Vakcinacijos įtaka eksperimentinio autoimuninio proceso eigai

Transcription

1 Gerontologija 9; (): 9 43 GERONTOLOGIJA Mokslinis straipsnis Vakcinacijos įtaka eksperimentinio autoimuninio proceso eigai L. Leonavičienė, R. Bradūnaitė, D. Vaitkienė,, A. Vasiliauskas, A. Venalis, Vilniaus universiteto Eksperimentinės ir klinikinės medicinos institutas Vilniaus universito Medicinos fakultetas Santrauka Darbo tikslas. Panaudojant eksperimentinį žiurkių artrito modelį adjuvantinį artritą (AA), įvertinti, ar imunizacija erkinio encefalito vakcina galėtų sukelti bei sustiprinti autoimuninio proceso eigą. Tyrimo medžiaga ir metodai. Darbui panaudoti 4 Wistar populiacijos lytiškai subrendę žiurkių patinai (3 su sukeltu AA ir sveikų gyvūnų). Naudojant profilaktinį ir terapinį vakcinacijos protokolus, dvi gyvūnų grupės su AA ir viena sveikų žiurkių grupė (7 gyvūnai) imunizuotos komercine erkinio encefalito vakcina (dozė, ml), suleidžiant ją keturis kartus į raumenis. Kontrolinėms grupėms (žiurkės su AA ir sveikų gyvūnų grupė) į raumenis buvo leidžiamas atitinkamas kiekis fiziologinio tirpalo. Bandymo metu įvertinta gyvūnų kūno ir organų masė, kraujo bei serumo pro/antioksidantinės sistemos rodikliai, sąnarių patinimas, poliartritų atsiradimas bei histologiniai pokyčiai sąnariuose, kepenyse ir plaučiuose. Rezultatai. Vakcinuotiems gyvūnams buvo stebimas agresyvesnis patologinis procesas: reikšmingai padidėjo ENG, blužnies masė, sumažėjo čiobrialiaukės masė, atsirado ryškesnių histologinių pokyčių kepenyse ir sąnariuose. Terapinė artritinių žiurkių ir sveikų gyvūnų vakcinacija padidino maloninio dialdehido (MDA) kiekį bei reikšmingai sumažino katalazės Adresas: Laima Leonavičienė Žygimantų g. 9, Vilnius Tel. (8-5) El. paštas: [email protected] aktyvumą, bet neturėjo įtakos kraujo serumo antioksidantiniam aktyvumui (AOA). Taikant terapinę vakcinaciją artritiniams gyvūnams rasta ryškesnė negu kontroliniams riebalinė distrofija, V.centralis pilnakraujystės padidėjimas ir plazminių ląstelių atsiradimas, o nekrozinių procesų sustiprėjimas bei uždegiminė kepenų stromos infiltraciją limfocitais ir makrofagais aptikta taikant abu vakcinacijos protokolus. Reikšmingai didėjo ir kepenų bendra uždegiminė infiltracija bei uždegiminių ląstelių skverbimasis į skiltelę. Jokių uždegiminės infiltracijos požymių nerasta sveikiems vakcinuotiems gyvūnams. Imunizacija erkinio encefalito vakcina neturėjo didelės įtakos plaučių morfologijai. Tik esant intersticiniam pažeidimui profilaktinė vakcinacija reikšmingai sustiprino infiltraciją limfocitais ir gigantinių makrofagų atsiradimą reumatoidinėje granulomoje. Vakcinuotiems gyvūnams sustiprėjo sąnarių patinimas bei histologiniai pokyčiai juose. Terapinė gyvūnų su AA vakcinacija reikšmingai padidino uždegiminę infiltraciją, sustiprino edemą ir angiomatozę minkštuose sąnario audiniuose, infiltraciją granulocitais sinovijoje. Vakcinuotiems artritiniams gyvūnams atsirado fisurų, ko nebuvo stebėta kontrolinėje AA grupėje, be to 33,3 proc. ir 6,7 proc. sustiprėjo kremzlės suplonėjimas taikant profilaktinį ir terapinį vakcinacijos protokolus. Imunizavus erkinio encefalito vakcina sveikas žiurkes, autoimuninio proceso atsiradimas nenustatytas, išskyrus nežymius histologinius pokyčius kai kurių gyvūnų sąnariuose. Išvados. Gyvūnų su autoimuniniu procesu imunizacija erkinio encefalito vakcina sustiprina jo eigą: padidėja sąnarių

2 3 L. Leonavičienė, R. Bradūnaitė, D. Vaitkienė, A. Vasiliauskas, A. Venalis patinimas ir histologiniai pokyčiai juose, sustiprėja prooksidantinis aktyvumas ir uždegiminio proceso rodikliai. Ryškesni pokyčiai stebėti taikant terapinę vakcinaciją. Raktažodžiai: žiurkės, adjuvantinis artritas, vakcinacija Įvadas Žmonių populiacija sparčiai senėja, todėl pagyvenusių asmenų XXI a. pradžioje yra žymiai daugiau nei anksčiau. Manoma, kad 5 m. apie 4 proc. Europos ir Jungtinių Amerikos valstijų populiacijos sudarys asmenys virš 6 metų []. Jungtinių tautų atlikta analizė pateikia šiek tiek kitokius duomenis ir rodo, kad pagyvenusių žmonių pasaulyje padidėjo nuo 8 proc. 95 m. iki proc. m.; šis procentas nuolat didėja, todėl manoma, jog 5 m. jų populiacija sudarys proc. []. Senėjanti populiacija kelia vis didesnį rūpestį sveikatos apsaugos sistemai, kadangi senstant didėja žmonių jautrumas infekcijoms, sumažėja atsakas į vakcinaciją [3, 4]. Pvz., gripo virusas, sukeliantis kasmetines epidemijas, pagyvenusiems žmonėms yra viena iš dešimties dažniausių mirtingumo priežasčių. Tai vyksta dėl imuninės sistemos senėjimo [5, 6]. Joje, ilgėjant žmonių amžiui, vyksta būdingi pokyčiai, vadinami imuniniu senėjimu (immunosenescence) [3, 7], kurie yra daugialypiai ir nevisiškai suprantami [8]. Tai lemia didesnį infekcinių ligų atsiradimą bei nepakankamą apsaugą naudojant vakcinas. Vienas svarbiausių senėjimo požymių yra čiobrialiaukės involiucija, progresuojantis naivių T ląstelių mažėjimas, todėl mažėja pirminės vakcinacijos sėkmė [9 ]. Kadangi vakcinų aktyvumas priklauso nuo imuninio atsako kokybės, silpnesnės imuninės sistemos individai, tokie kaip labai maži vaikai ir pagyvenę asmenys nėra pakankamai apsaugoti [, ]. Senėjant populiacijai ne tik mažėja galimybė gaminti pakankamą efektorinių ląstelių kiekį vykstant imuniniam atsakui, bet ir pakinta gretimi audiniai supantys šias ląsteles [3]. Atsako į gripo vakciną efektyvumas, lyginant su 7 9 proc. sveikiems suaugusiems, sudaro 7 53 proc. pagyvenusiems [4]. Tiriant erkinio encefalito vakcinos poveikį asmenims vyresniems nei metų, pasirodė, jog laikas nuo paskutinės vakcinacijos ir amžius statistiškai reikšmingai veikia antivirusinių antikūnų titrus [4]. Didėjant amžiui mažėja antikūnų koncentracija po vakcinacijos, o asmenims virš 6 metų dažniausiai nebūna apsauginės antikūnų koncentracijos. Todėl autoriai [4] daro išvadą, kad gyvenimo eigoje imunologinis atsakas į vakcinaciją mažėja, ir kad bendrai priimtos vakcinacijos strategijos, taikomos vaikams ir jaunimui, negali būti taip pat taikomos ir pagyvenusiems asmenims. Pastaraisiais metais gana aktyviai tyrinėjamas galimas ryšys tarp vakcinacijos ir autoimuninių ligų atsiradimo bei saugumo vakcinuojant pacientus, sergančius autoimuninėmis ligomis. Literatūroje aprašyti klinikiniai atvejai, ir atskiri gyvūnų tyrimai, apimantys autoimunines ligas, susijusias su vakcinacija [5, 6]. Egzistuoja nemažai stebėjimų, kad vakcinos skatina lėtinių ligų, tokių kaip išsėtinė sklerozė, diabetas, lėtinis artritas, atsiradimą [5, 7 ]. Šios ligos, ypač reumatoidinis artritas, atsiranda vyresnio amžiaus žmonėms. Galutinių išvadų dėl priežastinio ryšio tarp vakcinacijos ir autoimuninių ligų vystymosi nėra [8]. Nagrinėjant vakcinacijos problemą reumatologijoje, iškyla mažiausiai trys klausimai: ar įprastinė vakcinacija gali būti autoimuninės reumatinės ligos skatinamasis veiksnys, ar vakcinuojant sergančius reumatinėmis ligomis galima sukelti ligos paūmėjimą, bei kurios vakcinos dažniau, o kurios rečiau sukelia autoimunines reakcijas? Literatūroje paskelbti RA atvejai, susiję su juodligės vakcina [], tyrimai, skirti ligos aktyvumui ir antikūnų susidarymui po gripo vakcinacijos, sergant RA ar SRV [], artritai, susiję su vakcinacija nuo raudonukės [3]. Aprašyti pavieniai atvejai, kai po vakcinacijos gripo, stabligės, hepatito ir kita vakcina atsiranda ar sustiprėja RA simptomai [4 6]. Tačiau reikia pažymėti, kad autoimuninių ligų po vakcinacijos atvejai nėra patvirtinti dideliu klinikinių stebėjimų skaičiumi ir jokių didelės apimties ar atvejus kontroliuojančių tyrimų, patvirtinančių vakcinų įtaką minėtų ligų atsiradimui, iki šiol nėra [, 7]. Ryšys tarp vakcinų ir autoimuniteto vis dar neaiškus. Laboratorinių eksperimentų šiuo klausimu neatlikta ir tyrimams beveik nenaudojami gyvūnų modeliai. Literatūroje pavyko aptikti tik vieną paskelbtą placebu kontroliuojamą tyrimą, kuriame tirtas galimas priežastinis ryšys tarp vakcinų ir autoimuninių ligų: sveiki šuniukai buvo imunizuojami įvairiomis vakcinomis, jiems buvo rasta įvairių antikūnų, tačiau jokia tikra autoimuninė liga nebuvo nustatyta [8]. Kai kurie eksperimentiniai duomenys teigia, kad priklausomai nuo vakcinacijos laiko, ji gali arba apsaugoti nuo autoimuninės ligos arba sustiprinti ją [9, 3]. Ši teorija paremta į diabetą linkusioms nenutukusioms diabetinėms (NOD) pelėms atsirandančia padidėjusia autoimuninio diabeto rizika įskiepijus pediatrines vakcinas [3]. Tačiau kitų autorių darbai šių eksperimentinių duomenų nepatvirtino [3]. Įdomus Koppang ir bendraautorių darbas [33], kuria-

3 Vakcinacijos įtaka eksperimentinio autoimuninio proceso eigai me teigiama, jog komerciniais tikslais veisiamų lašišų vakcinavimas nuo infekcijų sukelia autoimuninius pokyčius, panašius į pelių vilkligės modelį autoantikūnų atsiradimą, IgM kiekio padidėjimą, trombozę ir uždegiminę granulomatozę kepenyse bei imuninių kompleksų sukeltą glomerulonefritą. Pelės ir žiurkės yra dažniausiai modeliuose naudojami maži gyvūnai tyrinėjant gripo ir erkinio encefalito virusų sukeliamų ligų patogenezę [34 37]. Mūsų atlikti preliminarūs duomenys [6] pirmą kartą parodė tam tikrą ryšį tarp vakcinacijos ir autoimuninės ligos sustiprėjimo. Imunizavus artritu sergančias žiurkes gripo vakcina padidėjo sąnarių patinimas, sustiprėjo pokyčiai minkštuosiuose audiniuose, dengiančiuose sąnarį, didesniam gyvūnų skaičiui rasta sinovijos ir kremzlės pažeidimų. Kliniškai matomo autoimuninio proceso nestebėta sveikų vakcinuotų gyvūnų grupėje, išskyrus minimalius histologinius pokyčius kai kurių gyvūnų sąnariuose. Atsižvelgiant į gautus rezultatus, šiame mūsų darbe buvo įdomu patyrinėti, kaip erkinio encefalito vakcina galėtų veikti autoimuninio proceso eigą, kadangi panašaus pobūdžio tyrimų literatūroje nepavyko aptikti. Erkinio encefalito virusas (EEV), priklausantis Flaviviridae šeimai, paplitęs daugelyje Europos (Europos potipis) ir Azijos (Tolimųjų Rytų potipis) šalių, ir yra perduodamas įsisiurbus Ixodes ricinus bei Ixodes persulcatus erkėms [38]. Tai vienas iš patogeniškiausių flavivirusų žmonėms. Letališkumas nuo erkinio encefalito Europoje yra,5proc., o poencefalitinis sindromas stebimas daugiau kaip 4 proc. paveiktų pacientų, dažnai sukeldamas gyvenimo kokybės pablogėjimą [39]. Nors, kaip manoma, endeminėje srityje tik vienam iš erkės įkąstam asmeniui atsiranda liga [4], tačiau eilėje šalių vykdoma aktyvi imunizacija, naudojant užmuštą viruso vakciną arba taikant pasyvią imunizaciją EEV imunoglobulinu. Duomenų, kad imunizacija galėtų lemti autoimuninių ligų sustiprėjimą literatūroje nepavyko aptikti. Todėl šio darbo tikslas nustatyti, ar imunizacija erkinio encefalito vakcina gali turėti įtakos autoimuninių procesų atsiradimui bei sustiprinti žiurkių adjuvantinį artritą (AA). Medžiaga ir tyrimo metodai Eksperimentiniai gyvūnai Darbui panaudoti 4 Wistar populiacijos lytiškai subrendę žiurkių patinai (kūno masė 8 g), gauti iš VU Imunologijos instituto veislyno (Vilnius, Lietuva). Gyvūnai buvo laikomi standartinėmis sąlygomis plastikiniuose, žiurkėms skirtuose, narveliuose, naudojant medžio drožlių paklotus, palaikant kambario temperatūrą ir šviesos-tamsos režimą bei šeriami kombinuotu pašaru, atitinkančiu laboratorinių gyvūnų fiziologines normas ir pagamintu laikantis ES reikalavimų pašarams (AB Kėdainių grūdai ). Viso eksperimento metu gyvūnai laisvai pasiekdavo maistą ir geriamą vandenį. Aklimatizacijos periodas prieš pradedant bandymą 4 dienos. Viso bandymo metu gyvūnais rūpinamasi laikantis Europos konvencijos dėl Laboratorinių gyvūnų naudojimo ir darbo su jais taisyklių bei Lietuvos Respublikos įstatymų. Eksperimentams atlikti buvo gautas Lietuvos laboratorinių gyvūnų naudojimo etikos komisijos prie Valstybinės maisto ir veterinarijos tarnybos leidimas. Medžiagos Adjuvantinio artrito (AA) sukėlimui naudotas pilnasis Froindo adjuvantas (CFA) (Calbiochem, JAV). Imunizacijai - komercinė erkinio encefalito (ENCERUP suaugusiems, Novartis Vaccines and Diagnostics GmbH & Co. KG; D-356 Marburg, Vokietija,,5 ml suspensija; imunizacinėje dozėje yra: Vaccinum encephalitidis ixodicum advectae inactivatum / K3,5 µg, Aluminum hydroxidum (,3,4 mg Al 3 ), Natrii chloridum, Aqua ad iniectabilia, Saccharum,, Chlortetracyclini, Gentamicini, Neomycini, Formaldehydi) vakcina. Biocheminiams tyrimams: trichloracto, ortofosforo, tiobarbiturinė, azoto, askorbininė rūgštys, geležies sulfatas, amonio molibdatas, vandenilio peroksidas, gauti iš Sigma-Aldrich Chemie and Fluka Chemie GmbH (Vokietija). Histologiniams tyrimams atlikti: proc. formalinas, spirit-formolas, hematoksilin-eozinas, toluidino mėlis, metil-žalias pironinas-9, safraninas O. Adjuvantinio artrito sukėlimas ir uždegiminio proceso rodiklių įvertinimas Adjuvantinis artritas (AA) buvo sukeliamas suleidžiant į kairės užpakalinės kojos padą, ml CFA. Tirti rodikliai, apibūdinantys uždegiminio proceso aktyvumą. Artrito atsiradimas buvo vertinamas kliniškai ir histologiškai. Bandymo eigoje buvo sekama žiurkių kūno masės ir sąnarių patinimo dinamika, registruojant pokyčius 3 kartus per savaitę. Patologiniam procesui sąnariuose įvertinti naudoti du parametrai: kojų sąnarių patinimas matuojamas pletizmografiškai naudojant PVP (Kent Scientific Corporation) ir vertinamas lyginant sveikos ir pažeistos kojos apimtį bei poliartrito atsiradimas kitose galūnėse, į kurias neleistas CFA. Eksperimento trukmė 35 dienos. 3

4 3 L. Leonavičienė, R. Bradūnaitė, D. Vaitkienė, A. Vasiliauskas, A. Venalis Žiurkių su AA imunizacija erkinio encefalito vakcina Atliktos 4 vakcinacijos procedūros. Vienas penktadalis standartinės žmogaus dozės (SŽD;,5 ml) suaugusiems atskiesta iki ml fiziologiniu tirpalu. Dviems gyvūnų su AA grupėms (kiekvienoje po žiurkių) leista po, ml į dešinės kojos šlaunies raumenį, 8, 5 ir 3 dieną (profilaktinė vakcinacija) ir 8, 5, ir 3 dieną (terapinė vakcinacija). 7 sveikos žiurkės vakcinuotos ta pačia vakcinos doze, 8, 5 ir 3 dieną. AA kontrolė gyvūnų grupė, kuriai vietoj vakcinos atitinkamomis dienomis leistas toks pat kiekis fiziologinio tirpalo. Intervalas tarp pirmųjų trijų vakcinacijos procedūrų buvo 7 dienos. Ketvirtoji paskutinė imunizacija atlikta po savaičių taikant profilaktinę vakcinaciją ir po 9 dienų terapinę vakcinaciją. Bendra vakcinos dozė,4 ml SŽD. Praėjus 5 dienoms po paskutinės vakcinacijos gyvūnai (35 eksperimento diena) dekapituoti. Kraujo tyrimai ir audinių pavyzdžiai Eksperimento pabaigoje įvertinta bendra gyvūnų būklė, vidaus organų masė ir makroskopiniai pokyčiai juose, uždegiminio proceso rodikliai. Nustatytas eritrocitų nusėdimo greitis (ENG), leukocitų ir eritrocitų skaičius, panaudojant kraujo analizatorių Picoscale (Vengrija). Tyrimų rezultatai palyginti su sveikų vakcinuotų ir nevakcinuotų gyvūnų grupių duomenimis. Kepenys, plaučiai ir sąnariai paimami tolimesnei histologinei analizei. Kraujas centrifuguojamas prie 8 g min., serumui gauti, kuris užšaldomas C temperatūroje vėlesniam įvertinimui. Lipidų peroksidacijos (MDA), katalazės kiekio ir bendro antioksidantinio aktyvumo nustatymas kraujo serume Atliekamas pro-/antioksidantinio aktyvumo kraujo serume biocheminis įvertinimas. Ištirta malondialdehido (MDA) koncentracija, katalazės kiekis kraujo serume bei bendras antioksidantinis (AOA) kraujo serumo aktyvumas panaudojant anksčiau aprašytas metodikas [4 46]. Histologiniai kepenų, plaučių ir sąnarių tyrimai Gyvūnai dekapituoti praėjus 35 dienoms nuo bandymo pradžios. Įvertinus vidaus organų makroskopinį vaizdą, kepenys, plaučiai ir sąnariai paimti histologiniam tyrimui. Medžiaga iš pažeistų sąnarių fiksuota proc. formaline, kepenų spirito ir formalino (:9) tirpale ir užlieta parafinu. Plaučiai pripompuoti proc. buferiniu formalinu iki jų normalios apimties ir įmerkiami į tą patį fiksacinį tirpalą. Po dekalcifikacijos proc. azoto rūgštyje (HNO 3 ) ir įliejimo į parafiną, sąnarių pavyzdžiai pjaustomi įvairiais lygiais mikrotomu. Parafininiai 5 mikronų storio organų pjūviai dažomi hematoksilino ir eozino mišiniu bendram morfologiniam vaizdui nustatyti, pikrofusinu pagal Van- Gison fibrozei išryškinti, toluidino mėliu (ph 3,4) gliukozaminoglikanams nustatyti, pironinmetilo žaluma pagal Braše plazminėms ląstelėms išryškinti, safraninu O pokyčiams kremzlėje nustatyti ir vertinami naudojant šviesos mikroskopiją. Plaučių audiniai dažomi hematoksilinu ir eozinu įvertinti uždegiminius procesus ir epitelio pažeidimą. Keturi plaučių uždegiminių pokyčių parametrai buvo vertinami kiekviename plaučių pjūvyje: peribronchiolitas (bronchocentrinė granuloma, uždegiminės ląstelės, besikaupiančios smulkių kvėpavimo takų periferijoje, peribronchinė fibrozė), intersticinis pažeidimas (intersticinė pneumonija, susijusi su uždegiminėmis ląstelėmis ir reumatoidinės granulomos su uždegiminių ląstelių infiltracija atsiradimas), alveolių (hemoragijos ir uždegiminė infiltracija) ir kraujagyslių (fibrinoidinė nekrozė, sklerozė, perivaskulinė fibrozė) pažeidimai. Pokyčiai audiniuose vertinami naudojant keturių balų ( 3) sistemą: nėra pokyčių (), ± minimalūs pokyčiai (,5), nedideli (), vidutiniai (), ryškūs pokyčiai (3). Statistika Duomenų statistinė analizė atlikta panaudojant SPSS/ PC programinę įrangą versiją 8. naudojant t testą duomenų statistiniam reikšmingumui įvertinti, kur esant P reikšmėms <,5 jie priimami kaip reikšmingi. Neparametrinis Mann-Whitney testas buvo taikomas įvertinti histologinius pokyčius tiriamuose organuose. Rezultatai Kūno ir organų masės pokyčiai ir kraujo rodikliai Vakcinacijos įtakai sisteminiam uždegimui nustatyti, buvo vertinama kūno ir vidaus organų masė bei kraujo rodikliai. žiurkių su AA ir 7 sveiki gyvūnai buvo imunizuoti 4 kartus erkinio encefalito vakcina (ENCERUP ). Tiriant kūno masės pokyčius sergančių AA gyvūnų grupėse bandymo eigoje stebėtas žymiai mažesnis jos didėjimas, lyginant su sveika vakcinuotų žiurkių grupe. Statistiškai reikšmingi skirtumai aptikti jau nuo 7 tyrimų dienos abiejose vakcinuotose grupėse, (P <,5,), o nuo 9 eksperimento dienos jau ir kontrolėje AA grupėje (P <,5,). Eksperimento gale gyvūnų kūno masė buvo mažesnė lyginant su sveikais vakcinuotais ir nevakcinuotais gyvūnais (duomenys nepateikiami).

5 Vakcinacijos įtaka eksperimentinio autoimuninio proceso eigai Nors tarp AA kontrolės ir vakcinuotų artritinių AA gyvūnų grupių nerasta statistiškai reikšmingų pokyčių, tačiau reikia pažymėti, kad vakcinas gavusių gyvūnų grupėse kūno masė buvo mažesnė. Tiriant organų masę, bandymo gale, nustatyta, kad santykinė kepenų, inkstų ir absoliuti bei santykinė blužnies masė statistiškai reikšmingai padidėjo visose tiriamosiose grupėse, palyginus su sveikų gyvūnų grupe ( lentelė). Reikšmingi inkstų masės skirtumai aptikti ir tarp imunizuotų erkinio encefalito vakcina artritinių grupių bei sveikos vakcinuotos grupės (P <,5). Gyvūnų su AA vakcinacija ryškiau negu sveikų imunizacija didino blužnies masę (P <,,). AA sergančiųjų vakcinuotų gyvūnų blužnies masė buvo didesnė ir reikšmingai skyrėsi ir nuo kontrolinės AA grupės. Ją didino erkinio encefalito vakcina, naudojama profilaktiškai. Vakcinuotų artritinių žiurkių čiobrialiaukės masė, reikšmingai sumažėjo palyginus su sveikomis nevakcinuotomis (P <,,) ir vakcinuotomis (P <,5,) žiurkių grupėmis (žr. lentelę). Tiriant kraujo rodiklius stebėtas statistiškai reikšmingas ENG, lyginant su sveikais gyvūnais padidėjimas sveikų vakcinuotų gyvūnų grupėje (P <,,) ir vakcinuotose su AA grupėse (P <,) ( pav.). Pastarosiose ENG buvo didesnis ir reikšmingai skyrėsi tiek nuo sveikų vakcinuotų gyvūnų grupės, tiek ir nuo kontrolinės AA grupės (P <,5). Leukocitų skaičius ryškiai padidėjo AA sergančiųjų gyvūnų grupėse ir reikšmingai skyrėsi nuo sveikų nevakcinuotų gyvūnų ir vakcinuotų gyvūnų grupių. Tiriant eritrocitų kiekį kraujyje, reikšmingų skirtumų tarp grupių neaptikta. Jis buvo panašus visose grupėse ir siekė apie 5,9 5,53x L (duomenys nepateikiami). Kraujo serumo pro/antioksidantinis aktyvumas žiurkėms su AA imunizuotoms erkinio encefalito vakcina Statistiškai reikšmingai lyginant su sveikų gyvūnų grupe padidėjo MDA kiekis kraujo serume žiurkėms su AA imunizuotoms erkinio encefalito (P <,,) vakcina ir sveikoms vakcinuotoms žiurkėms ( pav.). Lyginant kontrolinės AA grupės MDA kiekį kraujo serume su bandomųjų grupių MDA kiekiu, reikšmingas šio rodiklio padidėjimas aptiktas terapiškai vakcinuotoje AA grupėje (P <,) bei sveikų vakcinuotų gyvūnų grupėje (P <,). Katalazės aktyvumo mažėjimo tendencija lyginant su kontroline AA grupe ir su sveikais gyvūnais (kur katalazės aktyvumas buvo panašus) rasta AA grupėje profilaktiškai imunizuotoje erkinio encefalito vakcina. Statistiškai reikšmingai lyginant su kontrole ir su sveikų gyvūnų grupe katalazė sumažėjo tik vakcinuotoje sveikų gyvūnų grupėje ir segančių artritu grupėje, terapiškai imunizuotoje erkinio encefalito vakcina. AOA kraujo serume statistiškai reikšmingai nesiskyrė 33 lentelė. Kūno ir organų masės pokyčiai sveikoms ir AA sergančioms žiurkėms imunizuotoms erkinio encefalito vakcina Grupės Rodiklis I Kontrolė (AA) n = II (AA profilaktinė vakcinacija) n = III (AA terapinė vakcinacija) n = IV (Sveikos vakcinuotos žiurkės) n = 7 V (Sveikos žiurkės) n = 5 Kūno masė (g) 8,5 ± 5,73 65,64 ± 9,65 65,3 ±, 3,38 ± 3,4 39, ±,7 Kepenys (g) Absoliuti,78 ±,3 9,97 ±,35 9,9 ±,57,77 ±,84,34 ±,4 Santykinė 3,84 ±,5 3,76 ±,4 3,73 ±,7 3,77 ±,3 3,34 ±,6 Inkstai (g) Absoliuti,3 ±,8, ±,,5 ±,9,54 ±,8,6 ±,6 Santykinė,8 ±,,83 ±,,77 ±,,8 ±,,66 ±, Blužnis (g) Absoliuti,5 ±,5,8 ±,5,4 ±,,93 ±,8,6 ±, Santykinė,37 ±,,49 ±,,4 ±,,3 ±,3, ±,4 Plaučiai (g) Absoliuti,9 ±,8, ±,3,6 ±,, ±,9 Santykinė,8 ±,7,84 ±,5,8 ±,5,65 ±,3 Čiobrialiaukė (g) Absoliuti,5 ±,4,58 ±,7,57 ±,5,94 ±,8,84 ±,5 Santykinė,8 ±,, ±,, ±,,3 ±,,7 ±, Pastaba: Adjuvantinis artritas (AA) sukeltas 3 žiurkių lengvos anestezijos būklėje suleidžiant į kairės užpakalinės kojos padą, ml pilnojo Froindo adjuvanto. I grupė (kontrolė) žiurkės su sukeltu AA; II ir III grupės žiurkės su AA imunizuotos 4 kartus, ml vienkartinė žmogaus erkinio encefalito doze (VŽD) (bendras kiekis,4 ml VŽD), 8, 5, ir 3 bandymo dieną (profilaktinė vakcinacija; II grupė) ir 8, 5, ir 3 bandymo dieną (terapinė vakcinacija; III grupė); IV grupė 7 sveiki gyvūnai imunizuoti, 8, 5 ir 3 bandymo dieną; V grupė sveiki, neimunizuoti gyvūnai. Skirtumai statistiškai reikšmingi lyginant su sveikų gyvūnų grupe (); su sveikų vakcinuotų gyvūnų grupe (); su kontroline AA grupe ().

6 34 A L. Leonavičienė, R. Bradūnaitė, D. Vaitkienė, A. Vasiliauskas, A. Venalis B mm/val L nmol/ml nmol/l/min % sumažėjimas ENG Leukocitai MDA Katalazė AOA I II III IV V pav. Kraujo (A) ir pro/antioksidantinės sistemos (B) rodikliai artritinėms žiurkėms imunizuotoms erkinio encefalito vakcina. Adjuvantinis artritas (AA) sukeltas 3 žiurkių lengvos anestezijos būklėje suleidžiant į kairės užpakalinės kojos padą, ml pilnojo Froindo adjuvanto. I grupė (kontrolė) žiurkės su sukeltu AA; II ir III grupės žiurkės su AA imunizuotos 4 kartus, ml vienkartine žmogaus erkinio encefalito doze (VŽD) (bendras kiekis,4 ml VŽD), 8, 5, ir 3 bandymo dieną (profilaktinė vakcinacija II grupė) ir 8, 5, ir 3 bandymo dieną (terapinė vakcinacija; III grupė); IV grupė 7 sveiki gyvūnai imunizuoti, 8, 5 ir 3 bandymo dieną; V grupė sveiki, neimunizuoti gyvūnai. ENG eritrocitų nusėdimo greitis, MDA malondialdehidas, AOA antioksidantinis aktyvumas. Skirtumai statistiškai reikšmingi lyginant su sveikų gyvūnų grupe (); su sveikų vakcinuotų gyvūnų grupe (); su kontroline AA grupe (). tarp tiriamųjų grupių, nors lyginant su sveikais gyvūnais jis buvo atitinkamai,3 proc. ir,3 proc. mažesnis profilaktiškai ir terapiškai vakcinuotose AA gyvūnų grupėse ir,6 proc. sumažėjo sveikiems vakcinuotiems gyvūnams. Profilaktinė ir terapinė artritinių gyvūnų vakcinacija 3,7 proc. ir 4 proc. sumažino AOA lyginant su AA kontrole. Vakcinacijos įtaka kepenims AA grupėse, imunizuotose erkinio encefalito vakcina, statistiškai reikšmingai lyginant su sveikais vakcinuotais gyvūnais padidėjo parenchimos alteracija, sustiprėjus kepenų riebalinei distrofijai ir nekroziniams procesams (P <,,), V.centralis pilnakraujystė (P <,5), po terapinės vakcinacijos, bei uždegiminė stromos infiltracija (P <,) ir uždegiminių ląstelių skverbimasis į skiltelę (P <,) ( pav.). Riebalinė distrofija (P <,5) ir V.centralis pilnakraujystė (P <,), palyginus su kontroline AA grupe, padidėjo po terapinės vakcinacijos, o nekroziniai procesai taikant abu vakcinacijos protokolus (P <,). Imunizavus erkinio encefalito vakcina žiurkes su AA statistiškai reikšmingai padidėjo ir bendra uždegiminė infiltracija (P <,), bei uždegiminių ląstelių skverbimasis į skiltelę (P <,). Sustiprėjo uždegiminė stromos infiltracija limfocitais ir makrofagais, taikant ją profilaktiškai ir terapiškai, o plazminių ląstelių atsiradimą lėmė terapinis jos naudojimas. Jokių uždegiminės infiltracijos požymių neaptikta sveikų vakcinuotų gyvūnų kepenyse. Artritinių žiurkių vakcinacija daugiau kaip kartus negu kontrolėje sustiprino fibrozinius procesus (P <,). Jie buvo 56,4 proc. ryškesni ir sveikų vakcinuotų žiurkių grupėje. Vakcinacijos įtaka plaučiams Histologiniai pokyčiai plaučiuose pateikti 3 paveiksle. Peribronchiolitas (peribronchinė granuloma) su didesnio ar mažesnio laipsnio limfocitų ir plazminių ląstelių infiltracija, aptiktas proc. vakcinuotų ir kontrolinės grupės žiurkių su AA (3 pav. A []). Sveikų, imunizuotų erkinio encefalito vakcina, gyvūnų grupėje infiltracija limfocitais rasta 7,4 proc., o plazminėmis ląstelėmis 4,3 proc. žiurkių, kas reikšmingai skyrėsi nuo kontrolinės AA grupės

7 Vakcinacijos įtaka eksperimentinio autoimuninio proceso eigai A B C 35 balai balai balai,8,6,6,8,4,4,6,,,4,,8,8,8,6,6,6,4,4,4,,, Riebalinė distrofija Nekrozė V. centralis pilnakraujystė Fibrozė I II III IV Uždegiminė infiltracija Skverbimsis į skiltelę pav. Patomorfologiniai pokyčiai kepenyse artritinėms žiurkėms imunizuotoms erkinio encefalito vakcina. I grupė (kontrolė) gyvūnai su sukeltu adjuvantiniu artritu (AA). II ir III grupės žiurkės su AA imunizuotos 4 kartus, ml vienkartine žmogaus erkinio encefalito vakcinos doze (VŽD) (bendras kiekis,4 ml VŽD), 8, 5 ir 3 bandymo dieną (profilaktinė vakcinacija; II grupė) ir 8, 5, ir 3 eksperimento dieną (terapinė vakcinacija; III grupė). IV grupė 7 sveiki gyvūnai imunizuoti, 8, 5 ir 3 dieną. Skirtumai statistiškai reikšmingi lyginant su sveikų vakcinuotų gyvūnų grupe (); su kontroline AA grupe (). (P <,4 limfocitams ir plazminėms ląstelėms P <,5). Peribronchinės fibrozės nerasta nei kontrolinėje grupėje, nei vakcinuotose AA grupėse nors ji aptikta 8,6 proc. sveikų vakcinuotų gyvūnų (3 pav. B). Ryškesnis intersticinis plaučių pažeidimas su intersticinės pneumonijos atsiradimu ir reumatoidinės granuliomos formavimusi, limfocitų infiltracija bei plazminių ląstelių ir gigantinių makrofagų atsiradimu atskiriems gyvūnams, stebėtas visose AA grupėse (3 pav. C [4, 5]). Intersticinės pneumonijos atvejais, stebint infiltraciją limfocitais, reikšmingi skirtumai lyginant su kontroline grupe aptikti tik sveikų vakcinuotų gyvūnų grupėje (P <,), o infiltracija plazminėmis ląstelėmis buvo reikšmingai mažesnė taikant profilaktinę vakcinaciją žiurkėms su AA (P <,9) ir sveikiems vakcinuotiems gyvūnams (P <,8). Profilaktinė vakcinacija reikšmingai padidino ir infiltraciją limfocitais (P <,8) bei gigantinių makrofagų atsiradimą (P <,) reumatoidinėje granulomoje (3 pav. C [6, 8]). Stebint alveolių pažeidimą hemoragijų išraiška panaši tarp vakcinuotų ir kontrolinės grupės gyvūnų ir aptinkama proc. terapiškai ir 8 proc. profilaktiškai vakcinuotų gyvūnų (kontrolėje proc. gyvūnų su hemoragijomis) (3 pav. D []). Sveikų vakcinuotų gyvūnų grupėje pėdsakai ir minimalios hemoragijos rastos atitinkamai 8,6 proc. ir 4,3 proc., žiurkių, ir neaptikta uždegiminės infiltracijos (3 pav. D []), kas reikšmingai skyrėsi nuo kontrolinės ir vakcinuotų AA grupių (P <,5,). Reikšmingai mažesnė nei kontrolėje ir uždegiminė infiltracija abiejose vakcinuotose AA grupėse (P <,9; P <,5) lyginant su kontrole (3 pav. D []). Kraujagyslių pažeidimas su fibrinoidinės nekrozės požymiais buvo žymiai ryškesnis visose AA grupėse, ir reikšmingai skyrėsi nuo sveikų vakcinuotų gyvūnų grupės (P <,) (3 pav. E []). Statistiškai reikšmingų skirtumų tarp kontrolės ir bandomųjų AA grupių tiriant fibrinoidinę nekrozę ir kraujagyslių sklerozę neaptikta, nors pastaroji buvo didesnė visose vakcinuotose grupėse. Apibendrinant gautus duomenis galima teigti, kad žiurkių su AA imunizacija erkinio encefalito vakcina neturėjo didelės įtakos plaučių morfologijai, išskyrus tai, kad esant intersticiniam pažeidimui profilaktinė vakcinacija reikšmingai sustiprino infiltraciją limfocitais ir gigantinių makrofagų atsiradimą reumatoidinėje granulomoje. Sąnarių patinimas ir poliartritų atsiradimas Kontrolinės grupės ir grupių su AA profilaktiškai ir terapiškai imunizuotų keturis kartus erkinio encefalito vakcina, gyvūnų sąnarių patinimo dinamika, matuojant juos pletizmografiškai tris kartus per savaitę, pateikta 4 paveiksle. Profilaktinės vakcinacijos metu statistiškai

8 36 L. Leonavičienė, R. Bradūnaitė, D. Vaitkienė, A. Vasiliauskas, A. Venalis A B C D E Peribronchiolitas Peribronchinė fibrozė Intersticinis pažeidimas Alveolių pažeidimas Kraujagyslių pažeidimas balai,8,6,4,,8,6,4, balai,6,5,4,3,, 3,5,5, Intersticinė pneumonija Reumatoidinė granuloma I II III IV balai balai,6,6,4,4,,,8,8,6,6,4,4,, 3 3 pav. Patomorfologiniai pokyčiai plaučiuose artritinėms žiurkėms imunizuotoms erkinio encefalito vakcina. I grupė (kontrolė) gyvūnai su sukeltu adjuvantiniu artritu (AA). II ir III grupės žiurkės su AA imunizuotos 4 kartus, ml vienkartine žmogaus erkinio encefalito vakcinos doze (VŽD) (bendras kiekis,4 ml VŽD), 8, 5 ir 3 bandymo dieną (profilaktinė vakcinacija; II grupė) ir 8, 5, ir 3 eksperimento dieną (terapinė vakcinacija; III grupė). IV grupė 7 sveiki gyvūnai imunizuoti, 8, 5 ir 3 dieną. A Peribronchiolitas (bronchocentrinė granuloma) [infiltracija limfocitais () ir plazminėmis ląstelėmis ()]; B Peribronchinė fibrozė (3); C Intersticinė pneumonija [infiltracija limfocitais (4), plazminėmis ląstelėmis (5) ir reumatoidinė granuloma [infiltracija limfocitais (6), plazminėmis ląstelėmis (7), gigantiniais makrofagais (8)], fibrozė (9); D Alveolių pažeidimas [hemoragijos (), uždegiminė infiltracija ()]; E kraujagyslių pažeidimas [fibrinoidinė nekrozė (), sklerozė (3)]. Skirtumai statistiškai reikšmingi lyginant su sveikų vakcinuotų gyvūnų grupe (); su kontroline AA grupe (). reikšmingas sąnarių patinimo padidėjimas lyginant su kontroline grupe stebėtas jau po pirmos vakcinos dozės, t.y., 3-ią tyrimų dieną (P <,). Vėliau jis buvo didesnis -tą dieną (P <,), praėjus 4 dienoms po antros imunizacijos, 7-tą dieną praėjus dienoms po trečios imunizacijos (P <,) bei 3-tą dieną (P <,5), kai buvo atlikta ketvirta imunizacija, ir bandymo gale (P <,). Terapinė imunizacija erkinio encefalito vakcina, reikšmingai padidino sąnarių patinimą praėjus 4 dienoms po pirmos imunizacijos (P <,). Po antros imunizacijos, atliktos 5-tą eksperimento dieną, reikšmingai padidėjęs sąnarių patinimas buvo stebimas 5 dienas, t.y. nuo 7 iki tyrimų dienos (P <,5,), bei atlikus trečią ( d.) ir ketvirtą (3 d.) imunizacijas nuo 3 bandymo dienos iki eksperimento pabaigos (P <,,). Reikia pažymėti, kad poliartritai pradėjo atsirasti 3- ią tyrimų dieną ir buvo aptikti proc. kontrolinės grupės ir profilaktiškai bei terapiškai vakcinuotų AA grupių gyvūnams. Pastarojoje poliartritas buvo ryškiausias ir apėmė net tris galūnes. Nuo 5-tos dienos iki bandymo pabaigos grupėse imunizuotose encefalito vakcina proc. gyvūnų sąnarių patinimas buvo stebimas visose keturiose galūnėse, o kitoms proc. žiurkių dviejose galūnėse. Nors tiek kontrolinėje, tiek bandomosiose grupėse poliartritai atsirado tik proc. gyvūnų, tačiau, reikia pažymėti, kad jų išraiška naudojant erkinio encefalito vakciną buvo stipresnė. Sveikų vakcinuotų gyvūnų grupėje jokio sąnarių patinimo po vakcinacijos nestebėta. Sąnarių histologija Tiriant kontrolinės ir vakcinuotų AA grupių minkštuosius sąnario audinius supančius kulkšnį ( lentelė) aptikta reikšmingai padidėjusi uždegiminė infiltracija, edema, angiomatozė, bei jungiamojo audinio dezorganizacija (γ-metachromazija) lyginant su sveikų vakcinuotų gyvūnų grupe (P <,7,). Terapinė gyvūnų su AA vakcinacija palyginus su kontrole padidino bendrą uždegiminę infiltraciją (P <,), infiltraciją leukocitais (P <,) bei makrofagais (P <,3), sustiprino edemą (P <,) ir angiomatozę (P <,). Fibroziniai procesai buvo silpnesni visose bandomosiose grupėse ir reikšmingų skirtumų tarp jų neaptikta. Sinovijos gaurelių proliferacija, edema, γ-metachromazija, uždegiminė infiltracija bei angiomatozė tiek kontrolinėje, tiek ir vakcinuotose AA grupėse buvo stipresnė ir reikšmingai skyrėsi tik nuo sveikų vakcinuotų gyvūnų grupės (P <,3,). Lyginant su kontroline grupe padidėjo tik infiltracija granulocitais taikant terapinę vakcinaciją (P <,5), o profilaktinė vakcinacija sumažino infiltraciją limfocitais (P <,) ir angiomatozę (P <,) ( lentelė). 5 paveiksle pateikti histologiniai pokyčiai, žiurkės sinovijoje, po terapinės imunizacijos

9 Vakcinacijos įtaka eksperimentinio autoimuninio proceso eigai 37 Profilaktinė vakcinacija Terapinė vakcinacija ml 3,5 ml 3,5 3,5 3,5 Sąnarių patinimas,5 Sąnarių patinimas,5,5, Eksperimento dienos Eksperimento dienos I II I III 4 pav. Sąnarių patinimas žiurkėms su adjuvantiniu artritu imunizuotoms erkinio encefalito vakcina. Adjuvantinis artritas sukeltas 3 žiurkių lengvos anestezijos būklėje suleidžiant į kairės užpakalinės kojos padą, ml pilnojo Froindo adjuvanto. Kiekvieną grupę sudarė gyvūnų. I grupė (kontrolė) žiurkės su sukeltu AA; II ir III grupės - žiurkės su AA imunizuotos 4 kartus, ml vienkartine žmogaus erkinio encefalito vakcinos doze (VŽD) (bendras kiekis,4 ml VŽD), 8, 5 ir 3 bandymo dieną (profilaktinė vakcinacija; II grupė) ir 8, 5, ir 3 eksperimento dieną (terapinė vakcinacija; III grupė). Skirtumai statistiškai reikšmingi lyginant su kontroline AA grupe (). erkinio encefalito vakcina. Matosi sinovitas, gaurelių angiogenezė ir ryški uždegiminė infiltracija. Nors tiriant kremzlės histologiją reikšmingi skirtumai rasti tik lyginant su sveikais vakcinuotais gyvūnais, reikia pripažinti, kad gyvūnų su AA vakcinacija sukėlė fisurų atsiradimą, ko nebuvo stebėta kontrolinėje AA grupėje, be to 33,3 proc. ir 6,7 proc. sustiprėjo kremzlės suplonėjimas profilaktiškai ir terapiškai vakcinuotų gyvūnų grupėse. Sveikų vakcinuotų gyvūnų grupėje 4,3 proc. žiurkių rasta nedidelė edema ir fibrozės pėdsakai minkštuose sąnario audiniuose, silpna sinovijos gaurelių proliferacija ir sinovijos edema bei angiomatozės pėdsakai. Nedideli fibroziniai procesai sinovijoje aptikti 8,6 proc. gyvūnų, o sinovijos proliferacijos pėdsakai 57, proc. 8,6 proc. gyvūnų rasta nedidelė ir vidutinio laipsnio kremzlės erozija. Aptarimas Susirūpinimas dėl vakcinacijos saugumo ir efektyvumo imunizuojant asmenis, sergančius jungiamojo audinio ligomis, tęsiasi kelis dešimtmečius [47, 48]. Vakcinuotų individų tyrimai svarbūs dėl iškylančių rimtų problemų, susijusių su kai kurių užmuštų vakcinų naudojimu. Darbai panaudojant laboratorinius gyvūnus, kuriems sukeltos autoimuninės ligos, galėtų pagilinti žinias apie naudojamų vakcinų saugumą. Mūsų ankstesni tyrimai imunizavus žiurkes gripo vakcina [6] parodė tam tikrą ryšį tarp vakcinacijos ir autoimuninio proceso sustiprėjimo. Literatūroje mums nepavyko rasti darbų, kuriuose gyvūnai, sergantys autoimunine liga, būtų imunizuojami erkinio encefalito vakcina. Pateikiami tik eksperimentiniai gyvūnų modeliai, kuriuose tiriamas erkinio encefalito virusas ir vakcinų prieš jį efektyvumas [49 5]. Panaudodami AA kaip RA modelį mes parodėme, kad

10 38 L. Leonavičienė, R. Bradūnaitė, D. Vaitkienė, A. Vasiliauskas, A. Venalis lentelė. Patomorfologiniai pokyčiai sąnariuose sveikoms ir adjuvantiniu artritu sergančioms žiurkėms imunizuotoms erkinio encefalito vakcina Grupės Rodiklis I Kontrolė (AA) n = II (AA profilaktinė vakcinacija) n = III (AA terapinė vakcinacija) n = IV (Sveikos vakcinuotos žiurkės) n = 7 Minkštieji sąnario audiniai Sinovija Kremzlė Uždegiminė infiltracija Limfocitai,9 ±,4,85 ±,5,8 ±,3 Plazminės ląstelės,5 ±,5,5 ±,8 Leukocitai,55 ±,,8 ±,3,65 ±, Makrofagai,3 ±,5,4 ±,,8 ±,3 Bendra,3 ±,8, ±,3,65 ±,,4 ±,4 Edema,8 ±,3, ±,8,5 ±,8 Angiomatozė, ±,8,9 ±,3,8 ±, Fibrozė,5 ±,7, ±,,5 ±,5,7 ±,7 Jungiamojo audinio dezorganizacija,7 ±,7,55 ±,4,5 ±,7 Proliferacija,6 ±,,65 ±,7,65 ±,8,43 ±,3 Edema,5 ±,,7 ±,6,45 ±,4,7 ±,7 Jungiamojo audinio dezorganizacija,55 ±,6,65 ±,,45 ±, Uždegiminė infiltracija Limfocitai,45 ±,,65 ±,5,45 ±,4 Plazminės ląstelės, ±,7 Granulocitai,45 ±,,85 ±,,9 ±,8 Makrofagai,45 ±,6,35 ±,3,65 ±,3 Bendra,55 ±,,5 ±,3,55 ±,4 Fibrozė, ±,3,5 ±,7,9 ±,8 Angiomatozė,65 ±,, ±,,65 ±,3,7 ±,7 Erozija,8 ±,3,4 ±,3,5 ±,6,36 ±,3 Usura,95 ±,3,85 ±,3, ±,7 Fisura,35 ±,, ±,3 Rūgštūs glikozamino glikanai, ±,9,75 ±,7,8 ±,3 3, ± Panusas,6 ±,8,5 ±,5,4 ±, Kremzlės suplonėjimas,6 ±,8,8 ±,9,7 ±,9 Pastaba: Adjuvantinis artritas (AA) sukeltas 3 žiurkių lengvos anestezijos būklėje suleidžiant į kairės užpakalinės kojos padą, ml pilnojo Froindo adjuvanto. I grupė (kontrolė) žiurkės su sukeltu AA; II ir III grupės žiurkės su AA imunizuotos 4 kartus, ml vienkartinės žmogaus erkinio encefalito doze (VŽD) (bendras kiekis,4 ml VŽD), 8, 5, ir 3 bandymo dieną (profilaktinė vakcinacija; II grupė) ir 8, 5, ir 3 bandymo dieną (terapinė vakcinacija; III grupė); IV grupė 7 sveiki gyvūnai imunizuoti, 8, 5 ir 3 bandymo dieną. Skirtumai statistiškai reikšmingi lyginant su sveikų vakcinuotų gyvūnų grupe (), su kontroline AA grupe (). erkinio encefalito vakcina gali sustiprinti autoimuninius procesus. Keturios vakcinos injekcijos į raumenis reikšmingai padidino sąnarių patinimą. Vystėsi stipresnis autoimuninis procesas ir histologiniai pokyčiai juose. Stebėti tik nedideli skirtumai tarp profilaktinės ir terapinės vakcinacijos. Palyginus su AA kontrole, minkštuosiuose sąnario audiniuose taikant terapinę gyvūnų su AA vakcinaciją reikšmingai didėjo uždegiminė infiltracija, ryškiai sustiprėjo edema ir angiomatozė, o sinovijoje infiltracija granulocitais. Gyvūnų su AA vakcinacija sukėlė fisurų atsiradimą, ko nebuvo stebėta kontrolinėje AA grupėje, be to 33,3 proc. ir 6,7 proc. labiau suplonėjo kremzlė profilaktiškai ir terapiškai vakcinuotų gyvūnų grupėse. Palyginus silpnas atsakas į vakcinaciją buvo stebėtas sveikiems gyvūnams. Jiems nerasta jokio sąnarių patinimo, tačiau vertinant juos histologiškai vienam gyvūnui rasta nežymi edema ir fibrozės pėdsakai minkštuose sąnario audiniuose, o dviems žiurkėms nedidelė ir vidutinio laipsnio kremzlės erozija. Kiek ryškesni pokyčiai sinovijoje, kur proliferacijos pėdsakai ir silpna sinovijos gaurelių proliferacija aptikti 57, proc. ir 4,3 proc. gyvūnų, o nedidelė edema vienai žiurkei. Tai rodo, kad imunizacija erkinio encefalito vakcina nežymiai veikia net ir sveikų žiurkių sąnarius. Daugelyje tyrimų parodyta, kad sergant AA pažeidžiami ne tik sąnariai, bet taip pat ir vidaus organai.

11 Vakcinacijos įtaka eksperimentinio autoimuninio proceso eigai 39 5 pav. Patmomorfologinis vaizdas sąnaryje žiurkėms su adjuvantiniu artritu terapiškai imunizuotoms erkinio encefalito vakcina. Sinovitas. Sinovijos gaurelių angiomatozė ir ryški uždegiminė infiltracija. Pad. x=. Adjuvantinės ligos metu dėl baltymų metabolizmo pokyčių [5] sureaguoja kepenys, jų masė padidėja. Be to artritinėms žiurkėms mažėja kūno ir čiobrialiaukės masė [53]. Viena iš eksperimentinio artrito diagnostinių sisteminio uždegimo charakteristikų yra blužnies masės didėjimas ir splenomegalija, naudojama kaip patologinis AA rodiklių [54 56]. Vakcinacija pablogino sisteminius patologinio proceso parametrus, tokius kaip kraujo rodikliai ir organų masė. Po vakcinacijos mūsų eksperimento gyvūnams reikšmingai padidėjo blužnies masė, ENG. Mūsų gauti duomenys parodė, kad erkinio encefalito vakcina ne tik sustiprina autoimuninį procesą, pablogina patologinio proceso rodiklius, bet taip pat lemia histologinius pokyčius vidaus organuose. Gana ryškus vakcinacijos poveikis stebėtas kepenims: taikant terapinę vakcinaciją artritiniams gyvūnams rasta ryškesnė negu kontroliniams riebalinė distrofija, V.centralis pilnakraujystės padidėjimas ir plazminių ląstelių atsiradimas, o nekrozinių procesų sustiprėjimas bei uždegiminė stromos infiltraciją limfocitais ir makrofagais aptikta taikant abu vakcinacijos protokolus. Reikšmingai didėjo ir kepenų bendra uždegiminė infiltracija bei uždegiminių ląstelių skverbimasis į skiltelę. Jokių uždegiminės infiltracijos požymių nerasta sveikiems vakcinuotiems gyvūnams. Gyvūnams su AA vakcinacija daugiau kaip kartų sustiprino fibrozinius procesus, kurie buvo 56,4 proc. ryškesni ir sveikų vakcinuotų žiurkių grupėje. Žiurkių su AA imunizacija erkinio encefalito vakcina neturėjo didelės įtakos plaučių morfologijai, išskyrus tai, kad esant intersticiniam pažeidimui profilaktinė vakcinacija reikšmingai sustiprino infiltraciją limfocitais ir gigantinių makrofagų atsiradimą reumatoidinėje granulomoje. Oksidacinis stresas eksperimentinio ir RA metu taip pat svarbus sąnarių uždegimui ir destrukcijai [57 59]. Vienas iš oksidacinio pažeidimo rodiklių yra MDA, kaip galutinio lipidų peroksidacijos produkto, susidarymas [6]. Šis rodiklis kraujo serume reikšmingai padidėjo po terapinės vakcinacijos. MDA kiekis didėjo kartu su žymiu katalazės aktyvumo sumažėjimu, tačiau vakcinacija neturėjo įtakos kraujo serumo AOA, kuris buvo panašus abiejose vakcinuotuose grupėse ir nesiskyrė nuo kontrolės. Nors sveikiems vakcinuotiems gyvūnams ir neatsirado autoimuninės ligos simptomų ir tik nedideliam jų skaičiui buvo histologiškai stebimi minimalūs pokyčiai sąnariuose, tačiau reikia pažymėti, kad buvo rasta biocheminių ir hematologinių pokyčių (padidėjo ENG, MDA, sumažėjo katalazės aktyvumas). Apibendrinant galima teigti, kad gyvūnų, kuriems sukeltas autoimuninis procesas imunizacija erkinio encefalito vakcina sustiprina jo eigą. Tačiau ryšys tarp ligos stiprumo ir vakcinacijos dar nėra aiškus. Manome, kad vakcina sustiprintos AA ligos patogenezė yra sudėtinga ir priklauso nuo daugelio veiksnių: vakcinų komponentų

12 4 L. Leonavičienė, R. Bradūnaitė, D. Vaitkienė, A. Vasiliauskas, A. Venalis [7, 8], virusinių superantigenų, aktyvuojančių T ląsteles ir sukeliančių autoimuninio proceso sustiprėjimą [6], vakcinacijos aktyvuojamų molekulinės mimikrijos kelių [6, 63], interferono gama ir kitų uždegiminių citokinų gamybos [8]. Tikslesniam supratimui reikalingi tolimesni cheminių mediatorių (citokinų ir chemokinų) tyrimai ir histopatologinės studijos. Nors šiame darbe ir aprašyti histopatologiniai tyrimai, tačiau ląstelių, ypač T limfocitų, paviršiaus žymenų nustatymas vakcinuotoms žiurkėms suteiktų papildomą informaciją. Išvados. Imunizavus erkinio encefalito vakcina sveikas žiurkes, autoimuninio proceso atsiradimas nenustatytas, išskyrus nežymius histologinius pokyčius kai kurių gyvūnų sąnariuose.. Erkinio encefalito vakcina, ypač taikant terapinę imunizaciją, sustiprina uždegimą gyvūnams su AA: padidėja sąnarių patinimas, juose atsiranda daugiau patomorfologinių pokyčių, pablogėja kraujo rodikliai, sumažėja katalazės aktyvumas ir padidėja MDA kiekis kraujo serume. 3. Tolimesni tyrimai būtini mūsų duomenims patvirtinti ir detaliam vakcinų poveikio autoimuniniam procesui paaiškinti. Literatūra. Lutz W, Sanderson W, Scherbov S. Doubling of world population unlikely. Nature. 997; 387(6635): United Nations, Department of Economic and Social Affairs, Population Division: World population ageing Report prepared for the nd World Assembly on Ageing, population/publications/worldageingi955/]. (ST/ ESA/SER.A/7) United Nations Publishing; New York (accessed 4 February 7). 3. Gavazzi G, Krause KH. Ageing and infection. Lancet Infect Dis. ; (): Goodwin K, Viboud C, Simonsen L. Antibody response to influenza vaccination in the elderly: a quantitative review. Vaccine. 6; 4(8): Haynes L. How vaccines work on the background of the aging immune system. Exp Gerontol. 7; 4(5): Aspinall R, Del Giudice G, Effros RB, et al. Challenges for vaccination in the elderly. Immun Ageing. 7; 4: Cambier J. Immunosenescence: a problem of lymphopoiesis, homeostasis, microenvironment, and signaling. Immunol Rev. 5; 5: McElhaney JE. Overcoming the challenges of immunosenescence in the prevention of acute respiratory illness in older people. Conn Med. 3; 67(8): Fagnoni FF, Vescovini R, Passeri G, et al. Shortage of circulating naive CD8() T cells provides new insights on immunodeficiency in aging. Blood. ; 95(9): Lazuardi L, Jenewein B, Wolf AM, et al. Age-related loss of naïve T cells and dysregulation of T-cell/Bcell interactions in human lymph nodes. Immunology. 5; 4(): Weinberger B, Herndler-Brandstetter D, Schwanninger A, et al. Biology of immune responses to vaccines in elderly persons. Clin Infect Dis. 8; 46(7): Grubeck-Loebenstein B, Wick G. The aging of the immune system. Adv Immunol. ; 8: Han S, Yang K, Ozen Z, et al. Enhanced differentiation of splenic plasma cells but diminished long-lived high-affinity bone marrow plasma cells in aged mice. J Immunol. 3; 7(3): Hainz U, Jenewein B, Asch E, et al. Insufficient protection for healthy elderly adults by tetanus and TBE vaccines. Vaccine. 5; 3(5): Chen RT, Pless R, Destefano F. Epidemiology of autoimmune reactions induced by vaccination. J Autoimmun. ; 6(3): Leonavičienė L, Bradūnaitė R, Vasiliauskas A, et al. Development of autoimmune process in rats immunized with influenza vaccine. Acta Medica Lituanica. 9; 6(): Shoenfeld Y, Aron-Maor A. Vaccination and autoimmunity- vaccinosis : a dangerous liaison? J Autoimmun. ; 4():. 8. Vial T, Descotes J. Autoimmune diseases and vaccinations. Eur J Dermatol. 4; 4(): Robles DT, Eisenbarth GS. Type A diabetes induced by infection and immunization. J Autoimmun. ; 6(3): Zingg W. Does vaccination cause disease? Ther Umsch. 5; 6(): Vasudev M, Zacharisen MC. New-onset rheumatoid arthritis after anthrax vaccination. Ann Allergy Asthma Immunol. 6; 97():.. Heijstek MW, Wulffraat NM. Vaccination in au-

13 Vakcinacijos įtaka eksperimentinio autoimuninio proceso eigai toimmune diseases: a blessing in disguise? Summary Future Rheumatology. 7; (): Mitchell LA, Tingle AJ, MacWilliam L, et al. HLA-DR class II associations with rubella vaccine-induced joint manifestations. J Infect Dis. 998; 77(): Maillefert JF, Sibilia J, Toussirot E, et al. Rheumatic disorders developed after hepatitis B vaccination. Rheumatology. 999; 38(): Older SA, Battafarano DF, Enzenauer RJ, et al. Can immunization precipitate connective tissue disease? Report of five cases of systemic lupus erythematosus and review of the literature. Semin Arthritis Rheum. 999; 9(3): Geier DA, Geier MR. A case-control study of serious autoimmune adverse events following hepatitis B immunization. Autoimmunity. 5; 38(4): Offit PA, Hackett CJ. Addressing parents concerns: do vaccines cause allergic or autoimmune diseases? Pediatrics. 3; (3): Hogenesch H, Azcona-Olivera J, Scott-Moncrieff C et al. Vaccine-induced autoimmunity in the dog. Adv Vet Med. 999; 4: Classen DC, Classen JB. The timing of pediatric immunization and the risk of insulin-dependent diabetes mellitus. Infect Dis Clin Pract. 997; 6: Singh B. Stimulation of the developing immune system can prevent autoimmunity. J Autoimmun. ; 4(): Classen JB. The timing of immunization affects the development of diabetes in rodents. Autoimmunity. 996; 4(3): Ravel G, Christ M, Liberge P, et al. Effects of two pediatric vaccines on autoimmune diabetes in NOD female mice. Toxicol Lett. 3; 46(): Koppang EO, Bjerkås I, Haugarvoll E, et al. Vaccination-induced systemic autoimmunity in farmed atlantic salmon. J Immunol. 8; 8(7): Popovici V, Lungu A, Ungureanu A. Histopathology of the experimental tick-borne encephalitis in mice. Rom J Morphol Embryol. 993; 39( ): Evseenko VA, Bukin EK, Zaykovskaya AV, et al. Experimental infection of H5N HPAI in BALB/c mice. Virol J. 7; 4: Ottolini MG, Blanco JC, Eichelberger MC, et al. The cotton rat provides a useful small-animal model for the study of influenza virus pathogenesis. J Gen Virol. 5; 86(Pt ): Straight TM, Ottolini MG, Prince GA, et al. Evidence of a cross-protective immune response to influenza A in the cotton rat model. Vaccine. 6; 4(37 39): Monath TP, Heinz FX. Flaviviruses. In: Fields BN, Knipe DM, Howley PM, et al. (eds.). Fields virology. 3rd ed. Vol. Philadelphia: Lippincott-Raven, 996: Günther G, Haglund M. Tick-borne encephalopathies: epidemiology, diagnosis, treatment and prevention. CNS Drugs. 5; 9(): Kunz C, Hofmann H, Kundi M, et al. Efficacy of specific immunoglobulin against TBE. Wien Klin Wochenschr. 98; 93(): Gavrilov VB, Gavrilova AR, Mazhul LM. Analysis of methods for detection of lipid peroxidation products in blood serum using thiobarbituric acid test. Vopr Med Khim. 987; 33(): Ohkawa H, Ohishi N, Yagi K. Assay for lipid peroxides in animal tissues by thiobarbituric acid reaction. Anal Biochem. 979; 95(): Arutiunian AV, Dubinina EE, Zibina NN. Methods for evaluation of organism free radical oxidation and antioxidant system. St. Petersburg : 49 5 (in Russian). 44. Koroliuk MA, Ivanova LI, Mayorova IG, et al. Method for detection of catalase activity. Lab Delo. 988; : 6 9 (in Russian). 45. Aebi H. Catalase in vitro. Methods Enzymol. 984; 5: Galaktionova LP, Molchanov AV, Yelchaninova SA, et al. Lipid peroxidation in patients with gastroduodenal ulcer. Clin Lab Diagn. 998; 6: Older SA, Battafarano DF, Enzenauer RJ, et al. Can immunization precipitate connective tissue disease? Report of five cases of systemic lupus erythematosus and review of the literature. Semin Arthritis Rheum. 999; 9(3): Elkayam O, Yaron M, Caspi D. Safety and efficacy of vaccination against hepatitis B in patients with rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis. ; 6(7): Timofeev AV, Ozherelkov SV, Pronin AV, et al. Immunological basis for protection in a murine model of tick-borne encephalitis by a recombinant adenovirus carrying the gene encoding the NS non-structural protein. J Gen Virol. 998; 79 (Pt 4): Aleshin SE, Timofeev AV, Khoretonenko MV, et al. Combined prime-boost accination against tick-borne 4

14 4 L. Leonavičienė, R. Bradūnaitė, D. Vaitkienė, A. Vasiliauskas, A. Venalis encephalitis (TBE) using a recombinant vaccinia virus and a bacterial plasmid both expressing TBE virus nonstructural NS protein. BMC Microbiol. 5; 5: Labuda M, Trimnell AR, Lickova M, et al. An antivector vaccine protects against a lethal vector-borne pathogen. PLoS Pathog. 6; (4): e7. 5. Fedatto Júnior Z, Ishii-Iwamoto EL, Amado CB, et al. Gluconeogenesis in the liver of arthritic rats. Cell Biochem Funct. 999; 7(4): Bruot BC, Clemens JW. Effect of adjuvant-induced arthritis on serum luteinizing hormone and testosterone concentrations in the male rat. Life Sci. 987; 4(3): Fletcher DS, Widmer WR, Luell S, et al. Therapeutic administration of a selective inhibitor of nitric oxide synthase does not ameliorate the chronic inflammation and tissue damage associated with adjuvant-induced arthritis in rats. J Pharmacol Exp Ther. 998; 84(): Tanahashi M, Funaba Y, Itoh M, et al. Inhibitory effects of TRK-53 on rat adjuvant arthritis. Pharmacology. 998; 56(5): Paulos CM, Varghese B, Widmer WR, et al. Folate-targeted immunotherapy effectively treats established adjuvant and collagen-induced arthritis. Arthritis Res Ther. 6; 8(3):. 57. Sarban S, Kocyigit A, Yazar M, et al. Plasma total antioxidant capacity, lipid peroxidation, and erythrocyte antioxidant enzyme activities in patients with rheumatoid arthritis and osteoarthritis. Clin Biochem. 5; 38(): Tsuji G, Koshiba M, Nakamura H, et al. Thioredoxin protects against joint destruction in a murine arthritis model. Free Radic Biol Med. 6; 4(): Vasiliauskas A, Keturkienė A, Leonavičienė L, et al. Influence of Aesculus hippocastanum (L.) tincture in vitro on the indices of reactive oxygen species of gastric tissue in rats with indomethacin-induced ulcers in adjuvant arthritis. Biologija. 4; (): Ozkan Y, Yardym-Akaydyn S, Sepici A, et al. Oxidative status in rheumatoid arthritis. Clin Rheumatol. 7; 6(): Wucherpfennig KW. Mechanisms for the induction of autoimmunity by infectious agents. J Clin Invest. ; 8(8): Albert LJ, Inman RD. Molecular mimicry and autoimmunity. N Engl J Med. 999; 34(7): Fujinami RS, von Herrath MG, Christen U, et al. Molecular mimicry, bystander activation, or viral persistence: infections and autoimmune disease. Clin Microbiol Rev. 6; 9(): Straipsnis įteiktas redakcijai 9 m. vasario 9 d., priimtas spaudai 9 m. kovo 3 d. INFLUENCE OF VACCINATION ON THE DEVELOPMENT OF EXPERIMENTAL AUTOIMMUNE PROCESS L. Leonavičienė, R. Bradūnaitė, D. Vaitkienė,, A. Vasiliauskas, A. Venalis, Institute of Experimental and Clinical Medicine at Vilnius University Vilnius University, Faculty of Medicine Abstract Objective. To evaluate the development of autoimmune process in rats with adjuvant arthritis (AA) after immunization with tick-borne vaccine. Methods. 4 Wistar male rats (3 with AA and healthy) were used. Two groups of animals with AA and one group of healthy rats (7 animals) were immunized intramuscularly (i.m.) four times with. ml of tick-borne vaccine. Prophylactic and therapeutic vaccination was made. Untreated groups (with AA and healthy) served as controls. Body and organ s weight, blood and pro/antioxidant system indices in serum, joint swelling, development of polyarthritis, and histological changes in joints, liver and lungs were determined. Results. More aggressive pathological process with elevated ESR, increased weight of the spleen and decreased weight of the thymus and histological changes in the liver and joints were observed in vaccinated animals. An increase of malondialdehyde (MDA) level and the decrease of catalase activity in the blood serum of therapeutically vaccinated AA group and healthy vaccinated animals were found. The serum antioxidant activity (AOA) did not differ significantly among the tested groups. Therapeutic vaccination of arthritic rats induced significant changes in the liver: an increase of fatty distrophy, V.centralis hypervolemia and the rise of plasma cells were observed. Both protocols of vaccination exacerbated necrotic processes and inflammatory infiltration of hepatic stroma with lymphocytes and macrophages. The immunization of arthritic

15 Vakcinacijos įtaka eksperimentinio autoimuninio proceso eigai 43 rats with tick-borne vaccine did not have a great influence on lung morphology. Only the prophylactic vaccination, significantly increased inflammatory infiltration with lymphocytes and the rise of giant macrophages in rheumatoid granuloma in the case of interstitial lesion. Vaccination exacerbated joint swelling and histological articular changes. Inflammatory infiltration, edema, and angiomathosis in periarticular soft tissues, and infiltration with granulocytes in synovium significantly increased after therapeutic vaccination of arthritic animals. Vaccination of animals with AA induced the rise of fissures, which were not detected in the control AA group. The thinning of cartilage was enhanced by 33.3%. and 6.7% after prophylactic and therapeutic vaccination. We failed to detect any evidence of a clinically observed autoimmune process in healthy rats after vaccination, except only minimal histological changes in joints of some animals. Conclusions. Immunization of arthritic animals with tickborne vaccine exacerbated autoimmune disease what showed the increased prooxidant activity, indices of inflammatory process, joint swelling and histological changes in them. A greater impairment was observed after therapeutic vaccination. Keywords: rats, adjuvant arthritis, vaccination