DEZVOLTAREA UNOR METODE ANALITICE DE DETERMINARE A BISOPROLOLULUI. VALIDARE ȘI APLICAȚII

UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ȘI FARMACIE GRIGORE T. POPA IAŞI FACULTATEA DE FARMACIE Rezumatul tezei de doctorat DEZVOLTAREA UNOR METODE ANALITICE DE DETERMINARE A BISOPROLOLULUI. VALIDARE ȘI APLICAȚII CONDUCĂTOR ŞTIINŢIFIC: Prof. Univ. Dr. DORNEANU Vasile DOCTORAND: Asist. Univ. GUDRUMAN (căs. PANAINTE) Alina Diana

Conform deciziei Rectoratului Universității de Medicină și Farmacie GRIGORE T. POPA IAŞI nr. 16201 din data de 30.07.2014, a fost numită următoarea comisie de doctorat: Președinte: Prof. Dr. Monica Hăncianu Universitatea de Medicină și Farmacie Grigore T. Popa Iaşi Conducător științific: Prof. Dr. Vasile Dorneanu Universitatea de Medicină și Farmacie Grigore T. Popa Iaşi Referenți științifici: Prof. Dr. Crina Monciu Universitatea de Medicină și Farmacie Carol Davila București Conf. Dr. Luminița Agoroaei Universitatea de Medicină și Farmacie Grigore T. Popa Iaşi Conf. Dr. Romeo Olariu Universitatea Al.I. Cuza Iaşi

Teza de doctorat cuprinde: 183 pagini 81 figuri 135 tabele 206 indicaţii bibliografice În acest rezumat se păstrează numerotarea din teză pentru cuprins, tabele şi figuri. Bibliografia inclusă în rezumat este selectivă. Teza de doctorat a fost realizată cu sprijinul financiar al proiectului PARTENERIAT INTERUNIVERSITAR PENTRU CREȘTEREA CALITĂȚII ȘI INTERDISCIPLINARITĂȚII CERCETARII DOCTORALE MEDICALE PRIN ACORDAREA DE BURSE DOCTORALE DocMed.net POSDRU/107/1.5/S/78702. Cuvinte cheie: bisoprolol fumarat, metode analitice UV-Vis și HPLC de determinare din forme farmaceutice, hidrogeluri, evaluare in vitro, sisteme de transport controlat ale medicamentelor.

CUPRINS PRESCURTĂRI UTILIZATE... 6 PARTEA GENERALĂ... 7 CAPITOLUL 1. BISOPROLOLUL FUMARAT... 7 1.1. Aspecte generale... 7 1.2. Nomenclatură și formule... 11 1.3. Proprietăți fizico-chimice... 11 1.4. Sinteza bisoprololului... 14 1.5. Profil farmacologic... 15 1.5.1. Farmacocinetică... 15 1.5.2. Farmacodinamie... 17 1.5.3. Farmacotoxicologie... 18 1.5.4. Farmacoterapie... 18 1.5.5. Farmacoepidemiologie... 18 1.5.6. Farmacografie... 20 1.5.7. Condiții de calitate pentru utilizarea farmaceutică a bisoprololulului... 20 1.6. Metode de determinare cantitativă și calitativă... 21 1.6.1. Metode spectrofotometrice... 21 1.6.2. Metode cromatografice... 21 1.6.2.1. Metode cromatografice de lichide de înaltă performanță... 21 1.6.2.2. Metode cromatografice pe strat subțire... 24 1.6.3. Metode electroforetice... 25 1.6.4. Metode potențiometrice... 26 1.6.5. Metode voltametrice... 26 1.6.6. Metode de rezonanță magnetică nucleară... 26 CAPITOLUL 2. HIDROGELURI PE BAZĂ DE BIOPOLIMERI UTILIZATE CA SISTEME DE ELIBERARE CONTROLATĂ A MEDICAMENTELOR... 27 2.1. Aspecte generale... 27 2.2. Proprietățile hidrogelurilor... 28 2.3. Hidrogeluri pe bază de biopolimeri... 28 2.3.1. Chitosanul... 31 2.3.2. Poli(vinil alcool)... 33 2.3.3. Xantanul... 35 2.3.4. Lignina... 37 PARTEA PERSONALĂ... 41 CAPITOLUL 3. MOTIVAȚIA ȘI OBIECTIVELE CERCETĂRILOR PERSONALE... 41 CAPITOLUL 4. DATE PRIVIND METODOLOGIA DE LUCRU... 43 4.1. Metode de analiză și tehnici de lucru... 43 4.1.1. Metode spectrofotometrice UV-VIS... 43 4.1.2. Metode cromatografice de lichide de înaltă performanță... 43 4.1.3. Tehnica de încărcare/eliberare... 44 4.2. Analiza datelor experimentale... 44 4.2.1. Validarea metodelor de analiză... 44 4.2.2. Evaluarea in vitro a cineticii de încărcare/eliberare... 46 1

CAPITOLUL 5. METODE SPECTROFOTOMETRICE ÎN VIZIBIL DE DETERMINARE CANTITATIVĂ A BISOPROLOLULUI FUMARAT... 47 5.1. Determinarea spectrofotometrică de absorbție în vizibil a bisoprololului utilizând tropeolină 00... 47 5.1.1. Scop și obiective... 47 5.1.2. Material și metode... 47 5.1.2.1. Principiul metodei... 47 5.1.2.2. Mecanismul de reacție... 47 5.1.2.3. Aparatură și materiale... 48 5.1.3. Optimizarea parametrilor metodei analitice... 49 5.1.3.1. Stabilirea lungimii de undă de detecție... 49 5.1.3.2. Studiul stoechiometriei reacției chimice... 49 5.1.3.3. Stabilirea concentrației soluției de tropeolină 00... 49 5.1.3.4. Stabilirea acidității necesare reacției... 49 5.1.3.5. Stabilirea timpului optim de reacție... 50 5.1.3.6. Studiul influenței solventului folosit pentru extracție și a numărului de extracții... 50 5.1.3.7. Studiul stabilității produsului de reacție... 50 5.1.4. Procedura de lucru... 50 5.1.5. Validarea metodei de analiză... 50 5.1.5.1. Specificitatea... 50 5.1.5.2. Liniaritatea... 51 5.1.5.3. Limita de detecție și limita de cuantificare... 51 5.1.5.4. Precizia sistemului... 51 5.1.5.5. Precizia metodei... 52 5.1.5.5.1. Repetabilitatea... 52 5.1.5.5.2. Precizia intermediară... 52 5.1.5.6. Exactitatea... 52 5.1.5.7. Robustețea... 53 5.1.6. Studiul interferenților... 53 5.1.7. Determinarea spectrofotometrică în vizibil a bisoprololului din comprimate... 53 5.1.8. Rezultate... 54 5.1.9. Discuții... 63 5.1.10. Concluzii... 64 5.2. Determinarea spectrofotometrică de absorbție în vizibil a bisoprololului cu metiloranj... 65 5.2.1. Scop și obiective... 65 5.2.2. Material și metode... 65 5.2.2.1. Principiul metodei... 65 5.2.3.2. Mecanismul de reacție... 65 5.2.3.3. Aparatură și materiale... 65 5.2.3. Optimizarea parametrilor metodei analitice... 66 5.2.3.1. Stabilirea lungimii de undă de detecție... 66 5.2.3.2. Studiul stoechiometriei reacției chimice... 66 5.2.3.3. Stabilirea concentrației optime de metiloranj... 67 5.2.3.4. Stabilirea acidității necesare reacției... 67 5.2.3.5. Stabilirea ph-ului optim al tamponului fosfat... 67 5.2.3.6. Stabilirea timpului optim de reacție... 67 2

5.2.3.7. Studiul stabilității produsului de reacție... 67 5.2.3.8. Studiul influenței solventului folosit pentru extracție și a numărului de extracții... 67 5.2.4. Procedura de lucru... 67 5.2.5. Validarea metodei de analiză... 68 5.2.5.1. Specificitatea... 68 5.2.5.2. Liniaritatea... 68 5.2.5.3. Limita de detecție și limita de cuantificare... 69 5.2.5.4. Precizia sistemului... 69 5.2.5.5. Precizia metodei... 69 5.2.5.5.1. Repetabilitatea analizei... 69 5.2.5.5.2. Precizia intermediară... 70 5.2.5.6. Exactitatea... 70 5.2.5.7. Robustețea... 70 5.2.6. Studiul interferenților... 70 5.2.7. Determinarea spectrofotometrică în vizibil a bisoprololului din comprimate... 71 5.2.8. Rezultate... 71 5.2.9. Discuții... 81 5.2.10. Concluzii... 83 5.3. Determinarea spectrofotometrică de absorbție în vizibil a bisoprololului cu verde de bromcrezol... 83 5.3.1. Scop și obiective... 83 5.3.2. Material și metode... 83 5.3.2.1. Principiul metodei... 83 5.3.2.2. Mecanismul de reacție... 83 5.3.3.3. Aparatură și materiale... 84 5.3.3. Optimizarea parametrilor metodei analitice... 85 5.3.3.1. Stabilirea lungimii de undă de detecție... 85 5.3.3.2. Studiul stoechiometriei reacției chimice... 85 5.3.3.3. Stabilirea concentrației optime a soluției de verde de bromcrezol... 85 5.3.3.4. Stabilirea acidității necesare reacției... 85 5.3.3.5. Stabilirea timpului optim de reacție... 86 5.3.3.6. Studiul influenței solventului folosit pentru extracție și a numărului de extracții...86 5.3.3.7. Studiul stabilității produsului de reacție... 86 5.3.4. Procedura de lucru... 86 5.3.5. Validarea metodei de analiză... 86 5.3.5.1. Specificitatea... 86 5.3.5.2. Liniaritatea... 86 5.3.5.3. Limita de detecție și limita de cuantificare... 87 5.3.5.4. Precizia sistemului... 87 5.3.5.5. Precizia metodei... 88 5.3.5.5.1. Repetabilitatea... 88 5.3.5.5.2. Precizia intermediară... 88 5.3.5.6. Exactitatea... 88 5.3.5.7. Robustețea... 89 5.3.6. Studiul interferenților... 89 5.3.7. Determinarea spectrofotometrică în vizibil a bisoprololului din comprimate...89 3

5.3.8. Rezultate... 90 5.3.9. Discuții... 99 5.3.10. Concluzii... 100 5.4. Determinarea spectrofotometrică de absorbție în vizibil a bisoprololului fumarat utilizând acid picric... 101 5.4.1. Scop și obiective... 101 5.4.2. Material și metode... 101 5.4.2.1. Principiul metodei... 101 5.4.2.2. Mecanismul de reacție... 101 5.4.2.3. Aparatură și materiale... 102 5.4.3. Optimizarea parametrilor metodei analitice... 102 5.4.3.1. Stabilirea lungimii de undă de detecție... 102 5.4.3.2. Studiul stoechiometriei reacției chimice... 103 5.4.3.3. Stabilirea concentrației soluției de acid picric... 103 5.4.3.4. Stabilirea timpului optim de reacție... 103 5.4.3.5. Studiul stabilității produsului de reacție... 103 5.4.3.6. Studiul influenței solventului folosit la prepararea probelor... 103 5.4.4. Procedura de lucru... 103 5.4.5. Validarea metodei de analiză... 104 5.4.5.1. Specificitatea... 104 5.4.5.2. Liniaritatea... 104 5.4.5.3. Limita de detecție și limita de cuantificare... 104 5.4.5.4. Precizia sistemului... 105 5.4.5.5. Precizia metodei... 105 5.4.5.5.1. Repetabilitatea... 105 5.4.5.5.2. Precizia intermediară... 105 5.4.5.6. Exactitatea... 105 5.4.5.7. Robustețea... 105 5.4.6. Studiul interferenților... 106 5.4.7. Determinarea spectrofotometrică în vizibil a bisoprololului fumarat din comprimate... 106 5.4.8. Rezultate... 106 5.4.9. Discuții... 115 5.4.9. Concluzii... 116 CAPITOLUL 6. METODE CROMATOGRAFICE DE LICHIDE DE ÎNALTǍ PERFORMANŢǍ PENTRU DETERMINAREA BISOPROLOLULUI FUMARAT... 117 6.1. Metoda 1 de separare și determinare a bisoprololului fumarat prin RP-HPLC... 117 6.1.1. Scop și obiective... 117 6.1.2. Material și metode... 117 6.1.3. Optimizarea parametrilor metodei analitice... 118 6.1.3.1. Stabilirea timpului de retenție... 118 6.1.3.2. Stabilirea raportului componentelor fazei mobile... 118 6.1.3.3. Stabilirea ph-ului optim al fazei apoase... 118 6.1.3.4. Stabilirea debitului fazei mobile... 118 6.1.3.5. Stabilirea fazei staționare... 119 6.1.4. Validarea metodei... 119 6.1.4.1. Selectivitatea... 119 4

6.1.4.2. Liniaritatea... 119 6.1.4.3. Limita de detecție și limita de cuantificare... 119 6.1.4.4. Precizia sistemului... 120 6.1.4.5. Precizia metodei... 120 6.1.4.5.1. Repetabilitatea analizei... 120 6.1.4.5.2. Precizia intermediară... 120 6.1.4.6. Exactitatea... 120 6.1.4.7. Robustețea... 121 6.1.4.8. Studiul stabilității soluțiilor stoc de bisoprolol... 121 6.1.4.9. Studiul interferenților... 121 6.1.5. Determinarea cantitativă a bisoprololului fumarat din comprimate... 121 6.1.6. Aplicarea metodei în testul de dizolvare al comprimatelor... 121 6.1.7. Rezultate... 122 6.1.8. Discuții... 136 6.1.9. Concluzii... 138 6.2. Metoda 2 de separarea și determinare cantitativă a bisoprololului fumarat prin RP-HPLC... 139 6.2.1. Scop și obiective... 139 6.2.2. Material și metode... 139 6.2.3. Optimizarea parametrilor metodei analitice... 140 6.2.3.1. Stabilirea timpului de retenție... 140 6.2.3.2. Stabilirea raportului compoziției fazei mobile... 140 6.2.3.3. Stabilirea ph-ului fazei apoase... 140 6.2.3.4. Stabilirea debitului fazei mobile... 140 6.2.3.5. Stabilirea fazei staționare... 140 6.2.4. Validarea metodei... 140 6.2.4.1. Selectivitatea... 140 6.2.4.2. Liniaritatea... 141 6.2.4.3. Limita de detecție și limita de cuantificare... 141 6.2.4.4. Precizia sistemului... 141 6.2.4.5. Precizia metodei... 141 6.2.3.5.1. Repetabilitatea analizei... 141 6.2.3.5.2. Precizia intermediară... 142 6.2.4.6. Exactitatea... 142 6.2.4.7. Robustețea... 142 6.2.4.8. Stabilitatea soluțiilor stoc de bisoprolol... 142 6.2.4.9. Studiul interferenților... 142 6.2.5. Determinarea cantitativă a bisoprololului fumarat din comprimate... 142 6.2.6. Rezultate... 143 6.2.7. Discuții... 152 6.2.8. Concluzii... 154 CAPITOLUL 7. EVALUAREA IN VITRO A UNOR HIDROGELURI CA SISTEME CU ELIBERARE CONTROLATĂ A BISOPROLOLULUI FUMARAT... 155 7.1. Evaluarea in vitro a hidrogelurilor pe bază de poli(alcool vinil) și chitosan... 155 7.1.1. Scop și obiective... 155 7.1.2. Material și metode... 155 5

7.1.2.1. Comportamentul la umflare al hidrogelurilor... 156 7.1.2.2. Testul de încărcare a hidrogelurilor cu bisoprolol fumarat... 157 7.1.2.3. Testul de eliberare in vitro a bisoprololului din hidrogeluri... 157 7.1.3. Rezultate... 158 7.1.4. Discuții... 161 7.1.5. Concluzii... 163 7.2. Evaluarea in vitro a hidrogelurilor pe bază de xantan și lignină epoximodificată... 163 7.2.1. Scop și obiective... 163 7.2.2. Material și metode... 163 7.2.2.1. Comportamentul la umflare... 164 7.2.2.2. Testul de încărcare a hidrogelurilor cu bisoprolol fumarat... 164 7.2.2.3. Testul de eliberare in vitro a bisoprololului din hidrogeluri... 165 7.2.3. Rezultate... 165 7.2.4. Discuții... 167 7.2.5. Concluzii... 168 CONCLUZII GENERALE... 169 PERSPECTIVE DE CERCETARE... 170 BIBLIOGRAFIE... 171 ANEXE... 183 Diseminarea rezultatelor obținute... 183 Lucrări științifice... 183 Comunicări de tip poster... 183 6

PARTEA GENERALĂ În prima parte a lucrării s-a realizat un studiu bibliografic asupra bisoprololului și a hidrogelurilor pe bază de biopolimeri utilizate ca sisteme de eliberare controlată a substanțelor medicamentoase. Această parte este structurată în două capitole. În primul capitol au fost prezentate datele întâlnite în literatura de specialitate referitoare la beta-blocante, la caracterizarea analitică a bisoprololului fumarat și a profilului său farmacologic. Blocantele betaadrenergice reprezintă o clasă importantă de medicamente folosite în tratamentul variatelor boli cardiovasculare (3), incluzând hipertensiunea arterială (5), angina pectorală (7), aritmia (8), cardiomiopatia hipertrofică (10), insuficiența cardiacă (12). Beta-blocantele au acum și alte aplicații precum: prevenirea durerilor de cap, migrenelor (16), tratamentul de tremor esențial benign, pentru pacienții cu feocromocitom și tireotoxicoză și în formulări topice oftalmice pentru reducerea presiunii intraoculare la pacienții cu glaucom cu unghi deschis (17), disecția de aortă (19), hipertiroidism (ca medicație simptomatică, diminuând anxietatea, tremorul, tahicardia, aritmiile (21), după transplant renal (23), tratamentul cancerului (crește eficacitatea chimioterapicelor) (24). Au fost prezentaţi apoi principalii reprezentanţi din clasa beta-blocantelor funcție de selectivitate. A fost prezentat apoi bisoprololul fumarat (BF) medicament betablocant, beta-1 selectiv foarte util în terapia bolilor cardiovasculare cu activitate mai mare decât atenololul și betaxololul. Denumirea chimică a bisoprololului fumarat după BP este (RS)-1-[4-[[2-(1- metiletoxi)etoxi]metil]fenoxi]-3-[(1-metiletil)amino]-2-propanol fumarat (2:1) (sare) (28) și are formula structurală redată în fig. 1.1.. Fig. 1.1. Formula structurală a bisoprololului fumarat Au fost prezentate apoi metodele de determinare cantitativă și calitativă a bisoprololului fumarat. Printre aceste metode menționăm pe cele spectrale de fluorescență (70) şi UV-VIS (71) cromatografice de lichide de înaltă performanță (78) și pe strat subțire (118), electroforetice (124) precum şi cele de rezonanţă magnetică nucleară (130). 7

În capitolul al doilea s-a realizat o trecere în revistă a celor mai importante date din cadrul descoperirii şi dezvoltării hidrogelurilor pe bază de biopolimeri utilizate ca sisteme de eliberare controlată a substanțelor medicamentoase. Chitosanul, xantanul, lignina și poli(alcoolul vinilic), sunt polimerii tratați în teza de doctorat, deoarece acești polimeri au fost folosiți ca materii prime pentru realizarea hidrogelurilor utilizate în cercetările efectuate. Chitosanul (CS) este o biopoliaminozaharidă cationică liniară fiind al doilea cel mai răspândit biopolimer după celuloză. Numeroase medicamente au fost înglobate în structuri polimerice cu chitosan în vederea îmbunătățirii profilelor de eliberare a acestora printre care menționăm încapsularea cimetidinei (141), a capecitabinei (142), a mesalaminei (143), a metronidazolului (144), ramiprilului (145). Literatura prezintă și încapsulări ale bisoprololului fumarat. Sarath Chandran et al. au inclus bisoprololul în plasturi bucali pe bază de CS (146), pe bază de CS și hidroxipropil metilceluloză (HPMC) și pe bază de CS și carboximetil celuloză sodică (CMC-Na). Rezultatele obținute au fost satisfăcătoare pentru formulările cu 2% CS care au prezentat un procent de eliberare de 96% substanță activă în 12 ore. Poli (vinil alcoolul) (PVA), este un polimer ce a primit o atenție deosebită din partea cercetătorilor care are o structură simplă ce poate fi ușor modificată printr-o reacție chimică. În ultimul timp PVA-ul este utilizat și la obținerea de nanofibre sub formă de copolimeri PVA-Chitosan (150). Nu se cunosc aplicații ale PVAului în ceea ce privește medicamentele BB. Xantanul (X) este un compus de mare interes științific și industrial din clasa polizaharidelor naturale datorită caracterului său biocompatibil, biodegradabil, netoxic şi capacităţii sale de a forma reţele tridimensionale. Aceste caracteristici sunt de mare importanță în elaborarea de sisteme de eliberare controlată a medicamentelor (153). Xantanul a fost testat pentru eliberarea proteinelor și peptidelor în cavitatea nazală (155), a medicamentelor vasodilatatoare (156), a medicamentelor utilizate în terapia gastrointestinală (157) etc. Lignina (L) este un alt polimer natural important regenerabil, amorf constând din unități fenilpropanice cu grupări metoxilate unite între ele prin legături eterice și carbon-carbon. Recent au fost raportate o serie de utilizări ale ligninei în domeniul medical. Astfel lignina complexată cu polizaharide împiedică creșterea și viabilitatea celulelor canceroase și potențează activitatea citotoxică a vitaminelor K și C (160). Alte direcții de utilizare sunt indicate de activitatea sa antibacteriană, imunostimulatoare și antioxidantă (161). Lignina prezintă și activitate antivirală prin directa interacțiune cu virușii. Studiile efectuate au demonstrat că activitatea anti-hiv a ligninei este superioară față de cea a taninurilor și flavonoidelor (163). 8

PARTEA PERSONALĂ Partea a doua a lucrării cuprinde studiile efectuate în cadrul stagiului de doctorat. MOTIVAȚIA ȘI OBIECTIVELE CERCETĂRILOR PERSONALE Capitolul trei prezintă motivaţia alegerii temei care a fost reprezentată de faptul că problematica medicamentelor cardiovasculare suscită un larg interes în comunitatea științifică, deoarece profilaxia afecțiunilor cardiovasculare reprezintă un aspect important al sănătății populației, în general, și al individului în special. Scopul cercetărilor personale a constat în instituirea de noi metode analitice pentru determinarea cantitativă a BF precum și evaluarea in vitro a unor noi sisteme cu eliberare controlată a substanței medicamentoase studiate din punct de vedere al capacității acestora de eliberare optimă a substanței active. Argumentele care au stat la baza acestor cercetări sunt următoarele: - utilizate la început ca medicamente antiaritmice, beta-blocantele și-au mărit sfera de aplicabilitate, valoarea lor terapeutică fiind încă în curs de evaluare; - deoarece nu toate metodele din literatură pot fi aplicate cu rezultate satisfăcătoare la determinarea bisoprololului mai ales din produse farmaceutice, unde influența excipienților nu poate fi evitată s-a desprins necesitatea instituirii de noi metode de analiză și control a acestuia care să corespundă exigențelor impuse de controlul analitic al medicamentului; - perspectivele utilizării polimerilor au devenit incontestabile în contextul optimizării și condiționării medicamentelor și ca urmare testarea sistemelor de eliberare pe bază de polizaharide a avut ca scop utilizarea acestora pentru livrarea substanței medicamentoase la locul de acțiune pentru o lungă perioadă de timp, astfel încât dozele terapeutice să poată fi diminuate considerabil, în contextul în care cercetarea bibliografică prezentată ne-a condus la concluzia că utilizarea unor sisteme complexe de tip hidrogelmedicament pentru reglarea procesului de eliberare a principiilor active reprezintă un domeniu insuficient explorat. Direcţiile de cercetare urmărite au fost următoarele: 1. elaborarea de metode analitice pentru determinarea bisoprololului fumarat ca atare şi din forme farmaceutice; 2. validarea și evaluarea statistică a performanțelor funcționării instrumentelor și a metodelor de analiză instituite, în conformitate cu reglementările naționale și europene; 3. testarea unor hidrogeluri ca transportori pentru eliberarea controlată a BF. 9

Absorbance (AU) DATE PRIVIND METODOLOGIA DE LUCRU În capitolul patru sunt prezentate date privind metodele de analiză și tehnicile de lucru precum și analiza datelor experimentale. Metodele cantitative de determinare realizate au fost validate conform unor protocoale și ghiduri (165) întocmite în cadrul AOAC Internațional (Asociația Științifică Dedicată Excelenței în Metode Analitice), Conferinței internaționale privind armonizarea (ICH) și a documentelor Eurachem privind parametri de validare (172, 173, 174, 175, 176). METODE SPECTROFOTOMETRICE ÎN VIZIBIL DE DETERMINARE CANTITATIVĂ A BISOPROLOLULUI FUMARAT În capitolul al cincilea al acestei lucrări au fost realizate noi metode spectrofotometrice în vizibil, sensibile și rapide care să permită dozarea bisoprololului fumarat ca atare și din produse farmaceutice. Astfel, subcapitolul 5.1 a avut drept scop dezvoltarea şi validarea unei metode spectrofotometrice în Vis folosind ca reactiv tropeolina 00 pentru dozarea bisoprololului fumarat sub formă de complex de tip perechi de ioni cu absorbanța maximă la 412 nm proporțională cu concentrația probei (fig. 5.2.). 0.35 412 nm 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 400 500 600 700 800 900 Fig. 5.2. Spectrul de absorbție al produsului de reacție la diferite concentrații de BF (15, 22, 25 µg/ml) Metoda este liniară pe domeniul de concentrație 5-30 µg/ml și este selectivă în prezența matricei formei farmaceutice. Pe acest interval, coeficientul de corelație a avut valoarea 0,9997 iar eroarea standard a dreptei de regresie (SE) a avut vaoarea 0,0029. Pentru estimarea preciziei s-au determinat: repetabilitatea detecției (RSD = 1,20%); repetabilitatea metodei (RSD% = 0,70%); precizia intermediară (RSD% = 0,86%). Pentru estimarea exactității regăsirea medie a fost de 100,30% pe intervalul 99,20-101,88% și RSD% = 1,02. S-au calculat limitele de detecție (0,67 µg/ml) și de cuantificare (2,23 µg/ml). Metoda spectrofotometrică astfel dezvoltată şi validată a fost aplicată la dozarea BF din comprimatele filmate de 2,5; 5 și 10 mg BF/comp. Conţinutul de substanţă 10 Wav elength (nm)

339 656 658 Absorbance (AU) 269 427 activă regăsită a fost situat în intervalul 99,33-101,17% în acord cu prevederile în vigoare. Subcapitolul 5.2 a avut drept scop dezvoltarea şi validarea unei metode spectrofotometrice în Vis folosind ca reactiv metil oranjul pentru dozarea BF. Metoda se bazează pe formarea unui complex ionic colorat în galben extractibil în dicloretan cu absorbanța maximă la 427 nm (fig. 5.11). 0.4 0.3 0.2 0.1 0 300 400 500 600 700 800 900 Wav elength (nm) Fig. 5.11. Spectre de absorbție ale produsului de reacție la concentrații de 2, 3 și 5 µg/ml Metoda este liniară pe domeniul de concentrație 0,8-9 µg/ml şi este selectivă în prezenţa matricei formei farmaceutice. Pe acest interval, coeficientul de corelație a avut valoarea 0,9997 iar eroarea standard a dreptei de regresie (SE) a avut vaoarea 0,0066. Pentru estimarea preciziei s-au determinat: repetabilitatea detecției (RSD = 0,75%); repetabilitatea metodei (RSD% = 1,11%); precizia intermediară (RSD% = 1,04%). La estimarea exactității regăsirea medie a fost de 100,31% pe intervalul 98,8-101,57% și RSD% = 1,07. Metoda spectrofotometrică astfel dezvoltată şi validată a fost aplicată la dozarea BF din comprimatele filmate de 2,5; 5 și 10 mg BF/compr. Conţinutul de substanţă activă regăsită a fost situat în intervalul 99,42-101,0% în acord cu prevederile în vigoare. Subcapitolul 5.3 a avut drept scop dezvoltarea şi validarea unei metode spectrofotometrice în Vis de dozare a bisoprololului ca atare și din forme farmaceutice folosind ca reactiv verdele de bromcrezol. Metoda se bazează pe formarea unui compus de tip perechi de ioni, colorat în albastru și extractibil în cloroform, cu absorbanța maximă la 402 nm proporțională cu concentrația probei. Metoda este liniară pe domeniul de concentrație 7-80 µg/ml şi este selectivă în prezenţa matricei formei farmaceutice (fig. 5.23.). Pe acest interval, coeficientul de corelație a avut valoarea 0,9998 iar eroarea standard a dreptei de regresie (SE) a avut vaoarea 0,064. Pentru estimarea preciziei s-au determinat: repetabilitatea detecției (RSD = 0,97%); repetabilitatea metodei (RSD% = 1,19%); precizia intermediară (RSD% = 1,21%). 11

657 Absorbance (AU) 402 0.8 0.7 0.6 S 0.5 P 0.4 0.3 0.2 0.1 M 0 Fig. 5.23. Spectre de absorbție pentru martor 0,1% (M), standard 70 µg/ml (S), probă (P) 60 µg/ml La estimarea exactității regăsirea medie = 100,11% pe intervalul 98,35-101,57% și RSD% = 1,06. S-au calculat limitele de detecție (1,78 µg/ml) și de cuantificare (5,41 µg/ml). Metoda spectrofotometrică astfel dezvoltată şi validată a fost aplicată la dozarea BF din comprimatele filmate Conţinutul de substanţă activă regăsită a fost situat în în intervalul 99,42-101,0% în acord cu prevederile în vigoare. Subcapitolul 5.4 a avut drept scop dezvoltarea şi validarea unei metode spectrofotometrice în Vis de dozare a BF ca atare și din forme farmaceutice folosind ca reactiv acidul picric. Bisoprololul fumarat formează cu acidul picric în cloroform un complex colorat în galben cu absorbanța maximă la 420 nm, proporțională cu concentrația de bisoprolol. Metoda dezvoltată prezintă liniaritate în domeniul de concentraţii 5 µg/ml și 120 µg/ml BF şi este selectivă în prezenţa matricei formei farmaceutice. Pe acest interval, coeficientul de corelație a avut valoarea 0,9996 iar eroarea standard a dreptei de regresie (SE) a vut vaoarea 0,0056. Pentru estimarea preciziei metodei s-au determinat: repetabilitatea detecției, repetabilitatea și precizia intermediară pentru care valorile RSD% au fost de 1,04%, 1,74% respectiv 1,43%. La estimarea exactității regăsirea medie a fost 100,34% pe intervalul 98,64-101,08% și RSD% = 1,01. Metoda spectrofotometrică astfel dezvoltată şi validată a fost aplicată la dozarea BF din comprimatele filmate de 5 și 10 mg. Conţinutul de substanţă activă regăsită a fost în acord cu prevederile în vigoare (tabel 5.77). Conc. declarată (mg) 10 5 Tabel 5.77 Date experimentale privind analiza bisoprololului din comprimate Conc. Conc. Regăsire BF/ RSD calculată medie medie comprimat SD (%) (μg/ml) (μg/ml) (%) (mg) Absorbanță 300 400 500 600 700 800 0,2727 60,55 0,2755 60,97 0,2698 59,65 0,2721 60,18 0,2715 60,04 0,2675 59,98 12 Wav elength (nm) Abate re 60,39 100,65 10,23 0,67 1,12 0,65 60,07 100,73 5,33 0,18 1,17 0,73

METODE CROMATOGRAFICE DE LICHIDE DE ÎNALTǍ PERFORMANŢǍ PENTRU DETERMINAREA BISOPROLOLULUI FUMARAT Capitolul șase prezintă două metode HPLC-UV cu fază inversă, cu eluţie izocratică de separare, identificare şi cuantificare a bisoprololului fumarat. Astfel, subcapitolul 6.1 a avut drept scop dezvoltarea şi validarea unei metode sensibile și rapide de separare, identificare şi cuantificare a bisoprololului fumarat prin HPLC, folosind o coloană Nucleosil C18 RP. În urma studierii parametrilor au fost stabilite următoarele condiții cromatografice: - fază mobilă formată din amestecul CH 3 CN:CH 3 OH:KH 2 PO 4 (ph = 3) în raport 25:30:45; coloană Nucleosil C18, 125 mm x 4,0 mm cu dimensiunea particulelor de 5 μm; - debit fază mobilă: 0,3 ml/min; detecție la lungimea de undă de absorbție λ= 225 nm; - eluție izocratică; t R = 2,32 min. Metoda a fost validată conform reglementărilor de validare recomandate pentru metodele HPLC, dovedindu-se a fi specifică, liniară, exactă şi fidelă pe domeniul de concentraţii 0,3 µg/ml și 10 µg/ml BF. În urma studierii preciziei metodei s-a stabilit că valoarea RSD% a avut o valoare mai mică de 2% atât pentru repetabilitate cât și pentru precizia intermediară. La estimarea exactității regăsirea medie a fost 99,97% pe intervalul 98,49-101,61% și RSD% = 1,27. Bisoprololul fumarat este stabil în soluție timp de 8 ore la temperatura camerei. Conform rezultatelor obținute la evaluarea metodei prin testul de dizolvare, reiese că produsele farmaceutice analizate eliberează peste 85% din cantitatea de bisoprolol declarată, iar profilele lor de dizolvare sunt asemănătoare. Metoda HPLC astfel dezvoltată şi validată a fost aplicată la dozarea BF din comprimatele filmate de 5 și 10 mg. Conţinutul de substanţă activă regăsită a fost în acord cu prevederile farmacopeilor în vigoare (tabel 6.14.). Nr. crt. Tabel 6.14. Date experimentale obținute la analiza bisoprololului din comprimate Concentrația Concentrația medie BF Regăsire RSD declarată BF calculată pe comprimat BF (% ) (%) (mg/comprimat) (mg) n=3 13 Abatere (mg) 1 P 1 (5) 4,98 99,60 0,77-0,04 2 P 2 (10) 9,93 99,38 0,62-0,62 Subcapitolul 6.2 a avut drept scop dezvoltarea şi validarea unei metode sensibile și rapide de separare, identificare şi cuantificare a bisoprololului fumarat prin HPLC, folosind o coloană Zorbax SB-C18 RP.

0.588 0.817 0.409 1.157 0.410 1.157 În urma studierii parametrilor au fost stabilite următoarele condiții cromatografice: - fază mobilă formată din amestecul CH 3 CN: KH 2 PO 4 (ph=3,5) raport 30:70; coloană cromatografică Zorbax SB-C18 100 3 mm, cu dimensiunea particulelor 3,5 µm; - debit fază mobilă: 1 ml/min; detecție la lungimea de undă de absorbție λ= 225 nm; - eluție izocratică; temperatura coloanei 29 C; t R = 1,158 (fig.6.13). mau DAD1 A, Sig=225,4 Ref=450,80 (BISOPRO\BF000066.D) DAD1 A, Sig=225,4 Ref=450,80 (BISOPRO\BF000065.D) 400 300 200 100 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 Fig. 6.13. Stabilirea timpului de retenție min Metoda a fost validată conform reglementărilor de validare recomandate pentru metodele HPLC, dovedindu-se a fi specifică, liniară, exactă şi fidelă pe domeniul de concentraţii 5 µg/ml și 90 µg/ml BF. Valoarea RSD% la studiul preciziei metodei a avut o valoare mai mică de 2% atât pentru repetabilitate cât și pentru precizia intermediară. Pentru estimarea exactității s-a determinat regăsirea pentru un număr de trei probe la trei nivele de concentrație diferite, obținându-se regăsirea medie = 99,79% pe intervalul 97,34-101,04% și RSD% = 1,05. Metoda HPLC astfel dezvoltată şi validată a fost aplicată la dozarea BF din comprimatele filmate de 5 și 10 mg. Conţinutul de substanţă activă regăsită a fost în acord cu prevederile farmacopeilor în vigoare (tabel 6.40.). Nr. crt. Tabel 6.40. Date experimentale obținute la analiza bisoprololului din comprimate Concentrația Concentrația calculată Regăsire RSD declarată BF BF pe comprimat (mg) BF (% ) (%) (mg/comprimat) n=3 Abatere (mg) 1 P 1 (5) 4,97 99,40 0,77-0,6 2 P 2 (10) 9,95 99,50 0,62-0,5 14

EVALUAREA IN VITRO A UNOR HIDROGELURI CA SISTEME CU ELIBERARE CONTROLATĂ A BISOPROLOLULUI FUMARAT Capitolul șapte a avut ca scop evaluarea in vitro a unor hidrogeluri pe bază de poli(vinil alcool)/chitosan (PVA/CS) și xantan/lignină epoximodificată (X/L) din punct de vedere al capacității de încărcare/eliberare a bisoprololului fumarat, în vederea stabilirii unor eventuale aplicații ale acestora în industria farmaceutică ca sisteme de transport și eliberare controlată a medicamentelor. Astfel în subcapitolul 7.1. au fost testate hidrogeluri constituite din amestecuri de chitosan (CS) și poli(vinil alcool) (PVA) în diferite rapoarte masice. Curbele de umflare ale hidrogelurilor cu diferite compoziții PVA/CS (cu și fără liofilizare) în apă bidistilată la o temperatură de 37 C sunt prezentate în fig.7.1. și fig. 7.2.. Fig. 7.1. Comportamentul la umflare al hidrogelurilor obținute fără liofilizare în apă bidistilată la 37 C Fig. 7.2. Comportamentul la umflare al hidrogelurilor obținute prin liofilizare în apă bidistilată la 37 C 15

Medicament eliberat (%) Medicament eliberat (%) Hidrogelurile PVA/CS testate au avut capacitate ridicată de reținere a apei, gradul maxim de umflare variind cu compoziția matricei polimerice. Datele obținute la înglobarea BF au arătat o corelație între gradul de umflare și cel de încărcare cu medicament. Hidrogelurile obținute prin liofilizare datorită porozității mai accentuate permit o mai bună difuzie a medicamentului în structura lor. Profilele eliberării bisoprololului în condiții ce mimează mediul biologic din matricele cu și fără liofilizare sunt reprezentate în fig. 7.5. și fig. 7.6. 70 60 50 40 PVA/CS 80/20 PVA/CS 95/5 PVA/CS 60/40 PVA/CS 90/10 37 o C / ph 7.4 30 20 10 0 00:00 01:30 03:00 04:30 06:00 07:30 12:00 24:00 36:00 48:00 60:00 72:00 Timp (ore) Fig 7.5. Variația în timp a eficienței eliberării BF din hidrogeluri PVA/CS fără liofilizare 40 35 30 25 PVA/CS 95/5 PVA/CS 90/10 PVA/CS 80/20 PVA/CS 60/40 37 o C / ph 7.4 20 15 10 5 0 00:00 01:30 03:00 04:30 12:00 24:00 36:00 48:00 60:00 72:00 Timp (ore) Fig 7.6. Variația în timp a eficienței eliberării BF din hidrogeluri PVA/CS obținute prin liofilizare Din punct de vedere cinetic eliberarea BF din matricele polimerice PVA/CS prezintă o eliberare în trepte și întârziată a agentului terapeutic. Procesul de eliberare manifestă un burst effect relativ la fel de intens pentru toate sistemele studiate. Acest burst effect este mai pronunțat în cazul hidrogelurilor cu cantități mai mari de chitosan. 16

Grad de umflare(%) Subcapitolul 7.2. a avut ca scop evaluarea in vitro a unor noi sisteme cu eliberare controlată a bisoprololului fumarat sub formă de hidrogeluri constituite din amestecuri de xantan (X) și lignină (L) în diferite rapoarte masice. S-a urmărit înglobarea și eliberarea principiului activ din matricele polimerice precum și evaluarea cinetică a rezultatelor obținute. Curbele de umflare ale hidrogelurilor cu diferite compoziții X/L în apă bidistilată la temperatura camerei sunt prezentate în fig. 7.7.. 50 40 30 X/L 80/20 X/L 70/30 X/L 90/10 X/L 65/35 20 10 0 0 10 20 30 40 50 60 Timp (min) Fig. 7.7. Gradul de umflare funcție de timp a hidrogelurilor X/L la temperatura camerei Parametri cinetici de umflare pentru probele supuse testării sunt redați în tabelul 7.6.. Proba Tabel 7.6. Parametri cinetici de umflare 17 Parametrii cinetici n k (min -1 ) X/L 90/10 0,51 0,31 X/L 80/20 0,38 0,20 X/L 70/30 0,46 0,21 X/L 60/40 0,34 0,19 Calculul gradului de încărcare cu bisoprolol a hidrogelului s-a realizat pe baza curbei de calibrare obținută prin reprezentarea grafică a extincției funcție de concentrația de medicament din supernatant (tabel 7.7). Tabel 7.7. Cantitatea de medicament încărcată Cod probă mg medicament încărcat determinat prin metoda UV-Vis X/L 90/10 3,61 X/L 80/20 3,70 X/L 70/30 4,10 X/L 65/35 4,38

Eficienta eliberarii (%) Procesul de încărcare a medicamentului în rețelele polimerice pe bază de xantan și lignină a prezentat o influență dependentă de compoziția hidrogelurilor. S-a observat o creștere a capacității de încărcare în rețele odată cu scăderea conținutului de xantan (tabel 7.7.). Poate fi concluzionat că lignina are o capacitate sporită de a încorpora medicamentul. Profilul eliberării bisoprololului în condiții ce mimează mediul biologic este reprezentat în fig. 7.10.. 100 90 37 o C / ph 7.4 80 70 60 50 40 30 20 10 90X/10L 80X/20L 70X/30L 65X/35L 0-2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 1000 2000 3000 4000 Timp (min) Fig. 7.10. Profilul de eliberare a BF în timp din structura rețelelor X/L Parametri cinetici de eliberare estimați cu modelul matematic propus de Korsmeyer-Peppas sunt redați în tabelul 7.8.. Tabel 7.8. Parametrii cinetici de eliberare a BF din hidrogelurilor pe bază de X/L Cod probă n k, min -n r 2 X/L 90/10 0,48 0,13 0,998 X/L 80/20 0,42 0,25 0,999 X/L 70/30 0,72 0,32 0,999 X/L 65/35 0,41 0,19 0,997 r 2 = factorul de corelație, n = exponent de difuzie, k = viteza de difuzie Rețelele polimerice 90X/10L, 80X/20L, 65X/35L prezintă o cinetică de eliberare de ordinul 0,5, dependentă de compoziția hidrogelurilor, ceea ce sugerează un mecanism de difuzie conform legii lui Fick adică eliberarea medicamentului are loc cu o viteză egală cu viteza de relaxare a lanțurilor polimerice (tabel 7.8.) Hidrogelul 70X/30L are valoarea n egală cu 0,72 ceea ce sugerează o comportare ce nu respectă legea lui Fick în ceea ce privește eliberarea medicamentului. Acest fapt arată că procesul de eliberare este controlat și de alți factori în afară de difuzie iar eliberarea medicamentului are loc cu o viteză mai mare decât viteza de relaxare a lanțurilor polimerice. 18

CONCLUZII GENERALE Teza de doctorat intitulată Dezvoltarea unor metode analitice de determinare a bisoprololului. Validare și aplicații prezintă cercetările realizate în scopul instituirii și aplicării în practică a unor noi metode de dozare a bisoprololului fumarat precum și testarea unor hidrogeluri PVA/CS și X/L ca transportori în vederea eliberării controlate a substanței antihipertensive studiate. Concluziile desprinse în urma cercetărilor sunt prezentate succint în cele ce urmează. Cercetările întreprinse de noi privind caracterele analitice ale bisoprololului au condus la instituirea a noi metode de dozare a bisoprololului bazate pe caracterul acido-bazic al acestuia și a capacității sale de a forma prin protonare cationi capabili de a se asocia cu anioni voluminoși; Au fost elaborate 4 metode spectrofotometrice din care: -trei metode spectrofotometrice sunt bazate pe formarea unor asociații ionice extractibile în solvenți organici nepolari; -o metodă spectrofotometrică se bazează pe formarea unui complex ionic solubil în mediul de formare cu acidul picric. Datele experimentale și considerentele teoretice au arătat că procesul de formare al complecșilor se datorează protonării bisoprololului la gruparea amino secundară în mediu acid în prezența indicatorului. Acest lucru permite apariția unor cromofori în structura ionilor existenți în asocierile ionice formate care explică schimbarea de culoare. Pentru a evalua performanțele analitice ale metodelor spectrofotometrice realizate acestea au fost comparate cu datele din literatura de specialitate. S-a observat faptul că metoda de dozare a bisoprololului cu tropeolina 00, este mai perfomantă din punct de vedere analitic în comparație cu cea prezentată în literatură, având un domeniu de liniaritate mărit și fiind capabilă să detecteze bisoprololul la un nivel mai scăzut (de 0,67 μg/ml față de 0,99 μg/ml). Metoda cu metiloranjul este mai sensibilă, sugerând faptul că această metodă este optimă pentru analiza cantităților mici de substanță activă. Metoda de deteminare cu verde de bromcrezol, prezintă un domeniu liniar de aplicabilitate mai generos față metodele din literatură (domeniu liniar fiind între 7,0 80,0 μg/ml). Metoda bazată pe reacția de culoare cu acidul picric, prezintă cel mai mare domeniu care este cunoscut până la ora actuală între 5 120 μg/l și cu o limită de detecție mai mică decât metodele analitice publicate înainte de realizarea acestui studiu (0,89 μg/ml). Au fost instituite două metode cromatografice de lichide de înaltă performanță pentru separarea și dozarea bisoprololului. Metodele au fost 19

validate conform reglementărilor de validare recomandate pentru metodele HPLC, dovedindu-se a fi specifice, liniare, exacte, iar aplicabilitatea metodelor a fost demonstrată prin analiza bisoprololului fumarat din diverse produse farmaceutice și prin testul de dizolvare al comprimatelor. S-a constatat că toate metodele de analiză cantitativă, instituite pentru BF, prezintă valori ale coeficienților de corelație și de regresie foarte apropiate de unitate, așa cum cer normele europene. Pentru cele șase metode a fost evaluată liniaritatea rezultatelor, constatând că valorile calculate indică o dependență liniară între concentrația regăsită conform dreptei de calibrare și concentrația introdusă teoretic. S-a constatat de asemenea că RSD% are o valoare mai mică de 2% deci metodele sunt precise. Deoarece regăsirea medie a metodelor se află în intervalul 95-105% se poate afirma că metodele studiate sunt exacte. Au fost testate hidrogeluri PVA/CS și X/L ca matrice pentru includerea BF- medicament hidrosolubil - în formă liberă. Acestea prezintă capacitate diferită de reținere a apei, în funcție de compoziția matricei polimerice. Pentru descrierea cineticii de eliberare a BF din toate hidrogelurile studiate s-a apelat la modelul Peppas. Acest model a permis elaborarea unor ipoteze privind mecanismul de transport al BF ca exponent al unui medicament hidrosolubil, din matricele în care a fost inclus. La înglobarea BF în hidrogeluri s-a observat o corelație între gradul de umflare și cel de încărcare cu medicament. Eliberarea BF din matricele polimerice PVS/CS prezintă o eliberare în trepte și întârziată a agentului terapeutic iar parametrii cinetici evaluați indică un proces de eliberare controlat și de alți factori în afară de difuzie. Capacitatea de încărcare a hidrogelurilor cu substanța medicamentoasă fost mai eficientă în cazul hidrogelurilor X/L și procentul de substanță activă încapsulată a fost direct proporțional cu compoziția acestora. Eliberarea fumaratului de bisoprolol inclus prin difuzie în hidrogeluri pe bază de X/L se realizează cu un burst effect pronunțat, apoi cu viteză relativ constantă. Cinetica de eliberare este de ordinul 0,5 ceea ce sugerează un mecanism de difuzie ce respectă legea lui Fick. Din punct de vedere al potențialelor aplicații în domeniul farmaceutic, hidrogelurile evaluate au arătat că au capacitatea de a încorpora, transporta și elibera controlat principiul activ și, ca urmare aceste sisteme pot fi folosite ca suport cu eliberare controlată și a altor medicamente. Rezultatele prezentate aduc o contribuție importantă la analiza bisoprololului cu posibilitatea extinderii studiului la noi substanțe betablocante sau din alte clase terapeutice. Considerăm că, prin studiul întreprins am reușit să atingem obiectivele propuse inițial, iar prin rezultatele obținute să aducem o 20

contribuție reală la analiza bisoprololului fumarat din produse farmaceutice sub formă de comprimate filmate, cu posibilitatea de a extinde sfera de aplicare a acestora și la determinarea bisoprololului fumarat din medii biologice. Perspective de cercetare 1.Aplicarea metodelor de determinare dezvoltate și validate la analiza bisoprololului fumarat din produse farmaceutice în care este asociat cu alte substanțe medicamentoase cum sunt amlodipina sau hidroclorotiazida. 2.Aplicarea metodelor de determinare cantitativă elaborate pentru analiza bisoprololului fumarat din medii biologice (ser, urină, plasmă, lapte matern etc.). 3.Potențiala utilizare a hidrogelurilor evaluate pentru administrarea transdermică a bisoprololului fumarat sugerează necesitatea continuării studiilor pentru optimizarea sistemelor testate, prin caracterizarea interacțiunilor specifice dintre matrice și substanța activă, respectiv a biodisponibilității acesteia in vitro și in vivo. 21

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ 3. Cruickshank JM, Prichard BNC. Beta-adrenoceptors. În: Cruickshank JM, Prichard BNC, eds. Beta-blockers in clinical practice. London: Churchill Livingstone; 1996, 9-86. 5. Frishman WH, Sica DA. β-adrenergic blockers. În: Izzo JL Jr, Sica D, Black HR, eds. Hypertension Primer: The Essentials of High Blood Pressure, 4th ed. Philadelphia: Wolters Kluwer/Lippincott Williams & Wilkins; 2008, 446 450. 7. Cleophas TJ. Pressor responses from noncardioselective beta-blockers. În: T.J. Cleophas. Beta-blockers in hypertension and angina pectoris: different compounds, different strategies. Dordrecht: Kluwer Academic Publishers, 1995, 5-13. 8. Beta-blockers: Are they useful in arrhythmias?. Deshpande S, Lokhandwala Y, Panicker GK. JAPI.org 2009. http://www.japi.org/special_issue_2009/article_10.html, 2013. 10. Toda N. Vasodilating β adrenoceptor blockers as cardiovascular therapeutics. Pharmacoll Ther 2003; 100(3): 215-234. 12. Shin J, Johnson JA. Beta-blocker pharmacogenetics in heart failure. Heart Fail Rev 2010; 15(3): 187-96. 16. Silberstein SD, Holland S, Freitag F et all. Evidence-based guideline update: pharmacologic treatment for episodic migraine prevention in adults: report of the Quality Standards Subcommittee of the American Academy of Neurology and the American Headache Society. Neurology 2012; 78(17): 1337-1345. 17. Saxena R, Prakash J, Mathur P, Gupta SK. Pharmacotherapy of glaucoma. Indian J Pharmacol 2002; 34: 71-85. 19. Erbel(Chairman) R, Alfonso F, Boileau C et all. Diagnosis and management of aortic dissection. Eur Heart J 2001; 22: 1642-1681. 21. Geffner DL, Hershman JM. Beta-adrenergic blockade for the treatment of hyperthyroidism. Am J Med 1992; 93(1): 61-68. 23. Aftab W, Varadarajan P, Rasool S et all. Beta and angiotensin blockades are associated with improved 10-year survival in renal transplant recipients. J Am Heart Assoc 2013; 2(1): e000091. doi: 10.1161/JAHA.112.000091. 24. Luong KV, Nguyen LT. The roles of beta-adrenergic receptors in tumorigenesis and the possible use of beta-adrenergic blockers for cancer treatment: possible genetic and cell-signaling mechanisms. Cancer Manag Res 2012; 4: 431-445. 28. The British Pharmacopoeia 2012. http://bp2012.infostar.com.cn/bp2012, 2013. 70. Yang XM, Wang CB. Determination of bisoprolol în urine by fluorimetry. Fenxi Shiyanshi 2001; 20: 54 55. 22

71. Ulu ST, Kel E. Spectrophotometric determination of bisoprolol in pharmaceutical preparations by charge transfer reactions1. Opt Spectrosc 2012; 112: 864 867. 78. Hefnawy MM, Maha SultanMAA, Mohamed Al-Shehri MM. Enantioanalysis of Bisoprolol în Human Plasma with a Macrocyclic Antibiotic HPLC Chiral Column Using Fluorescence Detection and Solid Phase Extraction. Chem Pharm Bull 2007; 55(2): 227-230. 118. Kakde RB, Kotak VH, Kale DL. High performance thin layer chromatographic method for simultaneous estimation of amlodipine besilate and bisoprolol fumarate in pharmaceutical preparations. Pharma Rev 2008; 6: 168-170. 124. Liu YM,Yang Y, Li J, Du JJ. Capillary electrophoresis separation and sensitive electrochemiluminescence determination of β-blockers and study on interaction between human serum albumin and the drug. Anal Methods 2012; 4(8): 2562-2568. 130. Iorio MA, Mazzeo FA, Doldo A. Quantitative analysis of betaadrenergic blocking agents by NMR spectroscopy. J Pharm Biomed Anal 1987; 5: 1-10. 141. Vipin Bansal V, Sharma PK, Sharma N, Prakash Pal O, Malviya R. Applications of Chitosan and Chitosan Derivatives in Drug Delivery. Advan Biol Res 2011; 5(1): 28-37. 142. Agnihotri SA, Aminabhavi TM. Novel interpenetrating network chitosan-poly(ethylene oxide-g-acrylamide) hydrogel microspheres for the controlled release of capecitabine. Int J Pharm 2006; 324(2):103-115. 143. Patel NV. Formulation and in-vitro evaluation Stability of Chitosan of mesalamine matrix tablets using chitosan for colonic drug delivery. J Pharmacy Res 2009; 2(8): 1319-1323 144. Kamel A, Sokar M, Naggar V, Gamal S. Chitosan and sodium alginatebased bioadhesive vaginal tablets. AAPS Pharm Sci 2002; 4(4): 224-230. 145. Chadha R; Bhandari, Swati; Kataria, Darpan; Gupta, Sushma. Exploring Lecithin/Chitosan Nanoparticles of Ramipril for Improved Antihypertensive Efficacy. J. Nanopharmaceutics Drug Delivery 2013; 1(2): 173-181. 146. Sarath Chandran C, Shijith KV, Vipin KV, Augusthy AR. Chitosan Based Mucoadhesive Buccal Patches Containing Bisoprolol Fumarate. IJAPBC 2013; 2(3): 465-469. 150. Alhosseini N et al. Synthesis and characterization of electrospun polyvinyl alcohol nanofibrous scaffolds modified by blending with chitosan for neural tissue engineering. Int J Nanomedicine 2011; 6: 3509-3518. 153. Ramasamy T, Subbaih Kandhasami UD, Ruttala H, Shanmugam S. Formulation and evaluation of xanthan gum based aceclofenac tablets for colon targeted drug delivery. Braz J Pharm Sci 2011; 47(2): 299-311. 23

155. Betram U, Bodmeier R, În situ gelling, bioadhesive nasal inserts for extended drug delivery: in vitro characterization of a new nasal dosage form. Eur J Pharm Sci 2006; 27: 62-71. 156. Kara R, Mohapatraa S, Bhanjaa S et all. Formulation and În Vitro Characterization of Xanthan Gum-Based Sustained Release Matrix Tables of Isosorbide-5- Mononitrate. IJPR 2010; 9(1): 13-19. 157. Muqtader M, Ali S. Development of famotidine buoyant drug delivery system using natural polymers. IJB 2012; 3(1): 17-21. 160. Ciolacu D, Doroftei F, Cazacu G, Cazacu M. Morphological and surface aspects of cellulose-lignin hydrogels. Cellulose Chem Technol 2013; 47(5-6): 377-386. 161. Mitjans M, Vinardell MP. Biological activity and health benefits of lignans and lignins. Trends in Comp Biochem Physiol Trends 2005; 11:55-62. 163. Sakagami H, Satoh K, Fukamachi H et all. Anti-HIV and vitamin C- synergized radical scavenging activity of cacao husk lignin fractions. În vivo 2008; 22: 327-332. 165. ICH harmonised tripartite guideline validation of analytical procedures: text and methodology Q2, http://www.ich.org/fileadmin/public_web_site/ich_products/guideline s/quality/q2_r1/step4/q2_r1 Guideline.pdf, 2013 172. Validation of analytical procedures: Methodology, International Conference on Harmonisation, Federal Register 1997, 62(96): 27463-27467. 173. Roman L, Bojiță M, Săndulescu S. Validarea metodelor de analiză și control, Ed. Medicală, Cluj Napoca, 1998. 174. Validation of analytical procedures: Methodology, International Conference on Harmonisation, Federal Register 1997, 62(96): 27463 27467. 175. ICH Topic Q2B: Validation of Analytical Procedures (CPMP/ICH/281/95), The European Agency for the Evaluation of Medicinal Products. 24

Diseminarea rezultatelor obținute Lucrări științifice 1. Panainte AD, Bibire N, Țântaru G, Apostu M, Vieriu M, Dorneanu V. A New Method for the assay of bisoprolol using bromocresol green. Rev Chim (Bucharest) 2014; 65(8): 916-920. (ISI, FI=0,677) 2. Panainte AD, Bibire N, Țântaru G, Apostu M, Vieriu M, Dorneanu V. Spectrophotometric method for estimation of bisoprolol fumarat in tablets. Rev Med Chir Soc Med Nat Iași 2014; 118(2): 558-562. (B + ). 3. Gudruman (Panainte) AD, Bibire N, Țântaru G, Mihai Apostu M, Vieriu M, Dorneanu V. Validation of a new spectrophotometric method for the assay of bisoprolol fumarate using tropaeolin 00. Rev Chim (Bucharest) 2013; 64(4): 393-396. (ISI, FI=0,677) 4. Panainte (Gudruman) AD, Bibire N, Tantaru G, Apostu M, Vieriu M. Validation of a spectrophotometric assay method for bisoprolol using picric acid. Rev. Rev Med Chir Soc Med Nat Iași 2013; 117(2): 520-524. (B + ). 5. Gudruman AD, Murărașu A, Dorneanu V. Spectrophotometric determination of bisoprolol using methyl orange as reagent. Farmacia 2012; 60(5): 634-641. (ISI, FI=0,669) Comunicări de tip poster 5. 1. Panainte (Gudruman) AD, Țântaru G, Mihai Apostu M, Vieriu M, Bibire N. Spectrophotometric determination method for bisoprolol in pharmaceutical preparations. 16th Panhellenic Pharmaceutical Conference, mai 2013. Atena, Grecia. 2. Gudruman AD, Bibire N, Țântaru G, Apostu M, Vieriu M, Dorneanu V. Dosage spectrophotometrique du bisoprolol par bromocresol vert. Colloque franco-roumain de chimie applique COFrRoCA Bacău, România, 2012. 3. Gudruman AD, Bibire N, Țântaru G, Mihai Apostu M, Vieriu M, Dorneanu V. Determinarea spectrofotometrică în vizibil a bisoprololului din comprimate. 50 de ani învățământ universitar farmaceutic la Iași 2011. Iași, România. 4. Gudruman AD, Țântaru G, Bibire N, Apostu M, Vieriu M, Dorneanu V. Spectrophotometric assay of bisoprolol using picric acid. 15 th Panhellenic Pharmaceutical Congress, mai 2011. Atena, Grecia. 25