RAPORT DE CERCETARE (Selecţie)

Proiect 41-046: Subpopulaţiile celulare NK-bright, NK-dim şi glicoproteinele din familia tetraspaninelor: imunomodulatori implicaţi în invazia şi metastazarea tumorală (NKSPAN) RAPORT DE CERCETARE (Selecţie) ETAPA A II-A (30.VII.2008) - Evaluări celulare şi determinarea subgrupelor NK din sângele periferic Conducător proiect: I.N.C.D. VICTOR BABEŞ BUCUREŞTI, Director proiect: DR. CORNEL URSACIUC Pagini web: - I.N.C.D. Victor Babeş : HUwww.vbabes.roU - Proiect NKSPAN: HUhttp://www.vbabes.ro/pages/ro/00_ivb/proiecte/pncdi/nkspan/nkspan.htmlU

I. REZUMAT Proiectul propune investigaţia în tumorile maligne a două grupe de factori imunomodulatori ai dezvoltării tumorale, subpopulaţiile celulare NK-CD56 bright şi NK- CD56 dim/neg şi glicoproteinele din familia tetraspaninelor (CD9, CD37, CD53, CD63, CD81, CD82). De la debutul proiectului, am realizat un lot de studiu de 14 subiecţi cu tumori maligne şi un lot de 6 subiecţi normali (martori). Au fost utilizate materiale biologice umane pentru obţinere de celule NK: sânge integral, ţesut tumoral, placentă. Au fost efectuate testele imunologice (imunofenotipare, caracterizarea populaţiilor celulare NK), determinându-se procentelor populaţiilor şi subpopulaţiilor celulare din sângele periferic cu ajutorul unor markeri specifici de membrană (limfocite T totale-cd3+, T helper- CD4+, T supresoare/citotoxice -CD8+, B-CD19+, NK-CD16+CD56+). S-a efectuat separare în gradient de densitate Histopaque şi magnetică negativă şi pozitivă la aparatul VarioMACS (Miltenyi Biotech), pentru sânge şi suspensii celulare tumorale şi placentare. Analiza expresiei markerilor celulari a fost efectuată în prezenta etapă numai pe suspensiile separate din sânge. Determinările au fost realizate prin citometrie în flux 4 culori în sistem manual CellQuest la citometrul FACSCalibur (BD). Au fost evaluaţi următorii markeri: CD3, CD56, CD57, CD16, KIR, tetraspanine (TS: CD9, CD37, CD53, CD63, CD81, CD82). Suspensia celulară utilizată a fost obţinută după separarea 2 VarioMACS. Rezultatele au fost exprimate în procente de celule NK pozitive pentru combinaţiile de markeri CD56/CD57, CD57/CD16, CD57/KIR, CD57/TS. Imunofenotiparea limfocitară a relevat lipsa de diferenţe semnificative între martori şi pacienţi în privinţa limfocitelor T şi B, cu creşterea celulelor NK la pacienţi. Nivelul de îmbogăţire a suspensiei NK în urma separărilor magnetice a fost de 10 ori faţă de separarea în gradient, procentul de celule NK din suspensia finală fiind de ~85%. Grupul celulelor NK-CD57- a fost uşor crescut la subiecţii normali, în sânge şi suspensie. S-au relevat valori mai crescute la martori pentru celulele CD16+ şi valori mai crescute la pacienţi pentru celulele CD16-. Subpopulaţia CD57+ este în marea majoritate CD16+, cu repartiţie aproape identică la martori şi pacienţi.

Date teoretice: - Celulele NK ( Natural Killer ) sunt componente ale sistemului imun înnăscut, având rol în apărarea împotriva infecţiilor virale şi dezvoltării tumorale. Reprezintă 5-20% din mononuclearele din sânge şi splină, fiind definite prin prezenţa antigenului CD56 şi lipsa CD3. Recent s-a constatat că populaţia NK este eterogenă, cuprinzând subseturi CD56 bright şi CD56 dim (CD56 dim/neg ) cu proprietăţi fenotipice şi funcţionale distincte: - Subsetul CD56 bright reprezintă 10% din NK circulante şi se caracterizează prin fenotip CD16 +/ KIR +/, CD57, activitate citolitică redusă şi puţine granule citotoxice. Predomină (>90%) în ganglionii limfatici (GL) (în zona celulelor T) şi în tonsile. Se sugerează că NK-CD56 bright ar fi mai puţin mature în schema evolutivă a celulelor NK (Ferlazzo, 2004). - Subsetul NK-CD56 dim este majoritar în sângele periferic (>95%) şi în splină (>85%), prezentând fenotip CD16 +, CD57 +, KIR +, perforină, receptori de citotoxicitate naturală (NCR: NKp30 şi NKp46) şi granule citolitice din abundenţă. - Celulele NK uterine (unk) sunt prezente în endometrul uman, fără referire la existenţa sarcinei. Au expresie fenotipică CD56 +, CD3, CD57, CD9 +, CD94 +, KIR +. Celulele NK deciduale (dnk) derivă din unk, dar sunt prezente în etapele iniţiale ale sarcinei şi diminuează după săptămâna 20, fără a se mai regăsi în decidua la termen. Celulele unk diferă de NK din sângele periferic prin setul de gene exprimate: tetraspanina (TS) CD9, galectina-1 şi glicodelina A (potenţiali markeri de diferenţiere) sau supraexprimate (integrine, receptori lectin-like, KIR). Tetraspaninele (TS) sunt exprimate pe toate celulele sistemului imun. TS CD9, CD37, CD53,CD63, CD81 se asociază cu moleculele MHC-II, în timp ce CD82 interacţionează şi cu MHC-I. TS sunt asociate cu invazivitatea şi metastazarea celulelor tumorale, influenţând adeziunea şi motilitatea acestora. Există diferenţe de expresie a TS la nivelul tumorilor primare şi metastazelor, fiind găsite corelaţii ale prezenţei TS cu stadiul tumoral şi apariţia metastazelor în mai multe boli maligne: cancer de sân, colon, plămân, ovar, leucemie limfocitară cronică cu celule B. TS au fost propuse ca markeri în detectarea micrometastazelor din melanom în ganglionii santinelă. Trei membri ai familiei TS (CD151, CD9 şi TS-5) sunt exprimaţi numai pe celulele dnk (nu şi pe NK periferice), iar CD53 şi CD63 sunt supraexprimate, cu implicaţii în migrarea sau adeziunea celulară.

II. METODOLOGIE 1. Stabilirea şi evaluarea loturilor de cazuistică 2. Materialul biologic a. Sângele Sângele a fost recoltat de la subiecţi normali şi pacienţi cu tumori maligne. Pentru activităţile efectuate în această fază, s-a utilizat sânge integral recoltat în vacutainere cu EDTA. Sângele a fost procesat prin marcare cu anticorpi monoclonali fluorocromaţi în vederea fenotipării limfocitare, sau a fost introdus în sistemul de separare prin gradient de densitate şi magnetică. b. Ţesutul tumoral Fragmentele tumorale au fost recoltate prin prelevare intraoperatorie. c. Placenta Pentru studiile efectuate am folosit placente umane obţinute de la maternitatea Spitalului Caritas. d. Extractul placentar Metoda de obţinere a preparatului placentar folosit în diagnosticarea proceselor proliferative maligne a fost brevetată şi publicată (9300526/A; BOPI/1 1995, 30 01 1995). Preparatul astfel obţinut a fost supus la rândul lui analizei în vederea omogenizării şi identificării fracţiunilor active. 3. Imunofenotiparea limfocitară În Laboratorul Imunopatologie din Institutul Naţional Victor Babeş (CO) au fost practicate testele imunologice (imunofenotipare, caracterizarea populaţiilor celulare NK). Prin imunofenotipare s-au evaluat cantitativ şi funcţional limfocitele din sângele periferic de la 14 pacienţi cu tumori maligne şi 6 subiecţi normali. Metodologia evaluărilor cantitative şi funcţionale ale populaţiilor celulare din sângele periferic constă în următoarele etape: recoltarea sângelui de la pacient pe anticoagulant (EDTA) marcarea celulelor din sânge cu anticorpi monoclonali specifici fluorocromaţi pentru markerii subpopulaţiilor celulare. Anticorpii sunt individuali sau sub formă de trusă de imunofenotipare (MultiTest IMK Kit - BD) analizarea fluorescenţei celulare la citometrul de flux FACSCalibur (Becton-Dickinson, SUA) interpretarea computerizată automată a datelor achiziţionate

Analiza fluorescenţei celulare la citometrul de flux s-a efectuat prin metodologia pe 4 culori (anticorpi marcaţi cu 4 fluorocromi) pentru grupe celulare evaluate prin programele de achiziţie/analiză MultiTEST şi CellQuest. Rezultatele se exprimă în procente de populaţii celulare conform markerilor testaţi. Aprecierea rezultatelor s-a efectuat prin comparaţie cu valorile normale ale populaţiilor şi subpopulaţiilor celulare în funcţie de vârsta pacientului. 4. Separarea celulelor NK-CD56 + CD16 + S-a efectuat separare în gradient de densitate şi magnetică la aparatul VarioMACS (Miltenyi Biotech). Procedura a fost aplicată pe sânge şi suspensii celulare tumorale şi placentare şi a constat în 3 etape de separare (Tabel I): - separare în gradient de densitate Histopaque - separare magnetică negativă - separare magnetică pozitivă 5. Caracterizarea fenotipică a celulelor NK Analiza expresiei markerilor celulari a fost efectuată în prezenta etapă numai pe suspensiile separate din sânge. Determinările au fost realizate prin citometrie în flux 4 culori în sistem manual CellQuest la citometrul FACSCalibur (BD). Au fost evaluaţi următorii markeri: CD3, CD56, CD57, CD16, KIR, Tetraspanine (TS) (CD9, CD37, CD53, CD63, CD81, CD82). Suspensia celulară utilizată a fost obţinută după separarea 2 VarioMACS (Tabel III).

III. REZULTATE (Sumar) 1. Caracteristicile clinice ale loturilor de pacienţi Tabel IV - Parametri clinici si paraclinici de evaluare înregistraţi la cazuistică 16BParametri 17BRaport caz/nr.total cazuri 1BHb< normal 10/14 2BBilirubina>normal 3B5/14 4BTransaminaze >normal 5B4/14 0BTeste de laborator 6BCreatinina>normal 7B5/14 8BLeucocitoza> normal 6/14 9BCoagulograma< normal 5/14 10BTumora abdominala 3/14 11BSemne paraneoplazice 12/14 12BPrezenta ascitei 9/14 13BDebut aparent clinic al bolii >3 luni 10/14 14BSindrom febril 3/14 15BTulburari de tranzit 10/14 2. Rezultatele imunofenotipării limfocitare Imunofenotiparea limfocitară a fost efectuată la toţi pacienţii intraţi în studiu. Rezultatele sunt prezentate în fig.1. a. Valori limfocitare procentuale b. Valori limfocitare absolute martori cazuri martori cazuri 80 1800 70 1600 60 1400 50 1200 40 1000 30 800 20 10 600 400 200 0 T Th Ts Th/Ts B NK 0 T Th Ts B NK Fig. 1 Imunofenotiparea limfocitară în valori procentuale (a) şi absolute (b)

Nu au fost constatate diferenţe semnificative între martori şi pacienţi în ceea ce priveşte populaţiile limfocitare T şi B. Unele diferenţe există la celulele NK, media pacienţilor fiind crescută faţă de media subiecţilor normali, atât procentual, cât şi ca valoare absolută. 3. Evaluarea separării celulelor NK Eficienţa combinării separării în gradient cu separarea magnetică constă în alternanţa tipurilor de selecţie celulară. Separarea în gradient realizează o selecţie negativă pe bază de greutate celulară, limfocitele situându-se la un nivel diferit de al monocitelor, polimorfonuclearelor şi hematiilor. Totuşi, ponderea celulelor NK este mai mică decât cea obţinută la evaluarea prin citometrie în flux a sângelui total. Suspensia limfocitară obţinută prin recoltarea benzii de limfocite a fost supusă unei noi selecţii negative, de data aceasta cu bile magnetizate cuplate cu anti-non-nk (eritroide,t, B, stem, dendritice, monocite, granulocite), îndepărtându-se celulele non-nk. Astfel, suspensia a fost îmbogăţită în celule NK, procentul acestora fiind mai mare de 5 ori fată de suspensia iniţială rezultată din separarea în gradient (45% faţă de 9%, Tabel VI). Ultima selecţie a fost pozitivă, prin reţinerea celulelor CD16+ pe bile magnetizate cuplate cu anti- CD16. Nivelul de îmbogăţire a crescut de 2 ori faţă de precedenta selecţie, astfel că în final procentul de celule NK CD56 + CD16 + în suspensia finală a fost în jur de 85% (Tabel VI, Fig.3). Tabel VI Eficienţa separărilor succesive ale celulelor NK Separare Tip selecţie Celule separate % celule NK* Citometrie în flux pozitivă Celule NK 16 ± 5 Gradient pozitivă Limfocite 9 ± 2 VarioMACS 1 negativă celule non-nk 45 ± 19 VarioMACS 2 pozitivă Celule NK* 85 ± 5 * Rezultatul a 5 experimente

Suspensia finală rezultată după ultima selecţie a fost ulterior utilizată pentru caracterizarea celulelor NK din punct de vedere al distribuţiei markerilor principali şi a prezenţei membranare a TS. Suspensie 1 separare prin gradient de densitate Suspensie 2 separare VarioMACS negativă Suspensie 3 separare VarioMACS pozitivă CD16 CD16 CD16 CD56 CD56 CD56 9% 45% 85% Fig.3 Aspectul la citometria în flux (dot-plot) al suspensiilor separate succesiv 4. Caracterizarea markerilor principali ai celulelor NK Subpopulaţiile NK CD56 bright şi CD56 dim prezintă diferenţe fenotipice în privinţa markerilor membranari CD57 şi CD16. Deşi nu este statutat, grupul celular caracterizat prin distribuţia CD57-CD16- pare a reprezenta mai bine subpopulaţia NK CD56 bright. De aceea, studiul nostru a urmărit cu precădere identificarea acestei subpopulaţii în funcţie de distribuţia markerilor citaţi. Distribuţiile populaţiei NK-CD57+/- din sângele integral şi din suspensia finală după separările succesive sunt prezentate în fig.4. Grupul celulelor NK CD56 bright este uşor crescut la subiecţii normali, atât în sânge, cât şi în suspensie. Prezenţa mai scăzută la pacienţi tumorali poate fi de aşteptat în condiţiile în care răspunsul antitumoral este ineficient. Valorile sunt mai mari în sânge (44% faţă de 34%), ceea ce poate sugera unele pierderi la separări. Asocierile cu markerii CD16 şi KIR sunt prezentate în fig.5 şi 6. Analiza asocierii celulelor NK CD57- cu receptorul CD16 a relevat valori mai crescute la martori pentru celulele CD16+ şi valori mai crescute la pacienţi pentru celulele CD16-. Dacă celulele CD16- sunt considerate a desemna din grupul NK CD56 bright, este posibil ca prezenţa lor mai pregnantă la pacienţi să caracterizeze un răspuns antitumoral mai amplu. În ceea ce priveşte CD57+, marea majoritate a acestei subpopulaţii este CD57+CD16+, cu repartiţie aproape identică la martori şi pacienţi (Fig.6).

Asocierea CD57- cu receptorul KIR este prezentată în fig. 7. Receptorul KIR este foarte important pentru activitatea de citotoxicitate antitumorală a celulei NK. Rezultatele noastre sugerează că majoritatea celulelor KIR+ sunt din grupul NK-CD57+ (Fig.8), ceea ce poate sugera posibila încadrare şi a acestor celule în subpopulaţia NK CD56 bright. Nu s-au constatat diferenţe semnificative între martori şi pacienţi în reprezentarea KIR decât în cazul celulelor NK-CD57-KIR+ în sânge, acestea fiind sensibil mai scăzute la pacienţi (3,2% faţă de 10,8%). Tabel VII Modificările globale ale principalilor receptori NK Grup NK* Subiecţi Probă CD57+ CD57- CD57- CD57+ CD57- CD57+ CD16+ CD16- CD16+ CD16- KIR+ KIR- KIR+ KIR- Martori Sânge ± + ND ND + ND ND Suspensie ± ± ± ± ± Pacienţi Sânge ± + ND ND ± ND ND Suspensie ± ± ± * ± = uşor crescut, + = crescut, = valori egale, ND = nedeterminat 5. Caracterizarea TS exprimate pe celulele NK Au fost determinate TS din sânge şi suspensie în vederea stabilirii expresiei acestor markeri implicaţi în controlul dezvoltării tumorale. Rezultatele sunt prezentate în fig.9 şi 10. După cum se observă, în sânge TS sunt slab reprezentate pe celulele NK CD57- (Fig.9), fiind mai bine reprezentate în suspensie, probabil prin separarea mai bună a celulelor NK. TS CD9 şi CD37 sunt mai bine reprezentate pe celulele martorilor, în timp ce CD53, CD63 şi CD81 sunt mai crescute pe celulele pacienţilor. Semnificaţia acestor distribuţii urmează a fi studiată în continuare în cursul desfăşurării proiectului. Celulele CD57+ prezintă distribuţii semnificative ale tuturor TS la examinarea în suspensie (Fig.10). Reprezentarea este predominantă la martori faţă de pacienţi pentru CD9, CD37, CD63 şi CD81. Este posibil ca celulele CD57+ să fie astfel implicate în imunosupravegherea transformării celulelor normale.

a. % NK CD57-TS sânge b. NK CD57-TS suspensie 70 martori cazuri 80 martori cazuri 60 70 50 60 40 50 30 40 20 30 20 10 10 0 CD9 CD37 CD53 CD63 CD81 0 CD9 CD37 CD53 CD63 CD81 Fig. 9 - Distribuţia TS pe celulele NK-CD57- în sânge (a) şi în suspensie (b) % NK CD57+ TS suspensie martori cazuri 100 80 60 40 20 0 CD9 CD37 CD53 CD63 CD81 Fig. 10 - Distribuţia TS pe celulele NK-CD57+ în suspensie

IV. CONCLUZII 1. Au fost evaluate cantitativ şi funcţional limfocitele din sângele periferic de la 14 pacienţi cu tumori maligne şi 6 subiecţi normali. Celulele de interes au fost celulele NK, analizate pentru subpopulaţiile NK CD56 bright şi NK CD56 dim. S-a efectuat separare a celulelor NK în gradient şi magnetică în 3 etape de separare. 2. Parametrii de evaluare clinică şi paraclinică şi recoltarea probelor biologice în cazul pacienţilor cu neoplazii avansate loco-regional şi la distanţă au fost efectuate de partenerul 2, în timp ce partenerii 3 şi 4 au prezentat probe biologice de ţesut placentar, bogat în celule NK. 3. Analiza expresiei markerilor celulari a fost efectuată prin citometrie în flux 4 culori în sistem manual CellQuest la citometrul FACSCalibur (BD). Au fost evaluaţi următorii markeri: CD3, CD56, CD57, CD16, KIR, Tetraspanine (TS) (CD9, CD37, CD53, CD63, CD81, CD82). 4. Imunofenotiparea limfocitară a relevat lipsa de diferenţe semnificative între martori şi pacienţi în ceea ce priveşte populaţiile limfocitare T şi B, cu creşterea celulelor NK la pacienţi. 5. Nivelul de îmbogăţire a suspensiei NK în urma separărilor magnetice a fost de 10 ori faţă de separarea în gradient, astfel că în final procentul de celule NK în suspensia finală a fost în jur de 85%. 6. Grupul celulelor NK-CD57- (posibil NK CD56 bright ) a fost uşor crescut la subiecţii normali, atât în sânge, cât şi în suspensie. S-au relevat valori mai crescute la martori pentru celulele CD16+ şi valori mai crescute la pacienţi pentru celulele CD16-. Subpopulaţia CD57+ este în marea majoritate CD16+, cu repartiţie aproape identică la martori şi pacienţi.

7. Majoritatea celulelor KIR+ sunt din grupul NK-CD57+. Nu s-au constatat diferenţe semnificative între martori şi pacienţi în reprezentarea KIR decât în cazul celulelor NK-CD57-KIR+ în sânge, acestea fiind sensibil mai scăzute la pacienţi. 8. TS sunt slab reprezentate pe celulele NK CD57- în sânge, fiind mai bine reprezentate în suspensie, cu CD9 şi CD37 sunt mai bine reprezentate pe celulele martorilor, în timp ce CD53, CD63 şi CD81 au fost mai crescute pe celulele pacienţilor. Celulele CD57+ prezintă distribuţii semnificative ale tuturor TS la examinarea în suspensie, cu reprezentare predominantă la martori faţă de pacienţi pentru CD9, CD37, CD63 şi CD81. Director proiect, Dr. C. Ursaciuc

II. BIBLIOGRAFIE 1. Chidrawar, Shivani M, Naeem Khan, Y L Tracey Chan, Laxman Nayak, and Paul Ah Moss. geing is associated with a decline in peripheral blood CD56bright NK cells. Immunity & ageing : I & A 3 (2006): 10. 2. Cooper, Megan A., Todd A. Fehniger, Sarah C. Turner, Kenneth S. Chen, Bobak A. Ghaheri, Tariq Ghayur, et al. uman natural killer cells: a unique innate immunoregulatory role for the CD56bright subset. Blood 97, no. 10 (May 15, 2001): 3146-3151. HUhttp://bloodjournal.hematologylibrary.org/cgi/content/abstract/bloodjournal;97/10/314 6UH 3. Dalbeth, Nicola, Roger Gundle, Robert J. O. Davies, Y. C. Gary Lee, Andrew J. McMichael, Margaret F. C. Callan, et al. D56bright NK Cells Are Enriched at Inflammatory Sites and Can Engage with Monocytes in a Reciprocal Program of Activation. J Immunol 173, no. 10 (November 15, 2004): 6418-6426. HUhttp://www.jimmunol.org/cgi/content/abstract/173/10/6418UH 4. Differential expression of SHIP1 in CD56bright and CD56dim NK cells provides a molecular basis for distinct functional responses to monokine costimulation. December 16, 2004. HUhttp://bloodjournal.hematologylibrary.org/cgi/content/abstract/2004-10- 4072v1?ck=nckUH 5. Dosiou, Chrysoula, and Linda C. Giudice. atural Killer Cells in Pregnancy and Recurrent Pregnancy Loss: Endocrine and Immunologic Perspectives. Endocr Rev 26, no. 1 (February 1, 2005): 44-62. HUhttp://edrv.endojournals.org/cgi/content/abstract/26/1/44UH 6. Fehniger, Todd A., Megan A. Cooper, Gerard J. Nuovo, Marina Cella, Fabio Facchetti, Marco Colonna, et al. D56bright natural killer cells are present in human lymph nodes and are activated by T cell-derived IL-2: a potential new link between adaptive and innate immunity. Blood 101, no. 8 (April 15, 2003): 3052-3057. HUhttp://bloodjournal.hematologylibrary.org/cgi/content/abstract/bloodjournal;101/8/305 2UH 7. Ferlazzo, Guido, Dolca Thomas, Shao-Lee Lin, Kiera Goodman, Barbara Morandi, William A. Muller, et al. he Abundant NK Cells in Human Secondary Lymphoid Tissues Require Activation to Express Killer Cell Ig-Like Receptors and Become Cytolytic. J Immunol 172, no. 3 (February 1, 2004): 1455-1462. HUhttp://www.jimmunol.org/cgi/content/abstract/172/3/1455UH 8. Freud, Aharon G., Brian Becknell, Sameek Roychowdhury, Hsiaoyin C. Mao, Amy K. Ferketich, Gerard J. Nuovo, et al. Human CD34(+) Subset Resides in Lymph Nodes and Differentiates into CD56brightNatural Killer Cells. Immunity 22, no. 3 (March 2005): 295-304. HUhttp://www.sciencedirect.com/science/article/B6WSP-4FS6D9V- 5/2/721ecf2a87ef2fb1e35cc2f4534713baUH 9. Frey, Margaret, Nalini B. Packianathan, Todd A. Fehniger, Mary E. Ross, Wan-Chao Wang, Carleton C. Stewart, et al. ifferential Expression and Function of L-Selectin on CD56bright and CD56dim Natural Killer Cell Subsets. J Immunol 161, no. 1 (July 1, 1998): 400-408. HUhttp://www.jimmunol.org/cgi/content/abstract/161/1/400UH 10. Gene and protein characteristics reflect functional diversity of CD56dim and CD56bright NK cells. September 11, 2006. HUhttp://jleuk.highwire.org/cgi/content/abstract/jlb.0306191v1UH

11. Hanna, Jacob, Pamela Bechtel, Yufeng Zhai, Fadi Youssef, Karen McLachlan, Ofer Mandelboim, et al. ovel Insights on Human NK Cells' Immunological Modalities Revealed by Gene Expression Profiling. J Immunol 173, no. 11 (December 1, 2004): 6547-6563. HUhttp://www.jimmunol.org/cgi/content/abstract/173/11/6547UH 12. Koopman, Louise A., Hernan D. Kopcow, Basya Rybalov, Jonathan E. Boyson, Jordan S. Orange, Frederick Schatz, et al. uman Decidual Natural Killer Cells Are a Unique NK Cell Subset with Immunomodulatory Potential. J. Exp. Med. 198, no. 8 (October 20, 2003): 1201-1212. HUhttp://www.jem.org/cgi/content/abstract/198/8/1201UH 13. NK CD56 bright.txt. 14. SU Scientists Identify New Model of NK Cell Development. http://www.jamesline.com/news/press/?id=1973&i=0&sids= (accessed June 12, 2007). 15. Arck, P.C., M. Rose, K. Hertwig, E. Hagen, M. Hildebrandt, B.F. Klapp, et al. tress and immune mediators in miscarriage. Hum. Reprod. 16, no. 7 (July 1, 2001): 1505-1511. HUhttp://humrep.oxfordjournals.org/cgi/content/abstract/16/7/1505UH 16. Control of human trophoblast function. http://www.rbej.com/content/5/1/6 17. Cooper, Megan A., Todd A. Fehniger, Sarah C. Turner, Kenneth S. Chen, Bobak A. Ghaheri, Tariq Ghayur, et al. uman natural killer cells: a unique innate immunoregulatory role for the CD56bright subset. Blood 97, no. 10 (May 15, 2001): 3146-3151. HUhttp://bloodjournal.hematologylibrary.org/cgi/content/abstract/97/10/3146UH 18. Eriksson, Mikael, Sarah K. Meadows, Charles R. Wira, and Charles L. Sentman. nique phenotype of human uterine NK cells and their regulation by endogenous TGFbeta. J Leukoc Biol 76, no. 3 (September 1, 2004): 667-675. HUhttp://www.jleukbio.org/cgi/content/abstract/76/3/667UH 19. Hiby, Susan E., James J. Walker, Kevin M. O'Shaughnessy, Christopher W.G. Redman, Mary Carrington, John Trowsdale, et al. ombinations of Maternal KIR and Fetal HLA-C Genes Influence the Risk of Preeclampsia and Reproductive Success. J. Exp. Med. 200, no. 8 (October 18, 2004): 957-965. HUhttp://www.jem.org/cgi/content/abstract/200/8/957UH 20. How Do Natural Killer Cells Find Self to Achieve Tolerance? http://www.sciencedirect.com/science?_ob=articleurl&_udi=b6wsp- 4JHV6D7-6&_user=10&_coverDate=03%2F31%2F2006&_rdoc=1&_fmt=&_orig=search&_sor t=d&view=c&_acct=c000050221&_version=1&_urlversion=0&_userid=10&md5=4 eef0cc26a7a1b814ceb99e0f0b169b2 21. Human decidual lymphocytes and the immunobiology of pregnancy.pdf. http://www.people.fas.harvard.edu/~jlstrom/reprints/959.pdf 22. Human uterine lymphocytes -- King et al. 4 (5): 480 -- Human Reproduction Update. http://humupd.oxfordjournals.org/cgi/reprint/4/5/480 (accessed March 26, 2007). 23. King, A, S E Hiby, L Gardner, S Joseph, J M Bowen, S Verma, et al. Recognition of trophoblast HLA class I molecules by decidual NK cell receptors--a review. Placenta 21 Suppl A:S81-5. 24. Koopman, Louise A., Hernan D. Kopcow, Basya Rybalov, Jonathan E. Boyson, Jordan S. Orange, Frederick Schatz, et al. uman Decidual Natural Killer Cells Are a Unique NK Cell Subset with Immunomodulatory Potential. J. Exp. Med. 198, no. 8 (October 20, 2003): 1201-1212. HUhttp://www.jem.org/cgi/content/abstract/198/8/1201UH 25. The Miscarriage Clinic - Dedicated in diagnosing and treating miscarriage. http://www.miscarriageclinic.co.uk/causes2.html#2

UH UH 26. Moffett, Ashley, Lesley Regan, and Peter Braude. atural killer cells, miscarriage, and infertility. BMJ 329, no. 7477 (November 27, 2004): 1283-1285. HUhttp://www.bmj.comUH 27. Nature Reviews Immunology - Reviews. http://www.nature.com/nri/journal/v2/n9/abs/nri886_fs.html;jsessionid=6c0 3B3FCBB8E8B51C8855F9FCA13C6F2 28. NK CELL RECOGNITION.pdf. 29. Parham, Peter. K Cells and Trophoblasts: Partners in Pregnancy. J. Exp. Med. 200, no. 8 (October 18, 2004): 951-955. HUhttp://www.jem.org/cgi/content/abstract/200/8/951UH 30. People's Daily Online -- UK scientists find blood test for miscarriage ineffective. http://english.people.com.cn/200607/17/eng20060717_283783.html 31. Protocol: Microarray analysis of highly purified human decidual NK cells. http://www.natureprotocols.com/2006/08/07/microarray_analysis_of_highly.ph p 32. Uterine leukocytes and decidualization -- King 6 (1): 28 -- Human Reproduction Update. http://www.bmj.com/cgi/ijlink?linktype=abst&journalcode=humupd&resi d=6/1/28 33. Berditchevski, Fedor. omplexes of tetraspanins with integrins: more than meets the eye. J Cell Sci 114, no. 23 (December 1, 2001): 4143-4151. HUhttp://jcs.biologists.org/cgi/content/abstract/114/23/4143UH 34. Berditchevski, Fedor, and Elena Odintsova. haracterization of IntegrinTetraspanin Adhesion Complexes: Role of Tetraspanins in Integrin Signaling. J. Cell Biol. 146, no. 2 (July 26, 1999): 477-492. HUhttp://www.jcb.org/cgi/content/abstract/146/2/477 35. Gesierich, Sabine, Claudia Paret, Dagmar Hildebrand, Jurgen Weitz, Kaspar Zgraggen, Friedrich H. Schmitz-Winnenthal, et al. olocalization of the Tetraspanins, CO-029 and CD151, with Integrins in Human Pancreatic Adenocarcinoma: Impact on Cell Motility. Clin Cancer Res 11, no. 8 (April 15, 2005): 2840-2852. HUhttp://clincancerres.aacrjournals.org/cgi/content/abstract/11/8/2840UH 36. Hemler, Martin E. pecific tetraspanin functions. J. Cell Biol. 155, no. 7 (December 24, 2001): 1103-1108. HUhttp://www.jcb.org/cgi/content/abstract/155/7/1103 37. Identification of the motility-related protein (MRP-1), recognized by monoclonal antibody M31-15, which inhibits cell motility -- Miyake et al. 174 (6): 1347 -- The Journal of Experimental Medicine. http://www.jem.org/cgi/reprint/174/6/1347 38. Levy, Shoshana, and Tsipi Shoham. he tetraspanin web modulates immune-signalling complexes. Nature reviews. Immunology 5, no. 2 (February 2005): 136-48. 39. Maecker, HT, SC Todd, and S Levy. he tetraspanin superfamily: molecular facilitators. FASEB J. 11, no. 6 (May 1, 1997): 428-442. HUhttp://www.fasebj.org/cgi/content/abstract/11/6/428UH 40. The Tetraspan Molecule CD151, a Novel Constituent of Hemidesmosomes, Associates with the Integrin alpha6beta4 and May Regulate the Spatial Organization of Hemidesmosomes -- Sterk et al. 149 (4): 969 -- The Journal of Cell Biology. http://www.jcb.org/cgi/content/full/149/4/969 41. Tetraspanins and malignancy. http://www-ermm.cbcu.cam.ac. uk/01002381h.htm 42. Transmembrane 4 superfamily protein CD151 (PETA-3) associates with b1 and aiib b3 integrins in haemopoietic cell lines and modulates cell cell adhesion. http://www.pubmedcentral.nih.gov/picrender.fcgi?artid=1220025&blobtype =pdf