PLATELIA Candida Ag Plus CANDIDA MANNAN ANTIGEENI AVASTAMINE INIMESE SEERUMIS VÕI PLASMAS IMMUNOENSÜMAATILISE TEHNIKA MEETODIL

Transcription

1 PLATELIA Candida Ag Plus CANDIDA MANNAN ANTIGEENI AVASTAMINE INIMESE SEERUMIS VÕI PLASMAS IMMUNOENSÜMAATILISE TEHNIKA MEETODIL 1- SIHTOTSTARVE Platelia Candida Ag Plus on immuunoensümaatiline võileivatehnika analüüs mikroplaadil, mis võimaldab seerumis või plasmas määrata tsirkuleerivat Candida mannan antigeeni. 2- KASUTUSOTSTARVE Invasiivse kandidoosi diagnoos peab põhinema antikehade ja tsirkuleerivate antigeenide kombineeritud määramisel. Platelia Candida Ag Plus (kood 62784) on test, mis koos Platelia Candida Ab Plus (kood 62785) testi kasutamisega aitab parandada varajast 11 ja tundlikku diagnoosimist, olles osa terviklikust diagnostilisest lähenemisest, kus kombineeritakse sisemisi ja iatrogeenseid faktoreid ning kliinilisi ja mükoloogilisi andmeid 10,13,14. Antud testide kombinatsioon on osa kliinilisest ja laboratoorsest patsiendi jälgimise protsessist, abistades terapeutiliste otsuste tegemisel KLIINILINE VÄÄRTUS Candida infektsioonid on esimesel kohal nosokomiaalsete seeninfektsioonide seas; kandideemiad on nosokomiaalsete 12,15,16 vereringeinfektsioonide seas neljandal kohal. Invasiivne kandidoos on kõige tõsisem Candida nakkus, immuunsupresseeritud patsientide seas varieerub suremus 30 70%. Diagnoosimine on ikkagi keeruline, kuna puuduvad spetsiifilised kliinilised sümptomid ja verekülvide tundlikkus on madal. Invasiivse kandidoosi diagnoos, millega alustatakse ka sobivat ravi, põhineb tavaliselt kombineeritud andmetel 2. Selles kontekstis peab süsteemse kandidoosi diagnoos assotseeruma nii seroloogiliste tehnikate kui ka otseste mükoloogiliste meetoditega. Tsirkuleerivate antigeenide määramine seerumis või plasmas näib parandavat invasiivse kandidoosi riskirühma kuuluvate haigete diagnoosimist 10, 13, 14. Peamised riskifaktorid on kemoteraapia või immuunsupressiivse ravi järgne neutropeenia (vähi korral, onkohematoloogilistel ja transplantatsiooni patsientidel) 4, 10, laia toimespektriga antibiootikumravi, veenikateetrid, parenteraalne toitmine, neeru dialüüs, proteseerimine (intensiivravi patsientidel) 5, 13, 16. Candida antigeenide hulka kuuluv mannan on mittekovalentselt seene rakuseina külge seonduv polüsahhariid, mis moodustab rohkem kui 7% C. albicans i kuivmassist. Antigeen näib olevat invasiivse kandidoosi peamine diagnostiline biomarker. Riskipatsientide regulaarne jälgimine kombineeritult tsirkuleerivate mannan antigeenide ja mannani vastaste antikehade 9, 10, 13 määramisega on vahend invasiivse kandidoosi diagnoosimiseks. 4- PROTSEDUURI PÕHIMÕTE Platelia Candida Ag Plus on ühe-etapiline immuuno-ensümaatiline võileivatehnika, mida teostatakse mikroplaadil, mis võimaldab inimese seerumis või plasmas Candida mannan antigeeni avastamist. Analüüsiks kasutatakse roti Candida α 1-5 oligomannosiidide vastu suunatud ning eelnevate uuringute käigus iseloomustatud EBCA-1 monoklonaalseid antikehi (MAk) 13, 14. EBCA-1 MAk kasutatakse: mikroplaadi kannude katmiseks, et siduda mannan antigeeni sensibiliseeritud mikroplaadile seondunud antigeeni määramiseks (konjugaat: peroksüdaasmärgistatud MAk). Seerumi või plasma e kuumutatakse koos EDTAga, et lagundada immuunkompleksid ja välja sadestada seerumiproteiinid, mis võiksid segada testi käiku. Töödeldud seerumi või plasma id ja konjugaat lisatakse anti-mannan MAk-ga kaetud kannudesse. Pärast inkubeerimist 37 C juures pestakse kannuribad, et eemaldada võimalik mitteseondunud materjal. Kui inimese is on olemas tsirkuleeriv mannan antigeen, moodustub kompleks: mannani vastane MAk mannan Ag mannani vastane MAk/peroksüdaas. Seejärel lisatakse kromogeeni lahus, mis sisaldab peroksüdaasi substraati ja inkubeeritakse toatemperatuuril, mis võimaldab igat mikroplaadi kannu seondunud kompleksi määrata. Ensümaatiline reaktsioon peatatakse 1 N väävelhappe lisamisega. Proovide ja kalibraatori neeldumine (optiline tihedus) määratakse spektrofotomeetriga 450/620 nm lainepikkusel. 5- REAKTIIVID Reaktiive tarnitakse piisavas koguses, et sooritada 96 testi 9 partiina. Säilitustingimuste ja aegumiskuupäevade osas juhinduge kleebistel olevatest märgetest. Enne kasutamist viia kõik reaktiivid toatemperatuurile ( º C). Pärast kasutamist asetada kõik reaktiivid, tagasi 2-8 º C. Aseta kasutamata jäänud ribad tagasi kotti ja sulge kott hoolikalt. Ära eemalda niiskustõkendit. 1

2 Komponent Sisu Kogused R1 Microplate Mikroplaat: 1-96 kannu (12 riba, igas 8 kannu), mis on kaetud mannanivastaste monoklonaalsete antikehadega EBCA-1. R2 Concentrated Kontsentreeritud pesemislahus (20x): 1 x 70 ml Washing Solution - Tris-NaCl puhver (ph 7.4) (20x) - 2% Tween 20 R3 Calibrator 0 Konjugaat 0 pg/ml (kasutusvalmis) 1 x 2.0 ml - Tris-NaCl-trehhaloos puhver, mis ei sisalda Candida albicansi puhastatud mannanit R4a Calibrator 62.5 Konjugaat 62.5 pg/ml (kasutusvalmis) 1 x 2.0 ml - Tris-NaCl-trehhaloos puhver - Candida albicansi puhastatud mannan R4b Calibrator 125 Konjugaat 125 pg/ml (kasutusvalmis) 1 x 2.0 ml - Tris-NaCl-trehhaloos puhver - Candida albicansi puhastatud mannan R4c Calibrator 250 Konjugaat 250 pg/ml (kasutusvalmis) 1 x 2.0 ml - Tris-NaCl-trehhaloos puhver - Candida albicansi puhastatud mannan R4d Calibrator 500 Konjugaat 500 pg/ml (kasutusvalmis) 1 x 2.0 ml - Tris-NaCl-trehhaloos puhver - Candida albicansi puhastatud mannan R5 Negative control Positiivne kontroll: 2 x 1.5 ml - inimseerum, sisaldab mannanit R6 Positive Control Konjugaat (kasutusvalmis): 1 x 17 ml - monoklonaalsed mannanivastased antikehad, märgistatud peroksüdaasiga - broomkresoolpurpur R7 Conjugate Proovitöötlemislahus (kasutusvalmis): - EDTA happelahus ilma säilitusaineta 1 x 10.5 ml R9 Sample Treatment Solution Kromogeen TMB lahus (kasutusvalmis): - 3,3,5,5 -tetrametüülbensidiini lahus (<0.1%), H 2O 2 (<1.0%) 1 x 28 ml R10 Chromogen TMB Stopplahus (kasutusvalmis): 1 x 28 ml 1 N väävelhappe lahus Kleepkiled mikroplaatidele 4 6- HOIATUSED KASUTAJATELE 1. Ainult in vitro kasutamiseks. 2. Ainult professionaalseks kasutamiseks. 3. Testkomplekti pole soovitav kasutada muude idega kui inimese seerum ja plasma. 4. R5 positiivne kontroll on toodetud inimese seerumist, mida on kontrollitud ja see on negatiivne HbsAg ja HIV1, HIV2 ja HCV vastu suunatud antikehade suhtes CE märgistusega testides. Sellest hoolimata tuleb kõiki reaktiive käsitleda kui potentsiaalselt nakkusohtlikke. Kõik testid tuleb teostada kooskõlas OSHA standardiga verepatogeenidele, bioohutuse tasemel II või muudes sobivates bioohutuse tingimustes. 5. Kandke kaitseriietust, k.a. kittel, silmade/näo kaitse ja ühekordsed kindad (soovitatavad on sünteetilised, mittelatekskindad) ja käsitsega testreaktiive ning patsiendie vastavalt heale laboritavale. Pärast testi sooritamist peske hoolikalt käed. 6. Ärge pipeteerige suuga. 7. Ärge suitsetage, jooge või sööge piirkonnas, kus töötatakse ide ja reaktiividega. 8. Vältige ide ja lahuste pritsimist. 9. Bioloogilised pritsmed, mis ei sisalda hapet, tuleb hoolikalt ära pühkida efektiivse desinfitseerimisvahendiga. Sobivad (aga mitte ainuvõimalikud) desinfitseerimisained on 10% pleegiti lahus (0.5% naatrium hüpokloriti lahus), 70% etanool või 0.5% Wescodyne Plus. Materjalid, mida kasutati jäätmete pühkimiseks, võivad vajada käitlemist nagu bioloogiliselt ohtlikud jäätmed. 2

3 HOIATUS: Ärge asetage autoklaavi pleegitit sisaldavaid lahuseid. 10. Hapet sisaldavad pritsmed tuleb korralikult absorbeerida (ära pühkida) või neutraliseerida naatrium bikarbonaadiga ning ala loputada ja kuivaks pühkida; kui selles sisaldus bioloogiliselt ohtlik materjal, pühkige ala keemilise desinfitseerimisainega. 11. Testi tegemiseks kasutatud materjalid ja id tuleb ära visata kui nakkusohtlikud. Laboratoorseid keemilisi ja bioloogiliselt ohtlikke jäätmeid tuleb käidelda ja ära visata vastavalt kehtivale seadusandlusele. 12. HOIATUS: Järgmises loetelus on testi komponentides sisalduvad potentsiaalselt ohtlikud keemilised ained (vt. Jaotus 5- REAKTIIVID): Xi- ärritav Mõned reaktiivid sisaldavad ProClin < 1.5%: R43: Võib põhjustada nahaga kokkupuutel sensibiliseerumist S : ärge hingake sisse aurusid, aerosoole. Vältige kokkupuudet nahaga. Kandke sobivaid kindaid. Antud materjal ja selle konteiner tuleb ära visata kui ohtlik jääde. 13. Materjali ohutuskaardid (MSDS) on soovi korral saadaval. 7- ETTEVAATUSABINÕUD KASUTAJATELE 1. KÜLMUTATUD SEERUMI- VÕI PLASMAPROOVID, MIS HOIUSTATI TUNDMATUTES TINGIMUSTES, VÕIVAD ANDA VALEPOSITIIVSEID TULEMUSI SEOSES KONTAMINEERUMISEGA SEENTE JA/VÕI BAKTERITEGA. 2. Ärge kasutage komplekti või üksikuid reaktiive pärast näidatud aegumistähtaja möödumist. 3. Ärge segage omavahel reaktiive erinevate partiinumbritega komplektidest, välja arvatud Pesulahus (R2, identifitseerimine*: 20x rohelist värvi), Kromogeen (R9, identifitseerimine*: TMB türkiissinist värvi) ja Stopplahus (R10 identifitseerimine*: 1 N punast värvi), veendudes, et reaktiivid on samaväärsed ja kannavad antud töökorras kasutatavate reagentidega sama partiinumbrit. MÄRKUS: Pesulahus (R2, identifitseerimine*: 20x rohelist värvi), Kromogeen (R9, identifitseerimine*: TMB türkiissinist värvi) ja Stopplahus (R10 identifitseerimine*: 1 N punast värvi), veendudes, et reaktiivid on samaväärsed ja kannavad antud töökorras kasutatavate reagentidega sama partiinumbrit. MÄRKUS: Pesulahust (R2, identifitseerimine*: 20x rohelist värvi) ei tohi segada Pesulahusega (R2, identifitseerimine*: 10x sinist värvi), mis pärineb Bio-Radi reagendikomplektidest. * viaali kleebisel 4. Enne kasutamist tooge kõik reaktiivid toatemperatuurile (+18 kuni +30 C) vähemalt 30 minutit varem. 5. Kasutage hoolikalt pestud ja destveega loputatud klaasmaterjali või eelistatult ühekordseid materjale. 6. Kontrollige pipette ja teisi vahendeid täpsuse ja korrektse toimimise osas. 7. Hoolikalt taastage maht või lahjendage R2, vältides saastumist. 8. Ensümaatiline reaktsioon on metalli või metalli ioonide suhtes väga tundlik. Sellest tulenevalt ei tohi konjugaati või substraati sisaldavad lahused kokku puutuda metallesemetega. 9. Proovide ja kalibraatorite käsitsi pipeteerimisel kasutage ühekordseid otsikuid, et vältida i ülekandumist. 10. Tagamaks kannude adekvaatset pesemist, veenduge, et pesukordade arv oleks õige ja kindlustage, et kannud täidetakse ääreni ja tühjendatakse põhjani. Peske mikroplaadi pesijaga. 11. Mikroplaatidel ei tohi lasta kuivada pesemise järel, enne reaktiivide lisamist. 12. Ärge kasutage konjugaadi ja substraadi lahusele sama anumat. 13. Kaitske kromogeen TMB lahust hoiustamisel või inkubeerimisel tugeva valguse eest. Kromogeenilahused ei tohi kokku puutuda oksüdeerivate ainetega. 14. Kromogeenlahus (R9) peab olema värvitu. Siniseks muutumisel ei tohi reaktiivi enam kasutada ja ta tuleb ära visata. 15. Vältige stopplahuse kokkupuutumist oksüdeerijatega, metalliga või metalli ioonidega. 16. Ärge valage kasutamata jäänud konjugaati tagasi originaalnõusse. 8- REAKTIIVIDE VALMISTAMINE JA SÄILITAMINE Mikroplaat (R1) Pakendis on alusraam, mis sisaldab 12 riba. Avage pakend kääridega, lõigates sulguri alt. Avage kott ja võtke raam välja. Hoiustage kasutamata jäänud ribasid koos raamiga originaalkotis. Sulgege kott hoolikalt ja asetage tagasi +2-8 C juurde. Pärast vaakumpakendi avamist on mikrokannude ribad stabiilsed 8 nädalat, hoituna +2-8 C hoolikalt sule tud originaalpakendis, milles on niiskustõkend. Pesemislahus (R2) Valmistage vajalik kogus pesemise töölahust, lahjendades kontsentreritud pesemislahust 20 korda destveega: 50 ml R2 950 ml destvees. Ühele 12 ribaga täisplaadile kulub 400 ml pesulahuse töölahust, lisaks kasutatava seadme tühimaht. Valmis lahust võib hoida kuni 14 päeva 2-30 C. Pärast avamist on kontsentreeritud pesulahus stabiilne aegumistähtaja lõpuni, kui teda hoitakse C ja kaitstakse saastumise eest. Kalibraator 0 (R3), Kalibraator 62.5 (R4a), Kalibraator 125 (R4b), Kalibraator 250 (R4c), Kalibraator 500 (R4d): Kalibraatorid on kasutusvalmis. Pärast avamist on reaktiivid stabiilsed 8 nädalat, kui neid hoitakse +2-8 C ja kaitstakse saastumise eest. 3

4 Positiivne kontroll (R5): Positiivset kontrolli tuleb kuumtöödelda EDTA happelahusega (R7) nagu patsiendiegi, et saaks monitoorida ka ravi. Pärast avamist on reaktiiv stabiilne 8 nädalat, kui teda hoitakse +2-8 C ja kaitstakse saastumise ees t. Konjugaat (R6), Proovi töötlemise lahus (R7), TMB kromogeeni lahus (R9): Reaktiivid on kasutusvalmis. Pärast avamist on reaktiivid stabiilsed 8 nädalat, kui neid hoitakse +2-8 C ja kaitstakse saastumise eest. Stopplahus (R10) Reaktiiv on kasutusvalmis. Pärast avamist on reaktiiv stabiilne aegumistähtaja lõpuni, kui puudub kontaminatsioon ning teda hoitakse +2-8 C. 9- PROOVIMATERJAL 1. Test sooritatakse seerumi või plasma idega, mis on kogutud koos EDTA, hepariini või tsitraat antikoagulandiga. 2. Vereide kuumtöötlemisel, käsitlemisel ja säilitamisel juhinduge järgnevast: Võtke vere vastavalt labori standardprotseduuridele. Seerumi korral laske il enne tsentrifuugimist täiesti hüübida. Hoidke katsuteid kogu aeg suletuna. Pärast tsentrifuugimist ekstraheerige seerum või plasma ja säilitage korgitud katsutis. Proove võib enne testimist säilitada +2-8 C kuni 5 päeva. Kui testi ei ole võimalik sooritada 5 päeva jooksul, külmutage id -20 C (või -80 C). Seerumi või plasma e võib maksimaalselt 5 korda üles sulatada/ külmutada. Eelnevalt külmutatud id tuleb ülessulamise järel ja enne testimist hoolikalt segada. 3. Tulemusi ei mõjuta id, milles sisaldub 60 g/l inimese albumiini või 120 g/l üldvalku või 200 mg/l konjugeerimata bilirubiini või 200 mg/l konjugeeritud bilirubiini, lipeemilised id, mis sisaldavad 30 g/l trioleiini (triglütseriid) või 5 g/l kolesterooli või hemolüüsunud id, mis sisaldavad 2 g/l hemoglobiini. 4. Ärge kuumutage seerumit või plasmat. 10- PROTSEDUUR Komplekti kuuluvad materjalid Vt. jaotust REAKTIIVID. Vajalikud materjalid, mis komplekti ei kulu 1. Steriilne destilleeritud või deioniseeritud vesi kontsentreeritud pesulahuse lahjendamiseks. 2. Absorbentpaber 3. Ühekordsed kindad. 4. Kaitseprillid. 5. Naatrium hüpoklorit (pleegiti) ja naatrium bikarbonaat. 6. Pipetid või multipipetid, automaatsed või poolautomaatsed, muudetava või fikseeritud mahuga, et mõõta ja dispenseerida 10 µl kuni 1000 µl ja 1ml, 2 ml ja 10 ml mL polüpropüleenist mikrotsentrifuugituubid õhukindlate korkidega, mis kannatavad kuumutamist kuni 120 C (kuumplokis) või 100 C (kuumutavas vesivannis). Keeratava korgiga tuubid: 1.5 ml koonilised tuubid, Bio-Rad Kat. # või samaväärsed VÕI Vajutatava korgiga tuubid EZ mikrotest-tuubid, 1.5 ml, Bio-Rad Kat. # või samaväärsed 8. Mikrotuubide korgisulgurid (VWR Kat # või samaväärsed). Need sulgurid tagavad vajutatavate korkide kinnipüsimise temperatuuri ja rõhu muutumisel ning lihtsustavad tuubide väljatõstmist kuumutusplokist või kuumutavast vesivannist, vältides põletuseriski. 9. Laboratoorne lauatsentrifuug 1.5 ml tuubidele, kiirusega 10,000g. 10. Kui seerumite töötlemiseks kasutatakse kuumutusplokki: Kuumutusplokk. Soovitatavd on järgmised mudelid: - 1 plokiga mudel: Grant i Kat. # QBD1 (VWR Kat. # ) - 2 plokiga mudel: Grant i Kat. # QBD2 (VWR Kat ) Plokk kuumutusplokile: mõlemate kuumutusplokkidega tuleb kasutada Grant i plokki Kat. # QB-E1 (VWR Kat. # ) Kui seerumite töötlemiseks kasutatakse vesivanni: Ujuv mikrotsentrifuugituubide raam. Kuumutav vesivann 100 C ml, 50 ml, 100 ml ja 1000 ml gradueeritud testtuubid. 12. Bioloogiliselt ohtlike jäätmete konteiner. 13. Vorteks segaja. 14. Mikroplaadi inkubaator 37 ± 1 C (*). 15. Poolautomaatne või automaatne mikroplaadi pesija (*). 16. Mikroplaadi lugeja 450 nm ja 620 nm filtritega (*). (*) Konsulteerige sobivate seadmete üksikasjaliku informatsiooni saamiseks meie tehnilise toega. 4

5 Proovide töötlemine Positiivne kontroll (R5) tuleb teha koos seerumiidega, lisades 100 µl töötlemislahust (R7). R3, R4a, R4b, R4c ja R4d kalibraatoreid, mis on kasutusvalmis, ei tohi eeltöödelda. 1. Pipeteerige 300 µl igat testitavat seerumit ja Positiivset kontrolli (R5) individuaalsetesse 1.5 ml polüpropüleentuubidesse. 2. Lisage 100 µl seerumi töötlemise lahust (R7) igasse tuubi. 3. Segage tuube hoolikalt ja jõuliselt või vortekseerige hoolikalt. Sulgege tuubid tihedalt, et nad kuumutades ei avaneks. Ärge läbistage korki. 4. Kuumutusploki võimalus: Kuumutage tuube 6 minutit kuumutusplokis 120 C. Tuu bid tuleb asetada plokki alles siis, kui etteantud temperatuur on saavutatud.(*) VÕI Vesivanni võimalus: Kui kasutate kuumutavat vesivanni, keetke tuube 3 min. 100 C.(*). Tuubid tuleb asetada plokki alles siis, kui etteantud temperatuur on saavutatud. 5. Eemaldage ettevaatlikult kuumad tuubid kuumutusplokist või vesivannist ja asetage tsentrifuugi. Tsentrifuugige tuube 10,000 x g 6. Supernatanti kasutatakse mannan antigeeni määramiseks. Testige supernatanti vastavalt järgnevale protseduurile. Testimine peab toimuma kahe tunni jooksul peale seerumi või plasma kuumtöötlemist. (*) Testi õnnestumiseks tuleb rangelt kinni pidada etteantud temperatuurist ja ajast, kasutades soovitatud materjale. Ärge usaldage seadmete ekraaninäitu, vaid veenduge temperatuuri õigsuses, kasutades kalibreeritud termomeetrit, mis sisestatakse mineraalõliga täidetud tuubi: 120 C pe ab olema mõõtetulemus kuumutusplokis olevas tuubis ning vastavalt 100 C vesivannis oleva tuubis. NB: Kõiki sellisel moel töödeldud e saab kasutada Platelia Aspergillus EIA testiga, kuna kahe testi ide eeltöötlus on identne. Ärge säilitage e (positiivset kontrolli ja patsiendie) pärast kuumtöötlemist. EIA protseduur Järgi rangelt protokolli. Kasuta head laboritava. Enne kasutamist too reaktiivid toatemperatuurile (18-30 C) vähemalt 30 minutiks. Iga testikorraga kasutage kõiki kalibraatoreid ja positiivset kontrolli, et valideerida testi tulemus. Tehke järgnevalt: 1. Koostage skeem, mille alusel samastada kalibraatorid, positiivne kontroll ja patsiendiid vastavalt järgmisele plaanile: - A1: Positiivne kontroll R5 (töödeldud kontrolli supernatant) - B1: Kalibraator 500 pg/ml (R4d) - C1: Kalibraator 250 pg/ml (R4c) - D1: Kalibraator 125 pg/ml (R4b) - E1: Kalibraator 62.5 pg/ml (R4a) - F1: Kalibraator 0 pg/ml (R3) A R5 S3 S11 B R4d S4 C R4c S5 D R4b S6 E R4a S7 F R3 S8 G S1 S9 H S2 S10 2. Eemaldage ümbrisest mikrokannude ribadega raam (R1). Kõik ribad, mida ei kasutata, asetage kotti tagasi koos niiskustõkendiga ja sulgege kinnis hoolikalt. 3. Pipeteerige 100µl töödeldud patsiendii supernatanti ja 100µl töödeldud R5 kontrolli supernatanti vastavatesse kannudesse. 4. Seejärel pipeteerige 100µl R4d, R4c, R4b, R4a ja R3 vastavalt järjekorrale plaadil. NB: selles etapis saab kontrollida kalibraatorite jaotamist: vastavates kannudes muutub värvus oranzist (R4d) helekollaseks (R3). Katke plaat kilega või muude vahenditega, et takistada aurumist, veenduge et kogu pind on kaetud ja veekindel. 5. Segage viaal R6 enne kasutamist tagurpidi keerates. Kui kasutate mitmekanalist pipetti, võtke ainult töökorraks vajalik kogus: 2.5 ml kahele 8 kannuga ribale. 6. Lisage 100µl konjugaadilahust (R6) igasse kannu. 7. Katke mikroplaat kleepkilega, veendudes, et kogu pind on kaetud ja veekindel. 8. Inkubeerige mikroplaate koheselt kuivas mikroplaadiinkubaatoris 90 ± C ± 1 C 9. Valmistage pesulahuse töölahus (vt. jaotus 8). 5

6 10. Eemaldage plaadi kate. Aspireerige kannude sisu jäätmekonteinerisse (mis sisaldab naatrium hüpokloritit). Peske plaate mikroplaadi pesijaga 5 korda, (kasutades 800 µl pesulahuse töölahust). Pärast viimast pesu keerake plaat tagurpidi ja koputage õrnalt vastu absorbeerivat paberit, et eemaldada vedeliku jäägid. 11. Lisage kiiresti 200 µl Kromogeenilahust (R9) igasse kannu, vältige kokkupuudet ereda valgusega. 12. Inkubeerige mikroplaati C 30 ± 5 minutit. Ärge kasutage inkubeerimise ajal kleepkilet. 13. Lisage 100 µl stopplahust (R10) igasse kannu samas järjekorras kuidas lisasite kromogeenilahust. Segage hästi. 14. Pühkige hoolikalt plaadid põhja alt. 15. Lugege iga kannu optilist tihedust 450 nm (referentsfilter 620 nm). Mikroplaadid tuleb ära lugeda 30 minuti jooksul peale stopplahuse lisamist. (kannuribasid tuleb alati enne lugemist kaitsta valguse eest). 16. Kontrollige enne tulemuste väljastamist lugeja väljatrüki ja mikroplaadi jaotusplaani ühilduvust. 11- KVALITEEDI KONTROLL (VALIDEERIMISKRITEERIUMID) Kalibreerimiskõvera joonistamine Kalibratsioonikõver joonistatakse 5 punkti (kalibraatori) abil: Igal testimiskorral kasutage kalibraatoreid. Analüüsi valideerimiseks peavad olema täidetud järgmised kriteeriumid: Optilise tiheduse väärtus: OD R4a > Suhted: OD R4a / OD R3 > 1.80 OD R4b / OD R4a > 1.25 OD R4c / OD R4b > 1.20 OD R4d / OD R4c > 1.20 Mannani kontsentratsioon positiivses kontrollis R5: R5 kontsentratsioon peab olema võrdne viaalil näidatud kontsentratsiooniga ± 30%. 12- TULEMUSTE INTERPRETEERIMINE Kalibratsioonikõvera joonistamine Kalibratsioonikõver joonistatakse 5 punkti (kalibraatori) abil: 0 pg/ml, 62.5 pg/ml, 125 pg/ml, 250 pg/ml ja 500 pg/ml. Joonistage kõver, kandes vertikaalteljele (y telg) kalibraatorite R3, R4a, R4b, R4c ja R4d OD-d OD = funktsion (pg/ml) ja vastavate kalibraatorite kontsentratsioonid pg/ml kandke horisontaalteljele (x telg). Ühendage vastavad punktid. Mannani kontsentratsiooni (pg/ml) määramine testides. Mannani kontsentratsiooni (pg/ml) saab määrata iga i jaoks kalibratsioonikõveralt. Tulemuste tõlgendamine: Proovid, mille kontsentratsioon on väiksem kui 62.5 pg/ml (C < 62.5) loetakse mannan antigeeni osas negatiivseks. Proovid, mille kontsentratsioon on vahemikus 62.5 pg/ml ja 125 pg/ml (62.5 C < 125) loetakse mannan antigeeni osas vahepealseks. Proovid, mille kontsentratsioon on võrdne või suurem kui 125 pg/ml (C 125) loetakse mannan antigeeni osas positiivseks. Kalibratsioonikõvera joonistamiseks kasutatud punktid ei võimalda tiitrida kontsentratsioone üle 500 pg/ml. Et määrata täpsemalt tugevalt positiivsete ide kontsentratsioone, tuleb testi korrata, lahjendades eelnevalt töödeldud i (uuesti töödeldud) supernatandi vahekorras 1/5 pesemislahuse töölahusega (vt. jaotust 8). Tugevalt positiivse i kontsentratsiooni arvutamiseks korrutatakse saadud tiiter 5-ga. Vahepealset tulemust saab kinnitada, kui võetakse mõne nädala pärast samalt patsiendilt uus. 13- KASUTAMISE PIIRANGUD 1. Negatiivne testitulemus ei välista invasiivset kandidoosi, kuna nakkuse ajal on kontsentratsioonid väga madalad ja mannan antigeen elimineeritakse kiiresti. Invasiivset kandidoosi saab diagnoosida ainult arvestades nii kliinilisi, terapeutilisi, radioloogilisi, tsütoloogilisi, otseseid mükoloogilisi, kui seroloogilisi andmeid, interpreteerides igat üksikkriteeriumit ettevaatusega. 2. Negatiivset vastust mannan antigeeni osas tuleb interpreteerida koos mannani vastaste antikehade testi tulemusega: isegi invasiivse kandidoosi korral on mannani antigeeni raskem määrata kui mannani vastaseid antikehi ( vt. jaotus 15 Resultatiivsus). 3. Mannan antigeeni määramise resultatiivsus seerumis või plasmas on seotud testide tegemise sagedusega. Soovitav on regulaarne kõrge riskiga patsientide jälgimine ja mannani vastaste antikehade skriinimine, et suurendada testi tundlikkust ja varajast positiivsust. 4. Proovide testimisel mannan antigeeni suhtes tuleb järgida Platelia Candida Ag Plus testi protseduuri ning tulemuste tõlgendamist. Enne testi alustamist peab kasutaja hoolikalt juhendi läbi lugema. Eriti hoolikalt tuleb kinni pidada ide ja reaktiivide pipeteerimise, plaadi pesemise ja inkubatsiooniaegade protseduurireeglitest. 6

7 5. Kui ei lisata e ja reaktiive nõuetekohaselt, võib tulemuseks olla valepositiivne vastus. Kaaluda tuleb kordusuuringut lisaidega, kui on kliiniline kahtlus invasiivsele kandidoosile või protseduuriveale. 6. Kui mikroplaate käsitletakse lohakalt või reaktiive lisatakse halvasti pipeteerides, võib esineda ristsaastumist kannude vahel ning negatiivsed patsiendiid võivad kontamineeruda positiivse kontrolli või patsiendiiga. 7. Platelia Candida Ag Plus testi pole hinnatud neonataalsete või pediaatriliste patsiendiidega. 8. Platelia Candida Ag Plus testi pole hinnatud käsitsi lugemises osas ja/või visuaalse tulemuste hindamise suhtes. 9. Mõningatel patsientidel, kes saavad teatud partiist pärineva hüdroksüetüültärklisega plasma mahtu suurendavat infusioonravi (nagu Hesteril 6%), mida tehakse tsirkulatoorsete häirete (hüpovoleemia, hemorraagiline shokk ja septiline shokk) korral, on täheldatud ristreaktsioone. 10. Valepositiivseid tulemusi on saadud idega, mis sisaldavad inimese gammaglobuliine 60 g/l ning ka mõningate idega, mis olid reaktiivsed toksoplasma vastaste antikehade suhtes. 14- OODATAVAD TULEMUSED Candida mannan antigeeni esinemissagedust uuriti Platelia Candida Ag Plus testiga 613 ist koosnevas paneelis, mis pärines 51 hollandi patsiendilt (asukoht 1 Holland), kes olid hospitaliseeritud vähiraviks intensiivse kemoteraapiaga (49 onkohematoloogilist patsienti ja 2 mittehematoloogilist vähki). 613 ist osutusid 88 positiivseteks ja 51 vahepealseteks, esinemissagedus 88/613 = 14.4% IC 95%: %, kui lugeda vahepealsed tulemused negatiivseks ja 139/613 = 22.7% IC 95%: %, kui lugeda vahepealsed tulemused positiivseks. Testitud 51 patsiendil oli vähemalt üks positiivne 23 ja 14 oli vähemalt üks vahepealne ja mitte ühtegi positiivset, sagedus 23/51 = 45.1% IC 95%: %, kui lugeda vahepealne tulemus negatiivseks ja 37/51 = 72.6% IC 95%: %, kui lugeda vahepealne tulemus positiivseks. Neist 51 patsiendist 30 (388 ei esinenud dokumenteeritud invasiivset kandidoosi. Ülejäänutest 20 oli koloniseeritud pärmseentega (12 Candida albicans iga, 7 Candida albicans koos teise Candida liigiga ja 1 oli koloniseeritud vähemalt ühe Candida ga mis polnud Candida albicans). Neljal patsiendil esinesid kliinilised sümptomid ja mikrobioloogilised tõendid pindmisest Candida infektsioonist. Tõsine limaskesta kahjustus oli 24 patsiendil. Vastavast 388 ist oli 41 positiivset ja 43 vahepealset esinemissagedus 41/388 = 10.6% IC 95%: %, kui lugeda vahepealsed tulemused negatiivseks ja 84/388 = 21.7% IC 95%: %, kui lugeda vahepealsed tulemused positiivseks. Mis puutub uuritud 30 patsienti, siis 10 oli vähemalt 1 positiivne ja 11 vähemalt üks vahepealne ja mitte ühtegi positiivset, esinemissagedus 10/30 =33.3% IC 95%: %, kui lugeda vahepealsed tulemused negatiivseks ja 21/30 = 70.0% IC 95%: %, kui lugeda vahepealsed tulemused positiivseks. 15- TOIMIMISE KARAKTERISTIKUD A. Reprodutseeritavuse uuringud Analüüsisisene täpsus (korratavus): Et hinnata analüüsisisest korratavust, testiti viit i (kahte negatiivset ja kolme positiivset) 32 korda ühe analüüsikorra jooksul. Iga i kontsentratsioon määrati pg/ml. Keskmine kontsentratsioon, standardhälve (SD) ja variatsioonikoefitsent (%CV) iga i kohta on toodud alljärgnevas tabelis: Analüüsisisene täpsus (korratavus) N=32 Negatiivne Keskmine kontsentratsioon (pg/ml) Tugevalt negatiivne Madal positiivne Keskmine positiivne Kõrge positiivne SD CV% 16.3% 9.5% 6.7% 5.2% 6.5% Analüüsidevaheline täpsus (reprodutseeritavus): Et hinnata analüüsidevahelist reprodutseeritavust, testiti viit i (kahte negatiivset ja kolme positiivset), igat duplikaadina, kahes seerias päeva jooksul 20 päevase perioodi vältel. Iga i kontsentratsioon määrati pg/ml. Keskmine kontsentratsioon, standardhälve (SD), variatsioonikoefitsent (%CV) iga i kohta on toodud alljärgnevas tabelis: Analüüsidevaheline täpsus (reprodutseeritavus) N=80 Negatiivne Keskmine kontsentratsioon (pg/ml) Tugevalt negatiivne Madal positiivne Keskmine positiivne Kõrge positiivne SD CV% 29.0% 20.8% 20.7% 18.6% 14.6% 7

8 B. Ristreaktiivsus Patoloogia Testitud ide arv Positiivsete arv Vahepealsete arv Aspergillus ds-dna vastased antikehad Positiivsed ANAd Müeloomi IgG ja IgM Toxoplasma vastased IgG Inimese hiirevastased antikehad Reumatoidfaktor C. Lineaarsus Platelia Candida Ag Plus testi lineaarsus 4 positiivse i lahjenduste uurimisel oli vahemikus 20 kuni 470 pg/ml. D. Kliinilised uuringud Platelia Candida Ag Plus testi toimimise karakteristikuid hinnati 3 kohas, kokku 852 i, mis pärinesid 505 patsiendilt. TUNDLIKKUS Platelia Candida Ag Plus testi tundlikkus määrati 436 ist koosnevas paneelis, id pärinesid 89 patsiendilt, kes olid hospitaliseeritud 2 asukohas (Hollandis ja Prantsusmaal). Proovid jaotusid järgnevalt: 1. asukoht (Holland): 225 i 21 hollandi patsiendilt, kes olid ravil onkohematoloogias maliigse hemopaatiaga (19 juhtu) või mittehematoloogilise vähiga (2 juhtu), said intensiivset kemoteraapiat, millele järgnes sobivusel hematopoeetiliste tüvirakkude transplantatsioon. Kõikidel nendel patsientidel esines mikrobioloogiliselt kinnitatud (vähemalt üks positiivne külv Candidale verekülvis või normaalselt steriilses koevedelikus) invasiivne kandidoos asukoht (Prantsusmaa): 211 i 68 prantsuse patsiendilt, kes olid hospitaliseeritud erinevates intensiivravi või onkohematoloogia palatites invasiivse kandidoosiga, mis oli mikrobioloogiliselt kinnitatud vähemalt ühe positiivse verekülviga Candida spp-le. NB: Vereid ipaneelis, mida kasutati antud kahes uuringus, koguti patsientidelt ajavahemikus 1999 kuni Mannan antigeeni ja anti-mannan antikehade relatiivne stabiilsus ides külmutamise ajal ning igakordse külmutus-sulatus tsükli järel muudab tulemused sõltuvaks uuritava testpaneeli säilitustingimustest. Seetõttu võivad retrospektiivse kliinilise uuringu testväärtused olla madalamad kui värskete idega teostatud kliinilise uuringu tulemused. 1. asukoha tulemused 21 hollandi patsienti olid hospitaliseeritud maliigse hemopaatia (akuutne müeloidne leukeemia, akuutne lümfaatiline leukeemia, krooniline lümfaatiline leukeemia, müeloom, müelodüsplastiline sündroom, aplastiline aneemia või Mitte-Hodgkini lümfoom) või mittehematoloogilise vähi raviks, millele järgnes sobivusel hematopoeetiliste tüvirakkude transplantatsioon. Kõigil 21 patsiendil esines mikrobioloogiliselt kinnitatud (vähemalt üks positiivne külv Candidale verekülvis või normaalselt steriilses koevedelikus) invasiivne kandidoos. Platelia Candida Ag Plus testiga määratud tulemus loeti Candida mannan antigeenile positiivseks, kui vähemalt üks andis positiivse vastuse. Positiivse i puudumisel loeti tulemus vahepealseks, kui vähemalt üks patsiendi andis vahepealse tulemuse ja negatiivseks, kui kõik patsiendiid olid negatiivsed. 17 Patsientide kategooriad 21 patsienti (225, kus vähemalt üks külv oli Candida spp. positiivne Platelia Candida Ag Plus tulemused Patsientide arv (ide arv) positiivsed vahepealsed negatiivsed vahepealsed loeti negatiivseteks 13 (47) 3 (8) 5 (170) 61.9% 95% IC % vahepealsed loeti positiivseteks 76.2% 95% IC % Koos Platelia Candida Ag Plus testiga uuriti e ka mannani vastaste antikehade suhtes, kasutades Platelia Candida Ab Plus testi. 9 Patsiendi staatus loeti mannan antigeeni või mannanivastaste antikehade suhtes positiivseks, kui vähemalt ühe testi tulemus oli positiivne. Kui vähemalt ühe testi tulemus oli vahepealne, loeti staatus vahepealseks ja negatiivseks siis, kui mõlemad testitulemused olid negatiivsed. Patsientide kategooriad 21 patsienti (225, kus vähemalt üks külv oli Candida spp. positiivne Platelia Candida Ag Plus ja Platelia Candida Ab Plus kombineeritud tulemused Patsientide arv (ide arv) positiivsed vahepealsed negatiivsed vahepealsed loeti negatiivseteks vahepealsed loeti positiivseteks 15 (98) 4 (34) 2 (93) 71.4% 90.5% 95% IC % 95% IC % 8

9 2. asukoha tulemused 68 prantsuse patsienti olid hospitaliseeritud erinevates intensiivravi (kirurgia, transplantatsiooni, põletused, trauma, pneumoloogia, jne.) või onkohematoloogia (maliigsed hemopaatiad) palatites. Kõigil esines invasiivne kandidoos, mis oli mikrobioloogiliselt kinnitatud vähemalt ühe positiivse verekülviga Candida-le (albicans, parapsilosis, norvegensis, glabrata, krusei või tropicalis) 6,7,14 kas enne või pärast testimist. Vereid koguti (keskmiselt) 6 päeva pärast esimest positiivset verekülvi Candida-le (minimaalselt 61 päeva enne maksimaalselt 67 päeva pärast). Patsientide staatus loeti Candida mannan antigeen positiivseks, kui vähemalt üks andis positiivse vastuse. Positiivse i puudumisel loeti tulemus vahepealseks, kui vähemalt üks patsiendi andis vahepealse tulemuse ja negatiivseks, kui kõik patsiendiid olid negatiivsed. Patsientide kategooriad 68 patsienti (211, kus vähemalt üks verekülv oli Candida spp. positiivne Platelia Candida Ag Plus tulemused Patsientide arv (ide arv) positiivsed vahepealsed negatiivsed vahepealsed loeti negatiivseteks 35 (86) 7 (14) 26 (111) 51.5% 95% IC % vahepealsed loeti positiivseteks 61.8% 95% IC % - sisaldades 34 C. albicansi ( (55) 6 (12) 6 (46) 64.7% 82.5% 95% IC % 95% IC % - sisaldades 15 C. parapsilosis t (37 2 (3) 1 (1) 12 (33) 13.3% 20.0% 95% IC % 95% IC % - sisaldades 12 C. glabrata t (32 7 (13) 0 (0) 5 (19) 58.3% 66.7% 95% IC % 95% IC % - sisaldades 4 C. tropicalis t (19 4 (15) 0 (1) 0 (3) 100.0%* 100.0%* - sisaldades 2 C. krusei (19 0 (0) 0 (0) 2 (8) 0.0%* 0.0%* - sisaldades 1 C. norvegensis t (19 0 (0) 0 (0) 1 (2) 0.0%* 0.0%* *: 95% tõenäosusintervall jäi ide vähesuse tõttu arvutamata. Koos Platelia Candida Ag Plus testiga uuriti samu e ka mannani vastaste antikehade suhtes, kasutades Platelia Candida Ab Plus testi. 9 Patsiendi staatus loeti mannan antigeeni või mannanivastaste antikehade suhtes positiivseks, kui vähemalt ühe testi tulemus oli positiivne. Kui vähemalt ühe testi tulemus oli vahepealne, loeti staatus vahepealseks ja negatiivseks siis, kui mõlemad testitulemused olid negatiivsed. Patsientide kategooriad Platelia Candida Ag Plus ja Platelia Candida Ab Plus kombineeritud tulemused Patsientide arv (ide arv) positiivsed vahepealsed negatiivsed vahepealsed loeti vahepealsed loeti negatiivseteks positiivseteks 68 patsienti (211, kus 48 (122) 8 (40) 12 (49) 70.6% 82.4% vähemalt üks verekülv oli Candida 95% IC % 95% IC % spp. positiivne - sisaldades 34 C. albicansi ( (74) 2 (22) 4 (17) 82.4% 88.2% 95% IC % 95% IC % - sisaldades 15 C. parapsilosis t (37 5 (7) 6 (15) 4 (15) 33.3% 73.3% 95% IC % 95% IC % - sisaldades 12 C. glabrata t (32 11 (24) 0 (3) 1 (5) 91.7% 91.7% 95% IC % 95% IC % - sisaldades 4 C. tropicalis t (19 4 (17) 0 (0) 0 (2) 100.0%* 100.0%* - sisaldades 2 C. krusei (19 0 (0) 0 (0) 2 (8) 0.0%* 0.0%* - sisaldades 1 C. norvegensis t (19 0 (0) 0 (0) 1 (2) 0.0%* 0.0%* *: 95% tõenäosusintervall jäi ide vähesuse tõttu arvutamata. SPETSIIFILISUS Spetsiifilisuse uuring teostati kahest asukohast Prantsusmaal pärinevast 416 ist koosneva paneeliga, id jaotusid järgnevalt: Asukoht 1: 200 i 200 prantsuse naiselt, keda monitooriti toksoplasmoosi suhtes raseduse ajal ning kel puudusid kliinilised Candida nakkuse sümptomid. Asukoht 2: 219 i 216 prantslasest veredoonorilt. Patsientide kategooriad 200 rasedat naist (200, keda monitooriti seroloogiliselt toksoplasmoosile Platelia Candida Ag Plus tulemused Patsientide arv (ide arv) Spetsiifilisus, kui positiivsed vahepealsed negatiivsed vahepealsed loeti positiivseteks % 95% IC % 216 veredoonorit ( % 95% IC % Spetsiifilisus, kui vahepealsed loeti negatiivseteks 98.5% 95% IC % 99.5% 95% IC % 9

10 16- TOOTJAPOOLNE KVALITEEDIKONTROLL Kõik toodetud ja turustatud reaktiivid läbivad täieliku kvaliteedikontrolli alates toorme hankimisest ja lõpetades toote lõpliku turuleviimisega. Iga partii läbib kvaliteedikontrolli ning see lubatakse müüki ainult nõuetele vastavuse korral. Iga partii valmimist ja kontrollimist kajastavaid dokumente säilitatakse Bio-Rad ettevõttes. 17- BIBLIOGRAAFIA 1- Alam, F.F., Mustafa, A.S., Khan, Z.U Comparative evaluation of (1,3)-beta-D-glucan, mannan and anti-mannan antibodies, and Candidaspecies-specific snpcr in patients with candidemia. BMC Infectious Diseases 7(103): p Ascioglu, S., Rex, J.H., de Pauw, B., Bennett, J.E., Bille, J., Crokaert, F.,Denning, D.W., Donnelly, J.P., Edwards, J.E., Erjavec, Z., Fiere, D.,Lortholary, O., Maertens, J., Meis, J.F., Patterson, T.F., Ritter, J., Selleslag,D., Shah, P.M., Stevens, D.A., Walsh,T.J Defining opportunistic invasive fungal infections in immunocompromised patients with cancer and hematopoietic stem cell transplants: An international consensus. Clinical Infectious Diseases 34: p Ellepola, A.N.B., Morrison, C.J Laboratory Diagnosis of Invasive Candidiasis. Journal of Microbiology 43 (No. S): p Ellis, M., Al-Ramadi, B., Bernsen, R., Kristensen, J., Alizadeh, H., Hedstrom,U Prospective evaluation of mannan and anti-mannan antibodies for diagnosis of invasive Candida infections in patients with neutropenic fever. Journal of medical microbiology 58(5): p Guery, B.P., Arendrup, M.C., Auzinger, G., Azoulay, E., Borges Sá, M.,Johnson, E.M., Müller, E., Putensen, C., Rotstein, C., Sganga, G., Venditti,M., Zaragoza Crespo, R., Kullberg, B.J Management of invasive candidiasis and candidemia in adult non-neutropenic intensive care unit patients: Part I. Epidemiology and diagnosis. Intensive Care Med. 35: p Nucci, M., Colombo, A.L Candidemia due to Candida tropicalis: clinical, epidemiologic, and microbiologic characteristics of 188 episodes occurring in tertiary care hospitals. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease 58: p Oliveri, S., Trovato, L., Betta, P., Romeo, M.G., Nicoletti, G Experience with the Platelia Candida ELISA for the diagnosis of invasive candidiosis in neonatal patients. Clinical Microbiology and Infection 14 (4): p Pappas, P.G., Kauffman, C.A., Andes, D., Benjamin D.K.Jr., Calandra, T.F.,Edwards, J.E. Jr, Filler, S.G., Fisher, J.F., Kullberg, B.J., Ostrosky-Zeichner,L., Reboli, A.C., Rex, J.H., Walsh, T.J., Sobel, J.D Clinical Practice Guidelines for the Management of Candidiasis: 2009 Update by the Infectious Diseases Society of America. Clinical Infectious Diseases 48: p Persat, F., Topenot, R., Piens, M.A., Thiebaut, A., Dannaoui, E., Picot, S Evaluation of different commercial ELISA methods for the serodiagnosis of systemic candidiosis. Mycoses 45: p Prella, M., Bille, J., Pugnale, M., Duvoisin, B., Cavassini, M., Calandra, T.,Marchetti, O Early diagnosis of invasive candidiasis with mannan antigenemia and antimannan antibodies. Diagnostic Microbiology andinfectious Disease 51: p Rentz, A.M., Halpern, M.T., Bowden, R The Impact of Candidemia on Length of Hospital Stay, Outcome, and Overall Cost of Illness. Clinical Infectious Diseases 27: p Ruan, S.-Y., Hsueh, P.-R Invasive Candidiasis: An Overview from Taiwan. J. Formos. Med. Assoc. 108(6): p Sendid, B., Poirot, J.L., Tabouret, M., Bonnin, A., Caillot, D., Camus, D.,Poulain, D Combined detection of mannanaemia and anti mannan antibodies as a strategy for the diagnosis of systemic infection caused by pathogenic Candida species. J. Med. Microbiol. 51: p Sendid, B., Caillot, D., Baccouch-Humbert, B., Klingspor, L., Grandjean, M.,Bonnin, A., Poulain, D Contribution of the Platelia Candida-specific antibody and antigen tests to early diagnosis of systemic Candida tropicalis infection in neutropenic adults. Journal of Clinical Microbiology 41(10): p Tortorano, A.M., Peman, J., Bernhardt, H., Klingspor, L., Kibbler, C.C., Faure,O., Biraghi, E., Canton, E., Zimmermann, K., Seaton, S., Grillot, R Epidemiology of Candidaemia in Europe: Results of 28-Month European Confederation of Medical Mycology (ECMM) Hospital-Based Surveillance Study.Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 23: p Vardakas, K. Z., Michalopoulos, A., Kiriakidou, K. G., Siampli, E. P.,Samonis, G., Falagas, M. E Candidaemia: incidence, risk factors, characteristics and outcomes in immuno competent critically ill patients. Clin. Microbiol. Infect. 15: p Verduyn Lunel, F.M., Donnelly, J.P., van der Lee, H. A. L., Blijlevens, N.M. A.,Verweij, P. E Circulating Candida-specific anti-mannan antibodies precede invasive candidiasis in patients undergoing myelo-ablative chemotherapy. Clin. Microbiol. Infect. 15(4): p Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) /2011 Fax : +33 (0)