvornom kanáliku semenníka.. Hoci semenník ako orgán má veľkú adaptačnú a regeneračnú schopnosť, vlastná spermatogenéza je veľmi senzitívna na rôzne vplyvy, ktoré ju ľahko narušia. Preto je spermatogenéza citlivým barometrom na prejavenie sa účinkov rôznych látok a faktorov, ktoré sa nemusia prejaviť na iných orgánoch alebo tkanivách tela. V súčasnosti môžeme definovať rôzne zmeny v ultraštruktúre spermií. Tieto majú svoje pomenovania a charakteristiku. Materiál a metódy V práci sme použili ejakuláty od 20 býkov, 10 baranov a 7 žrebcov. Plemenníci, ktorým boli ejakuláty odobraté, museli vyhovovať predpísaným zdravotným podmienkam. Po získaní ejakulátu sa posúdila

346 aktivita, koncentrácia a vzhľad. Na ďalšie spracovanie sme použili len ejakuláty, ktoré vyhovovali stanoveným požiadavkám. Po spracovaní sa ejakulát riedil pomocou laktózového riedidla. Zberač s neriedeným ejakulátom sme uzavreli, obalili buničitou vatou a umiestnili do chladničky s teplotou 1 3 C. Ochladenie ejakulátu na 1 3 C sa dosiahlo o 90 minút. Ejakulát bol zmrazený na hranoloch suchého ľadu, pričom doba zmrazovania bola 7 minút. Potom sa pelety a hliníkové tuby presypali do téglika naplneného tekutým dusíkom a umiestnili do transportných alebo zásobných kontajnerov. Rozmrazovanie sme uskutočnili v 1 cm 3 roztoku citrátu sodného s teplotou 39 C počas sekúnd. Sklíčka sme označili, a zhotovili náter inseminačnej dávky, ktorý sme nechali usušiť na ohrievacej doske (38 C). Po usušení sme nátery fixovali Hancockovým roztokom 30 minút. Na farbenie sme použili Hancockovu metódu, ktorá je vhodná na sledovanie abnormalít akrozómu, ale aj ostatných anomálií spermií. Farbenie sme vykonali v kyvetách Giemsovým roztokom po dobu 3 hodín. Po farbení sme preparáty dôkladne opláchli destilovanou vodou. Dosiahnuté výsledky sa štatisticky vyhodnocovali Studentovým t- testom, Scheffeho testom a vypočítali sa aj korelačné koeficienty. Hodnotenie farebných preparátov sme vykonávali na optickom mikroskope pri 1500-násobnom zväčšení. Počet hodnotených spermií u jedného samca bol Patologicky zmenené spermie sme zaraďovali do klasifikančej tabuľky patologických foriem spermií bežne používanej na hodnotenie spermií v plemenných chovoch. Výsledky a diskusia Po dosadení patologických zmien do klasifikačnej tabuľky sme spočítali súčty jednotlivých zmien. U jednotlivých druhov sme zistili nasledovný výskyt patologicky zmenených spermií. Percento patologických spermií u jednotlivých druhov hospodárskych zvierat Druhy HZ Počet spermií Percento hodnotených patologických zmien Býk ,98 Baran ,56 Žrebec ,19 Z dosiahnutých výsledkov vyplýva, že percentuálny výskyt patologických spermií sa pohyboval v priemere 10,98 % u býkov, 10,56 %

347 I VI. Celoslovenský seminárz fyziológie živočíchov u baranov a 11,19 % u žrebcov. Najvyššie percento teda bolo u žrebcov a najnižšie u býkov. Za fyziologický výskyt možno považovať množstvo zmien do 20 %. Morfologické zmeny vyvolávajú poruchy plodnosti vtedy, keď sa vyskytujú vo veľkom množstve trvale pri tom istom plemenníkovi. Platia určité normy a pravidlá. Podľa našich výsledkov zistených mikroskopickým hodnotením náterov ejakulátov možno zaradiť sledovaných býkov, baranov a žrebcov medzi kvalitných, pretože priemerné percento patologických spermií bolo do 20 %. Z našich výsledkov vyplýva, že z celkového počtu hodnotených spermií býkov (20 000) malo zmeny na hlavičke 0,98 %, u baranov (10 000) tvorili zmeny na hlavičke 0,43 % a u žrebcov (7 000) bolo týchto zmien 0,43%. Uvádza sa, že abnormality hlavičiek býkov predstavovali 1,34 3,72 % z celkového počtu všetkých hodnotených spermií. Zmeny na bičíku tvorili u býkov 8,83 %, u baranov 9,8 % a u žrebcov 10,49 % z celkového počtu hodnotených spermií. Malformácie na bičíku spermie býkov sa pohybujú v rozmedzí 2,91 % na jar a 4,60 % v lete. Percento spermií s abnormalitami krčku, stredovej a koncovej časti bičíka u holsteinského dobytka bolo priemerne 3,1; 4,2 a 3,0. Priemerné hodnoty najčastejšie sa vyskytujúcich patologických zmien spermií z celkového počtu hodnotených spermií (v %) Výskyt patologických spermií z celkového počtu hodnotených spermií Zmeny v % Býci Barani Žrebci 0 AZ HBB KĽ T KB ZB Patologické zmeny RC MH VH VP Býci Legenda: VP všetky patologické spermie; HBB hlavička bez bičíka; T torzo bičíka; KĽ kľučkovité stočenie bičíka; I iné patologické zmeny; ZB zlomený bičík; KB zvinutie (klbko) bičíka; MH malá hlavička; RC retencia cytoplazmatickej kvapky; AZ akrozomálne zmeny; VH veľká hlavička.

348 Záver V práci bola predložená morfologická analýza 37 náterov od 20 býkov, 10 baranov a 7 žrebcov. Celkovo bolo zhodnotených spermií, pričom bol priemerný výskyt patologických spermií 10,98 % u býkov, 10,56 % u baranov a 11,19 % u žrebcov. Zmeny na hlavičke predstavovali u býkov 8,88 %, u baranov 4,07 % a u žrebcov 3,83 %, ale tvorili u býkov len 0,98 %, u baranov 0,43 % a u žrebcov 0,43 % zo všetkých zmien. Na akrozóme patologické zmeny predstavovali v priemere u býkov 41,03 %, u baranov 48,84 % a u žrebcov 3,33 % zo zmien na hlavičke, čo je zo všetkých hodnotených spermií u býka 0,40 %, u baranov 0,21 % a u žrebcov 0,01 %. Súbor zmien na bičíku predstavoval 80,42 % u býkov, 92,80 % u baranov a 93,74 % u žrebcov, čo tvorilo zo všetkých spermií 8,83 % u býkov, 9,8 % u baranov a 10,49 % u žrebcov. Najčastejšia zmena bola dekapitácia (hlavička bez bičíka), ktorá v priemere tvorila u býkov 37,88 %, u baranov 48,67 % zo všetkých zmien na bičíku, ale iba 3,50 % u býka a 4,77 % u barana zo všetkých sledovaných spermií. U žrebca bolo najčastejšou zmenou kľučkovité stočenie bičíka, ktoré tvorilo v priemere 43,73 %, čo je len 4,59 % zo všetkých spermií. Z ďalších najčastejších anomálií boli zaznamenané: retencia cytoplazmatickej kvapky, torzo bičíka, zlomený bičík, zvinutie (klbko) bičíka, malá hlavička, veľká hlavička. V našej práci sme zistili výraznejšie zmeny u býka č. 20, ktoré tvorili 34,40 %, čo je viac ako fyziologická hranica 20 %. Ostatní plemenníci spĺňajú požiadavky a sú vhodní na insemináciu. Literatúra 1. GAMČÍK, P., KOZUMPLÍK, J. et al Andrológia a inseminácia hospodárskych zvierat. Príroda, Bratislava, KOZUMPLÍK, J Morfologické zmeny a dekapitácia spermií jako príčina poruch plodnosti plemenníků. Vet. Med. 6, 1990, s. 35, MASSÁNYI, L Ultraštrukturálne aspekty kančej spermie. In: Acta zootechnica, roč. 46, 1990, s MASSÁNYI, L Funkčná morfológia spermie. In: Veda, vydavateľstvo SAV, Bratislava, 1991, s. 194.

349 FYZIOLOGICKÁ GENETIKA A MOŽNOSTI ŠTÚDIA METABOLIZMU ŽIVOČÍCHOV PHYSIOLOGICAL GENETICS AND POSSIBILITY OF THE STUDY OF ANIMAL METABOLISM Bulla, J. Katedra fyziológie živočíchov, Fakulta biotechnológie a potravinárstva SPU v Nitre Genetic variability among animals for measures of many characteristics has been well established. Experiments studying metabolic control of production characteristics can be designed to capitalize on the existence of genetic differences. Consideration is given in this presentation to the use of genetic concepts and variation in the study of metabolic control. Discussion includes qualitative and quantitative characteristics, interpreting genetic parameters and the use of selected lines an breed comparisons. Key words: Animals, Metabolism, Genetic Control, Variability Úvod Biologické procesy ako napr. laktácia alebo rast sú výsledkom synchronizovaných, harmonických dejov metabolizmu. Napriek pokroku vo výskume jednotlivých fenoménov je stále neznámych veľa prvkov metabolickej kontroly týchto procesov. Výskum je potrebné orientovať na riešenie dvoch zásadných otázok: 1. Ktoré sú významné faktory úspešného dosahovania biologického efektu? 2. Ktoré faktory ovplyvňujú rozdiely pozorované pri hodnotení biologických efektov? Pri obidvoch otázkach je realitou štúdium resp. skúmanie v smere či genetická kontrola metabolizmu je potrebnou informáciou o jej transkripcii v genotype zvieraťa. Existujúce výsledky experimentov pri hodnotení úrovne metabolizmu poukazujú na genetickú kontrolu. Z hľadiska koncepcie uplatnenia fyziologickej genetiky sú práve metabolické funkcie vhodným modelom poznávania podstaty variability biologických efektov. 340

350 Kvalitatívne vlastnosti Sú v podstate podmienené génmi veľkého účinku (major gény). Pri nich sú malé prostreďové vplyvy na expresiu (prejav) vlastnosti alebo znaku a výsledkom je nízky vzťah medzi genotypom zvierať a jeho fenotypom. Príkladom je dw recesivny gén pre dwarfizmus (zakrpatenosť) u myší i dobytka, ktorý rezultuje v individuálnej deficiencii acidofilov pre syntézu rastového hormónu. V tabuľke 1 na príklade tohto génu demonštrujeme výsledky genetickej kontroly fyziologického vývoja pri myšiach. Tab. 1 Príklad využitia dw génu myší ako modelu pre uplatnenie vo fyziologickej genetike 1. Regulácia veľkosti buniek v rôznych orgánoch. 2. Kontrola ploidity tkanív prostrednícvotm obsahu DNA. 3. Kontrola úrovne RNA polymerázy v pečeni 4. Stimulácia syntézy bielkovín 5. Kontrola postnatálneho doznievania kostry a periférnych nervov 6. Regulácia hladiny sérového somatomedinu 7. Metabolické dispozície pre reguláciu teploty prostredia 8. Kontrola diuvnálnej aktivity 9. Vývoj imunitného systému. Podobne je možné charakterizovať sledovanie variability jednotlivých charakteristík metabolizmu (cukor, tuky, cholesterol, enzýmy) vo vzťahu ku genotypu organizmu. V ostatnej dobe sú aktuálne genetické markery (napr. kazeínové bielkoviny mlieka) a ich význam pri hodnotení predispozície jedinca na konkrétnu produkciu alebo reakciu na záťaže prostredia (Hal resp. RYR1 lokus). Kvantitatívne vlastnosti Sú podmienené tzv. génmi malého účinku alebo mnohými lokusmi a patrí k nim napr. rastová intenzita, produkcia mlieka, reprodukčné vlastnosti. Variabilita týchto vlastností je rozhodujúcou mierou ovplyvnená faktormi prostredia, ktoré je pri akceptácii poznania fyziologicko-genetických vzťahov potrebné akceptovať. Z metodologického hľadiska je významné reálne sa orientovať pri hodnotení efektov genotypu, prostredia, ich interakcií a vzťahov k poznaniu fyziologických parametrov nasledovne: 341

351 - realizovať exaktné porovnávacie experimenty alebo hodnotenia - vybrať vhodný variačno-štatistický model hodnotenia - rešpektovať počet opakovaní hodnotenia - akceptovať rozdiely v efektoch prostredia - poznať rozdiely v definovaní genetickej základne vrátane genotypovej štruktúry populácie a v úrovni chovateľských a šľachtiteľských výsledkov. Pre tieto účely je vhodné použiť model hodnotenia genotypových rozdielov pre rôzne typy pozorovaní a možné interakcie: Yijklm = µ + bi + brj + Pk + g l + (g x br) jl + (g x p) kl + l ijklm kde Yijklm je výsledná hodnota jedinca µ je konštanta spoločná pre všetky pozorovania bi je vektor pre konštantné efekty (napr. pohlavie, chovateľ) brj plemeno alebo kríženec Pk chovateľské prostredie g l genotyp a príp. konkrétny lokus l ijklm reziduálne vzťahy medzi pozorovaniami Výsledky porovnávania fyziologických vlastností pri rôznych plemenách a druhoch hosp. zvierat umožňujú pochopenie manifestácie a realizácie úžitkových potencií i zdravotných efektov v konkrétnych podmienkach prostedia. 342

352 OBSAH MASTNÝCH KYSELÍN A CHOLESTEROLU V TUKU NIEKTORÝCH TKANÍV DIFERENCOVANÝCH PLEMIEN HOVÄDZIEHO DOBYTKA FATTY ACID COMPOSITION AND CHOLESTEROL CONTENT OF THE SOME FAT FROM TISSUE OF DIFFERENT CATTLE BREEDS Bulla, J. 1, Bullová, M. 1, Szarek, J. 2, Szulc T. 3, Gibaštík, P. 4, Pavličová, S. 1, Vavrišinová, K. 1 1 SPU v Nitre 2 AR Krakow 3 AR Wroclaw 4 Jakub Ilavský, s. r. o., Trenčín Abstract Cholesterol and fatty acid composition of cattle musculus longissimus thoracic (MLT) and liver were analyzed in samples from purebred and crossbred bulls (Slovak Pied, Slovak Pinzgau, Charolaise, Limosine and Holstein). Fatty acid composition was determined by gras chromatography (Chrompack CP 9000). Total cholesterol content was determined by the method (Horňakova et al., 1974). Differences (P < 0,05) among breeds were detected in cholesterol content of liver and muscle. Fatty acid composition and content of liver and muscle not differed (P > 0,05). Key words: Cattle, Tissue Fatty Acids, Cholesterol, Breeding Úvod Problematika tuku v organizme živočíchov je stále aktuálna nielen vo vzťahu a významu pre metabolické funkcie, ale tiež v súvislosti s racionálnou výživou človeka. Obsah tuku, mastných kyselín a cholesterolu v organizme patrí k ukazovateľom charakterizujúcim senzorickú kvalitu mäsa a zdravotné hľadisko orientované na príjem týchto zložiek prostredníctvom výživy. Podľa Arave et al. (1975) obsah cholesterolu a lipidov v živočíšnych tkanivách je ovplyvnený geneticky, pri rôznej variabilite prostreďových faktorov. Dôkazom je koeficient dedivosti (h 2 ), ktorého hodnoty sa pohybujú od 0,25 do 0,80. Genetickú podmienenosť obsahu cholesterolu a koncentrácie celkových lipidov v krvnej plazme diferencovaných úžitkových typov pinzgauského dobytka demonštrujú 343

353 hodnoty opakovateľnosti (Bulla et al., 1998). Tieto (rop) sa pohybujú na úrovni 0, ,04 pri cholesterole a 0, ,08 pri celkových lipidoch. Intramuskulárny tuk ovplyvňuje kulinárska hodnota mäsa a jeho kvalita je závislá od zloženia mastných kyselín (Bee et al., 2002). Mojto et al. (1995) hodnotili zastúpenie mastných kyselín a cholesterolu v intramuskulárnom tuku jatočných býkov rôznych plemien. Nezistili štatisticky významné rozdiely medzi jednotlivými genotypmi. Materiál a metódy Do hodnotenia bolo zaradených 60 výkrmných býkov v nasledovnej plemennej štruktúre (Holštajn 17, slovenské strakaté 15, slovenské pinzgauské 10, Charolaise 5, Limousine 5, kúžence Ss x H 8). Priemerná živá hmotnosť býkov pred zabitím bola 525 kg. Pre stanovenie jednotlivých charakteristík tukového metabolizmu boli odobraté vzorky z MLT na úrovni 9. a 10. rebra a pečene pokusných zvierat. Pre stanovenie spektra mastných kyselín boli vzorky zhomogenizované a extrahované podľa metódy Folch et al. (1957) v zmesi chloroformu a metanolu (2:1). Estery mastných kyselín boli extrahované použitím n-heptacnu a analyzované plynovým chromotografom (Chrompack CP 9000). Obsah celkového cholesterolu bol stanovený podľa metódy Horňákovej et al. (1974). Výsledky sú pri mastných kyselinách uvedené v % podielu a pri cholesterole v mg/100 g tkaniva. Pre variačno-štatistické spracovanie bola použitá analýza variancie (F-test) v programe Statgrafic. Výsledky a diskusia Prehľadná tabuľka 1 charakterizuje základnú premenlivosť podielu jednotlivých mastných kyselín pri hodnotených plemenách v intramuskulárnom tuku MLT: 344

354 Zastúpenie mastných kyselín v intramuskulárnom tuku býkov (%) Tab. 1 Plemeno Mastná kyselina HF (n=17) Ss (n=15) SP (n=10) CH (n=5) Li (n=5) K (n=8) C12:0 0,06 0,04 0,04 0,05 0,03 0,07 C12:1 0,04 0,03 0,05 0,04 0,04 0,06 C14:0 2,76 2,49 2,65 2,28 2,30 2,60 C14:1 0,98 0,74 0,88 0,65 0,63 0,59 C16:0 30,20 28,40 29,56 28,75 30,10 31,16 C16:1 4,00 4,12 3,84 4,06 3,79 3,58 C17:0 0,29 0,29 0,36 0,34 0,27 0,38 C18:0 16,00 16,38 14,57 15,20 16,00 14,49 C18:1 42,83 40,56 38,69 42,16 40,85 40,66 C18:2 2,34 2,69 2,42 2,28 2,58 2,31 C18:3 0,68 0,54 0,61 0,49 0,56 0,67 Najvyšší podiel bol pri všetkých hodnotených genotypoch v kyseline olejovej (C18:1 38,69 do 42,83 %) a palmitovej (C16:0 28,40 31,16 %). Najnižšie hodnoty boli pri kyseline laurovej (C12:0) a dodekanovej (C12:1). Výsledky sú pri niektorých plemenách (Ss a SP) v zhode s Mojtom et al. (1995). Obsah celkového cholesterolu v intramuskulárnom tuku a pečeni býkov je v tabuľke 2. Obsah cholesterolu v intramuskulárnom tuku MLT a pečeni býkov (mg/100g) Cholesterol Plemeno HF Ss SP CH Li v tkanive K (n=8) (n=17) (n=15) (n=10) (n=5) (n=5) MLT 78,12 61,36 59,01 54,25 56,84 81,36 Pečeň 320,49 280,48 270,31 256,84 270,16 338,24 Najvyššie hodnoty cholesterolu pri obidvoch analyzovaných tkanivách (sval a pečeň) boli u holštajnských býkov a ich kúžencoch so slovenským strakatým plemenom. Naopak najnižší obsah mali 345

355 reprezentanti mäsových plemien (charolaise a Limousine). Rozdiely boli štatisticky významné (P < 0,05). Záver Na základe dosiahnutých výsledkov je možné konštatovať, že existujú signifikantné rozdiely medzi plemenami hovädzieho dobytka a obsahu cholesterolu stanovenom v najdlhšom chrbtovom svale (MLT) a pečeni. Nižšie hodnoty majú genotypy mäsových plemien a najvyššie zase mliekové. Intermediárne postavenie majú plemená s kombinovanou úžitkovosťou (SP a Ss). Pri mastných kyselinách rozdiely neboli štatisticky potvrdené. Literatúra: ARAVE, C. W. et al. (1975): Genetic and environmental effects on serum cholesterol of dairy cattle of various age. J. Dairy Sci., 58, BULLA, J. et al. (1998): The lipid concentrations on blood plasma in different type of Pinzgauer cattle. In: 49 Animal Meeting of EAAP, Wrasaw, Poland, FOLCH, J. et al. (1957): A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues. Journal of Biological Chemistry, 226, HORŇÁKOVÁ, M., CHROMÝ, V., HEYROVSKÝ, A.: Spektrofotometrické stanovení cholesterolu. Biochem. Clin. Bohem., 27, MOJTO, J. et al (1995): Zastúpenie mastných kyselín a cholesterolu v intramuskulárnom tuku jatočných býkov rozdielnych genotypov. Živoč. Výroba, 40 (6),

356 OBSAH DOMINANTNÉ PREOVULAČNÉ A ATRETICKÉ TERCIÁRNE FOLIKULY VAJEČNÍKOV OVIEC PO ASISTOVANOM ESTRE A OVULÁCII. 1 ANTAL J., MARAČEK I., HALAGAN J., VPLYV HORMÓNOV GHRELÍNU A LEPTÍNU NA EXPRESIU TRANSKRIPČNÝCH FAKTOROV CREB, STAT-1, APOPTÓZU, PROLIFERÁCIU A SEKREČNÚ AKTIVITU U KULTIVOVANÝCH OVARIÁLNYCH BUNIEK OŠÍPANÝCH BENČO, A., SIROTKIN A.V., PAVLOVÁ S., A. TANDLMAJEROVÁ, M. MESÁROŠOVÁ VÝŽIVA DETÍ RÓMSKEHO ETNIKA Z BANSKEJ BYSTRICE CUDRÁKOVÁ, Z VPLYV MEDI, KADMIA, HORĆÍKA, KOBALTU, ZINKU A BARIA NA ENZYMATICKÚ AKTIVITU V BACHORE 14 FAIXOVÁ, Z., * FAIX, Š., MAKOVÁ, Z. 14 EFFECT OF RESVERATROL ON THE TESTOSTERONE PRODUCTION OF MOUSE PRIMARY LEYDIG CELL CULTURE 18 1 FORGÁCS, ZS, 2 SOMOSY, Z, 2 TELBISZ, Á, 3 MASSÁNYI, P, 3 LUKÁC, N 18 VPLYV KONTINUÁLNEHO OŽAROVANIA, DMBA A MELATONÍNU NA IN VITRO FAGOCYTÁRNU AKTIVITU V KRVI POTKANOV 25 FRIEDMANOVÁ, L., PAULÍKOVÁ, E., ORENDÁŠ, P., AHLERSOVÁ, E., AHLERS, I. 25 VPLYV PODMIENOK NA PREŽÍVANIE VYBRANÝCH PROBIOTICKÝCH MIKROORGANIZMOV GOLIAN, J.2, SOKOL, J.1, HANZEL, S.1, RAJSKÝ, D.3, LABORATÓRNA DIAGNOSTIKA GRAVIDITY PRASNÍC HAJURKA, J., SIROTKIN, A.*, HURA, V., MAKAREVIČ, A.* PUERPERÁLNA INFEKCIA MATERNICE KRÁV A CELKOVÁ IMUNITNÁ ODPOVEĎ 36 HAJURKA, J., REVAJOVÁ, V., MACÁK, V., NOVOTNÝ, F. 36 HORMONÁLNA A AKUPUNKTÚRNA SYNCHRONIZÁCIA RUJE U ANESTRICKÝCH BAHNÍC. 40 HALAGAN, J., MARAČEK, I., STANÍKOVÁ, A. 40

357 VPLYV VÝŽIVY NA CHEMICKÉ ZLOŽENIE PRSNEJ SVALOVINY BROJLEROVÝCH KURČIAT 44 HAŠČÍK,P., ČUBOŇ, J., KULÍŠEK, V. REGULÁCIA PERIFÉRNYCH CIRKADIÁNNYCH OSCILÁTOROV U KURČAŤA POČAS PRENATÁLNEHO A POSTNATÁLNEHO VÝVINU HERICHOVÁ I. 1, ZEMAN M. 1,2, LAMOŠOVÁ D. 2 INOVAČNÉ METÓDY ZISKU EMBRYÍ U OŠÍPANÝCH HORŇÁKOVÁ Ľ., POŠIVÁK J., LAZAR G., VALOCKÝ I. SLEDOVANIE VPLYVU LACTOBACILUS CASEI VAR. SUBP. PSEUDOPLANTARUM Č. 294 NA VYBRANÉ UKAZOVATELE U PRASIAT HÚSKA M., KOVÁČ G., LINK R., NOVOTNÝ J., POPELKOVÁ M. VPLYV PODÁVANIA LACTOBACILLUS REUTERI NA VNÚTORNÉ PROSTREDIE PRASIAT HÚSKA, M., REICHEL, P., NOVOTNÝ J., LINK R., POPELKOVÁ M. ANALÝZA MLIEKA TRANSGÉNNYCH A NETRANSGÉNNYCH KRÁLIKOV 6 CHRENEK 1,3, P., S. DRAGIN 1,2, L. CHRASTINOVA 1, K. KIRCHNEROVA 1, J. RAFAY 1, J. BULLA 3 ÚČINOK FYTOBIOTIK A EXOGÉNNYCH TRÁVIACICH ENZÝMOV NA ZDRAVIE A UŽITKOVOSŤ HOSPODÁRSKYCH ZVIERAT IVANKO, Š., DINDA, Š., MAŘEČEK, E.,*CHALUPA,M **. FALAT, M.*** APPLICATION PCR BASED POLYMORPHISM OF LEPTIN GENE AS QTL FOR MILK PRODUCTION TRAITS IN DAIRY CATTLE IN SLOVAKIA. 80 JAKABOVÁ, D. 1, TRANDŽÍK, J. 1, HAŠKO, M. 1, MASSÁNYI, P. 2, KOZLÍK, P. 1, CHRASTINA J. 1, JAKAB, F. 3, TURČAN, J. 3, KUKUROVÁ L. 4, BULLA J. 2 MAMÁRNA KARCINOGENÉZA A JEJ OVPLYVNENIE PODÁVANÍM MELATONÍNU U OPAKOVANE STRESOVANÝCH POTKANOV KASSAYOVÁ, M., ADÁMEKOVÁ, E., BOJKOVÁ, B., MARKOVÁ M., KUBATKA, P., AHLERS, I., AHLERSOVÁ, E. ÚLOHA PROGESTERÓNU, IGF-I A IGFBP-3 V REGULÁCII POHLAVNÉHO DOSPIEVANIA PRASNIČIEK KOLESÁROVÁ A. 1, SIROTKIN A. 2, KRAMÁROVÁ M. 1, MASSÁNYI, P. 1, KOVÁČIK J

358 EXPRESIA PROTEÍNKINÁZY G, MAP KINÁZY ERK1,2, TYROZÍNKINÁZY PHT A ODOZVA OVARIÁLNYCH GRANULÓZNYCH BUNIEK PRASNIČIEK NA DBCAMP, IGF-I A OXYTOCÍN 92 KOLESÁROVÁ A. 1, SIROTKIN A. 2, KRAMÁROVÁ M. 1, MASSÁNYI, P. 1, KOVÁČIK J. 1 HODNOTENIE NUTRIČNÉHO STAVU DOSPELÝCH OSÔB S VYUŽITÍM ANTROPOMETRICKÝCH PARAMETROV A STANOVENIA TELESNÉHO TUKU KOPČEKOVÁ, J., ŠRAMKOVÁ, K., DANIŠKA, J. APOPTÓZA AKO MARKER KVALITY A ŽIVOTASCHOPNOSTI KRÁLIČÍCH EMBRYÍ PO MIKROMANIPULÁCIÁCH KORDOVÁNOVÁ, D. 1, MAKAREVIČ, A. 2, CHRENEK, P. 2 ZMENY AKTIVITY CHYMOTRYPSÍNU A TRYPSÍNU V TRUSE JAPONSKÝCH PREPELÍC PO APLIKÁCII CD A CR KORÉNEK, M., KORÉNEKOVÁ, B., SKALICKÁ M., NAĎ, P SLEDOVANIE ÚČINKU SELÉNU U VAJEC JAPONSKÝCH PREPELÍC PO APLIKÁCII KADMIA 109 KORÉNEKOVÁ, B., ŠÁLY, J., SKALICKÁ, M. NAĎ, P., BULECA, V., *SOTÁK, M. PROTEÍNY AKÚTNEJ FÁZY U ZVIERAT KOVÁČ G., VARGOVÁ M., POPELKOVÁ M. PROBIOTIKÁ: ICH FUNKCIE A VLASTNOSTI KRAMÁROVÁ, M., KOLESÁROVÁ, A., KOVÁČIK, J., MASSÁNYI, P., LUKÁČ, N. VPLYV MATERNÁLNEHO TESTOSTERÓNU NA SOCIÁLNE A EXPLORAČNÉ SPRÁVANIE MLÁĎAT LABORATÓRNEHO POTKANA KRŠKOVÁ, L., TALAROVIČOVÁ, A. VPLYV VÍRUSOV (BHV-1 A BVDV) BOVINNÝCH EMBRYÍ IN VITRO NA VITALITU VČASNÝCH KUBOVIČOVÁ, E., PIVKO, J., MAKAREVIČ, A., GRAFENAU, P., RÍHA, Ľ., PARKÁNYI, V. 128 SPOROTVORNÉ BAKTÉRIE AKO POTENCIÁLNE RIZIKO KONTAMINÁCIE POTRAVÍN LINK, R., KOVÁČ, G., NOVOTNÝ, J. VPLYV BACILLUS LICHENIFORMIS NA FYZIOLÓGIU TELIAT PRI DIARHOICKOM SYNDRÓME LINK, R., KOVÁČ, G

359 ZLEPŠENIE UTILIZÁCIE KRMIVA V CHOVE OŠÍPANÝCH POMOCOU PROBIOTICKÝCH PREPARÁTOV 139 LINK, R., KOVÁČ, G., HÚSKA, M. VZŤAH MEDZI SÉROVÝMI HLADINAMI ANTIOXIDAČNÝCH VITAMÍNOV A IMUNOGLOBULÍNOV NEONATÁLNYCH TELIAT LUKÁČ, N 1., BÁRDOS, L 2., MASSÁNYI, P 1., BREZINA, B 1., KRAMÁROVÁ, M 1. ÚČINOK KOBALTU NA ŠTRUKTÚRU A FUNKCIU SEMENNÍKA U CHRČKA LUKÁČ, N., MASSÁNYI, P., KRAMÁROVÁ, M., TOMAN, R., KOLESÁROVÁ, A. SLEDOVANIE A POROVNÁVANIE TRANSPORTU NIEKTORÝCH MASTNÝCH KYSELÍN CEZ ČREVNÝ EPITEL OVIEC MAKOVÁ, Z. KVALITATÍVNE A KVANTITATÍVNE HODNOTENIE TERCIÁRNYCH FOLIKULOV VAJEČNÍKOV MODERNÝMI ZOBRAZOVACÍMI METÓDAMI A HORMONÁLNYMI PARAMETRAMI MARAČEK, I., HALAGAN, J., DANKO, J. DAPA AKO MARKER PRE HODNOTENIE SYNTETICKEJ KAPACITY BACHOROVEJ MIKROFLÓRY MASKAĽOVÁ I., VAJDA V., ALTERÁCIE ŠTRUKTÚRY OBLIČIEK MYŠÍ PO EXPERIMENTÁLNOM PODANÍ OLOVA MASSÁNYI, P., LUKÁČ, N., KOVÁČIK, J., TOMAN, R., KRAMÁROVÁ, M., KOLESÁROVÁ, A. CADMIUM INDUCED OVARIAN ULTRASTRUCTURE ALTERATIONS IN VIVO AND IN VITO PETER MASSÁNYI(1), VLADIMÍR UHRIN(1), JAROSLAV KOVACIK(1), RÓBERT TOMAN(1), JURAJ PIVKO(1,2), ALEXANDER V. SIROTKIN(2), NORBERT LUKAC(1), ZSOLT FORGACS(3), ZOLTAN SOMOSY(3), AND JAN DANKO(4) VPLYV VYBRANÝCH IMPLEMENTOROV NA ULTRAŠTRUKTURÁLNU KATEGORIZÁCIU SPERMIÍ BARANA MATEJAŠÁKOVÁ, E., PIVKO, J., MAKAREVIČ, A.V., KUBOVIČOVÁ, E., SIROTKIN, A.V., RIHA, Ľ KORTIZOL, MALONDIALDEHYD (TBARS) A ANTIOXIDAČNÁ KAPACITA PLAZMY U DOJNÍC VYSTAVENÝCH OPERAČNÉMU STRESU MUDROŇ P., 2 REHAGE J

360 ÚČINOK KADMIA NA VYBRANÉ PARAMETRE BUNKOVEJ IMUNITY U HYDINY 185 NAĎ P., PISTL J.*, SKALICKÁ M., KORÉNEKOVÁ, B. POROVNANIE KINETIKY SÉROVÝCH HLADÍN OXYTETRACYKLÍNU U OVIEC PO PRÍPRAVKOCH S PREDĹŽENÝM ÚČINKOM A ICH ZNÁŠANLIVOSŤ NEUSCHL, J., J NAGY, SOKOL, J.,, ŠÁLY, J. VPLYV SUBAKÚTNYCH DÁVOK SALINOMYCÍNU SODNÉHO NA HMOTNOSTNÉ PRÍRASTKY A ZDRAVOTNÝ STAV KURČIAT NEUSCHL J., ŠÁLY J., KORÉNEK M., KREMEŇ J.,VALENČÁKOVÁ,A. BIOLOGICKÁ DOSTUPNOSŤ CHLORIDU TETRACYKLÍNIA U OVIEC PO APLIKÁCII VUBIVET C PRM.A.U.V. V MLIEKU A VODE NEUSCHL, J., NAGY, J., SOKOL, J., ŠÁLY, J. ANTIMIKROSPORIDIÁLNY ÚČINOK ALBENDAZOL U KRÁLIKOV EXPERIMENTÁLNE INFIKOVANÝCH ENCEPHALITOZOON CUNICULI NEUSCHL, J., ČONKOVÁ, E.,ČELLÁROVÁ,E., ŠÁLY,J. VPLYV VYBRANÝCH METABOLICKÝCH PARAMETROV V KRVNOM SÉRE DONORIEK KRÁV NA ZISK A KVALITU EMBRYÍ NOVOTNÝ F., MACÁK V., HAJURKA J., VALOCKÝ I., ČERNOTA S. BIOPLEXY STOPOVÝCH PRVKOV A ICH VPLYV NA MINERÁLNY METABOLIZMUS OŠÍPANÝCH NOVOTNÝ, J., KOVÁČ, G., LINK, R., HÚSKA, M. VPLYV SUPEROVULÁCIE NA KATECHOLAMINERGICKÝ SYSTÉM A AKTIVITU MONOAMINOOXIDÁZY HYPOFÝZY OVIEC PÁSTOROVÁ, B., MARAČEK, I., STANÍKOVÁ, A. DYNAMIKA ZMĚN UKAZATELŮ METABOLICKÉHO PROFILU KREVNÍ PLAZMY NOSNIC V PRŮBĚHU SNÁŠKOVÉHO CYKLU PAVLÍK, A. ÚČASŤ TRANSKRIPČNÉHO FAKTORA STAT-1 V REGULÁCII FUNKCIÍ OVARIÁLNYCH BUNIEK OŠÍPANÝCH PAVLOVÁ 1, S., ALEXANDER V. SIROTKIN 1,2, ANDREJ BENČO 2, DUŠAN VAŠÍČEK 1, ALŽBETA TANDLMAJEROVÁ

361 VPLYV IGF-I NA DOZRIEVANIE OOCYTOV A VÝVOJ BOVINNÝCH EMBRYÍIN VITRO 223 POPELKOVÁ 1, M., MAKAREVIČ 3, A., J. PIVKO 3, J. KAČMÁRIK 2, G. KOVÁČ 1, M. HÚSKA VPLYV SEZÓNY NA PRODUKCIU LH A TESTOSTERÓNU U INTAKTNÉHO A KASTROVANÉHO JELEŇA KARPATSKÉHO (CERVUS ELAPHUS). POŠIVÁK J. 1, LAZAR G. 1,VALOCKÝ I. 1, HORŇÁKOVÁ Ľ. 1, ČURLIK J. 2 METODICKÝ POSTUP ZMRAZOVANIA SEMENA BARANOV V PLÁVAJÚCOM ZÁVESNOM ZMRAZOVAČI RIHA, Ľ., APOLEN, D., PIVKO, J., GRAFENAU, P., KUBOVIČOVÁ, E. METABOLICKÝ PROFILOVÝ TEST SCHNEIDGENOVÁ, M. NOVÝ REGULÁTOR OVARIÁLNYCH FUNKCIÍ OŠÍPANÝCH HORMÓN THROMBOPOIETÍN SIROTKIN, A. V., P. SANISLO, H.-J. SCHAEFFER 2, I. FLORKOVIČOVÁ, J. KOTWICA 3, L. HETÉNYI VPLYV ZINKU A KADMIA NA ICH DISTRIBÚCIU VO VAJCIACH JAPONSKÝCH PREPELÍC SKALICKÁ, M., KORÉNEKOVÁ, B., NAĎ, P.,*DOLINSKÁ, S., *KUŠNÍROVÁ, E. VPLYV BIELKOVINOVÝCH FRAKCIÍ BOVINNEJ AMNIÓNOVEJ TEKUTINY NA PROLIFERÁCIU LYMFOCYTOV PERIFÉRNEJ KRVI SOBEKOVÁ, A., KOSTECKÁ, Z., BLAHOVEC, J. ORGANIZAČNÉ, HYGIENICKÉ A VETERINÁRNE KRITÉRIÁ NA ČINNOSŤ ZARIADENÍ PRE LABORATÓRNE ZVIERATÁ SOKOL, J. 1, HANZEL, S. 1, GOLIAN, J. 2, RAJSKÝ, D. 3, PAVLIČOVÁ, S. 2 ZMENY KVALITATÍVNYCH UKAZOVATEĽOV BRAVČOVÉHO MÄSA POČAS DLHODOBÉHO MRAZIARENSKÉHO USKLADNENIA SOPKOVÁ, D. ANALÝZA PRODUKTOV DEGRADÁCIE LIPIDOV V TUKOVOM TKANIVE OŠÍPANÝCH POČAS MRAZIARENSKÉHO USKLADNENIA SOPKOVÁ D., STANÍKOVÁ, A., MARAČEK, I. ŠUNKA V PLECHU Z PSE MÄSA SOPKOVÁ, D

362 NUTRIČNÉ PARAMETRE BRAVČOVÉHO KVALITATÍVNE ZMENENÉHO - PSE MÄSA 271 SOPKOVÁ, D. 271 CADMIUM AND LEAD CONTENTS IN SELECTED ORGANS OF DOMESTIC PIG (SUS SCROFA) ROBERT STAWARZ, GRZEGORZ FORMICKI DENNÝ PROFIL HLADÍN MELATONÍNU VO VYBRANÝCH TKANIVÁCH A MELATONÍNOVÝCH RECEPTOROV V HYPOTALAME POTKANA. STEBELOVÁ K., HERICHOVÁ I., ZEMAN M. VPLYV VITAMÍNU E NA PRODUKCIU VAJEC U NOSNÍC ŠÁLY, J., KUŠEV, J., BARANOVÁ, D., NEUSCHL, J., MÁTEOVÁ, S., KREMEŇ, J., METABOLIZMUS VÁPNIKA V SÚVISLOSTI S TVORBOU VAJEČNEJ ŠKRUPINY ŠÁLY, J., BARANOVÁ, D., NEUSCHL, J. VPLYV SIMULOVANEJ MIKROGRAVITÁCIE NA RAST KOSTÍ NOHY PREPELICE JAPONSKEJ ŠKROBÁNEK, P., BARANOVSKÁ, M., ŠÁRNIKOVÁ, B. SPRÁVANIE SA POTKANOV OŽIARENÝCH GAMA-LÚČMI V OBLASTI HLAVY V TESTE NA HORÚCEJ PLATNI A V KRÍŽOVOM LABYRINTE ŠMAJDA, B., KISKOVÁ, J., ORAVCOVÁ, Z., TOMÁŠOVÁ, L. POROVNANIE CHOLESTEROLÉMIE A SOMATOMETRICKÝCH UKAZOVATEĽOV V SKUPINE DOSPELÝCH OSÔB ŠRAMKOVÁ, K., KOPČEKOVÁ, J., DANIŠKA, J KOSTNÁ DENZITA, RIZIKO OSTEOPORÓZY A NUTRIČNÉ PARAMETRE 304 ŠRAMKOVÁ, K. 1, BITTER, K. 2, LUKÁČOVÁ, O. 3 VÝSKYT RUJE PO HORMONÁLNOM OŠETRENÍ U ZVERNICOVO CHOVANÝCH DANIELIC PO SEZÓNNEJ ANESTRII ŠŤAVOVÁ Ľ. 1,HARVÁNKOVÁ M. 1, HARBÁČ D. 1, KOŠÚTHOVÁ L. 2 FUNKCIA ŠTÍTNEJ ŽĽAZY A STREDNOMOLEKULOVÉ PEPTIDY V KRVNOM SÉRE HOVÄDZIEHO DOBYTKA V PODMIENKACH EKOLOGICKY PODMIENENÉHO NEDOSTATKU JÓDU A PRI JEHO KOREKCII TURIANICA, I., *ROSTOKA, L., ANGELOVIČOVÁ, M., DANIŠKA, J., KRIVOSUDSKÁ, E

363 LIMITY NUTRIČNEJ FYZIOLÓGIE PRI REGULOVANÍ METABOLICKÝCH FUNKCIÍ DOJNÍC. 316 VAJDA. V., MASKAĽOVÁ I. VPLYV MONOKLONOVÝCH PROTILÁTOK NA AKROZÓMOVÚ REAKCIU BÝČÍCH SPERMIÍ. VALENTOVIČOVÁ, J., SIMON, M., ANTALÍKOVÁ, J. CHOISEN HISTOLOGICAL PARAMETERS OF OVIDUCT IN PUERPERAL EWES AFTER CARBETOCIN TREATMENT VALOCKÝ, I., LENHARDT, Ľ., KRAJNIČÁKOVÁ, M., LAZAR, G., POŠIVÁK, J., HORŇÁKOVÁ, Ľ., NOVOTNÝ, F. KVANTITATÍVNE A KVALITATÍVNE ZMENY FOLIKULOV OVÁRIÍ PO INDUKOVANEJ RUJI OVIEC V ANESTRICKOM OBDOBÍ. VLČKOVÁ R., LACKOVÁ Z., ANTAL J., MARAČEK I. MÔŽU MATERNÁLNE HORMÓNY PRÍTOMNÉ VO VAJCI OVPLYVNIŤ POSTEMBRYONÁLNY VÝVIN A SPRÁVANIE MLÁĎAT PREPELÍC JAPONSKÝCH? ZEMAN, M. 1,2, OKULIAROVÁ, M. 1, SLOBODOVÁ D. 1, STANOVENIE VÝSKYTU PATOLOGICKÝCH SPERMIÍ BÝKOV, BARANOV A ŽREBCOV ZEMANOVÁ, J., MASSÁNYI, P., LUKÁČ, N., TRANDŽÍK, J